CN101711154A

CN101711154A - 氨基甲酸酯化合物

Info

Publication number: CN101711154A
Application number: CN200880013458A
Authority: CN
Inventors: 刘耀全; 傅红
Original assignee: Kosan Biosciences Inc
Current assignee: Kosan Biosciences Inc
Priority date: 2007-02-26
Filing date: 2008-02-20
Publication date: 2010-05-19
Also published as: US7795457B2; WO2008106047A3; EP2124927A2; WO2008106047A2; US20080214617A1; JP2010519337A

Abstract

氨基甲酸酯化合物，其具有由式I表示的结构(其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶如本申请中所定义)，可用作抗肿瘤药。

Description

氨基甲酸酯化合物

技术领域

本发明涉及具有作为抗癌药的实用性的氨基甲酸酯化合物和它们的制备方法和用途。

背景技术

本发明是部分在美国政府支持下(资助号为5R43CA109840-02，其由国立卫生研究院(National Institutes of Health)提供)完成的。***合众国政府在本发明中具有某些权利。

蛋白质进出真核细胞(eukaryotic cell)的细胞核的通道是紧密控制的主动转运过程，称为核输入(或输出)。待转运的蛋白质含有称为核定位序列(nuclear localization sequence(“NLS”))或核输出序列(nuclear exportsequence(“NES”))的特征性短氨基酸序列，将所述蛋白质分别鉴定为待输入或待输出的“货物蛋白质(cargo protein)”。转运因子蛋白(transport factorprotein)识别NLS或NES，与货物蛋白质结合，并且将所述货物蛋白质运送经过核孔复合体(nuclear pore complex)，所述核孔复合体是发生进出细胞核的门口(portal)。介导核输入的转运因子称为输入蛋白(importin)；相反地，介导核输出的转移因子称为输出蛋白(exportin)。

一种输出蛋白是CRM1，其也称为输出蛋白1。参与核输出的另一种蛋白质是Ran，发现其以三磷酸鸟嘌呤(guanine triphosphate)结合形式(“Ran-GTP”)和二磷酸鸟嘌呤结合形式(“Ran-GDP”)存在。在细胞核内部，CRM1与Ran-GTP和货物蛋白质形成三元复合物。所述复合物通过核孔复合体从细胞核中出来并进入到细胞质中。在细胞质中，蛋白质RanGAP活化Ran-GTP的固有三磷酸腺苷酶活性(intrinsic ATPase activity)，并将其转化为Ran-GDP并引起所述三元复合物解离和释放所述货物蛋白质。然后，CRM1再次进入细胞核中以开始新的循环。若核输出被抑制，则正常细胞循环进程被中断并可发生细胞凋亡。

细霉素B(Leptomycin B，“LMB”)(以前称为自乳菌素(elactocin)、NSC364372或PD 114720)是最初从链霉菌属种(Streptomyces spp.)中分离的抗肿瘤的、抗微生物的天然产物，这些报道在Hokanson等人US 4,771,070(1988)和Nettleton等人US 4,792,522(1988)中。

后来发现LMB是CRM1的共价抑制剂。在CRM1货物蛋白质中其核输出因此被LMB抑制的有p53、p73、STAT1、(i)ADAR1、Rev、肌动蛋白(actin)和Bcr-abl。参见例如Nishi et al.，J.Biol.Chem.1994，269(9)，6320-6324；Fukuda et al.，Nature 1997，390，308-311；和Kudo et al.，Exp.CellRes.1998，242，540-547。在癌症中涉及这些货物蛋白质中的多种，这引起了人们对LMB作为潜在抗癌药的兴趣(Komiyama et al.，J.Antibiotics 1985，38(3)，427-429和Wang et al.，US 2003/0162740A1(2003))。然而，LMB对哺乳动物细胞的细胞毒性(Hamamoto et al.，J.Antibiotics 1983，36(6)，639-645)抵消了其作为抗癌药的潜力。LBM的1期试验由于极度的毒性而在1994年被停止(Newlands et al.，Br.Cancer J.1996，74，648-649)。

LMB是称为细霉素家族的天然产物家族的原始型(archetype)，所述家族的特征为处于分子一端的2，3-去氢-δ-戊内酯环(C₁-C₅)以及位于C₅的具有6E，8Z-二烯***和12E，14E-二烯***的延伸碳链。细霉素家族的化学和生物学综述请参见Kalesse et al.，Synthesis 2002，8，981-1003。细霉素家族的其它成员包括细霉素A、Ratjadone、似蛇霉素A-D(Anguinomycin A-D)、CallystatinA、上总霉素A(Kazusamycin A)(以前称为CL-1957B)、上总霉素B(以前称为CL-1957E)、Leptolstatin和Leptofuranin A-D。细霉素家族的一些其它成员的结构如下所示：

Leptolstatin： R^a＝Me R^b＝H R^c＝H R^d＝CH₂OH

细霉素A： R^a＝Me R^b＝Me R^c＝H R^d＝CO₂H

似蛇霉素A： R^a＝Me R^b＝H R^c＝H R^d＝CO₂H

似蛇霉素B： R^a＝Et R^b＝H R^c＝H R^d＝CO₂H

上总霉素A： R^a＝Et R^b＝Me R^c＝OH R^d＝CO₂H

上总霉素B： R^a＝Me R^b＝Me R^c＝OH R^d＝CO₂H

对细霉素家族化合物的构效关系(structure activity relationship)的研究是很少的。上述Kudo等人的研究显示LMB的硝基甲基戊内酯衍生物是无活性的，这表明2，3-去氢-δ-戊内酯部分是关键的药效团。Kuhnt et al.，AppliedEnviron.Microbiol.1998，64(2)，714-720使LMB通过多种细菌和真菌来生物转化，这得到了几种衍生物。Dong等人US 2005/0272727A1(2005)和Dong等人WO 2007/033214(2007)分别披露了细霉素家族化合物的酰胺和酯。

在此将该章节引用的文献公开内容引入作为参考。

发明内容

本发明提供了可用作抗癌药并且结构上与细霉素家族相关的化合物。

第一个实施方案提供了具有式I所示结构的化合物或其药用盐：

其中

R¹为H或C₁-C₅烷基；

R²为C₁-C₅烷基；

R³为H或OH；

R⁴和R⁵在其每次出现时独立为H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈炔基、-CHR⁷R⁹或-(CHR⁹)_nR⁸，或R⁴和R⁵与它们连接的氮结合在一起形成

条件是R⁵也可以是-C(＝O)NH₂；

R⁶为H或-C(＝O)NR⁴R⁵；

R⁷为未取代的或取代的芳基、未取代的或取代的杂芳基、未取代的或取代的环脂肪族基团、未取代的或取代的杂环脂肪族基团、-CO₂R⁹、氰基或-COR⁹；

R⁸为未取代的或取代的芳基、未取代的或取代的杂芳基、未取代的或取代的环脂肪族基团、未取代的或取代的杂环脂肪族基团、-NR⁴R⁵、-CO₂R⁹、OH、卤素、氰基、-OR⁹或-COR⁹；

R⁹在其每次出现时独立为H、OH或C₁-C₅烷基；以及

n在其每次出现时独立为2、3、4、5或6。

第二个实施方案提供了抑制靶标细胞增殖的方法，所述方法包括使所述靶标细胞与有效量的本发明化合物接触。所述靶标细胞可以是癌细胞，尤其是下列癌症的癌细胞：膀胱癌(bladder cancer)、乳癌(breast cancer)、子***(cervical cancer)、CNS癌(中枢神经***癌，CNS cancer)、结肠癌(coloncancer)、头颈癌(head and neck cancer)、白血病(leukemia)、肝癌(liver cancer)、肺癌(lung cancer)、黑素瘤(melanoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、***癌(prostate cancer)或肾癌(renal cancer)。

第三个实施方案提供了治疗过度增殖性疾病(hyperproliferative disease)的方法，所述方法包括给予患有所述过度增殖性疾病的患者治疗有效量的本发明化合物。如此治疗的过度增殖性疾病可以是癌症，尤其是膀胱癌、乳癌、子***、CNS癌、结肠癌、头颈癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌或肾癌。所述患者优选为哺乳动物，尤其是人类。

第四个实施方案提供了本发明化合物在制备用于治疗过度增殖性疾病的药物中的用途，所述过度增殖性疾病可以是癌症，尤其是膀胱癌、乳癌、子***、CNS癌、结肠癌、头颈癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌或肾癌。

