BR112020024935A2

BR112020024935A2 - Terapia gênica cardíaca com aav para cardiomiopatia

Info

Publication number: BR112020024935A2
Application number: BR112020024935-1A
Authority: BR
Inventors: Hugh Lee Sweeney; Margaret Mary Sleeper
Original assignee: University Of Florida Research Foundation, Incorporated
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2019-06-07
Publication date: 2021-03-09
Also published as: CN112272705A; CA3100280A1; EP3814512A4; SG11202011061SA; KR20210018902A; EP3814512A1; CO2020016718A2; MX2020013313A; JP2021526818A; AU2019282822A1; CL2020003190A1; US20210260215A1; WO2019237067A1; IL279225A

Abstract

"terapia gênica cardíaca com aav para cardiomiopatia". a presente invenção refere-se as composições e aos métodos úteis no tratamento de condições cardíacas. as composições e os métodos divulgados são baseados em uma terapia com o aav que compreende um vetor de aav recombinante, para a liberação de dois ou mais transgenes no coração de um paciente, em que os transgenes compreendem uma proteína da família s100 e um inibidor apoptótico. em alguns aspectos, visar as múltiplas fontes de uma ou mais condições cardíacas pode proporcionar benefícios sinergísticos durante o tratamento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPIA GÊNICA CARDÍACA COM AAV PARA CARDIOMIOPATIA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício das datas de depósito do Pedido Provisório U.S. No. 62/682.772, depositado em 8 de junho de 2018, e do Pedido Provisório U.S. No. 62/822.015, depositado em 21 de março de 2019, todo o conteúdo de cada um deles sendo incorporado por referência.

ANTECEDENTES

[0002] A cardiomiopatia dilatada (DCM) é a segunda causa mais comum de doença cardíaca em cães, e o tratamento médico dos sinais secundários é a única opção terapêutica. O prognóstico para os cães afetados depende do estágio da doença e da raça. Os doberman pinschers apresentam progressão particularmente rápida e uniforme logo que a insuficiência cardíaca congestiva (ICC) tenha ocorrido, com a maioria vivendo menos que 6 meses. A cardiomiopatia dilatada (DCM) é o tipo mais comum de cardiomiopatia humana, ocorrendo principalmente em adultos de 20 a 60 anos. Ela afeta os ventrículos e os átrios do coração, as câmaras inferior e superior do coração, respectivamente. A maioria das formas de DCM são adquiridas a partir de diversas causas que incluem a doença cardíaca coronariana, o ataque cardíaco, a hipertensão, o diabetes, a doença da tireoide, a hepatite viral e as infecções virais que inflamam o músculo cardíaco. O abuso de álcool e certas drogas, como a cocaína e as anfetaminas, bem como pelo menos dois fármacos usados para tratar o câncer (doxorrubicina e daunorrubicina), também podem levar à DCM. Além disso, há uma série de formas genéticas da DCM, incluindo, porém, não limitadas à, DCM associada às distrofias musculares de Duchenne e Becker. No caso de certas formas de distrofia muscular de Becker, bem como na maioria dos casos da distrofia muscular de Duchenne, a cardiomiopatia pode limitar, no final das contas, a sobrevivência do paciente.

SUMÁRIO

[0003] A cardiomiopatia é a segunda causa mais comum de doença cardíaca em pacientes e o tratamento médico dos sinais secundários é a única opção terapêutica. O prognóstico para os pacientes afetados depende do estágio da doença e da raça. A função cardíaca é criticamente dependente da sinalização dependente de cálcio. Durante a doença cardíaca, o mau funcionamento dos canais de cálcio dentro das células cardíacas promove anormalidades do ciclo do cálcio, inibindo ainda mais a função cardíaca. Demonstrou-se que as estratégias de transferência de genes para reduzir as anormalidades do ciclo do cálcio melhoram as doenças cardíacas em modelos de animais pequenos e grandes, bem como em ensaios clínicos em humanos.

[0004] Nos humanos, a cardiomiopatia dilatada é o tipo mais comum de cardiomiopatia e pode ter origem a partir de diversas doenças adquiridas e genéticas. Como nos cães e em outros modelos de animais, enquanto as origens da doença estão enraizadas na disfunção do trânsito de cálcio, a progressão final da doença é conduzida por disfunção mitocondrial e/ou apoptose induzida por estiramento dos cardiomiócitos. Embora a abordagem do trânsito de cálcio sozinha possa ser eficaz nos estágios iniciais da doença, a abordagem da combinação de trânsito de cálcio, disfunção mitocondrial e apoptose será necessária para tratar todas as formas de DCM e em todos os estágios da progressão da doença.

[0005] São divulgadas neste documento abordagens de liberação de genes para o tratamento de pacientes com cardiomiopatia e insuficiência cardíaca congestiva. Essas abordagens compreendem a expressão de S100A1 para abordar o trânsito de cálcio e a expressão de ARC (Repressor de Apoptose com Domínio de Recrutamento de

Caspase) para bloquear todas as fontes de apoptose e normalizar a função mitocondrial. A expressão dos transgenes S100A1 e ARC através da abordagem divulgada do vetor de AAV autocomplementar é rápida (isto é, dentro de horas), o que é crítico na neutralização dos efeitos da insuficiência cardíaca em estágio terminal, e está restrita ao coração. Assim, essas abordagens abordam todos os três impulsionadores do início e da progressão da DCM e, desse modo, devem ser aplicáveis a qualquer forma de DCM, em qualquer estágio da progressão da doença.

[0006] Alguns aspectos da presente divulgação proporcionam vetores de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) para a liberação de transgenes no coração de um paciente. Em algumas modalidades, tais vetores de rAAV incluem pelo menos dois transgenes, um que codifica uma proteína da família S100 e um que codifica um inibidor apoptótico. Esses vetores de rAAV podem incluir, de 5’ para 3’, em ordem, uma primeira sequência de repetição terminal invertida (ITR) do vírus adenoassociado (AAV), um promotor operavelmente ligado aos transgenes e uma segunda sequência de repetição terminal invertida (ITR) do AAV. Em algumas modalidades, os dois transgenes estão operavelmente ligados ao mesmo promotor individual. Em outras modalidades, cada transgene está operavelmente ligado a um promotor separado. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV também inclui pelo menos um sinal de poliadenilação (por exemplo, 3’ em relação aos dois transgenes expressos a partir de um promotor individual, ou 3’ em relação a um ou ambos os transgenes expressos a partir de diferentes promotores). Os aspectos da divulgação proporcionam vetor de ácido nucleico de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) para a liberação de dois ou mais transgenes no coração de um paciente, em que o dito vetor compreende, de 5’ para 3’, em ordem, uma primeira sequência de repetição terminal invertida (ITR) do vírus adenoassociado (AAV), dois ou mais transgenes e um promotor operavelmente ligado aos dois ou mais transgenes, um sinal de poliadenilação e uma segunda sequência de repetição terminal invertida (ITR) do AAV, em que os dois ou mais transgenes compreendem uma proteína da família S100 e um inibidor apoptótico.

[0007] Os transgenes da presente divulgação podem ser uma proteína da família S100 e um inibidor apoptótico. Por exemplo, a proteína da família S100 é a proteína de ligação ao cálcio S100 A1 cardíaca (cS100A1) ou uma variante dela. Em outro exemplo, o inibidor apoptótico é o Repressor de Apoptose com Domínio de Recrutamento de Caspase cardíaco (cARC) ou uma variante dele.

[0008] Em algumas modalidades, um ou mais dos transgenes da presente divulgação são sequências que ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades, um ou mais transgenes são planejados para serem específicos para uma espécie. Em algumas modalidades, um ou mais transgenes são com códons otimizados para a expressão em uma espécie de interesse, por exemplo, canina. Em certas modalidades, um ou mais transgenes (por exemplo, o transgene cARC) são com códons otimizados.

[0009] Em algumas modalidades, um Sítio Interno de Entrada do Ribossomo (IRES) está presente entre os dois ou mais transgenes (por exemplo, entre o transgene cS100A1 e o transgene cARC). Em algumas modalidades, o transgene que codifica a proteína da família S100 está 5’ em relação ao transgene que codifica o inibidor apoptótico. Em outras modalidades, o transgene que codifica o inibidor apoptótico está 5’ em relação ao transgene que codifica a proteína da família S100.

[00010] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor restrito ao coração. O promotor restrito ao coração pode ser um promotor a partir de um dos seguintes genes: gene da cadeia pesada da α-miosina, gene da cadeia pesada da 6-miosina, gene da cadeia leve da miosina

2v, gene da cadeia leve da miosina 2a, gene de CARP, gene da α-actina cardíaco, gene da acetilcolina muscarínica m2 cardíaco, ANF, troponina C cardíaca, troponina I cardíaca, troponina T cardíaca (cTnT), gene da Ca-ATPase do retículo sarcoplasmático cardíaco, α-actina esquelética; ou um promotor cardíaco artificial derivado do gene da MLC-2v. Em algumas modalidades, o promotor restrito ao coração é um promotor da cTnT.

[00011] São adicionalmente proporcionadas neste documento partículas do rAAV contendo os vetores de rAAV divulgados neste documento, encapsidadas em capsídeos do AAV. Em algumas modalidades, o capsídeo do AAV compreende proteínas do capsídeo derivadas dos sorotipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV8 ou AAV9. Em algumas modalidades, o capsídeo do AAV compreende proteínas do capsídeo derivadas do sorotipo AAVrh.10.

[00012] Os outros aspectos da presente invenção incluem as composições contendo as partículas do rAAV descritas neste documento. Tais composições podem ser administradas a um paciente para a terapia gênica para a doença cardíaca. Em algumas modalidades, a doença cardíaca causa insuficiência cardíaca no paciente. Em algumas modalidades, a doença cardíaca é a cardiomiopatia. Em outras modalidades, a doença cardíaca é a cardiomiopatia hipertrófica ou a cardiomiopatia dilatada. Em outras modalidades, a doença cardíaca é a isquemia aguda.

[00013] As composições da presente invenção podem ser administradas ao paciente por meio de rotas diferentes. Em algumas modalidades, a composição é administrada por meio de injeção no coração do paciente. Em algumas modalidades, a administração da composição resulta na expressão dos transgenes no coração do paciente.

[00014] Em algumas modalidades, o paciente é um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades, o mamífero é um animal de companhia. Por exemplo, o animal de companhia pode ser um cão, gato, cavalo, porco, vaca, ovelha, coelho ou outro animal de estimação.

[00015] Cada um dos elementos da invenção pode abranger várias modalidades da invenção. Portanto, antecipa-se que cada uma das limitações da invenção envolvendo qualquer um dos elementos, ou combinações de elementos, pode ser incluída em cada aspecto da invenção. Esta invenção não está limitada em sua aplicação aos detalhes de construção e ao arranjo dos componentes apresentados na descrição a seguir ou conforme ilustrados nos desenhos. A presente invenção é capaz de outras modalidades e de ser praticada ou realizada de várias maneiras.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00016] Os desenhos a seguir fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar adicionalmente certos aspectos da presente invenção. A divulgação pode ser mais bem compreendida por referência à seguinte descrição, tomada em conjunto com os desenhos anexos, nos quais numerais de referência semelhantes identificam elementos semelhantes:

[00017] A FIG. 1 representa um diagrama de uma construção do AAV ilustrativa. Uma primeira repetição terminal invertida (ITR) do AAV é seguida pelo promotor da troponina T cardíaca (cTnT), então a sequência com códons otimizados para a proteína de ligação ao cálcio S100 A1 (cS100A1) específica para uma espécie, seguida por um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES), seguido pela sequência com códons otimizados para o Repressor de Apoptose com Domínio de Recrutamento de Caspase (cARC) específico para uma espécie, seguida por uma sequência de poliadenilação (PA) e uma segunda ITR do AAV.

