CN101705218A - 一种蛋白酶、该蛋白酶的制备方法及其应用和药用剂型 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白酶、该蛋白酶的制备方法及其应用和药用剂型，从具有吐丝结茧能力的昆虫在羽化前分泌的吐出液中分离、提取出一种蛋白酶。这种具有纤溶活性的蛋白酶，具备生物活性高、稳定性良好等特点。该蛋白具有强烈的精氨酸酯酶活力，能够降解纤维蛋白原中的Aa Bb r 链，从而对纤维蛋白以及纤维蛋白原有降解作用。由于该类蛋白酶具有降解动物及人类血栓的功效，并且对释放出的血细胞不造成损伤等特点，将成为一种新的用于治疗血栓相关疾病的溶栓类药物。

Description

一种蛋白酶、该蛋白酶的制备方法及其应用和药用剂型

技术领域

本发明涉及昆虫、酶学、医药等领域，是来自柞蚕蛹羽化时分泌的一种具有纤溶酶活性的蛋白酶的提取方法、溶血栓作用、基因的序列和编码的氨基酸序列，以及在临床上治疗人类血栓性疾病的应用等。

背景技术

血栓栓塞性疾病目前已成为发达国家人类疾病死亡的首要原因。在我国随着人们生活水平的不断提高，心脑血管疾病的发病率呈逐年上升趋势，据不完全统计，每年约有200万人死于心脑血管疾病。

目前，血栓栓塞性疾病主要治疗手段有三种：第一，采用外科手术清除血栓或切除栓塞部位的血管而用“人造血管”桥接或取代等，如心肌梗塞。此法操作复杂，费用高，且术后易出现再栓塞；第二，采用长期服用抗凝剂，降低凝血倾向的保守疗法。此法属于辅助治疗方法；第三，药物溶栓法，即注射溶栓剂使血管再通。与保守疗法相比，治疗后两周内死亡率显著降低，而且费用比外科手术低得多。因此，以溶栓法治疗人类血栓疾病是最具应用前景的治疗方法。

治疗血栓性疾病的药物主要来源，包括动物、植物、微生物等。例如，1951年Willams首次从人尿及肾组织培养物中提取出尿激酶(Urokinase，UK)，属纤溶酶原激活剂。从蚯蚓体腔液中获取的蚓激酶(Limbrokinase)。这些酶类多数具有直接溶解纤维蛋白和纤溶酶原激活的双重功效；1955年首例应用于临床的溶栓药物——链激酶(Streptokinase，SK)来源于微生物，是溶血性链球菌分泌的一种单链胞外蛋白；而某些海藻的植物血凝素能抑制血小板的聚集、褐藻内皮细胞中的岩藻甾醇能够产生纤溶酶原激活剂等。

目前，溶栓药物已发展了三代，有效地降低了心脑血管疾病的死亡率和致残率。然而，现有的溶栓药物仍存在着一些缺点：①缺乏溶栓特异性；②出血副作用强；③半衰期短；④用药剂量难以控制；⑤易出现再栓塞；⑥出现抗性反应。因此，临床治疗中急需寻找一种更有效、安全、廉价的新型溶栓药物。

一些具有营丝结茧能力的昆虫(如柞蚕)在羽化时能够合成和分泌一类蛋白酶，用以溶解茧壳中的丝胶蛋白，完成羽化过程。因此推测这类蛋白酶可能具有纤溶酶的活性，有可能成为开发新的抗血栓药物的资源。在柞蚕中，这种蛋白酶的分离纯化、酶活性分析鉴定及在溶血栓上的作用尚没有研究报道。

发明内容

为开发新的抗血栓药物，本发明的目的是研究并确认从柞蚕蛹羽化成蛾时的吐出液中首次纯化得到一种具有降解纤维蛋白作用的蛋白酶和它在溶血栓上的新用途，同时还提供该蛋白酶的分离纯化方法、基因的序列和编码的氨基酸序列、在临床上治疗人类血栓性疾病的应用。