第五个实施方案提供了包含本发明化合物和赋形剂的药物制剂。

第六个实施方案提供了抑制蛋白质经由CRM1所介导的过程从细胞的细胞核中输出的方法，所述方法包括使所述细胞与抑制量的本发明化合物接触。

附图说明

图1、2和3描绘了合成本发明化合物的第一种、第二种和第三种方案。

图4至15显示了本发明化合物的¹H-NMR谱。

具体实施方式

定义

“脂肪族基团”表示直链或支链的、饱和或不饱和的、非芳香族的烃基，其具有指定数目的碳原子(例如在“C₃脂肪族基团”、“C₁-C₅脂肪族基团”或“C₁至C₅脂肪族基团”中，所述“C₁-C₅脂肪族基团”和“C₁至C₅脂肪族基团”是同义的，它们用于表示具有1至5个碳原子的脂肪族基团)，或当碳原子的数目没有明确指定时，“脂肪族基团”表示具有1至4个碳原子(在不饱和脂肪族基团的情况下为2至4个碳原子)的直链或支链的、饱和或不饱和的、非芳香族的烃基。

“烷基”表示饱和的脂肪族基团，其中就指定所适用的碳原子数目而言具有相同的惯例。举例来说，C₁-C₅烷基部分包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、1-丁基、2-丁基、正戊基等。

“烯基”表示具有至少一个碳-碳双键的脂肪族基团，其中就指定所适用的碳原子数目而言具有相同的惯例。举例来说，C₂-C₅烯基部分包括但不限于乙烯基(乙烯基(vinyl))、2-丙烯基(烯丙基或丙-2-烯基)、顺式-1-丙烯基、反式-1-丙烯基、E-(或Z-)2-丁烯基、3-丁烯基、1，3-丁二烯基(丁-1，3-二烯基)、1-戊烯基等。

“炔基”表示具有至少一个碳-碳叁键的脂肪族基团，其中就指定所适用的碳原子数目而言具有相同的惯例。举例来说，C₂-C₅炔基基团包括乙炔基(乙炔基(acetylenyl))、炔丙基(丙-2-炔基)、1-丙炔基、丁-2-炔基等。

“环脂肪族基团”表示饱和或不饱和的、非芳香族的烃基，其具有1至3个环并且每个环具有3至8个(优选3至6个)碳原子。“环烷基”表示其中每个环都是饱和的环脂肪族基团。“环烯基”表示其中至少一个环具有至少一个碳-碳双键的环脂肪族基团。“环炔基”表示其中至少一个环具有至少一个碳-碳叁键的环脂肪族基团。举例来说，环脂肪族基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基和金刚烷基。优选的环脂肪族基团是环烷基，尤其是环丙基、环丁基、环戊基和环己基。

“杂环脂肪族基团”表示环脂肪族基团，其中在其至少一个环中至多三个(优选1至2个)碳已经被独立选自N、O或S的杂原子取代，其中所述N和S可任选被氧化，并且所述N可任选被季铵化。相似地，“杂环烷基”、“杂环烯基”和“杂环炔基”分别表示其中其至少一个环已经如此改变的环烷基、环烯基或环炔基。示例性的杂环脂肪族基团包括氮丙啶基(aziridinyl)、氮杂环丁烷基(azetidinyl)、1，3-二噁烷基(1，3-dioxanyl)、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢噻喃基(tetrahydro-thiopyranyl)、1，1-二氧化四氢噻喃基(tetrahydrothiopyranylsulfone)、吗啉基、硫吗啉基(thiomorpholinyl)、1-氧化硫吗啉基(thiomorpholinyl sulfoxide)、1，1-二氧化硫吗啉基(thiomorpholinyl sulfone)、1，3-二氧戊环基、四氢-1，1-二氧代噻吩基(tetrahydro-1，1-dioxothienyl)、1，4-二噁烷基、硫杂环丁烷基(thietanyl)等。

“烷氧基”、“芳基氧基”、“烷基硫基”和“芳基硫基”分别表示(烷基)O-、(芳基)O-、(烷基)S-和(芳基)S-。实例分别为甲氧基、苯氧基、甲基硫基和苯基硫基。

“卤素”或“卤”表示氟、氯、溴或碘。

“芳基”表示具有单环环系、二环环系或三环环系的烃基，其中每个环具有3至7个碳原子，并且至少一个环是芳香性的。所述环系中的环可以相互稠合(如萘基)或相互结合(如联苯)，并且可以与非芳香性的环稠合或结合(如茚满基或环己基苯基)。进一步举例来说，芳基部分包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯基、菲基、蒽基和苊基(acenaphthyl)。

“杂芳基”表示具有单环环系、二环环系或三环环系的基团，其中每个环具有3至7个碳原子，并且至少一个环是含有1至4个独立选自N、O或S的杂原子的芳香族环，其中所述N和S可任选被氧化，并且所述N可任选被季铵化。这样含有至少一个杂原子的芳香族环可以与其它类型的环稠和(例如苯并呋喃基或四氢异喹啉基)或直接与其它类型的环结合(例如苯基吡啶基或2-环戊基吡啶基)。进一步举例来说，杂芳基部分包括吡咯基、呋喃基、噻吩基(噻吩基(thienyl))，咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、***基、四唑基、吡啶基、N-氧代吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、噌啉基(cinnolinyl)、喹喔啉基(quinozalinyl)、二氮杂萘基(naphthyridinyl)、苯并呋喃基、吲哚基、苯并噻吩基、噁二唑基、噻二唑基、吩噻唑基(phenothiazolyl)、苯并咪唑基、苯并***基、二苯并呋喃基、咔唑基、二苯并噻吩基、吖啶基等。

当指明基团可以被取代时，如在“取代或未取代的C₁-C₅烷基”或“任选取代的杂芳基”中使用词语“取代或未取代的”或“任选取代的”那样，这样的基团可具有一个或多个独立选择的取代基，其优选的数目为1至5个，更优选的数目为1或2个。本领域普通技术人员在考虑了取代基所连部分的情况下可选择取代基和取代形式，以提供化学稳定的并可通过本领域已知技术以及本申请所列方法来合成的化合物。

“芳基烷基”、“(杂环脂肪族基团)烷基”、“芳基烯基”、“芳基炔基”、“联芳基烷基”等表示视情况之可能而被芳基、杂环脂肪族基团、联芳基等视情况而可能的基团取代的烷基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基具有开放的(未满足的)化合价，所述“芳基烷基”、“(杂环脂肪族基团)烷基”、“芳基烯基”、“芳基炔基”、“联芳基烷基”等为例如苯甲基、苯乙基、N-咪唑基乙基、N-吗啉代乙基等。相反地，“烷基芳基”、“烯基环烷基”等表示视情况之可能而被烷基、烯基等视情况而可能的基团取代的芳基、环烷基等，所述“烷基芳基”、“烯基环烷基”等为例如甲基苯基(甲苯基)或烯丙基环己基。“羟基烷基”、“卤代烷基”、“烷基芳基”、“氰基芳基”等表示视情况之可能而被一个或多个所确定的取代基(羟基、卤素等视情况而可能的基团)取代的烷基、芳基等。

举例来说，可能的取代基包括但不限于烷基(尤其是甲基或乙基)、烯基(尤其是烯丙基)、炔基、芳基、杂芳基、环脂肪族基团、杂环脂肪族基团、卤素(尤其是氟)、卤代烷基(尤其是三氟甲基)、羟基、羟基烷基(尤其是羟基乙基)、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)(尤其是-OCF₃)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷基硫基、芳基硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂、-NHC(＝NH)NH₂、-OSO₂(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)(烷基)、-SO₂(烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(烷基)、-SO₂N(烷基)₂等。

当被取代的基团是脂肪族基团时，优选的取代基为芳基、杂芳基、环脂肪族基团、杂环脂肪族基团、卤素、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷基硫基、芳基硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂、-NHC(＝NH)NH₂、-OSO₂(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)(烷基)、-SO₂(烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(烷基)和-SO₂N(烷基)₂。更优选的取代基是卤素、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(芳基)、＝O、＝NOH、＝NO(烷基)、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)NH₂，-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂和-NHC(＝NH)NH₂。