[00018] A FIG. 2 representa imagens de MRI diastólica de um cão com distrofia muscular tratado na linha de base e em várias semanas após a liberação do gene. Os dados apoiam uma remodelação cardíaca estável ou ligeiramente melhorada, com uma leve diminuição no volume ventricular esquerdo diastólico.

[00019] A FIG. 3 representa imagens de MRI sistólica de um cão com distrofia muscular tratado na linha de base e em várias semanas após a liberação do gene. Os dados apoiam a função sistólica ventricular esquerda estável ou ligeiramente melhorada após o tratamento, com uma leve redução no volume sistólico, sugerindo uma contratilidade melhorada e um aumento no débito cardíaco ventricular esquerdo.

[00020] A FIG. 4 mostra a fração de ejeção, a tensão de pico e o débito cardíaco de camundongos D2.mdx, após o tratamento com AAVrh.10-S100A1/ARC. Durante um período de 24 semanas, os camundongos injetados com o AAV terapêutico mantiveram melhor as frações de ejeção, o desenvolvimento da cepa e o débito cardíaco, em comparação com os camundongos com injeção simulada.

[00021] A FIG. 5 mostra os níveis de expressão de S100A1 e ARC nos camundongos tratados com o vetor AAVrh.10-S100A1/ARC recombinante e nos camundongos de controle. A análise de proteínas (Western blots) confirmou que ambos os níveis de S100A1 e ARC estavam elevados nos tecidos tratados, em comparação com os controles (injeção simulada).

[00022] A FIG. 6 mostra os cardiomiócitos de camundongos de controle e tratados sob ampliação de 10X e 20X. Os dados de histologia cardíaca indicam que os camundongos tratados exibiram menos patologia de DMD em comparação com os corações de controle.

[00023] A FIG. 7 mostra que o primeiro de dois cães deficientes de distrofina (cães com GRMD), Calvin, apresentou função cardíaca melhorada após tratamento com AAVrh.10-S100A1/ARC recombinante.

Ambos os cães injetados exibiram melhorias na fração de ejeção e em outros parâmetros cardíacos após o tratamento, medidos por MRI cardíaca e confirmados por dados de ECO.

[00024] A FIG. 8 mostra dados de que o segundo cão com GRMD, Sebastian, mostrou função cardíaca melhorada após o tratamento com AAVrh.10-S100A1/ARC.

[00025] As FIGs. 9A a 9C mostram que o tratamento com AAV- S100A1/ARC diminuiu os níveis de creatina quinase (CK) sérica e impediu a atrofia muscular nos cães com GRMD Sebastian e Calvin. Medições por MRI da massa muscular dos membros, conforme medidas pela área de ambas as pernas (FIG. 9A), pela área de seção transversal máxima (CSA) (FIG. 9B) e pelo volume de ambas as pernas (FIG. 9C). Os resultados demonstram que a massa do músculo esquelético aumentou ou permaneceu inalterada após o tratamento cardíaco.

[00026] A FIG. 10 mostra que os níveis circulantes de creatina quinase (CK) no músculo esquelético dos pacientes com GRMD foram reduzidos após a injeção de AAVrh.10-S100A1/ARC, indicando uma redução no dano muscular existente.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00027] A presente invenção refere-se a composições e métodos de terapia gênica cardíaca para doenças cardíacas, por exemplo, cardiomiopatia, em um paciente. Os métodos da presente invenção referem-se ao uso de partículas do AAV recombinante (rAAV) para a liberação e a expressão simultâneas de dois transgenes. Os transgenes da presente invenção compreendem pelo menos duas classes de proteínas, cada uma tendo uma função específica para abordar os diferentes aspectos das doenças cardíacas. Uma classe de transgenes regula a sinalização de cálcio em cardiomiócitos, por exemplo, as proteínas da família S100. A outra classe de transgenes compreende os repressores de apoptose. Em algumas modalidades, os transgenes podem ser a proteína de ligação ao cálcio S100 A1 cardíaca (cS100A1), ou uma variante dela, e o Repressor de Apoptose com Domínio de Recrutamento de Caspase cardíaco (cARC) ou uma variante dele.

[00028] As composições e os métodos da presente invenção são baseados, pelo menos em parte, nos efeitos sinergísticos de dois transgenes, por exemplo, S100A1 e ARC, quando eles são liberados e expressos simultaneamente no coração do paciente. A proteína S100A1 melhora os aspectos do trânsito do cálcio, incluindo a normalização dos transientes de cálcio reticular sarcoplasmático, levando à normalização da função contrátil. A proteína ARC bloqueia a apoptose iniciada por mecanismos mitocondriais e não mitocondriais (como a apoptose induzida por estiramento) e melhora a função mitocondrial. Em outras palavras, S100A1 e ARC abordam dois componentes separados de insuficiência cardíaca (disfunção do trânsito de cálcio e apoptose) com benefícios sinergísticos, levando a melhores resultados terapêuticos em longo prazo. Além disso, as composições e os métodos da presente invenção são eficazes em qualquer estágio de doença de insuficiência cardíaca.

[00029] São proporcionados adicionalmente neste documento métodos de preparação das partículas do rAAV, adequadas para a liberação de transgenes, por exemplo, S100A1 e ARC ou uma variante deles, no coração do paciente. Tais partículas do rAAV podem compreender um genoma de AAV recombinante, compreendendo moléculas de ácido nucleico que codificam os transgenes, em que as ditas moléculas de ácido nucleico são encapsidadas pelas proteínas do capsídeo do AAV. Em algumas modalidades, as partículas do rAAV incluem um vetor de ácido nucleico de vírus adenoassociado recombinante (rAAV). O genoma de AAV recombinante é um DNA de fita simples que pode compreender ainda elementos de sequência que facilitam a integração do genoma de AAV no genoma do hospedeiro e a expressão dos transgenes. Por exemplo, o genoma de AAV recombinante pode compreender promotores específicos para um tecido, para assegurar a expressão dos transgenes em tecidos ou órgãos-alvo. Essas partículas do rAAV podem ser usadas em uma composição para o tratamento de doenças cardíacas.

[00030] Assim, a presente divulgação proporciona ainda vetores de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) para a liberação de transgenes no coração de um paciente. Em algumas modalidades, os vetores de rAAV divulgados incluem pelo menos dois transgenes, um que codifica uma proteína da família S100 e um que codifica um inibidor apoptótico. Estes vetores de rAAV podem incluir, de 5’ para 3’, em ordem, uma primeira sequência de repetição terminal invertida (ITR) do vírus adenoassociado (AAV), um promotor operavelmente ligado aos transgenes e uma segunda sequência de repetição terminal invertida (ITR) do AAV. Em algumas modalidades, dois transgenes estão operavelmente ligados ao mesmo promotor individual. Em outras modalidades, cada transgene está operavelmente ligado a um promotor separado. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV também inclui pelo menos um sinal de poliadenilação (por exemplo, 3’ em relação aos dois transgenes expressos a partir de um promotor individual, ou 3’ em relação a um ou ambos os transgenes expressos a partir de diferentes promotores).

[00031] A divulgação proporciona ainda um vetor de ácido nucleico de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) para a liberação de dois ou mais transgenes no coração de um paciente, em que o dito vetor compreende, de 5’ para 3’, em ordem, uma primeira sequência de repetição terminal invertida (ITR) do vírus adenoassociado (AAV), dois ou mais transgenes e um promotor operavelmente ligado aos dois ou mais transgenes, um sinal de poliadenilação e uma segunda sequência de repetição terminal invertida (ITR) do AAV, em que os dois ou mais transgenes compreendem um proteína da família S100 e um inibidor apoptótico.

[00032] Um "transgene", como utilizado neste documento, refere-se a um gene ou material genético que tenha sido transferido naturalmente, ou por qualquer de uma série de técnicas de engenharia genética, de um organismo para outro. Um transgene pode ser uma proteína ou polipeptídeo de interesse (por exemplo, S100A1, ARC) ou um RNA de interesse (por exemplo, um siRNA ou microRNA). Em algumas modalidades, um vetor de rAAV pode compreender a sequência de codificação para um ou mais transgenes. Por exemplo, um vetor de rAAV pode compreender a sequência de codificação para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 transgenes. Em algumas modalidades, os vetores de rAAV da presente divulgação compreendem a sequência de codificação tanto de S100A1 quanto de ARC ou suas variantes. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende ainda uma região que codifica uma proteína Rep. Os transgenes da presente divulgação compreendem duas classes de proteínas, cada uma tendo uma função específica para abordar os diferentes aspectos de uma ou mais doenças cardíacas. Uma classe de transgenes pode regular a sinalização do cálcio em cardiomiócitos, por exemplo, as proteínas da família S100. Outra classe de transgenes pode compreender os repressores de apoptose.

[00033] Como utilizado neste documento, o termo "variante" refere- se a um ácido nucleico tendo características que se desviam do que ocorre na natureza, por exemplo, uma "variante" é pelo menos cerca de 70% idêntica, pelo menos cerca de 80% idêntica, pelo menos cerca de 90% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 96% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica, pelo menos cerca de 99% idêntica, pelo menos cerca de 99,5% idêntica ou pelo menos cerca de 99,9% idêntica ao ácido nucleico do tipo selvagem. Por exemplo, uma variante do transgene é um ácido nucleico que compreende uma ou mais substituições nos nucleotídeos de um transgene, em comparação com a sua sequência do tipo selvagem. Essas substituições podem ser silenciosas, ou seja, elas não modificam a sequência de aminoácidos de qualquer proteína codificada (ou, de outra forma, resultam em uma sequência de aminoácidos variante). Alternativamente, essas substituições podem resultar em modificações na sequência de aminoácidos de uma proteína codificada, resultando em uma proteína codificada tendo uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-15 ou 15-20 substituições de aminoácidos) em relação à sequência de proteína do tipo selvagem. Essas substituições incluem modificações químicas, bem como truncamentos. Em algumas modalidades, uma proteína tendo uma ou mais substituições de aminoácidos mantém a função da proteína do tipo selvagem ou mantém substancialmente a mesma função (por exemplo, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, por exemplo, 50-75% ou 75-100% da função) que a função da proteína do tipo selvagem. Este termo inclui ainda os fragmentos funcionais de uma sequência de ácidos nucleicos do tipo selvagem.

[00034] Em algumas modalidades, um ou mais dos transgenes divulgados são sequências que ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades, um ou mais transgenes são planejados para serem específicos para uma espécie. Em algumas modalidades, um ou mais transgenes são com códons otimizados para a expressão em uma espécie de interesse, por exemplo, canina. Em certas modalidades, o transgene cARC é com códons otimizados.