本发明技术方案包括：收集柞蚕蛹羽化时分泌的吐出液，用缓冲液0.02mol/L HAC-NaAC(pH6.0)调整pH至6.0，12000r/min离心10min，取上清备用，纯化时，取上清用阳离子柱(HiTrap^TMSP-FF)进行纯化。每次纯化的量通常为2ml，如果上清不足2ml，可用缓冲液0.02mol/L HAC-NaAC，pH6.0补足至2ml。蛋白质凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果显示纯化的蛋白酶的分子量约为24000道尔顿。用纤维蛋白平板法对纯化的蛋白酶纤溶酶活性进行测定，结果显示该蛋白酶在pH值7～9.5范围有较高的纤溶酶活力，最适pH＝8.0；而当pH＜7.0时，其酶活力迅速下降至50％以下。

对纤维蛋白原水解活性进行测定，结果显示纯化的蛋白酶可以直接水解纤维蛋白原，有效地水解纤维蛋白原的Aα-链和Bβ-链，孵育4小时后，对γ-链也有明显的降解作用。

利用昆明鼠体外血栓模型进行蛋白酶的体外溶栓试验，结果表明该蛋白酶具有较好的溶栓活性，溶栓率达到92.9％，且显微镜下观察对释放出的血细胞没有损伤。

我们对该蛋白酶进行了N端氨基酸序列分析，结果表明该蛋白酶含有IVGGYSVTIDKAPYQ氨基酸序列。进一步的基因克隆和DNA序列分析表明，该蛋白酶是由一个含有786bp的基因编码的。完整的基因共编码一个含有261个氨基酸的蛋白质，推测拥有酶活性部分的蛋白酶是由228个氨基酸组成，理论上的分子量为23858.91道尔顿，与纯化的蛋白酶的分子量接近；其中包含IVGGYSVTIDKAPYQ氨基酸序列，与蛋白质的N端氨基酸测序结果相一致。本发明要求保护的柞蚕(Antheraeapernyi)体内提取蛋白酶完整的基因序列为：

ATGTACAAGTATTATTTTTTACTATTGGCTTGTGCCATTTTTTGGAAAGATGGTAGC

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GTCACAGCACTCCGTGGTTGGATACGAAAGACTGCAGGAGTTTAA

根据上述基因序列推测该蛋白酶完整的氨基酸序列：

mykyyflllacaifwkdgsckkssqrtndvggk

黑体大写字母部分为推测的纯化的蛋白酶的氨基酸序列。

这种蛋白酶的获得既包括通过分离手段直接从昆虫中分离提取，也包括通过分子生物学技术手段在植物、动物和微生物体中表达产生的产物，以及通过化学方法人工合成的产物。例如也可以延伸到从其它种类的鳞翅目昆虫中分离提取的蛋白。

其在体外、体内溶解血栓纤维蛋白的生物学作用可以各种药物制剂的形式应用于人类血栓类疾病的预防与治疗，这些制剂主要包括粉针剂、口服等剂型。

通过对剂型、赋形剂进行研究、筛选，获得了在临床上应用和在药学上可接受的最佳制剂为粉针剂，每瓶含0.2mg柞蚕蛋白酶，90mg右旋糖酐-40。

本发明首次从柞蚕蛹羽化时的吐出液中分离纯化了一种蛋白酶，推测是由228个氨基酸组成，理论分子量为23858.91道尔顿。这种蛋白酶具有纤溶酶活性，并且在体外能够溶解血栓。本发明还提供了该蛋白酶的分离纯化方法，纤溶酶活性的分析方法，溶血栓作用的分析方法，基因克隆的方法。同时还提供了基因的全序列及编码的氨基酸序列，以及在临床上的应用和在药学上可接受的制剂。这种具有纤溶活性的蛋白酶，具备生物活性高、稳定性良好等特点。该蛋白具有强烈的精氨酸酯酶活力，能够降解纤维蛋白原中的Aa Bb r链，从而对纤维蛋白以及纤维蛋白原有降解作用。由于该类蛋白酶具有降解动物及人类血栓的功效，并且对释放出的血细胞不造成损伤等特点，将成为一种新的用于治疗血栓相关疾病的溶栓类药物。