当被取代的基团是环脂肪族基团、杂环脂肪族基团、芳基或杂芳基时，优选的取代基为烷基、烯基、炔基、卤素、卤代烷基、羟基、羟基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷基硫基、芳基硫基、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂、-NHC(＝NH)NH₂、-OSO₂(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)(烷基)、-SO₂(烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(烷基)和-SO₂N(烷基)₂。更优选的取代基为烷基、烯基、卤素、卤代烷基、羟基、羟基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂和-NHC(＝NH)NH₂。

对于本发明的芳基、杂芳基、杂脂肪族基团和杂环脂肪族基团而言优选的取代基包括C₁-C₅烷基、C₂-C₅烯基、C₂-C₅炔基、卤素(尤其是氟或氯)、-O(C₁-C₅烷基)、-OCF₃、CF₃、-CF₂CF₃、氰基、硝基、-C(＝O)(C₁-C₅烷基)、OH、-O(CH₂)_mOH、-O(CH₂)_mO(C₁-C₅烷基)和-O(CH₂)_m(卤素)，其中m为2、3或4。

当描述范围时，如在“C₁至C₅烷基”或“5至10％”中，这样的范围包括范围的终点。

除非对具体的立体异构体进行特别的指明(例如如下指明：在结构式的相关立体中心处的粗线键或虚线键、在结构式中将双键描述为具有E或Z构型或使用立体化学命名法)，所有立体异构体以纯化合物的形式及其混合物的形式包括在本发明的范围内。除非另有说明，单独的对映异构体、非对映异构体、几何异构体及其组合和混合物都包括在本发明的范围内。

本领域技术人员应该理解的是，化合物可具有与本申请所用结构式中描绘的那些形式等价的互变异构形式(例如酮和烯醇形式)、共振形式和两性离子形式，并且所述结构式涵盖这些互变异构形式、共振形式或两性离子形式。

“药用盐”表示化合物适于药物制剂的盐。当化合物具有一个或多个碱性官能团时，所述盐可以是酸加成盐，例如硫酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐(embonate))、氢碘酸盐、硝酸盐、盐酸盐、乳酸盐、甲基硫酸盐、富马酸盐(fumarate)、苯甲酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、乳糖醛酸盐(lactobionate)、辛二酸盐、甲苯磺酸盐等。当化合物具有一个或多个酸性基团时，所述盐可以是盐如钙盐、钾盐、镁盐、葡甲胺盐、铵盐、锌盐、哌嗪盐、氨基丁三醇盐、锂盐、胆碱盐、二乙胺盐、4-苯基环己胺盐、苄星盐(benzathine salt)、钠盐、四甲基铵盐等。多晶型的结晶形式和溶剂化物也包括在本发明的范围内。

化合物和方法

在优选的实施方案中，在式I中R¹为H或Me(Me为甲基)。在另一个优选的实施方案中，在式I中R²为Me或Et(Et为乙基)。在另一个优选的实施方案中，在式I中R¹为H或Me，以及R²为Me或Et。

在另一个优选的实施方案中，R⁴和R⁵中的每个缺乏在生理学pH时被离子化的官能团。

在另一个优选的实施方案中，在式I中R¹为H，R²为Me，以及R³为H，这相当于具有式I-a所示结构的化合物：

在式I或式I-a化合物的优选实施方案中，R⁵为H。在式I或式I-a化合物的另一个优选实施方案中，R⁶为H。在式I或式I-a化合物的另一个优选实施方案中，R⁵和R⁶各自为H。

在另一个优选的实施方案中，在式I中R⁴和R⁵在其每次出现时独立为H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈炔基、-CHR⁷R⁹或-(CHR⁹)_nR⁸，或R⁴和R⁵与它们连接的氮结合在一起形成

以及

R⁹在其每次出现时独立为H或C₁-C₅烷基。

在式I或式I-a中优选的基团NR⁴R⁵包括：

本发明化合物的实施例在表A中列出。

在这些化合物中，优选的化合物是A-1、A-2、A-4、A-15、A-16、A-17、A-19和A-21。它们的完整结构如下所示：

在式I-a化合物的另一个优选实施方案中，基团NR⁴R⁵含有三氟甲基取代的吡啶基环，以及R⁶为H。这些化合物的具体实施例包括：

在另一个优选的实施方案中，本发明化合物具有式A-4的结构：

制备本发明化合物的第一种方法示于图1中。从C24醇II(其中R¹、R²和R³如上文所定义)开始，与异氰酸酯O＝C＝NR⁴进行氨甲酰化，得到化合物I-b(即其中R⁵和R⁶都为H的化合物I)。在C24处的伯醇基团比在C19处的仲醇更具有反应性，因此氨甲酰化实质上专有地发生在C24处，甚至在更有力的条件(其中加入4-(二甲基氨基)吡啶(“DMAP”))下。图1的方法是最实用的，其中异氰酸酯O＝C＝NR⁴是市售的。

第二种方法示于图2中。与图1的方法不同的是，该方法可得到其中R⁶为H(即化合物I-c)或R⁶为C(＝O)NR⁴R⁵(即化合物I-d)的化合物I。还与图1的方法不同的是，该方法可得到其中R⁵不是H的化合物。也从C24醇II开始，与1.0至1.2当量羰基二咪唑反应，得到单酰基咪唑III-a。然而，若使用较大量的羰基二咪唑(约2.5当量)，则形成二(酰基咪唑)化合物III-b。使酰基咪唑III-a或III-b与胺HNR⁴R⁵反应，分别得到化合物I-c或I-d。

第三种方法示于图3中。当在式I中基团NR⁴R⁵(无论是与C24相连还是与C19相连)为NH₂时，该方法是合适的。使C24醇II与约1.75当量异氰酸三氯乙酰基酯反应，接着用中性氧化铝处理，得到化合物I-e(即其中R⁶为H以及NR⁴R⁵为NH₂的化合物I)和化合物I-f(即其中R⁶为NR⁴R⁵以及NR⁴R⁵在其每次出现时为NH₂的化合物I)的约1∶1混合物。然而，若使用较大量(约5当量)的异氰酸三氯乙酰基酯，则仅得到化合物I-f。

合适的C24醇II是Leptolstatin(以前称为S-59917a)，其是通过微生物链霉菌属种SAM 1595来生物合成的。其产生、分离和表征描述在Abe et al.，J.Antibiotics 1993，46(5)，735-40、Abe et al.，JP05-039283(1993)(corresponding Chemical Abstract No.119：137524)和Abe etal.，J.Antibiotics 1993，46(5)，728-734中，将上述文献公开的内容引入作为参考。

另一种合适的C24醇II为还原型细霉素A(reductoleptomycin A)，其从链霉菌属种MJ132-NF5培养物中的制备和分离描述在Hosokawa et al.，J.Antibiotics 1993，46(4)，676-8中，将上述文献公开的内容引入作为参考。就结构而言，还原型细霉素A相当于其中C24羧酸基团被还原成醇的细霉素A。

与还原型细霉素A相似，其中C24羧酸基团被还原的细霉素B衍生物是另一种可使用的合适C24醇II。其制备描述在Kobayashi et al.，TetrahedronLett.1998，39(45)，8291-8294中，将上述文献公开的内容引入作为参考。

本领域技术人员应该理解的是，其它C24醇II可如下制备：对细霉素家族的其它天然成员(如上总霉素和似蛇霉素)中的C24羧酸基团进行还原。

另一个实施方案提供了具有式(IV)所示结构的氨基甲酸酯化合物：

抛开理论的束缚，相信本发明化合物通过以下机理来发挥作用，所述机理与LMB在抑制靶标癌细胞中CRM-1所介导的核输出过程中的机理相似，由此诱导细胞周期停滞(cell cycle arrest)和/或细胞凋亡。LMB中的2，3-去氢-δ-戊内酯部分为麦克尔反应(Michael reaction)的受体。已显示LMB通过与酵母CRM1的半胱氨酸529形成麦克尔加成物来抑制CRM1(Kudo et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)1999，96(3)，9112-9117)(人CRM1中的相应半胱氨酸处于528位)。已显示Ratjadone(细霉素家族的另一个成员)通过相同机理来抑制CRM1(Meissner et al.，FEBS Lett.2004，576，27-30)。