[00035] As proteínas da família S100, que podem ser usadas de acordo com a presente divulgação, incluem, sem limitação, S100A1, S100A2, S100A3, S100A4, S100A5, S100A6, S100A6, S100A7 (por exemplo, psoriasina), S100A8 (por exemplo, calgranulina A), S100A9

(por exemplo, calgranulina B), S100A10, S100A11, S100A12 (por exemplo, calgranulina C), S100A13, S100A14, S100A15 (por exemplo, koebnerisina), S100A16, S100B, S100P e S100Z, ou suas variantes.

[00036] Em algumas modalidades, a proteína da família S100 pode ser a proteína de ligação ao cálcio S100 A1 (S100A1). Em algumas modalidades, a S100A1 é a S100A1 cardíaca (cS100A1) ou uma variante dela. A proteína cS100A1 é um regulador da contratilidade miocárdica. Os níveis da proteína cS100A1 estão reduzidos no tecido hipertrofiado ventricular direito em um modelo de hipertensão pulmonar. Além disso, a S100A1 é um regulador do programa genético que é a base da hipertrofia cardíaca, já que a S100A1 inibe a estimulação adrenérgica alfa1 de genes hipertróficos, incluindo MYH7, ACTA1 e S100B. Nos cardiomiócitos, a S100A1 regula a rede controlada pelo cálcio da função do SR, sarcômero e mitocôndria por meio da modulação de RyR2, SERCA2, titina e atividade da F1-ATPase mitocondrial. Como resultado, os cardiomiócitos e os corações com expressão aumentada da S100A1 mostram desempenho sistólico e diastólico aumentado, um resultado de amplitudes transitórias de Ca2+ melhoradas resultantes da carga de Ca2+ do SR aumentada e subsequente liberação de Ca2+ sistólica juntamente com vazamento de Ca2+ do SR diastólico diminuído e sequestração novamente de Ca2+ aumentada. Ao mesmo tempo, a S100A1 aumenta a produção de fosfato de alta energia mitocondrial e, desse modo, coordena o suprimento de energia com a demanda aumentada de 5′-trifosfato de adenosina (ATP) pela renovação aumentada de Ca2+ nos cardiomiócitos. A expressão da S100A1 reduzida nos cardiomiócitos está associada à função contrátil reduzida, corroborando o significado fisiopatológico dessa proteína.

[00037] Em algumas modalidades, a sequência de cDNA (transgene) de S100A1 tem 100% de identidade com uma sequência de S100A1 que ocorre naturalmente. Em outras modalidades, a sequência de cDNA de S100A1 tem pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 95% de identidade, pelo menos cerca de 96% de identidade, pelo menos cerca de 97% de identidade, pelo menos cerca de 98% de identidade, pelo menos cerca de 99% de identidade, pelo menos cerca de 99,5% de identidade ou pelo menos cerca de 99,9% de identidade com uma sequência de S100A1 que ocorre naturalmente.

[00038] Em algumas modalidades, a sequência de cDNA de S100A1 é planejada para ser específica para uma espécie. Nas modalidades particulares, a sequência de cDNA de S100A1 é com códons otimizados para a expressão em uma espécie de interesse. Os exemplos não limitativos de sequências de cDNA de S100A1 são listados abaixo. S100A1 (canis lupus familiaris) (Sequência de Referência do NCBI: XM_005622816.2)

ATGGGCTCTGAGCTGGAGACAGCGATGGAGACTCTCATCAATGTG TTCCATGCCCACTCGGGCAAGGAGGGAAACAAGTACAAGCTGAG CAAGAAGGAGCTAAAGGAGCTGCTGCAGACTGAGCTCTCCGGCT TCCTGGACGCCCAGAAGGATGCGGATGCTGTGGACAAGGTGATG AAAGAGCTAGATGAGAATGGAGATGGGGAGGTGGACTTCCAGGA

GTATGTGGTGCTGGTGGCTGCCCTCACAGTGGCCTGTAACAACTT CTTCTGGGAAAACAGTTGA (SEQ ID NO: 1) S100A1 (felis catus) (Sequência de Referência do NCBI: XM_003999773.3)

ATGGGCTCAGAGCTGGAGACGGCGATGGAGACTCTCATCAACGT GTTCCACGCCCACTCGGGCAAGGAGGGAGACAAGTACAAGCTGA GCAAGAAGGAGCTAAAAGAGCTGCTGCAGACCGAGCTCTCTGGC TTCCTGGACGCCCAGAAGGATGCCGACGCTGTGGACAAGGTGAT GAAAGAGCTAGACGAGAATGGAGATGGGGAGGTGGACTTCCAAG AGTATGTGGTGCTGGTGGCTGCCCTCACAGTGGCCTGTAACAACT

TTTTCTGGGAGAACAGTTGA (SEQ ID NO: 2)

[00039] Alguns aspectos do pedido proporcionam composições e métodos que incluem a liberação de um transgene que codifica um inibidor apoptótico (por exemplo, um agente antiapoptótico). Os exemplos ilustrativos de inibidores apoptóticos incluem fink, p35, crmA, Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, E1B-19K a partir de adenovírus, bem como antagonistas de agentes pró-apoptóticos (por exemplo, antissenso, ribozimas, anticorpos etc.). Em algumas modalidades, o inibidor apoptótico é o Repressor de Apoptose com Domínio de Recrutamento de Caspase (ARC). Em outras modalidades, o inibidor apoptótico é o ARC cardíaco ou uma variante dele. Em algumas modalidades, pode ser desejável liberar uma proteína da família S100 e o inibidor apoptótico separadamente. Em certas modalidades, um transgene que codifica a proteína da família S100 é liberado simultânea ou sequencialmente com um ou mais inibidores apoptóticos de moléculas pequenas. Os inibidores apoptóticos de molécula pequena ilustrativos incluem os inibidores de c-Myc, os inibidores de Bax, os inibidores de p53, os inibidores de tBid, os inibidores de caspase e os inibidores de membros da família BCL-2 pró-apoptóticos. Em algumas modalidades, o repressor de apoptose pode ser o Repressor de Apoptose com Domínio de Recrutamento de Caspase cardíaco (cARC).

[00040] O cARC é uma proteína reguladora apoptótica, expressa quase exclusivamente em células miogênicas. Ele contém um domínio de recrutamento de caspase (CARD), através do qual bloqueia a ativação de algumas caspases iniciadoras. O ARC também bloqueia eventos independentes da caspase associados à apoptose. A apoptose causada por isquemia aguda e subsequente remodelação ventricular está implicada como um mediador da insuficiência cardíaca. Embora a insuficiência cardíaca pós-isquêmica possa ter múltiplas causas, a atenção recente tem sido direcionada para a compreensão da contribuição da apoptose ou da morte celular programada. A apoptose é caracterizada por preservação das membranas mitocondrial e sarcolemal, condensação da cromatina nuclear e fagocitose por macrófagos ou células vizinhas, sem desencadear uma resposta inflamatória. Sabe-se que a ativação da apoptose ocorre por meio de mecanismos que envolvem as caspases, uma família de cisteína proteases que são sintetizadas como precursores inativos e clivadas proteoliticamente em sua forma ativa. O ARC é capaz de bloquear a ativação da apoptose por bloqueio das caspases.

[00041] Em algumas modalidades, a sequência de cDNA (transgene) de cARC tem identidade com uma sequência de cARC que ocorre naturalmente. Em outras modalidades, a sequência de cDNA de cARC tem pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 95% de identidade, pelo menos cerca de 96% de identidade, pelo menos cerca de 97% de identidade, pelo menos cerca de 98% de identidade, pelo menos cerca de 99% de identidade, pelo menos cerca de 99,5% de identidade ou pelo menos cerca de 99,9% de identidade com uma sequência de cARC que ocorre naturalmente.

[00042] Em algumas modalidades, a sequência de cDNA de cARC é planejada para ser específica para uma espécie. Nas modalidades particulares, a sequência de cDNA de cARC é com códons otimizados para a expressão em uma espécie de interesse. Nas modalidades particulares, a sequência de cDNA de cARC é com códons otimizados para a expressão em células caninas.

[00043] O transgene que codifica a proteína da família S100 (por exemplo, uma cS100A1) pode estar posicionado 5’ em relação ao transgene que codifica o inibidor apoptótico (por exemplo, um cARC) dentro dos vetores de ácido nucleico de rAAV descritos. Alternativamente, o transgene que codifica o inibidor apoptótico pode estar posicionado 5’ em relação ao transgene que codifica a proteína da família S100 dentro dos vetores de ácido nucleico de rAAV descritos.

[00044] Os exemplos não limitativos de sequências de cDNA de cARC são listados abaixo. ARC (canis lupus familiaris) (Sequência de Referência do NCBI: NM_001048121.1)

ATGCAGGAAGCGCCAGCCGCGCTGCCCACGGAGCCGGGCCCCA GCCCCGTGCCTGCCTTCCTCGGCAAGCTGTGGGCGCTGGTGGGC GACCCGGGGACCGACCACCTCATCCGCTGGAGCCCGAGCGGGA CCAGTTTCCTCGTCAGCGACCAGAGCCGCTTCGCCAAGGAAGTG CTGCCCCAGTACTTCAAGCACAGCAACATGGCGAGCTTCGTGCG GCAGCTCAACATGTACGGTTTTCGGAAGGTGGTGAGCATCGAGCA GGGCGGCCTGCTCAGGCCGGAGCGCGACCACGTCGAGTTCCAG CACCCGAGCTTCGTCCGCGGCCGAGAGCAACTCCTGGAGCGCGT GCGGCGCAAGGTGCCCGCGCTGCGCAGCGACGACGGCCGCTGG CGCCCCGAGGACCTGGGCCGGCTGCTGGGCGAGGTGCAGGCTT TGCGGGGAGTGCAGGAGATCACCGAGGCGCGGCTGCGGGAGCT CAGGCAGCAGAACGAGATCTTATGGAGGGAGGTGGTGACTCTGC GGCAGAGCCACGGTCAGCAGCATCGCGTCATTGGCAAGCTGATC CAGTGCCTCTTTGGGCCACTTCAGACAGGGTCCAGCGGCGCAGG AGCTAAGAGAAAGCTGTCTCTGATGCTGGATGAGGGGAGCTCATG CCCAACACCGGCCAAATTCAACACCTGTCCTTTACCTGGTGCCCT CTTGCAGGATCCCTACTTTATCCAGTCGCCCCTCCCAGAGACCAC CTTGGGCCTCAGCAGCTCTCATAGGACCAGGGGCCCTATCATCTC TGACATCCATGAAGACTCTCCCTCCCCTGATGGGACCAGGCTTTC TCCTTCCAGTGGTGGCAGGAGGGAGAAGGGCCTGGCACTGCTCA AAGAAGAGCCGGCCAGCCCAGGGGGGGAAGGCGAGGCCGGGCT GGCCCTGGCCCCAAACGAGTGTGACTTCTGCGTGACAGCCCCCC CCCCACTGTCCGTGGCTGTGGTGCAGGCCATCCTGGAAGGGAAG GGGAACTTCAGCCCCGAGGGGCCCAGGAATGCCCAACAGCCTGA ACCAAGGGGTCCCAGGGAGGTACCTGACAGGGGGACTCTGGGC CTGGACAGGGGGGCACGAAGCCCAGAGAATCTGCTGCCTCCCAT GCTGCTTCGGGCCCCCCCTGAAAGTGTGGAGCCTGCAGGGCCCC TGGATGTGCTGGGCCCCAGCCATCAAGGGCGAGAATGGACCCTG ATGGACTTGGACATGGAGCTGTCCCTGATGCAGCCCTTGGGTCCA GAGAGGAGTGAGACTGAGCTGGCGGTCAAGGGGTTAAATTCTCC GGGGCCAGGGAAGGACTCCACACTTGGGGCACCACTCCTGCTCG ATGTCCAAGCGGCTTTGGGAGGCCCAGCTCTCAGCCTTCCTGGA