本发明化合物保留了麦克尔受体药效团，因此预期它们通过相同的抑制机理来发挥作用。

多种癌细胞具有突变，这导致诱导细胞凋亡的肿瘤抑制蛋白p53的功能丧失(Vousden et al.，Nat.Rev.Cancer 2002，2，594-504)。所述癌症的实例包括***癌和与人***状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)相关的子***。已显示LMB引起p53蛋白在子***细胞的细胞核中的蓄积(Lane et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)2000，97(15)，8501-8506)。已显示LMB捕获细胞核中的p53并诱导***癌细胞的细胞凋亡。因此，***癌细胞对LMB高度敏感(Peehl et al.，Prostate 2003，54，258-267)。

当对抗适当类型的癌症时，本发明化合物可与其它抗癌药特别是酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼(其甲磺酸盐通过专利药品名稀

而为人所知)协同使用。一些癌症如慢性骨髓性白血病(CML)的特征在于融合蛋白(fusion protein)Bcr-Abl的表达。尽管Bcr-Abl通常不输入到细胞核中，但Bcr-Abl/伊马替尼复合物输入到细胞核中。若LMB也存在，则其阻止Bcr-Abl从细胞核中输出。一旦Bcr-Abl从其与伊马替尼的可逆复合物中释放，核所捕获的Bcr-Abl就诱导细胞凋亡，这导致Bcr-Abl阳性细胞的死亡。参见例如Vigneri et al.，Nature Medicine 2001，7，228-234和Wang et al.，US2003/0162740A1(2003)。因此，伊马替尼和本发明化合物的组合可提供协同攻击Bcr-Abl阳性癌细胞的机理。

Santi et al.，US 2005/0203174A1(2005)描述了涉及LMB和第二种抗癌药的组合疗法，在此将其公开的内容引入作为参考。鉴于作用机理可能相同，预期上述公开的组合疗法可使用本发明化合物代替LMB来实施。

因此，本发明化合物可用于通过以下方式来抑制蛋白质如p53、p73、Bcr-Abl、STAT1、(i)ADAR1、Rev和肌动蛋白从细胞的细胞核中的核输出，所述方式为本发明化合物与CRM1形成共价加成物并干扰CRM1所介导的所述蛋白质的输出过程。在一个实施方案中，被抑制的蛋白质为p53。在另一个实施方案中，被抑制的蛋白质为Bcr-Abl。尽管基于细胞类型和靶标蛋白而预期某种变量，但通常所用抑制量的范围可为0.03至740nM，优选0.3至100nM，更优选0.3至20nM。

本发明化合物可用于治疗如过度增殖性疾病那样但不限于过度增殖性疾病的疾病，所述过度增殖性疾病包括：头颈癌，所述头颈癌包括头部、颈部、鼻腔、鼻旁窦(paranasal sinuses)、鼻咽(nasopharynx)、口腔(oral cavity)、口咽(oropharynx)、喉(larynx)、下咽(hypopharynx)和唾液腺(salivary gland)的肿瘤和神经节细胞瘤(paraganglioma)；肝脏和胆系的癌症，特别是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)；肠癌，特别是结肠直肠癌；卵巢癌；小细胞肺癌和非小细胞肺癌；乳癌；肉瘤，如纤维肉瘤(fibrosarcoma)、恶性纤维组织细胞瘤(malignant fibrous histiocytoma)、胚胎性横纹肌肉瘤(embryonalrhabdomyosarcoma)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)、神经纤维肉瘤(neurofibrosarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、滑膜肉瘤(synovial sarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)和软组织腺泡状肉瘤(alveolar soft part sarcoma )；白血病，如急性骨髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性骨髓性白血病(CML)；中枢神经***的肿瘤(neoplasm)，特别是脑癌；以及淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、淋巴浆细胞样淋巴瘤(lymphoplasmacytoid lymphoma)、滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma)、外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、B谱系大细胞淋巴瘤(B-lineage large celllymphoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)和T细胞间变性大细胞淋巴瘤(T-cell anaplastic large cell lymphoma)。在临床上，所述方法的实践和本申请所述组合物的使用将减小癌性生长的大小或数目和/或减小相关的症状(当适用时)。在病理学上，所述方法的实践和本申请所述组合物的使用将产生病理学上相关的应答，如抑制癌细胞的增殖、减小癌症或肿瘤的大小、预防进一步的转移和抑制肿瘤的血管发生。治疗所述疾病的方法包括将治疗有效量的本发明组合给予受试者。如果需要，所述方法可重复进行。特别地，所述癌症可以是***癌、白血病、肺癌、乳癌、成神经细胞瘤(neuroblastoma)、肾癌、子***(尤其是与人***状瘤病毒(HPV)相关的子***)和结肠癌。

以细胞过度增殖(cellular hyperproliferation)为特征的非癌性病症也可通过本发明化合物来治疗。所述病症的示例性实例包括但不限于萎缩性胃炎(atrophic gastritis)、炎性溶血性贫血(inflammatory hemolytic anemia)、移植物排斥(graft rejection)、炎性嗜中性粒细胞减少(inflammatory neutropenia)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)、腹部疾病(coeliac disease)、脱髓鞘性神经病(demyelinating neuropathy)、皮肌炎(dermatomyositis)、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩病(Crohn’s disease))、多发性硬化(multiple sclerosis)、心肌炎(myocarditis)、肌炎(myositis)、鼻息肉(nasal polyp)、慢性鼻窦炎(chronicsinusitis)、寻常性天疱疮(pemphigus vulgaris)、原发性肾小球肾炎(primaryglomerulonephritis)、牛皮癣(psoriasis)、外科手术粘连(surgical adhesion)、狭窄(stenosis)或再狭窄(restenosis)、巩膜炎(scleritis)、硬皮病(scleroderma)、湿疹(包括特应性皮炎(atopic dermatitis)、刺激性皮炎(irritant dermatitis)、变应性皮炎(allergic dermatitis))、牙周病(periodontal disease)(即牙周炎(periodontitis))、多囊性肾病(polycystic kidney disease)和I型糖尿病。其它实例包括血管炎(例如巨细胞动脉炎(giant cell arteritis)(颞动脉炎(temporalarteritis)、高安动脉炎(Takayasu’s arteritis))、结节性多动脉炎(polyarteritisnodosa)、变应性脉管炎(allergic angiitis)、肉芽肿病(granulomatosis)(邱-斯二氏病(Churg-Strauss disease))、多脉管炎重叠综合征(polyangitis overlapsyndrome)、高敏感性脉管炎(hypersensitivity vasculitis)(亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura))、血清病(serum sickness)、药物诱导的脉管炎、感染性脉管炎、赘生性脉管炎(neoplastic vasculitis)、与***病症相关的脉管炎、与补体***的先天性缺陷相关的脉管炎(vasculitis associated withcongenital deficiencies of the complement system)、韦氏肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)、川崎病(Kawasaki’s disease)、中枢神经***的脉管炎、伯格病(Buerger’s disease)和全身性硬化症(systemic sclerosis))；胃肠道疾病(例如胰腺炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosingcholangitis)和任何起因的良性狭窄(benign stricture)(包括特发性的(ideopathic)(例如胆管、食管、十二指肠、小肠或结肠的狭窄))；呼吸道疾病(例如哮喘、高敏感性肺炎、石棉沉着病(asbestosis)、矽肺病(silicosis)和其它形式的尘肺症(pneumoconiosis)、慢性支气管炎和慢性阻塞性气道疾病)；鼻泪管疾病(例如各种起因的狭窄(包括特发性的))；和咽鼓管(eustachean tube)疾病(例如各种起因的狭窄(包括特发性的))。特别地，所述非癌性病症可为足底疣(plantar wart)、心脏肥大(cardiac hypertrophy)或癌性恶病质(cancercachexia)。

本发明化合物可与其它抗癌药或细胞毒性药(cytotoxic agent)组合给药，这些抗癌药或细胞毒性药包括烷化剂、血管生成抑制剂、抗代谢剂(antimetabolite)、DNA裂解剂(DNA cleaver)、DNA交联剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂(DNA minor groove binder)、烯二炔(enediyne)、热休克蛋白90抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor)、免疫调节剂、微管稳定剂、核苷(嘌呤或嘧啶)类似物、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶(I或II)抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂。具体的抗癌药或细胞毒性药包括β-拉帕醌(β-lapachone)、安丝菌素P3(ansamitocin P3)、auristatin、比卡鲁胺(bicalutamide)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、白消安(busulfan)、翠菊苷A(callistatin A)、喜树碱(camptothecin)、卡培他滨(capecitabine)、CC-1065、顺铂(cisplatin)、cryptophycin、柔红霉素(daunorubicin)、disorazole、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、duocarmycin、dynemycin A、埃坡霉素(epothilone)、依托泊苷(etoposide)、氟尿苷(floxuridine)、氟尿苷、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉非替尼(gefitinib)、格尔德霉素(geldanamycin)、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)、17-(2-二甲基氨基乙基)氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-DMAG)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、伊马替尼、干扰素、白细胞介素(interleukin)、伊立替康(irinotecan)、美登素(maytansine)、甲氨喋呤(methotrexate)、丝裂霉素C(mitomycin C)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、辛二酰基苯胺异羟肟酸(suberoylanilidehydroxamic acid，SAHA))、塞替派(thiotepa)、托泊替康(topotecan)、曲古抑菌素A(trichostatin A)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、来那度胺(lenalidomide)

贝伐单抗

曲妥单抗

和西妥昔单抗

优选地，本发明化合物例如在柱色谱、高压液相色谱、重结晶或其它纯化技术后以纯化的和分离的形式来提供。当指明本发明化合物的具体立体异构体时，所述立体异构体优选基本上不含其它立体异构体。

本发明化合物可按包含本发明化合物和赋形剂的药物制剂的形式来使用。可使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散助剂或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、矫味剂、包衣剂、崩解剂、润滑剂、增甜剂、防腐剂、等渗剂和它们的组合。Gennaro，ed.，Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)教导了合适赋形剂的选择和使用，在此将其公开的内容引入本申请作为参考。

所述组合物可呈任何合适的形式例如固态形式、半固态形式或液态形式。通常，所述药物制剂可含有作为活性成分的一种或多种本发明化合物以及混合有适于外部、肠内或肠外施用的有机或无机载体或赋形剂。所述活性成分可例如与通常无毒的药用载体混合而用于片剂、小丸剂、胶囊剂、栓剂、***栓剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或适于使用的任何其它形式。可使用的载体包括水、葡萄糖、乳糖、***胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、胶体二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素和适于在制备呈固态形式、半固态形式或液化形式的制剂中使用的其它载体。此外，可使用辅助性的稳定剂、增稠剂和着色剂及香料。优选的给药模式包括静脉内给药，并且在某些适应症如子***、膀胱癌或足底疣的情况下为局部给药。

当适用时，可将本发明化合物配制成微囊和纳米颗粒。一般方案描述在例如Bosch et al.，US 5,510,118(1996)、De Castro，US 5,534,270(1996)和Bagchi et al.，US 5,662,883(1997)中，在此将这些文献全部引入作为参考。通过增加表面积与体积的比例，这些制剂允许口服递送以其它形式可能不顺应于口服递送的化合物。

本发明化合物的剂量水平为以下级别：约0.1mg至约100mg/千克体重/日，优选约1mg至约50mg/千克体重/日。更优选地，所述剂量水平为约1mg至约20mg/千克体重/日，这相当于70mg至1400mg/患者/日(假设患者为70kg)。本发明化合物可间歇地即以每半周、每周、每半月或每月的间隔来给药。

与载体物质组合以制备单一剂型的活性成分的量将基于所治疗的宿主(host)及具体的给药模式而变化。例如，意在口服给药于人类的制剂可含有载体物质，其变化量可为总组合物的约5％至约95％。剂量单位形式可通常含有约5mg至约500mg的活性成分。

然而，应该理解的是，用于任何具体患者的特定剂量水平可取决于多种因素。这些因素包括所使用的特定化合物的活性；受试者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；给药的时间和途径以及药物的***速率；在治疗中是否使用药物组合；和疗法所探寻的具体疾病或病症的严重程度。

可参考以下实施例来进一步理解本发明的实施，提供所述实施例是用于解释而非限制。

实施例1：Leptolstatin

在小瓶中将链霉菌属种菌株SAM1595在-80℃贮存在甘油(30％，v/v)中。使一个小瓶解冻，然后将内容物转移到经遮蔽的(baffled)250mL锥形摇瓶(Erlenmeyer shake flask)中，所述摇瓶含有50mL L2培养基(大豆油，60mL/L；基础酵母(basic yeast)，30g/L；KCl，3g/L；K₂HPO₄，0.2g/L；CaCO₃，3g/L)。在2英寸长的孵育器(2-inch throw incubator)中将烧瓶在24℃培养四日。将***内容物转移到含有500mL L2培养基的2.8L冯巴赫瓶(Fernbachflask)中。在2英寸长的孵育器中将冯巴赫瓶在24℃培养二日。使用200mL次级接种培养物(secondary seed culture)来接种生物反应器中的4L L2培养基。将培养条件控制在温度为24℃、通气速率为0.5v/v/m、溶解氧张力为30％饱和度、使用最初设定为600rpm的搅拌级联(stir cascade)以及pH为7.0(使用2.5N H₂SO₄或2.5N NaOH)。培养七日后，3L肉汤用3L 100％甲醇提取过夜。使提取混合物过滤通过布氏漏斗，并且滤饼用200mL 50∶50甲醇∶水洗涤。用于纯化过程的所有溶剂都含有0.1％(v/v)乙酸。Leptolstatin从甲醇提取物中通过低压C18色谱来纯化。得到总共115mg的Leptolstatin，其为黄色油状物，其中总回收率为32％。

实施例2：24-酰基咪唑Leptolstatin(24-Acylimidazole Leptolstatin)

该实施例阐述了经由图2的方案使用Leptolstatin作为代表性C24醇II来制备单酰基咪唑化合物III-a。

将1，1’-羰基二咪唑(54mg，0.3333mmol，1.01当量)加到Leptolstatin(164mg，0.3293mmol，1当量)于1mL无水乙腈中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌2.5h，然后除去溶剂。产物经硅胶柱色谱(10-50％丙酮/己烷梯度)纯化，得到182mg 24-酰基咪唑Leptolstatin。MS(m/z)：C₃₅H₄₈N₂O₆计算值592.765；观测值615.427(M+Na⁺)。

实施例3：19，24-二(酰基咪唑)Leptolstatin(19，24-Bisacylimidazole Leptolstatin)

该实施例阐述了经由图2的方案使用Leptolstatin作为代表性C24醇II来制备二(酰基咪唑)化合物III-b。

将1，1’-羰基二咪唑(127mg，0.7840mmol，2.4当量)加到Leptolstatin(163mg，0.3273mmol，1当量)于3mL无水乙腈中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后除去溶剂。产物经硅胶柱色谱(10-50％丙酮/己烷梯度)纯化，得到128mg 19，24-二(酰基咪唑)Leptolstatin。MS(m/z)：C₃₉H₅₀N₄O₇计算值686.4；观测值687.5(M+H⁺)和709.5(M+Na⁺)。

实施例3：化合物A-1

该实施例描述了按照图1的方案来合成化合物A-1。

将异氰酸苄酯(benzylisocyanate)(192μL，1.5562mmol，2.48当量)和DMAP(115mg)加到Leptolstatin(312mg，0.6265mmol，1当量)于5mL无水CH₂Cl₂中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌2.5h并除去溶剂。产物先后经硅胶柱色谱(10-50％丙酮/己烷梯度)和C-18反相MPLC(20-100％乙腈/水梯度)纯化，得到279mg化合物A-1。MS(m/z)：C₃₉H₅₃NO₆计算值631.4；观测值654.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.42，164.08，156.72，144.88，139.94，139.00，138.63，136.24，136.34，130.75，129.45，128.57，128.33，127.70，127.41，127.34，125.40，121.50，121.06，78.65，74.09，61.67，46.71，45.61，44.99，44.01，40.70，33.12，32.25，30.01，20.70，20.34，16.16，15.98，13.73，13.06，12.57。化合物A-1的¹H-NMR谱示于图4中。

实施例4：化合物A-2

这是按照图1的方案进行合成的另一个实施例。

将异氰酸甲酯(66μL，1.100mmol，2.5当量)和MAP(40mg)加到Leptolstatin(219mg，0.4398mmol，1当量)于5mL无水CH₂Cl₂中的溶液中。在室温将反应混合物在氮气下搅拌4h并除去溶剂。产物先后经硅胶柱色谱(5-40％丙酮/己烷梯度)和C-18反相MPLC(20-100％乙腈/水梯度)纯化，得到185mg化合物A-2。MS(m/z)：C₃₃H₄₉NO₆计算值555.4；观测值578.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.54，164.03，157.29，144.70，139.87，139.05，136.29，135.34，130.81，129.47，128.34，127.75，125.40，121.65，121.22，78.66，74.19，61.52，46.49，45.62，43.95，40.73，33.10，32.28，30.08，27.54，20.72，20.36，16.15，15.99，13.92，13.08，12.29。化合物A-2的¹H-NMR谱示于图5中。