GCTTTAACCATTTACAGCACCCCTGAGAGCCGAGCCAACTACCTA GGCCCAGGGGCCAATCCCTCCCCCTGA (SEQ ID NO: 3) ARC (felis catus) (Sequência de Referência do NCBI: XM_006941587.2)

ATGGGCAATGCGCAGGAGCGGCCCTCAGAGACGATCGATCGCGA GCGGAAACGCCTAGTGGAGACGCTGCAGGACGACTCCGGGCTG CTGCTGGATGCACTGCTGGCGCGCGGCGTGCTCACCGGGCCTGA GTATGAGGCGTTGGACGCGCTGCCTGATGCCGAGCGCAGGGTGC GTCGCCTGCTGCTGCTGGTACAAAGCAAGGGCGAGGCCGCCTGC CAGGAGCTGCTGCACTGCGCCCAGCGTACTACGCGCGCGCCAGA CCCGGCCTGGGACTGGCAGCACGTGGGCACTGGCTACCGGGAA CGCAGCTACGACTCTCCATGCCCTGGCCACTGGACGCCTGAGGC ACCTGACTTGAGGACCGCTTGCCCCGAAACGCCCAGAGCTTCAG ACTGCGACGAGGCTGGGGTTTCAGGGGGCTCGGAGGCAGTATCC GGAACCCTCGAGGAACTCGATCCGGAAGTGGAAGCTGAAGTCTC

TGAAGGGGCTGAGCCAGAGCCAGAGCCAGAGCCCGACTTTGAGG CGGGTGATGAGTCTGAAGATTCC (SEQ ID NO: 4) Vetores de AAV recombinante (rAAV)

[00045] Alguns aspectos da presente invenção referem-se aos vetores de AAV recombinante que podem ser usados para a terapia gênica para doenças cardíacas. Como utilizado neste documento, o termo "vetor" pode referir-se a um vetor de ácido nucleico (por exemplo,

um plasmídeo ou genoma viral recombinante), um genoma de AAV do tipo selvagem ou um vírus que compreende um genoma viral.

[00046] O genoma de AAV do tipo selvagem é um ácido desoxirribonucleico de fita simples (ssDNA), com sentido positivo ou negativo. O genoma compreende duas repetições terminais invertidas (ITRs), uma em cada extremidade da fita de DNA, e dois quadros de leitura abertos (ORFs): rep e cap entre as ITRs. O ORF rep compreende quatro genes de sobreposição que codificam as proteínas Rep necessárias para o ciclo de vida do AAV. O ORF cap compreende genes de sobreposição que codificam as proteínas dos capsídeos: VP1, VP2 e VP3, que interagem entre si para formar o capsídeo viral. VP1, VP2 e VP3 são traduzidas a partir de um transcrito de mRNA, que pode ser removido de duas maneiras diferentes. Um íntron mais longo ou mais curto pode ser excisado, resultando na formação de duas isoformas de mRNAs: uma isoforma de mRNA de ~2,3 kb e uma de ~2,6 kb de comprimento. O capsídeo forma uma estrutura supramolecular de aproximadamente 60 subunidades individuais da proteína do capsídeo em uma treliça icosaédrica T-1 sem envelope, capaz de proteger o genoma de AAV. Um capsídeo do AAV maduro é composto de VP1, VP2 e VP3 (massas moleculares de aproximadamente 87, 73 e 62 kDa, respectivamente) em uma razão de cerca de 1:1:10.

[00047] As partículas do AAV recombinante (rAAV) podem compreender um vetor de ácido nucleico recombinante (doravante referido como "vetor de rAAV"), que pode compreender, no mínimo: (a) uma ou mais regiões de ácido nucleico heterólogas compreendendo uma sequência que codifica um transgene; e (b) uma ou mais regiões compreendendo sequências que facilitam a integração da região de ácido nucleico heteróloga (opcionalmente com as uma ou mais regiões de ácido nucleico compreendendo uma sequência que facilita a expressão) no genoma do paciente. Em algumas modalidades, as sequências que facilitam a integração da região de ácido nucleico heteróloga (opcionalmente com as uma ou mais regiões de ácido nucleico compreendendo uma sequência que facilita a expressão) no genoma do paciente são sequências de repetição terminal invertida (ITR) (por exemplo, sequências de ITR do tipo selvagem ou sequências de ITR planejadas) flanqueando as uma ou mais regiões de ácido nucleico (por exemplo, regiões de ácido nucleico heterólogas). As sequências de ITR podem ser derivadas de qualquer sorotipo de AAV (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) ou podem ser derivadas de mais do que um sorotipo. Em algumas modalidades, as sequências de ITR são derivadas dos sorotipos AAV2 ou AAV6. Em algumas modalidades, um primeiro sorotipo proporcionado neste documento não é um sorotipo AAV2 ou AAV8. Em algumas modalidades, as sequências de ITR do primeiro sorotipo são derivadas de AAV3, AAV5 ou AAV6. Em algumas modalidades, as sequências de ITR são derivadas de AAV2, AAV3, AAV5 ou AAV6. Em algumas modalidades, as sequências de ITR são do mesmo sorotipo que o capsídeo (por exemplo, as sequências de ITR de AAV6 e o capsídeo do AAV6 etc.). Em algumas modalidades, as sequências de ITR são derivadas do sorotipo AAVrh.10.

[00048] As sequências de ITR e os plasmídeos contendo as sequências de ITR são conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente (ver, por exemplo, os produtos e os serviços disponíveis da Vector Biolabs, Filadélfia, PA; Cellbiolabs, San Diego, CA; Agilent Technologies, Santa Clara, Ca; e Addgene, Cambridge, MA; e Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7; e Curtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine™. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201 ©

Humana Press Inc. 2003. Capítulo 10. Targeted Integration by Adeno- Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen e Richard Jude Samulski; Pats.U.S. Nos. 5.139.941 e

5.962.313, todas sendo incorporadas neste documento por referência). Em algumas modalidades, o rAAV compreende uma estrutura do plasmídeo pTR-UF-11, que é um plasmídeo que contém as ITRs do AAV2. Este plasmídeo está comercialmente disponível da American Type Culture Collection (ATCC MBA-331).

[00049] Em algumas modalidades, os vetores de rAAV da presente invenção compreendem tanto o transgene cS100A1 quanto o transgene ARC, para a sua liberação e expressão simultâneas em um paciente. Assim, em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende uma ou mais regiões compreendendo uma sequência que facilita a expressão do transgene (por exemplo, o ácido nucleico heterólogo), por exemplo, sequências de controle da expressão operavelmente ligadas ao ácido nucleico. Diversas dessas sequências são conhecidas na técnica. Os exemplos não limitativos de sequências de controle da expressão incluem os promotores, os isoladores, os silenciadores, os elementos de resposta, os íntrons, os reforçadores, os sítios de iniciação, os sinais de terminação de sítios internos de entrada do ribossomo (IRES) e os sinais de poli(A). Qualquer combinação de tais sequências de controle é considerada neste documento (por exemplo, um promotor e um sinal de poli(A)). Em algumas modalidades, os vetores de rAAV compreendem um promotor que está operavelmente ligado à sequência de codificação dos transgenes e facilita a expressão dos transgenes.

[00050] Um "promotor", como utilizado neste documento, refere-se a uma região de controle de um ácido nucleico, na qual são controladas a iniciação e a taxa de transcrição do restante de uma sequência de um ácido nucleico. Um promotor conduz a transcrição da sequência de um ácido nucleico que ele regula, portanto, está normalmente localizado no,

ou próximo ao, sítio de início transcricional de um gene. Um promotor pode ter, por exemplo, um comprimento de 100 a 1000 nucleotídeos. Em algumas modalidades, um promotor está operavelmente ligado a um ácido nucleico ou a uma sequência de um ácido nucleico (sequência de nucleotídeos). Um promotor é considerado estar "operavelmente ligado" a uma sequência de um ácido nucleico que ele regula quando o promotor estiver em uma localização e uma orientação funcionais corretas em relação à sequência, de modo tal que o promotor regule (por exemplo, para controlar ("conduzir") a iniciação transcricional e/ou a expressão dessa) essa sequência.

[00051] Os promotores que podem ser usados de acordo com a presente invenção podem compreender qualquer promotor que possa conduzir a expressão dos transgenes no coração do paciente. Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor específico para um tecido. Um "promotor específico para um tecido", como utilizado neste documento, refere-se aos promotores que só podem funcionar em um tipo específico de tecido, por exemplo, o coração. Assim, um "promotor específico para um tecido" não é capaz de conduzir a expressão dos transgenes em outros tipos de tecidos. Em algumas modalidades, o promotor que pode ser usado de acordo com a presente invenção é um promotor restrito ao coração. Por exemplo, o promotor pode ser, sem limitação, um promotor a partir de um dos seguintes genes: gene da cadeia pesada da α-miosina, gene da cadeia pesada da 6-miosina, gene da cadeia leve da miosina 2v, gene da cadeia leve da miosina 2a, gene de CARP, gene da α-actina cardíaco, gene da acetilcolina muscarínica m2 cardíaco, ANF, troponina C cardíaca, troponina I cardíaca, troponina T cardíaca (cTnT), gene da Ca- ATPase do retículo sarcoplasmático cardíaco, α-actina esquelética; ou um promotor cardíaco artificial derivado do gene da MLC-2v.

[00052] Em algumas modalidades dos vetores de rAAV divulgados,

os dois ou mais transgenes são operavelmente controlados por um promotor individual. Em outras modalidades, cada um dos dois ou mais transgenes é operavelmente controlado por um promotor distinto.

[00053] Em algumas modalidades, os vetores de rAAV da presente invenção compreendem ainda um Sítio Interno de Entrada do Ribossomo (IRES). Um IRES é uma sequência de nucleotídeos que permite o início da tradução no meio de uma sequência de RNA mensageiro (mRNA) como parte do processo mais importante de síntese de proteínas. Normalmente, nos eucariotos, a tradução pode ser iniciada apenas na extremidade 5’ da molécula de mRNA, uma vez que o reconhecimento do cap em 5' é necessário para a montagem do complexo de iniciação. Em algumas modalidades, o IRES está localizado entre os transgenes. Em tais modalidades, as proteínas codificadas por diferentes transgenes são traduzidas individualmente (ou seja, em contraste com traduzidas como uma proteína de fusão).

[00054] Em algumas modalidades, os vetores de rAAV da presente divulgação compreendem ainda um sinal de poliadenilação (pA). Os mRNAs eucarióticos são tipicamente transcritos como um mRNA precursor. O mRNA precursor é processado para gerar o mRNA maduro, incluindo um processo de poliadenilação. O processo de poliadenilação começa à medida que a transcrição de um gene termina. O segmento mais 3’ do mRNA precursor recém-feito é primeiro clivado por um conjunto de proteínas. Essas proteínas então sintetizam a cauda de poli(A) na extremidade 3’ do RNA. O sítio de clivagem tipicamente contém o sinal de poliadenilação, por exemplo, AAUAAA. A cauda de poli(A) é importante para a exportação nuclear, a tradução e a estabilidade do mRNA.