实施例5：化合物A-3和A-4(混合物)

该实施例描述了按照图3的方案来合成化合物A-3和A-4的混合物。

将异氰酸三氯乙酰基酯(trichloroacetylisocyanate)(5μL，0.04204mmol，1.74当量)加到Leptolstatin(12mg，0.0241mmol，1当量)于1mL无水CH₂Cl₂中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌30分钟，然后直接加载到中性Al₂O₃色谱柱上。4小时后，产物用丙酮洗脱。蒸发溶剂，并且产物经硅胶柱色谱(5-60％丙酮/己烷梯度)纯化，得到6mg化合物A-3和6mg化合物A-4(MS(m/z)：C₃₃H₄₈N₂O₇计算值584.346.340；观测值607.392(M+Na⁺))。化合物A-3的MS(m/z)：C₃₂H₄₇NO₆计算值541.3；观测值564.4(M+Na⁺)。化合物A-3的¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.54，164.05，156.87，144.71，140.25，139.05，136.30，135.34，130.82，129.48，128.33，127.77，125.39，121.65，120.82，78.66，74.19，61.81，46.49，45.63，43.94，40.73，33.09，32.28，30.08，20.72，20.36，16.14，16.00，13.93，13.09，12.28。化合物A-3的¹H-NMR谱示于图6中。有关化合物A-4的分析细节请参见下一个实施例。

实施例6：化合物A-4

该实施例描述了通过图1的方案使用有限量的异氰酸三氯乙酰基酯来合成化合物A-4。

将异氰酸三氯乙酰基酯(73.6μL，0.6189mmol，5当量)加到Leptolstatin(74mg，0.1237mmol，1当量)于2mL无水CH₂Cl₂中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌30分钟，然后直接加载到中性Al₂O₃色谱柱上。4小时后，产物用丙酮洗脱。蒸发溶剂，并且产物经硅胶柱色谱(5-60％丙酮/己烷梯度)纯化，得到55mg化合物A-4。MS(m/z)：C₃₃H₄₈N₂O₇计算值584.4；观测值607.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，211.89(C17)，164.16(C1)，157.25，157.13，145.02(C3)，139.36(22)，139.05(C9)，136.25(C14)，135.29(C13)，130.89(C7)，129.52(C8)，128.53(C15)，127.83(C12)，125.36(C6)，121.48(C2)，121.05(C23)，78.94(C5)，76.64(C19)，61.78(C24)，46.78(C18)，45.45(C16)，44.38(C21)，40.77(C11)，32.79(C20)，32.54(C10)，30.11(C4)，20.87(10Me)，20.34(8Me)，16.05(16Me)，15.91(22Me)，14.07(18Me)，13.13(14Me)，12.82(20Me)。化合物A-4的¹H-NMR谱示于图7中。

化合物A-4也可如下来合成：向Leptolstatin(17.78g，35.70mmol，1当量)于360mL无水CH₂Cl₂中的溶液中加入异氰酸三氯乙酰基酯(10.57mL，89.25mmol，2.5当量)。将反应混合物在室温搅拌30分钟。CH₂Cl₂用旋转蒸发仪除去，然后先后加入甲醇(360mL)和NaHCO₃(89g)。将反应混合物在室温搅拌2.5小时。过滤除去固体，然后用旋转蒸发仪除去溶剂。产物经硅胶柱色谱(5-60％丙酮/己烷梯度)纯化，得到16.5g化合物A-4。

实施例7：化合物A-5

化合物A-5按照图2的方案经由中间体III-a来合成。

将N-(2-氨基乙基)吡咯烷(6.8μL，0.05374mmol，4.4当量)和乙酸(3μL，0.053mmol，4.3当量)加到24-酰基咪唑Leptolstatin(7.3mg，0.01233mmol，1当量)于1.5mL无水四氢呋喃中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌5h。将反应混合物直接加载到硅胶色谱柱(2-6％甲醇/CH₂Cl₂梯度)上用于纯化，得到7.1mg化合物A-5。MS(m/z)：C₃₈H₅₈N₂O₆计算值638.4；观测值639.4(M+H⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.52，164.04，156.78，144.73，139.76，139.05，136.27，135.35，130.80，129.46，128.34，127.73，125.40，121.63，121.20，78.67，74.07，61.63，55.22，54.03，46.54，45.62，43.95，40.72，38.86，33.08，32.28，30.07，29.68，20.71，20.36，16.16，15.98，13.91，13.08，12.36。化合物A-5的¹H-NMR谱示于图8中。

在以下实施例中，以与先前实施例相似的方式进行的合成出于简洁的原因而如此记录。除非另有说明，在所述合成中使用的胺是市售的，其为游离碱形式或盐酸盐形式。若以盐酸盐的形式得到，则游离碱如下产生：将盐酸盐溶于甲醇中，用过量的固体碳酸钠处理，过滤，通过旋转蒸发仪除去甲醇，然后在高真空下干燥。

实施例8：化合物A-6

化合物A-6以与化合物A-5相似的方式使用2-(吡啶-3-基)乙胺来制备。MS(m/z)：C₃₉H₅₄N₂O₆计算值646.4；观测值647.4(M+H⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.44，164.02，156.52，150.14，147.85，144.69，140.12，139.05，136.38，136.24135.39，134.33，130.77，129.46，128.340，127.68，125.41，123.54，121.65，121.00，78.64，73.54，61.54，46.89，45.70，44.05，41.84，40.73，33.37，33.06，32.28，30.08，20.70，20.37，16.18，15.92，13.88，13.09，12.82。化合物A-6的¹H-NMR谱示于图9中。

实施例9：化合物A-7

化合物A-7以与化合物A-5相似的方式使用2-吗啉代乙胺来制备。MS(m/z)：C₃₈H₅₈N₂O₇计算值654.4；观测值655.4(M+H⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.45，164.02，156.62，144.70，139.95，139.03，136.29，135.34，130.81，129.48，128.33，127.75，125.40，121.65，121.15，78.65，74.11，66.88，61.55，57.44，53.32，46.56，45.61，43.98，40.73，37.19，33.10，32.29，30.08，20.72，20.37，16.17，16.01，13.86，13.08，12.41。化合物A-7的¹H-NMR谱示于图10中。

实施例10：化合物A-8

化合物A-8以与化合物A-5相似的方式使用N¹，N¹-二乙基乙-1，2-二胺来制备。MS(m/z)：C₃₈H₆₀N₂O₆计算值640.5；观测值641.5(M+H⁺)。¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.52，164.02，156.74，144.70，139.70，139.04，136.27，135.35，130.80，129.46，128.34，127.74，125.40，121.45，121.31，78.66，74.18，61.46，51.87，46.75，46.50，45.61，43.96，40.72，38.41，33.09，32.28，30.07，20.71，20.36，16.17，15.98，13.91，13.08，12.30，11.51。化合物A-8的¹H-NMR谱示于图11中。

实施例11：化合物A-9

将2-(4-氟苯基)乙胺(13μL，0.09923mmol，4.02当量)和乙酸(3μL，0.053mmol，2.15当量)加到24-酰基咪唑Leptolstatin(14.6mg，0.02466mmol，1当量)于1mL无水四氢呋喃中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌3h。将反应混合物直接加载到硅胶色谱柱(5-40％丙酮/己烷梯度)上用于纯化，得到9.6mg化合物A-9。MS(m/z)：C₄₀H₅₄NO₆计算值663.4；观测值686.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.49，164.03，162.84，160.41，156.55，144.71，140.00，139.03，136.29，135.34，134.41，130.80，130.20，130.13，129.48，128.33，127.75，125.40，121.64，121.08，115.48，115.26，78.65，74.16，61.54，46.51，45.61，43.94，42.23，40.73，36.63，35.38，33.09，32.28，30.07，20.72，20.36，16.16，16.00，13.87，13.08，12.34。化合物A-9的¹H-NMR谱示于图12中。