[00055] Em algumas modalidades, os vetores de rAAV da presente invenção compreendem pelo menos, na ordem de 5’ para 3’, uma primeira sequência de repetição terminal invertida (ITR) do vírus adenoassociado (AAV), um promotor operavelmente ligado a um primeiro transgene, um IRES operavelmente ligado a um segundo transgene, um sinal de poliadenilação e uma segunda sequência de repetição terminal invertida (ITR) do AAV.

[00056] Em algumas modalidades, o rAAV é circular. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV é linear. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV é de fita simples. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV é de fita dupla. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV é um vetor de rAAV autocomplementar. Qualquer vetor de rAAV descrito neste documento pode ser encapsidado por um capsídeo viral, tal como um capsídeo do AAV6 ou qualquer outro sorotipo (por exemplo, um sorotipo que é do mesmo sorotipo que as sequências de ITR). Partículas do AAV recombinante (rAAV)

[00057] São adicionalmente proporcionadas neste documento partículas do rAAV ou preparações do rAAV contendo tais partículas. As partículas do rAAV compreendem um capsídeo viral e um vetor de rAAV como descrito neste documento, que é encapsidado pelo capsídeo viral. Os métodos de produção das partículas do rAAV são conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente (ver, por exemplo, Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158- 167; e as Publicações de Pedidos de Patentes U.S. Números US 2007/0015238 e US 2012/0322861, que são incorporados neste documento por referência; e os plasmídeos e os kits disponíveis da ATCC e da Cell Biolabs, Inc.). Por exemplo, um plasmídeo contendo o vetor de rAAV pode ser combinado com um ou mais plasmídeos auxiliares, por exemplo, que contêm um gene rep (por exemplo, que codifica Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40) e um gene cap (que codifica VP1, VP2, e VP3, incluindo uma região de VP3 modificada, conforme descrito neste documento), e transfectado em uma linhagem celular produtora, de modo tal que a partícula do rAAV possa ser acondicionada e subsequentemente purificada.

[00058] As partículas do rAAV ou as partículas dentro de uma preparação do rAAV divulgadas neste documento podem ser de qualquer sorotipo do AAV, incluindo qualquer derivado ou pseudotipo (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 2/1, 2/5, 2/8, 2/9, 3/1, 3/5, 3/8 ou 3/9). Como utilizado neste documento, o sorotipo de um rAAV uma partícula do rAAV refere-se ao sorotipo das proteínas do capsídeo do vírus recombinante. Em algumas modalidades, a partícula do rAAV é rAAV6 ou rAAV9. Os exemplos não limitativos de derivados e pseudotipos incluem AAVrh.10, rAAV2/1, rAAV2/5, rAAV2/8, rAAV2/9, híbrido de AAV2-AAV3, AAVhu.14, AAV3a/3b, AAVrh32.33, AAV- HSC15, AAV-HSC17, AAVhu.37, AAVrh.8, CHt-P6, AAV2.5, AAV6.2, AAV2i8, AAV-HSC15/17, AAVM41, AAV9.45, AAV6(Y445F/Y731F), AAV2.5T, AAV-HAE1/2, clone do AAV 32/83, AAVShH10, AAV2 (Y->F), AAV8 (Y733F), AAV2.15, AAV2.4, AAVM41, e AAVr3.45. Tais sorotipos e derivados/pseudotipos do AAV, e os métodos de produção de tais derivados/pseudotipos, são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.). Em algumas modalidades, a partícula do rAAV é uma partícula do rAAV pseudotipada, a qual compreende (a) um vetor de rAAV compreendendo ITRs a partir de um sorotipo (por exemplo, AAV2, AAV3) e (b) um capsídeo compreendido de proteínas do capsídeo derivadas de outro sorotipo (por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAV10). Os métodos para produzir e usar os vetores de rAAV pseudotipados são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002; e Auricchio et al.,

Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001). Terapia Gênica com rAAV para Doenças Cardíacas

[00059] A presente invenção também se refere às composições que compreendem uma ou mais das partículas ou preparações do rAAV divulgadas. Em algumas modalidades, a preparação do rAAV compreende uma partícula do rAAV que compreende um vetor de rAAV contendo ITRs de um primeiro sorotipo (por exemplo, AAV3, AAV5, AAV6 ou AAV9) e proteínas do capsídeo que encapsidam o vetor de rAAV. Em algumas modalidades, as proteínas do capsídeo são do primeiro sorotipo (por exemplo, AAV3, AAV5, AAV6 ou AAV9). Em algumas modalidades, a preparação tem pelo menos uma eficiência de transdução quatro vezes maior (por exemplo, em uma linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano, como Huh7) em comparação com uma preparação preparada usando um vetor de rAAV contendo ITRs do AAV2.

[00060] Conforme descrito neste documento, tais composições podem compreender ainda um excipiente, tampão ou diluente farmacêutico e podem ser formuladas para a administração a uma célula hospedeira ex vivo ou in situ em um animal e, particularmente, um ser humano. Tais composições podem compreender ainda opcionalmente um lipossoma, um lipídio, um complexo lipídico, uma microesfera, uma micropartícula, uma nanoesfera ou uma nanopartícula, ou podem ser de outra forma formuladas para a administração às células, tecidos, órgãos ou corpo de um paciente em necessidade disso. Tais composições podem ser formuladas para uso em uma variedade de terapias, como, por exemplo, na melhoria, na prevenção e/ou no tratamento de condições, como a deficiência de peptídeo, a deficiência de polipeptídeo, a superexpressão de peptídeo, a superexpressão de polipeptídeo, incluindo, por exemplo, as condições que resultem em doenças ou distúrbios como descritos neste documento.

[00061] Os vetores de rAAV, as partículas do rAAV ou a composição que compreende as partículas do rAAV da presente divulgação podem ser usados para a terapia gênica para doenças cardíacas em um paciente em necessidade. Os exemplos de doença cardíaca que pode ser tratada usando os métodos e as composições da presente invenção incluem, porém não estão limitados à, cardiomiopatia e isquemia aguda. Em algumas modalidades, a cardiomiopatia cardíaca é a cardiomiopatia hipertrófica ou a cardiomiopatia dilatada. A insuficiência cardíaca causada por cardiomiopatia ou outras doenças cardíacas compreende dois componentes, a disfunção do trânsito do cálcio e a apoptose. Os vetores de rAAV, as partículas e as composições que compreendem as partículas do rAAV podem ser usados para o tratamento de tais insuficiências cardíacas, quando administrados a um paciente em necessidade, por exemplo, pela injeção direta no coração. Os vetores de rAAV, as partículas e as composições que compreendem as partículas do rAAV conduzem a expressão simultânea da proteína cS100A1 e das proteínas ARC nos cardiomiócitos do paciente. A S100A1 melhorará os aspectos do trânsito do cálcio, incluindo a normalização dos transitórios de cálcio reticular sarcoplasmático, levando à normalização da função contrátil. O ARC bloqueará a apoptose iniciada por mecanismos mitocondriais e não mitocondriais (como a apoptose induzida por estiramento), bem como melhorará a função mitocondrial. Assim, os benefícios sinergísticos das duas proteínas expressas pelos transgenes da presente divulgação podem levar a melhores resultados terapêuticos de longo prazo, visando ambos os aspectos da cardiomiopatia.

[00062] Assim, os outros aspectos da presente invenção estão relacionados com a administração, a um paciente em necessidade, das partículas do rAAV da presente invenção. Em algumas modalidades, o número de partículas do rAAV administradas a um paciente pode estar na ordem que varia de cerca de 106 a cerca de 1014 partículas/mL ou cerca de 103 a cerca de 1013 partículas/mL, ou quaisquer valores entre as duas faixas, como, por exemplo, cerca de 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 ou 1014 partículas/mL. Em algumas modalidades, o número de partículas do rAAV administradas a um paciente pode estar na ordem que varia de cerca de 106 a cerca de 1014 genomas de vetor (vgs)/mL ou 103 a 1015 vgs/mL, ou quaisquer valores entre as duas faixas, como, por exemplo, cerca de 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 ou 1014 vgs/mL. As partículas do rAAV podem ser administradas como uma dose única ou divididas em duas ou mais administrações, conforme possa ser necessário para atingir a terapia da doença ou do distúrbio particular que está sendo tratado. Em algumas modalidades, doses que variam de cerca de 0,0001 mL a cerca de 10 mL são liberadas para um paciente.

[00063] Se desejado, as partículas do rAAV e os vetores de rAAV podem ser administrados em combinação com outros agentes também, como, por exemplo, as proteínas ou os polipeptídeos ou vários agentes farmaceuticamente ativos, incluindo uma ou mais administrações de polipeptídeos terapêuticos, fragmentos biologicamente ativos ou suas variantes. Na verdade, não há virtualmente nenhum limite para os outros componentes que também podem ser incluídos, desde que os agentes adicionais não causem um efeito adverso significativo em contato com as células-alvo ou os tecidos hospedeiros. As partículas ou as preparações do rAAV podem, assim, ser liberadas juntamente com vários outros agentes farmaceuticamente aceitáveis, conforme necessário no caso particular. Essas composições podem ser purificadas a partir de células hospedeiras ou outras fontes biológicas ou, alternativamente, podem ser sintetizadas quimicamente, conforme descrito neste documento.

[00064] As formulações compreendendo excipientes e/ou soluções transportadoras farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidas dos versados na técnica, como é o desenvolvimento de dosagem e regimes de tratamento adequados, para usar as composições particulares descritas neste documento em uma variedade de regimes de tratamento, incluindo, por exemplo, a administração e a formulação orais, parenterais, intravenosas, intranasais, intra-articulares e intramusculares.

[00065] Tipicamente, essas formulações podem conter pelo menos cerca de 0,1% do agente terapêutico (por exemplo, partícula ou preparação do rAAV e/ou vetor de rAAV) ou mais, embora a porcentagem do(s) ingrediente(s) ativo(s) possa, é claro, ser variada e possa estar convenientemente entre cerca de 1 ou 2% e cerca de 70% ou 80% ou mais do peso ou volume da formulação total. Naturalmente, a quantidade de agente(s) terapêutico(s) em cada composição terapeuticamente útil pode ser preparada, de modo tal que uma dosagem adequada seja obtida em qualquer dose unitária do composto. Fatores como a solubilidade, a biodisponibilidade, a meiavida biológica, a rota de administração, o prazo de validade do produto, bem como outras considerações farmacológicas, serão considerados por um especialista na técnica ao preparar tais formulações farmacêuticas. Além disso, pode ser desejável uma variedade de dosagens e regimes de tratamento.