实施例12：化合物A-10

化合物A-10以与化合物A-9相似的方式使用2-甲氧基乙胺来制备。MS(m/z)：C₃₅H₅₃NO₇计算值599.4；观测值622.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.52，164.02，156.67，144.69，139.88，139.04，136.28，135.34，130.81，129.47，128.34，127.75，125.40，121.66，121.15，78.66，74.19，71.43，61.57，58.74，46.49，45.61，43.94，40.73，33.09，32.29，30.07，29.68，20.71，20.36，16.16，15.99，13.90，13.08，12.28。化合物A-10的¹H-NMR谱示于图13中。

实施例13：化合物A-11

化合物A-11以与化合物A-9相似的方式使用2-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)乙胺来制备。MS(m/z)：C₃₉H₅₆N₂O₇计算值664.4；观测值665.4(M+H⁺)和687.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.45，165.85，164.05，159.62，156.58，144.73，140.12，139.03，136.28，135.35，130.80，129.49，128.34，127.75，125.40，121.63，120.95，110.57，78.65，74.08，61.62，46.58，45.62，43.95，40.73，40.61，33.08，32.28，30.08，22.28，20.72，20.36，16.16，15.98，13.86，13.09，12.42，10.90，10.13。化合物A-11的¹H-NMR谱示于图14中。

实施例14：化合物A-12

化合物A-12以与化合物A-9相似的方式使用(4-氟苯基)甲胺来制备。MS(m/z)：C₃₉H₅₂FNO₆计算值649.4；观测值672.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.44，164.09，163.30，160.86，156.69，144.84，140.06，139.02，136.26，135.33，134.46，130.78，129.46，129.15，129.07，128.32，127.73，125.38，121.53，120.98，115.48，115.26，78.66，74.08，61.73，46.66，45.61，44.28，43.98，40.71，33.11，32.26，30.03，20.70，20.34，16.15，15.98，13.76，13.06，12.51。化合物A-12的¹H-NMR谱示于图15中。

实施例15：化合物A-13

化合物A-13以与化合物A-5相似的方式使用1-(2-氨基乙基)吡咯烷-2-酮来制备。MS(m/z)：675.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.42，176.08，164.03，156.88，144.73，139.77，139.01，136.21，135.35，130.74，129.43，128.36，127.66，125.38，121.59，121.12，78.63，73.69，61.55，47.59，46.77，45.61，44.03，42.51，40.69，38.95，33.00，32.24，30.84，20.67，20.33，18，03，16.03，16.15，15.87，13.78，13.05，12.68。

实施例16：化合物A-14

向24-酰基咪唑Leptolstatin(190mg，0.3204mmol，1当量)于5mL无水四氢呋喃中的溶液中加入2-(咪唑-1-基)-乙胺(142mg，1.281mmol，4当量)和乙酸(90.7μL，1.6023mmol，5当量)。将反应混合物在室温搅拌5小时。将反应混合物直接加载到硅胶柱(2-6％甲醇/二氯甲烷)上用于纯化，得到102mg化合物A-14。MS(m/z)：观测值636.4(M+H⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.40，164.09，156.72，144.90，140.23，139.01，137.41，136.12，135.41，130.70，129.40，128.42，127.55，125.38，121.48，120.80，118.86，78.65，72.93，61.71，47.41，46.43，45.74，44.19，，41.68，40.68，33.09，32.22，30.01，20.64，20.33，16.20，15.86，13.65，13.51，13.04。

实施例17：化合物A-15

化合物A-15以与化合物A-14相似的方式使用(5-甲基异噁唑-3-基)甲胺来制备。MS(m/z)：659.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.41，169.88，164.06，161.62，156.65，144.83，140.15，138.99，136.25，135.32，130.75，129.45，128.31，127.71，125.40，121.54，120.84，100.85，78.64，74.04，61.91，46.67，45.60，43.98，40.70，36.91，33.09，32.24，30.03，20.69，20.34，16.14，15.97，13.75，13.06，12.53，12.21。

实施例18：化合物A-16

化合物A-16以与化合物A-14相似的方式使用吡啶-2-基甲胺来制备。MS(m/z)：655.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.36，164.02，157.22，156.78，149.04，144.82，139.85，138.98，136.71，136.20，135.33，130.72，129.42，128.34，127.67，125.40，122.25，121.63，121.51，121.08，78.62，74.05，61.70，46.74，46.03，45.59，44.03，40.69，33.12，32.23，30.01，20.68，20.33，16.15，15.96，13.71，13.05，12.60。

实施例19：化合物A-17

化合物A-17以与化合物A-5相似的方式使用(R)-3-氨基丙-1，2-二醇来制备，不同的是所使用的溶剂为THF(四氢呋喃)/DMF(二甲基甲酰胺)(1mL∶1mL)。MS(m/z)：638.4(M+H⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.49，164.26，157.96，145.00，140.15，139.06，136.30，135.34，130.84，129.45，128.27，127.72，125.32，121.51，120.91，78.75，73.57，71.17，63.75，61.96，47.00，45.71，44.10，43.27，40.71，33.10，32.27，30.04，20.71，20.35，16.16，15.96，13.65，13.08，13.08。

实施例20：化合物A-18

化合物A-18以与化合物A-4相似的方式来制备。在这种情况下，化合物A-1用作起始物质，其与异氰酸三氯乙酰基酯(2.5当量)反应。MS(m/z)：740.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，211.75，164.08，156.80，155.88，155.41，144.86，141.40，139.00，138.16，136.30，135.26，130.87，129.52，128.51，128.24(2x)，127.85(3x)，127.11，125.33，121.55，119.59，78.90，76.48，63.61，46.77，46.64，45.38，44.38，40.76，32.67，32.53，30.13，20.84，20.35，16.02，15.98，14.19，13.15，12.82.

实施例21：化合物A-19

化合物A-19以与化合物A-5相似的方式使用噻唑-2-基甲胺作为胺来制备。MS(m/z)：661.3(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.28，168.32，163.97，156.47，144.74，142.33，140.11，138.89，136.13，135.23，130.65，129.34，128.23，127.59，125.28，121.42，120.70，119.23，78.54，73.88，61.93，46.65，45.50，43.92，42.39，40.59，33.00，32.14，29.92，20.59，20.24，16.06，15.88，13.62，12.96，12.55。

实施例22：化合物A-20

化合物A-20以与化合物A-4相似的方式来制备。在这种情况下，化合物A-19用作起始物质，其与异氰酸三氯乙酰基酯(1.2当量)反应。MS(m/z)：704.3(M+Na⁺)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，7.70(d，J＝3.2Hz，1H)，7.28(d，J＝3.2Hz，1H)，6.91(dt，J＝9.6，4.4Hz，1H)，6.69(d，J＝15.6Hz，1H)，6.05(d，J＝9.6Hz，1H)，6.02(d，J＝15.6Hz，1H)，5.72(dd，J＝15.6，7.2Hz，1H)，5.57(dt，J＝15.6，6.8Hz，1H)，5.49(br，1H)，5.31(t，J＝6.4Hz，1H)，5.26(d，J＝10Hz，1H)，5.09(d，J＝9.6Hz，1H)，5.01(dd，J＝8.8，2Hz，1H)，4.95(q-like，J＝7.6Hz，1H)，4.72(br，2H)，4.68(d，J＝6Hz，2H)，4.63(m，2H)，3.66(m，1H)，2.93(m，1H)，2.65(m，1H)，2.46(m，2H)，2.06(m，3H)，1.83(s，3H)，1.82(s，3H)，1.66(m，1H)，1.64(s，3H)，1.13(d，J＝6.8Hz，3H)，1.10(d，J＝6.4Hz，3H)，0.96(d，J＝6.4Hz，3H)，0.67(d，J＝6.4Hz，3H)。

实施例23：化合物A-21

化合物A-21以与化合物A-14相似的方式使用(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲胺来制备。MS(m/z)：701.4(M+H⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.42，164.05，161.48，156.79，146.08(d，J＝4Hz)，144.78，140.18，139.01，136.27，135.32，133.86(d，J＝3Hz)130.78，129.46，128.31，127.73，125.37，125.32(q，J＝66Hz)，121.57，121.30，120.88，78.65，74.04，61.92，46.64，46.01，45.61，43.98，40.71，33.11，32.26，30.04，20.69，20.33，16.14，15.99，13.77，13.06，12.49.