[00066] Em certas circunstâncias, será desejável liberar as partículas ou as preparações do rAAV e/ou os vetores de rAAV nas composições farmacêuticas adequadamente formuladas, divulgadas neste documento; de forma subcutânea, intracardial, intraocular, intravítrea, parenteral, subcutânea, intravenosa, intracerebroventricular, intramuscular, intratecal, oral, intraperitoneal, por inalação oral ou nasal ou por injeção direta em uma ou mais células (por exemplo,

cardiomiócitos e/ou outras células do coração), tecidos ou órgãos. Em algumas modalidades, as partículas do rAAV ou a composição que compreende as partículas do rAAV da presente invenção são injetadas diretamente no coração do paciente. A injeção direta no coração pode compreender a injeção em um ou mais dos tecidos do miocárdio, no revestimento cardíaco ou no músculo esquelético que envolve o coração, por exemplo, usando um cateter de agulha.

[00067] As formulações farmacêuticas das composições adequadas para uso injetável incluem as soluções ou as dispersões aquosas estéreis. Em algumas modalidades, a formulação é estéril e fluida na medida em que existe uma fácil capacidade de injetar com seringa. Em algumas modalidades, a forma é estável sob as condições de fabricação e armazenamento e é preservada contra a ação contaminante de microrganismos, como as bactérias e os fungos. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, solução salina, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e semelhantes), suas misturas adequadas, óleos vegetais ou outros transportadores farmaceuticamente aceitáveis, como aqueles que são Em Geral Reconhecidos como Seguros ("Generally Recognized as Safe") (GRAS) pela United States Food and Drug Administration. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido, no caso de dispersão, e pelo uso de tensoativos.

[00068] O termo "transportador" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual a partícula ou a preparação do rAAV e/ou os vetores de rAAV são administrados. Esses transportadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como a água e os óleos, incluindo os de óleo de petróleo, como o óleo mineral, o óleo vegetal, como o óleo de amendoim, o óleo de soja e o óleo de gergelim, o óleo animal ou o óleo de origem sintética. As soluções salinas e as soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser usadas como transportadores líquidos.

[00069] Para a administração de uma solução aquosa injetável, por exemplo, a solução pode ser adequadamente tamponada, se necessário, e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para a administração intravenosa, intramuscular, intravítrea, subcutânea e intraperitoneal. A este respeito, um meio aquoso estéril que pode ser usado será conhecido pelos versados na técnica à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 mL de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no local proposto de infusão (ver, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente, dependendo da condição do paciente que está sendo tratado. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer caso, a dose apropriada para o paciente individual. Além disso, para a administração humana, as preparações devem atender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade e da segurança e pureza gerais, conforme exigido, por exemplo, pelos padrões do FDA Office of Biologics.

[00070] As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando as partículas ou as preparações do rAAV, as proteínas Rep e/ou os vetores de rAAV, na quantidade necessária, no solvente apropriado, com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização por filtração. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril, que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes a partir dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são as técnicas de secagem a vácuo e de liofilização, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração dele.

[00071] A quantidade de partícula ou preparação do rAAV e/ou composições de vetor de rAAV e o tempo de administração de tais composições estarão dentro do alcance do especialista na técnica tendo o benefício dos presentes ensinamentos. É provável, no entanto, que a administração de quantidades terapeuticamente eficazes das composições da presente invenção possa ser atingida por uma única administração, como, por exemplo, uma única injeção de quantidades suficientes de partículas infecciosas para proporcionar um benefício terapêutico ao paciente que está sendo submetido a tal tratamento. Alternativamente, em algumas circunstâncias, pode ser desejável proporcionar administrações múltiplas ou sucessivas da partícula ou da preparação do rAAV e/ou das composições de vetor de rAAV, durante um período relativamente curto ou relativamente prolongado, conforme pode ser determinado pelo médico supervisionando a administração de tais composições.

[00072] As composições da presente invenção podem incluir partículas ou preparações do rAAV e/ou vetores de rAAV, sozinhos ou em combinação com um ou mais ingredientes ativos adicionais, que podem ser obtidos de fontes naturais ou recombinantes ou sintetizados quimicamente. Em algumas modalidades, as partículas ou as preparações do rAAV são administradas em combinação, na mesma composição ou administradas como parte do mesmo regime de tratamento, com um inibidor de proteassoma, como o Bortezomib ou hidroxiureia.

[00073] "Tratar" uma doença, conforme o termo é usado neste documento, significa reduzir a frequência ou a gravidade de pelo menos um sinal ou sintoma de uma doença ou distúrbio sofrido por um paciente. As composições descritas acima são tipicamente administradas a um paciente em uma quantidade eficaz, que é uma quantidade capaz de produzir um resultado desejado. O resultado desejado dependerá do agente ativo que está sendo administrado. Por exemplo, uma quantidade eficaz de uma partícula do rAAV pode ser uma quantidade da partícula que é capaz de transferir um ácido nucleico heterólogo para um órgão, tecido ou célula hospedeira.

[00074] A toxicidade e a eficácia das composições utilizadas nos métodos da presente invenção podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão, usando células em cultura ou animais experimentais para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população). A razão de doses entre a toxicidade e a eficácia é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. As composições que exibem grandes índices terapêuticos são preferidas. Embora as composições que exibem efeitos colaterais tóxicos possam ser usadas, deve-se tomar cuidado para projetar um sistema de liberação que minimize o dano potencial de tais efeitos colaterais. A dosagem das composições como descritas neste documento encontra- se em geral dentro de uma faixa que inclui uma ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem usada e da rota de administração utilizada.

[00075] Os outros aspectos da presente invenção referem-se aos métodos e preparações para uso com um paciente, como os pacientes humanos ou não humanos, uma célula hospedeira in situ em um paciente ou uma célula hospedeira derivada de um paciente. Em algumas modalidades, o paciente é um mamífero. Em algumas modalidades, o paciente é um animal de companhia. "Um animal de companhia", como utilizado neste documento, refere-se aos animais de estimação e a outros animais domésticos. Os exemplos não limitativos de animais de companhia incluem os cães e os gatos; os animais de fazenda, como os cavalos, o gado, os porcos, as ovelhas, as cabras e as galinhas; e outros animais, como os camundongos, os ratos, os porquinhos-da-índia e os hamsters. Em algumas modalidades, o paciente é um paciente humano. Em algumas modalidades, o paciente tem ou é suspeito de ter uma doença cardíaca que pode ser tratada com a terapia gênica. Em algumas modalidades, o paciente está em quaisquer estágios de insuficiência cardíaca. Em algumas modalidades, a insuficiência cardíaca é causada por cardiomiopatia. Em algumas modalidades, a insuficiência cardíaca é causada por cardiomiopatia hipertrófica ou cardiomiopatia dilatada.

[00076] Os exemplos a seguir pretendem ser ilustrativos de certas modalidades da presente invenção e não pretendem ser limitativos. Todo o conteúdo de todas as referências (incluindo as referências de literatura, as patentes expedidas, os pedidos de patentes publicados e os pedidos de patentes copendentes) citadas ao longo deste pedido é, pelo presente, expressamente incorporado neste documento por referência.

EXEMPLOS Exemplo 1: Terapeuticamente visando os múltiplos aspectos da insuficiência cardíaca

[00077] Em alguns aspectos, a presente invenção proporciona composições e métodos que são úteis no tratamento de uma ou mais condições cardíacas (por exemplo, cardiomiopatia, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia dilatada, insuficiência cardíaca, doença cardíaca etc.). Em algumas modalidades, as composições proporcionadas pelo pedido podem ser proporcionadas a um paciente por meio de múltiplas injeções diretas no coração. Uma construção de

AAV ilustrativa que pode ser proporcionada a um paciente é representada na FIG. 1. Em certas modalidades, tal construção ilustrativa é encapsidada por um AAV recombinante (por exemplo, AAV6) e compreende sequências de codificação específicas para uma espécie da proteína de ligação ao cálcio S100 A1 (S100A1) e do Repressor de Apoptose com Domínio de Recrutamento de Caspase (ARC) para abordar dois aspectos separados de uma ou mais condições cardíacas (por exemplo, cardiomiopatia). Ambos os transgenes da construção ilustrativa na FIG. 1 são conduzidos pelo promotor TnT cardíaco e, desse modo, só se expressarão nos cardiomiócitos.

[00078] A S100A1 melhorará os aspectos do trânsito do cálcio, incluindo a normalização dos transitórios de cálcio reticular sarcoplasmático, levando à normalização da função contrátil. O ARC bloqueará a apoptose iniciada por mecanismos mitocondriais e não mitocondriais (por exemplo, apoptose induzida por estiramento), bem como melhorará a função mitocondrial. Esses dois componentes separados da insuficiência cardíaca (disfunção do trânsito do cálcio e apoptose) são abordados separadamente, porém nunca juntos. Como tal, os benefícios sinergísticos de tal abordagem proporcionam opções terapêuticas que podem resultar em resultados melhorados a longo prazo. Ao visar ambos os aspectos da cardiomiopatia, as composições e os métodos proporcionados pelo presente pedido podem ser usados para abordar as múltiplas condições cardíacas (por exemplo, a cardiomiopatia hipertrófica ou dilatada) e serão benéficos em qualquer estágio da insuficiência cardíaca.

[00079] Todas as publicações, patentes e entradas de banco de dados de sequência mencionadas no relatório descritivo contido neste documento são incorporadas, pelo presente, por referência em sua totalidade, como se cada publicação ou patente individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer definições contidas neste documento, comandará. Exemplo 2: Terapia gênica de cardiomiopatia dilatada em cães

[00080] A cardiomiopatia dilatada (DCM) é a segunda causa mais comum de doença cardíaca adquirida em cães, afetando mais comumente os cães de raças grandes, como os Doberman pinschers, os Dogues alemães e os Wolfhounds irlandeses. Nos seres humanos afetados com esta doença, existem opções cirúrgicas, como o transplante cardíaco e os dispositivos de assistência ventricular esquerda. No entanto, na medicina veterinária, a única opção terapêutica é o controle médico dos sinais associados à insuficiência cardíaca. O prognóstico para um cão afetado depende do estágio da doença e da raça. Por exemplo, a maioria dos Doberman pinschers vive menos que 6 meses após o desenvolvimento de insuficiência cardíaca congestiva (ICC). Em contraste, as outras raças, como os cocker spaniels, tendem a sobreviver mais. Conforme a doença cardíaca progride, o mau funcionamento dos canais que regulam o movimento do cálcio dentro das células cardíacas promove anormalidades do ciclo do cálcio, desregulando ainda mais a contração e o relaxamento do coração. Notavelmente, as anormalidades no transporte de cálcio foram reconhecidas nos cães com DCM5 de ocorrência natural e ocorrem também com a insuficiência cardíaca secundária a muitas etiologias diferentes.

[00081] As estratégias de transferência de genes, planejadas para normalizar as anormalidades do ciclo do cálcio, melhoram a doença cardíaca em modelos de animais pequenos e grandes com várias formas de doença cardíaca. Na verdade, os ensaios clínicos já estão em andamento em seres humanos, para testar esta abordagem terapêutica para a cardiomiopatia, e os resultados preliminares são encorajadores. Um estudo piloto está avaliando a eficácia da liberação de genes, planejada para normalizar o trânsito do cálcio em Doberman pinschers afetados com a DCM e exibindo ICC. Os Doberman pinschers são utilizados porque a DCM está disseminada nesta raça e a doença tende a progredir rápida e uniformemente nesta raça assim que a ICC tiver se desenvolvido. Novas modalidades para abordar a DCM terão um impacto significativo sobre todas as raças caninas predispostas a esta doença idiopática, incluindo os Doberman pinschers, os boxers, os Dogues alemães, os Pastores alemães, os golden retrievers etc. Notavelmente, as investigações anteriores sobre os níveis de proteína do miocárdio, em amostras de cães com as formas mais comuns da doença cardíaca de ocorrência natural (doença valvar degenerativa canina e DCM), verificaram que níveis de proteínas múltiplas (incluindo a S100A1) estavam anormais (a S100A1 foi diminuída).

[00082] Essas descobertas sugerem que a liberação de genes direcionados para a S100A1 pode tratar eficazmente a DCM, bem como a insuficiência miocárdica que se desenvolve secundária à doença valvar degenerativa. Além disso, a apoptose (morte celular programada) é mais comum no miocárdio doente e o ARC é um inibidor potente e multifuncional da apoptose. Atualmente, o padrão de atendimento para a insuficiência cardíaca veterinária é o controle médico da sobrecarga de fluidos e da congestão. As técnicas de liberação de genes direcionadas em moléculas reguladoras miocárdicas anormais oferecem um alvo mecanístico que pode permitir ao médico veterinário abordar especificamente o processo da doença miocárdica pela primeira vez. Além disso, o custo associado às técnicas de produção de vetores e à liberação gênica intramiocárdica de vetores atuais torna o custo desta terapia ao alcance de muitos proprietários, com custos que deverão diminuir com o tempo.

[00083] Um método minimamente invasivo de transferência de genes usando os vetores de AAV 2/6 resultou na transdução de >75% das células do miocárdio nos cães normais (ver Bish LT, Sleeper MM, Brainard B, et al.

Percutaneous transendocardial delivery of self- complementary adeno-associated virus 6 achieves global cardiac gene transfer in canines.

Mol.

Ther. 16, 1953-9 (2008)). Seis cães sem raça definida foram tratados com um vetor de AAV2 ou um de AAV6 que codifica uma forma negativa dominante do Fosfolambam (dn-PLN) (uma forma pseudofosforilada que compete com o fosfolambam nativo, portanto, reduzindo o seu efeito inibitório sobre SERCA2a) (n = 4) ou AAV2/6 dn-PLN e S100A1 (n = 2). Todos os cães permaneceram saudáveis, com função cardiovascular normal, durante 2 anos após o tratamento, indicando que a terapia não causou miocardite ou alterou significativamente a função cardíaca, apoiando assim a segurança desta abordagem terapêutica.

Na verdade, mais de 40 cães normais e doentes (ver abaixo) foram injetados e os resultados até o momento indicam que a técnica de injeção é bem tolerada.

Além disso, 20 casos caninos aleatórios no Hospital Veterinário Matthew J.

Ryan da Universidade da Pensilvânia foram amostrados para anticorpos para rAAV2/6 e os títulos encontrados estavam dentro da faixa aceitável para o tratamento em 19 dos 20 cães, indicando que as respostas imunológicas anteriores não excluirão uma proporção significativa de candidatos terapêuticos.

Para determinar se esta abordagem terapêutica seria eficaz para o tratamento de DCM, os cães de água portugueses, com uma forma grave da DCM juvenil de progressão rápida, foram então tratados.

Notavelmente, os cães injetados com AAV2/6 dn-PLN exibiram uma diminuição marcada no PLN fosforilado, apoiando a capacidade potencial desta abordagem de normalizar o ciclo do cálcio neste modelo de doença.

Além disso, a liberação de genes com um vetor contendo tanto o dn-PLN quanto a S100A1 retardou o desenvolvimento de ICC secundária à DCM em um grau maior do que a liberação de um vetor contendo o dn-PLN sozinho.

O vetor de combinação retardou o início da ICC em uma média de 4 semanas em comparação com a terapia do dn-PLN sozinho. Por esse motivo, a abordagem de vetor combinado é utilizada em um estudo piloto, para determinar se a terapia gênica é eficaz em prolongar a vida dos Dobermans afetados com a DCM de início na idade adulta e a insuficiência cardíaca congestiva.

[00084] O estudo tem um planejamento cego e controlado por placebo. Com base nos últimos 12 casos de Doberman pinschers de DCM e ICC que foram tratados, houve uma sobrevida média de 148 dias (desvio padrão de 160 dias). Usando uma potência de 0,8, alfa (2 lados) de 0,05 e uma razão de casos para controles de 1, um tamanho de amostra de 13 cães em cada grupo é necessário para detectar uma diferença na sobrevida de 6 meses. Esse cálculo foi determinado utilizando um teste paramétrico de tamanho de amostra. Vinte e seis Doberman pinschers com DCM e ICC controlada estão inscritos. Para ser elegível para a inscrição, o cão deve ter um título de anticorpo neutralizante circulante para AAV2/6 de menos do que 1:20 e estar livre de doença extracardíaca. Além disso, são excluídos os cães com doença cardíaca congênita concomitante ou evidência de doença valvar mitral primária. Na linha de base (momento da inscrição), um título de anticorpo, CBC, e o painel químico é usado para fins de triagem. Os cães são submetidos a um eletrocardiograma (ECG) de 3 minutos e um ecocardiograma (ECO) completo e os donos preenchem um questionário de qualidade de vida previamente validado. O ECG é avaliado quanto à duração do intervalo e à presença de arritmias. O ECO inclui estudos 2D, modo M e Doppler (incluindo Doppler tecidual). As radiografias torácicas são usadas para determinar o estágio da doença (os cães são clinicamente compensados com uma história de insuficiência cardíaca congestiva).

[00085] Os cães que preenchem os requisitos para a inscrição são atribuídos aleatoriamente ao braço do placebo (injeção cardíaca com solução salina) ou ao grupo de terapia gênica (injeção cardíaca com AAV2/6-ARC-s100a1). O tratamento médico padrão para a DCM e a insuficiência cardíaca congestiva continua ao longo do estudo, em todos os cães (pimobendam, inibidor da angiotensina e terapia diurética). Utiliza-se a solução salina, em vez do capsídeo vazio, como a terapia simulada, para que os cães de controle possam ser submetidos à liberação de genes se o grupo de tratamento demonstrar uma melhora significativa, em comparação com o grupo de placebo. Aos 2, 4, 6, 9 e 12 meses após a terapia, repetem-se o ECG, o ECO, um questionário de qualidade de vida e as análises laboratoriais. A análise estatística é realizada em intervalos bimestrais.

[00086] As FIGs. 2 e 3 representam os dados de diástole (relaxamento) e sístole (contração), respectivamente, em um cão com distrofia muscular tratado. Podem ser vistos os contornos endocárdico e epicárdico em cada uma das figuras. Os dados indicam uma função pós-tratamento estável ou ligeiramente melhorada ao longo de várias semanas, como visto na Tabela 1. A Tabela 1, abaixo, mostra os resultados da massa ventricular esquerda (LVM [g]), do volume diastólico final (EDV [ml]), do volume sistólico final (ESV [ml]), do volume sistólico (VS [ml]), da fração de ejeção (EF [%]) e do débito cardíaco (CO [l/min]) para os dados obtidos no tempo 1 (pré-tratamento) e tempo 2 (pós-tratamento). Tabela 1 Data da LVM[g] EDV[ml] ESV[ml] SV[ml] EF[%] CO[l/min] Aquisição Tempo 2 91,395035 54,22289 24,595001 29,627889 54,640926 3,940509 Tempo 1 87,251524 57,471229 25,660014 31,811215 55,351548 3,117499 Exemplo 3: Avaliação dos fenótipos de distrofia após a liberação do vetor em camundongos e cães

[00087] A liberação de genes de AAV cardíaco do vetor autocomplementar de S100A1/ARC foi avaliada em modelos de camundongos e cães de distrofia muscular de Duchenne (deficiência de distrofina). Anteriormente, os sorotipos AAV8 (incluindo suas múltiplas variantes), AAV9 e AAVrh.10 foram comparados em sua capacidade de infectar os corações caninos, e o AAVrh.10 foi verificado ser o mais eficiente. Por esta razão, o AAVrh.10 foi usado para todas as experiências descritas neste Exemplo.

[00088] Os camundongos Mdx (deficientes de distrofina) na base de DBA/2J ("D2.mdx") foram injetados, em 4 semanas de idade, com o vetor AAVrh.10-S100A1/ARC recombinante (referido abaixo como o "AAV terapêutico") e sacrificados 24 semanas depois. Os camundongos D2.mdx repetem várias características humanas da miopatia de distrofia muscular de Duchenne, como massa muscular reduzida dos membros inferiores, miofibras atrofiadas, fibrose e inflamação aumentadas e fraqueza muscular. Ao longo deste período de 24 semanas, os camundongos injetados com o AAV terapêutico mantiveram melhor as frações de ejeção, o desenvolvimento da cepa e o débito cardíaco, em comparação com os camundongos com injeção simulada (ver a FIG. 4), conforme medidos por MRI cardíaca. A análise de proteínas (Western blots) confirmou que os níveis tanto de S100A1 quanto de ARC estavam elevados nos tecidos tratados, em comparação com os controles (injeção simulada) (ver a FIG. 5). Além disso, a histologia cardíaca demonstrou que os corações tratados demonstraram muito menos patologia em comparação com os corações de controle (ver a FIG. 6).

[00089] Dois cães com GRMD (deficientes de distrofina) foram injetados com o vetor terapêutico no momento da primeira diminuição em suas frações de ejeção cardíaca - um sintoma que indica o início da cardiomiopatia. As descobertas anteriores de um estudo de história natural de pacientes caninos indicaram que, logo que as frações de ejeção começam a cair, elas continuam a cair progressivamente durante o ano seguinte. Os cães tipicamente não sobrevivem mais do que 8-12 meses após a fração de ejeção começar esta diminuição constante.

[00090] Conforme mostrado nas FIGs. 7 e 8, ambos os pacientes mostraram melhorias na fração de ejeção e em outros parâmetros cardíacos vários meses após o tratamento com AAVrh.10- S100A1/ARC, conforme medida por MRI cardíaca e confirmada por medições de ecocardiograma. Quase 12 meses após o tratamento, o primeiro paciente exibiu uma fração de ejeção constante dentro da faixa normal. Da mesma forma, quase 7 meses após o tratamento, o segundo paciente exibiu uma fração de ejeção constante e normal.

[00091] Não apenas a função cardíaca melhorou, como também houve uma melhoria constante na capacidade de exercitar dos cães, conforme avaliada qualitativamente pela filmagem dos pacientes durante o exercício. Consistente com esta capacidade de exercitar melhorada, as medições da MRI dos membros dos pacientes demonstraram que a massa do músculo esquelético foi aumentada ou estava inalterada após o tratamento com o AAV (FIGs. 9A a 9C). Além disso, os níveis circulantes de creatina quinase (CK) no músculo esquelético foram reduzidos após o tratamento (FIG. 10), indicando uma redução no dano muscular existente. Exemplo 4: Tratamento de Pacientes Caninos Adicionais

[00092] Dois pacientes Doberman pinscher foram tratados com AAVrh.10-S100A1/ARC até o momento, em que ambos os cães apresentaram insuficiência cardíaca no momento do tratamento. O primeiro cão estava perto da morte no momento do tratamento, exibindo uma fração de ejeção cardíaca de apenas 10%. Dentro de 24 horas após o tratamento, a fração de ejeção melhorou para 25% (dados não mostrados). Na primeira visita de acompanhamento do cão, 4 meses após o tratamento, a fração de ejeção se manteve estável em 26%. Este paciente ainda vivia 5 meses após o tratamento.