(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲胺(VI)如下制备：将碳酸氢钠(0.25g)和钯/碳(0.5g，50％水分，10％Pd/C)加到(3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲胺盐酸盐(V)的甲醇溶液(0.5g于50mL甲醇中)中。将混合物在氢气气囊下氢化3h。将反应混合物过滤，然后真空蒸发。将残余物再次溶于甲醇(5mL)中，再次过滤，然后再次蒸发，得到粗产物(VI)(0.33g)。¹H-NMR(CD₃OD，400MHz)：δ8.92(s，1H)，8.16(d，J＝8.2Hz，1H)，7.66(d，J＝8.2Hz，1H)，4.35(s，2H)。

实施例24：化合物A-22

化合物A-22以与化合物A-14相似的方式使用(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲胺来制备。MS(m/z)：723.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.42，164.07，156.75，149.08，147.00(q，J＝34.5Hz)，144.81，140.40，138.99，137.79，136.39，136.25，135.28，130.77，129.44，128.25，127.70，125.31，121.49，120.65，120.27，78.63，73.97，62.00，46.62，45.59，43.91，42.09，40.68，33.07，32.22，30.01，20.66，20.29，16.09，15.95，13.76，13.02，12.45。

实施例25：化合物A-23

化合物A-23以与化合物A-14相似的方式使用(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲胺来制备。MS(m/z)：723.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.46，164.02，158.33，156.72，147.57(q，J＝35Hz)，144.73，140.18，138.98，138.04，136.25，135.29，130.76，129.43，128.28，127.71，125.36，124.46，121.55，120.88，118.93，78.62，74.13，61.86，46.51，45.80，45.57，43.91，40.68，33.07，32.23，30.01，20.66，20.30，16.10，15.96，13.82，13.03，12.30。

实施例26：化合物A-24

化合物A-24以与化合物A-14相似的方式使用(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲胺来制备。MS(m/z)：701.4(M+H⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.45，164.04，159.25，156.76，150.17，144.77，140.19，139.01，138.97(q，J＝68Hz)，136.25，135.33，130.77，129.45，128.32，127.72，125.38，121.57，120.88，117.91，117.17，78.65，74.09，61.93，46.62，46.05，45.61，43.96，40.70，33.11，32.26，30.04，20.68，20.33，16.14，15.98，13.78，13.05，12.43。

实施例27：化合物A-25

化合物A-25以与化合物A-14相似的方式使用(3-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲胺来制备。MS(m/z)：723.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)，215.53，164.02，156.55，154.22，151.50，144.72，139.92，139.03，136.28，135.34，134.22，134.17，130.80，129.45，128.34，127.74，125.40，124.36，124.04，123.71，123.38，122.14，121.87，121.62，121.15，78.66，74.21，61.77，46.50，45.61，43.96，43.07，40.71，33.10，32.27，30.05，20.69，20.34，16.15，16.00，13.90，13.07，12.27。

实施例28：化合物IV

将异氰酸三氯乙酰基酯(125μL，1.054mmol，2.5当量)加到24-酰基咪唑Leptolstatin(250mg，0.4216mmol，1当量)于3mL CH₂Cl₂中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌30分钟，然后加载到中性Al₂O₃柱上并在柱上保持过夜。用甲醇将产物从柱中洗脱，然后经硅胶柱色谱(3-4％MeOH/CH₂Cl₂梯度)纯化。得到化合物IV(100mg)产物。MS(m/z)：564.4(M+Na⁺)。¹³C NMR(100MHz，CDCl³)，δ(ppm)，211.80，164.14，157.13，144.95，139.05，136.89，136.38，135.26，130.95，129.5，128.52，127.93，126.15，125.31，121.54，79.02，75.52，59.13，46.93，45.39，44.73，40.80，32.65，32.52，30.15，20.93，20.36，15.93，15.50，14.27，13.29，13.19。

实施例29：核输出阻断

本发明化合物的核输出阻断能力如下评价：

将1-5×10⁴个细胞接种到12mm玻璃盖玻片上或接种到腔室载玻片(chamber slide)(例如Lab-Tek#177445)的孔中。使细胞在37℃生长过夜，从而使细胞贴附于表面。除去培养基，然后用含有所期望测试化合物的培养基代替，并孵育所需要的时间段(通常1h)。对于恢复实验(recoveryexperiment)，细胞用PBS或培养基洗涤，然后在不含测试化合物的培养基中孵育所期望的恢复时间段(recovery period)(通常8、24或48h)。除去培养基，然后盖玻片/孔(盖玻片或孔)用PBS(pH 7.4)洗涤1分钟。盖玻片或载玻片在室温用3.7％甲醛于PBS中的溶液固定20分钟，在PBS中洗涤三次，然后针对CRM1底物RanBP1进行染色。

对盖玻片或腔室载玻片进行透化处理(permeabilize)，然后在室温历时30分钟在10％驴血清和0.1％Triton X-100于PBS中的溶液中进行阻断。将第一抗体稀释在PBS中，然后在室温孵育1小时：山羊抗RanBP1(Santa CruzBiotechnology，sc-1160；1∶50稀释度)和小鼠抗微管蛋白(Sigma，T9026；1∶400)。将细胞在PBS中洗涤(3×5分钟)。将第二抗体驴抗山羊Cy3(705-165-147，Jackson Immunoresearch)和驴抗小鼠FITC(715-095-150，Jackson Immunoresearch)以1∶200稀释在PBS中，然后在室温孵育1小时。除去第二抗体，并且细胞在室温用核染料(nuclear dye)如DAPI(Sigma，D8417；2.5μg/mL于PBS中)或Hoechst 33342(Molecular Probes，H3570；100ng/mL于PBS中)染色5分钟。将细胞在PBS中洗涤(3×5分钟)，并且盖玻片用FluorSave(EMD Biosciences，80058-108)固定。RanBP1的细胞核(N)定位或细胞质(C)定位在Zeiss Axiovert 200倒置落射荧光显微镜(invertedepiflourescence microscope)上使用40×物镜来检查。在初始给药阶段后确认细胞核定位(N＞C)。“恢复”如下定义：快速恢复(在8h时C≥N)、中速恢复(在24h时C≥N)或慢速恢复(在24h时N＞C)。

结果示于表B中，其中包括有关天然产物细霉素A、细霉素B和Leptolstatin的对比数据。可从结果中看出的是，核输出阻断的持续时间是可变的，这取决于测试化合物。

实施例30：生物活性

本发明化合物的生物活性通过测量其对各种肿瘤细胞系增殖的抑制作用来评价。结果(包括有关细霉素A、细霉素B和Leptolstatin的对比数据)列于表C中。HCT-116为人结肠癌细胞系。LNCap为人***癌细胞系。SiHa为HPV-16阳性人子***系。

表D提供了有关化合物A-1和A-4对抗各种细胞系的活性的额外数据。在一些情况下也提供了有关细霉素B(LMB)和/或化合物VI(Dong et al.，US2005/0272727A1(2005)的对比数据。

所测试的额外细胞系代表各种不同的癌症：膀胱癌(UM-UC-3)、乳癌(BT474、HCC 1937、MDA-MB468、NCI-ADR)、CNS癌(U87MG(胶质瘤)、SKNSH(成神经细胞瘤))、结肠癌(LoVo、LS411N、LS513)、头颈癌(CAL-27、FaDu)、白血病(CCRF-CEM、MOLT-4)、肝癌(HepG2)、肺癌(A549、NCI-H23、NCI-H358)、黑素瘤(Colo829)、卵巢癌(OVCAR-4)、胰腺癌(BxPC-3、Mia-PaCa2)、***癌(22Rv1、PC-3)和肾癌(A-498、Caki-1)。

总之，表C和D中的数据显示，本发明化合物就治疗各种癌症而言是有效的，这些癌症即膀胱癌、乳癌、子***、CNS癌、结肠癌、头颈癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌和肾癌。

前面对本发明的详细描述包括主要或专门涉及本发明具体部分或方面的段落。应该理解的是，这是为了清楚和方便，并且具体的特征可以不只是与将其公开的段落相关，并且本申请公开的内容包括不同段落中存在的信息的所有适当组合。相似地，尽管本申请的各种附图和描述涉及本发明的特定实施方案，但应该理解的是，当特定的特征披露于具体附图或实施方案的上下文中时，所述特征也可在适当的程度上用于另一附图或实施方案的上下文中，用于与另一特征组合，或一般性地用于本发明中。

此外，尽管已就某些优选的实施方案具体描述了本发明，但本发明不限于所述优选的实施方案。相反地，本发明的范围通过所附的权利要求书来定义。