[00093] O segundo Doberman pinscher tratado tinha uma fração de ejeção de 32% antes do tratamento - uma fração que é baixa, porém sem perigo imediato de morte. A fração de ejeção do cão melhorou para 49% dentro de 24 horas após o tratamento (dados não mostrados), o que está dentro da faixa normal. O segundo cão foi relatado estar se saindo bem 5 semanas após o tratamento. Este paciente teve uma primeira visita de acompanhamento 4 meses após o tratamento.

[00094] Com base nesses achados preliminares, o tratamento com AAVrh.10-S100A1/ARC é capaz de restaurar a função cardíaca nos cães para a faixa normal.

EQUIVALENTES

[00095] Embora várias modalidades inventivas tenham sido descritas e ilustradas neste documento, aqueles versados na técnica prontamente imaginarão uma variedade de outros meios e/ou estruturas para realizar a função e/ou obter os resultados e/ou uma ou mais das vantagens descritas neste documento, e cada uma de tais variações e/ou modificações é considerada estar dentro do escopo das modalidades inventivas descritas neste documento. De modo mais geral, aqueles versados na técnica perceberão prontamente que todos os parâmetros, dimensões, materiais e configurações descritos neste documento se destinam a ser ilustrativos e que os parâmetros, as dimensões, os materiais e/ou as configurações reais dependerão da aplicação ou das aplicações específicas para as quais os ensinamentos inventivos são usados. Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades inventivas específicas descritas neste documento. Deve, portanto, ser entendido que as modalidades anteriores são apresentadas a título de exemplo apenas e que, dentro do escopo das reivindicações anexas e dos equivalentes a elas, as modalidades inventivas podem ser praticadas de outra forma que não conforme especificamente descrito e reivindicado. Múltiplas modalidades da presente invenção são direcionadas a cada recurso, sistema, artigo, material, kit e/ou método individual descrito neste documento. Além disso, qualquer combinação de dois ou mais recursos, sistemas, artigos, materiais, kits e/ou métodos, se esses recursos, sistemas, artigos, materiais, kits e/ou métodos não forem mutuamente inconsistentes, está incluída no escopo inventivo da presente divulgação.

[00096] Todas as definições, conforme definidas e usadas neste documento, devem ser entendidas como controlando sobre as definições de dicionário, as definições nos documentos incorporados por referência e/ou os significados comuns dos termos definidos.

[00097] Todas as referências, patentes e pedidos de patentes divulgados neste documento são incorporados por referência com respeito ao assunto para o qual cada um é citado, o que, em alguns casos, pode incluir a totalidade do documento.

[00098] Os artigos indefinidos "um" e "uma", conforme usados neste documento, no relatório descritivo e nas reivindicações, a menos que claramente indicado em contrário, devem ser entendidos como significando "pelo menos um(a)".

[00099] A frase "e/ou", conforme usada neste documento, no relatório descritivo e nas reivindicações, deve ser entendida como significando "um ou ambos" dos elementos assim unidos, isto é, elementos que estão conjuntamente presentes, em alguns casos, e separadamente presentes, em outros casos. Os múltiplos elementos listados com "e/ou" devem ser interpretados na mesma maneira, ou seja, "um ou mais" dos elementos assim unidos. Outros elementos podem opcionalmente estar presentes, além dos elementos especificamente identificados pela cláusula "e/ou", sejam eles relacionados ou não a esses elementos especificamente identificados. Assim, como um exemplo não limitativo, uma referência a "A e/ou B", quando usada em combinação com uma linguagem ilimitada, como "compreendendo", pode referir-se, em uma modalidade, apenas a A (opcionalmente incluindo elementos diferentes de B); em outra modalidade, a apenas B (opcionalmente incluindo elementos diferentes de A); ainda em outra modalidade, tanto a A quanto a B (opcionalmente incluindo outros elementos); etc.

[000100] Como utilizado neste documento, no relatório descritivo e nas reivindicações, "ou" deve ser entendido como tendo o mesmo significado que "e/ou" conforme definido acima. Por exemplo, ao separar os itens em uma lista, "ou" ou "e/ou" deve ser interpretado como inclusivo, ou seja, a inclusão de pelo menos um, porém também incluindo mais do que um, de uma quantidade ou lista de elementos e, opcionalmente, os itens adicionais não listados. Apenas os termos claramente indicados em contrário, como "apenas um de" ou "exatamente um de" ou, quando usado nas reivindicações, "consistindo em", referir-se-ão à inclusão de exatamente um elemento de uma quantidade ou lista de elementos Em geral, o termo "ou", conforme usado neste documento, somente deve ser interpretado como indicando alternativas exclusivas (ou seja, "um ou o outro, porém não ambos") quando precedido por termos de exclusividade, como "qualquer um", "um de", "apenas um de" ou "exatamente um de". "Consistindo essencialmente em", quando usado nas reivindicações, deve ter o seu significado comum conforme usado no campo da lei de patentes.

[000101] Como utilizada neste documento, no relatório descritivo e nas reivindicações, a frase "pelo menos um", em referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser entendida como significando pelo menos um elemento selecionado a partir de qualquer um ou mais dos elementos na lista de elementos, porém não necessariamente incluindo pelo menos um de todo e qualquer elemento especificamente listado na lista de elementos e não excluindo quaisquer combinações de elementos na lista de elementos. Esta definição também permite que elementos possam estar opcionalmente presentes, diferentes dos elementos especificamente identificados na lista de elementos à qual a frase "pelo menos um" se refere, sejam eles relacionados ou não àqueles elementos especificamente identificados. Assim, como um exemplo não limitativo, "pelo menos um de A e B" (ou, equivalentemente, "pelo menos um de A ou B" ou, equivalentemente, "pelo menos um de A e/ou B") pode se referir, em uma modalidade, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais do que um, A, sem B presente (e, opcionalmente, incluindo elementos diferentes de B); em outra modalidade, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais do que um, B, sem A presente (e, opcionalmente, incluindo elementos diferentes de A); ainda em outra modalidade, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais do que um, A e pelo menos um, opcionalmente incluindo mais do que um, B (e, opcionalmente, incluindo outros elementos); etc.

[000102] Também deve ser entendido que, a menos que claramente indicado o contrário, em quaisquer métodos reivindicados neste documento que incluam mais do que uma etapa ou ato, a ordem das etapas ou dos atos do método não está necessariamente limitada à ordem na qual as etapas ou os atos do método são descritos.

[000103] Nas reivindicações, bem como no relatório descritivo acima descrito, todas as frases de transição, como "compreendendo", "incluindo", "transportando", "tendo", "contendo", "envolvendo", "mantendo", "composto de" e semelhantes, devem ser entendidas como ilimitadas, isto é, significar incluindo, porém não se limitando a. Apenas as frases de transição "consistindo em" e "consistindo essencialmente em" devem ser frases de transição limitadas ou semilimitadas,

respectivamente, conforme estabelecido no Manual de Procedimentos de Exame de Patentes do Escritório de Patentes dos Estados Unidos, Seção 2111.03. Deve ser percebido que as modalidades descritas neste documento, usando uma frase de transição ilimitada (por exemplo, "compreendendo"), também são consideradas, nas modalidades alternativas, como "consistindo em" e "consistindo essencialmente em", o recurso descrito pela frase de transição ilimitada.

Por exemplo, se a divulgação descrever "uma composição compreendendo A e B", a divulgação também considera as modalidades alternativas "uma composição consistindo em A e B" e "uma composição consistindo essencialmente em A e B".

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Vetor de ácido nucleico de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) para liberar dois ou mais transgenes no coração de um paciente, caracterizado pelo fato de que o dito vetor compreende, de 5’ para 3’, em ordem, uma primeira sequência de repetição terminal invertida (ITR) do vírus adenoassociado (AAV), dois ou mais transgenes e um promotor operavelmente ligado a dois ou mais transgenes, um sinal de poliadenilação e uma segunda sequência de repetição terminal invertida (ITR) do AAV, em que os dois ou mais transgenes compreendem uma proteína da família S100 e um inibidor apoptótico.

2. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína da família S100 é a proteína de ligação ao cálcio S100 A1 cardíaca (cS100A1) ou uma variante dela.

3. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o inibidor apoptótico é o Repressor de Apoptose com Domínio de Recrutamento de Caspase cardíaco (cARC) ou uma variante dele.

4. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que um Sítio Interno de Entrada do Ribossomo (IRES) está presente entre o transgene cS100A1 e o transgene cARC.

5. Vetor de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os transgenes são específicos para uma espécie.

6. Vetor de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor restrito ao coração.

7. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o promotor restrito ao coração é selecionado a partir do grupo de genes que consiste em: gene da cadeia pesada da α-miosina, gene da cadeia pesada da 6-miosina, gene da cadeia leve da miosina 2v, gene da cadeia leve da miosina 2a, gene de CARP, gene da α-actina cardíaco, gene da acetilcolina muscarínica m2 cardíaco, ANF, troponina C cardíaca, troponina I cardíaca, troponina T cardíaca (cTnT), gene da Ca-ATPase do retículo sarcoplasmático cardíaco e α-actina esquelética, e um promotor cardíaco artificial derivado do gene da MLC-2v.

8. Vetor de rAAV, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o promotor restrito ao coração é a cTnT.

9. Partícula do rAAV, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de rAAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, encapsidado em um capsídeo do AAV.

10. Partícula do rAAV, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a capsídeo do AAV compreende proteínas do capsídeo derivadas dos sorotipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV8 ou AAV9.

11. Partícula do rAAV, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o capsídeo do AAV compreende proteínas do capsídeo derivadas do sorotipo AAVrh.10.

12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a partícula do rAAV, como definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 11.

13. Método de tratamento de um paciente que sofre de uma doença cardíaca, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente a composição, como definida na reivindicação 12 ou a partícula do rAAV como definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 11.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a doença cardíaca causa insuficiência cardíaca no paciente.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a doença cardíaca é a cardiomiopatia.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que a doença cardíaca é a cardiomiopatia hipertrófica ou a cardiomiopatia dilatada.

17. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a doença cardíaca é a isquemia aguda.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada por meio de injeção no coração do paciente.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo fato de que a administração da composição resulta na expressão dos dois ou mais transgenes no coração do paciente.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado pelo fato de que o paciente é um mamífero.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um animal de companhia.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o animal de companhia é um cão ou um gato.

24. Vetor de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o transgene que compreende uma proteína da família S100 está posicionado 5’ em relação ao transgene que compreende um inibidor apoptótico.

25. Vetor de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o transgene que compreende um inibidor apoptótico está posicionado 5’ em relação ao transgene que compreende uma proteína da família S100.

26. Uso de um vetor de rAAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou uso de uma partícula do rAAV como definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 11; ou uso de uma composição, como definida na reivindicação 12 ou a partícula do rAAV, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição ou medicamento para o tratamento de um paciente que sofre de uma doença cardíaca.

27. Invenção, caracterizada pelo fato de que é em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, produto ou processo ou uso, ou qualquer outro tipo de reivindicação englobada pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.