附图说明

附图1纯化的蛋白酶的凝胶电泳结果，分子量约为24000道尔顿

附图2蛋白酶降解纤维蛋白原的凝胶电泳分析

附图3蛋白酶作用活性的最适pH测定

附图4抑制剂及金属离子对蛋白酶活性的影响凝胶电泳分析

附图5蛋白酶的体外溶血栓作用

附图6蛋白酶对细胞影响的显微镜观察

具体实施方式

以下通过具体实施例做进一步的说明：

实施例一：蛋白酶的分离制备

柞蚕(Antheraea pernyi)属于鳞翅目(Lepidoptera)天蚕蛾科(Saturniidae)，是主要在我国北方地区野外放养的一种经济昆虫，其茧丝用于缫丝纺织，蚕蛹可以食用。本发明中所使用的实验材料即为市场所售的活柞蚕蛹。取柞蚕蛹，在25℃条件下进行孵育至羽化出蛾，收集下颚腺吐出液。取吐出液，置于离心管中，用缓冲液0.02mol/L HAC-NaAC(pH6.0)调整pH至6.0，12000r/min离心10min，取上清备用(样品如不足2ml，可用缓冲液0.02mol/LHAC-NaAC，pH6.0补足至2ml).先用双蒸水清洗阳离子交换柱(HiTrap^TMSP-FF)，再用5倍柱体积的Binding Buffer(0.02mol/L HAC-NaAC，pH6.0)进行平衡，流速为2ml/min。取样品2ml进行上样，然后用Elution Buffer(0.02mol/LHAc-NaAC，1mol/L NaC L pH6.0)进行线性梯度洗脱，流速为2ml/min。当柱内电导达到8.8时，收集洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳检验，结果显示纯化产物的分子量约为24000道尔顿，见附图1。

实施例二：蛋白酶的纤溶酶活性分析及酶学性质测定

1、对纤维蛋白原的降解及其纤溶酶活性的测定

(1)、对纤维蛋白原的降解

取0.2％人纤维蛋白原(0.1mol/L Tris-HCL，pH 8.0)溶液与纯化后的蛋白酶各10微升，混合后在37℃培育0、0.5、1、2、3、4、8、16、24小时，加入变性剂(10M尿素，4％SDS，4％2-巯基乙醇)中止反应，用SDS-PAGE进行测定。如图2，所示，柞蚕蛋白酶能有效地水解纤维蛋白原的Aα-链和Bβ-链，而对γ-链的水解活性较弱。用Bandscan软件经过计算所得的结果如图3.4所示，柞蚕蛋白酶首先水解纤维蛋白原的Aα-链，在2小时内即可水解90％以上，对于Bβ-链的水解需要4个小时达到90％，而对γ链的水解则要等到6h后降解90％，见附图2。

(2)、纤溶酶活性的测定(纤维蛋白平板法)

依据Astrup和Deogny法进行纤溶活性的测定。具体过程如下，将1％琼脂糖凝胶(50mM Tris-HCL，pH7.5，100mMNaCL)9ml溶化，待液体降温到37-42℃时加入0.2％人纤维蛋白原(0.1mol/L Tris-HCL，pH 8.0)1ml，倒入10-cm Petri平皿中，再加入0.2ml人凝血酶(100NIH U/mL，0.1mol/L Tris-HCL，pH8.0)，室温静置1h使其凝结。加10μl纯化后的蛋白酶溶液于平板小孔中，37℃孵育24h，测量水解圈的直径。用不同浓度梯度的标准尿激酶，以其溶圈面积(cm²)做为活力大小，绘制标准曲线。柞蚕蛋白酶的纤溶活力依据其在纤维蛋白平板上的溶圈大小，与标准曲线相比较，计算纤溶活力。结果表明柞蚕蛋白酶的纤溶活力相对于标准尿激酶约为487.2U/mg(UK)。

2、蛋白酶最适温度、pH的测定

(1)、蛋白酶最适温度测定

配制柞蚕蛋白酶提取液，浓度为0.1mg/ml(0.1mol/L Tris-HCL，pH 8.0)，置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃恒温水浴中孵育，每隔30min依次取样，以上述纤维蛋白平板法分别测定其在不同温度条件下残余的酶活力。每一样品均测量三次，然后取平均值。发现此柞蚕蛋白酶对温度的适应性较强，适应范围在25-35℃之间，在此温度范围内，始终保持有较高的水解底物的活力。当温度低于20℃或高于40℃时，其酶活力迅速降至50％以下；温度高于50℃时，基本失活。这表明，此柞蚕蛋白酶对热变化具有较好的耐受能力，是一种热稳定酶。

(2)、蛋白酶最适pH测定

取20微升浓度为0.1mg/ml(0.1mol/L Tris-HCL，pH 8.0)蛋白酶液，分别加入到180微升0.1mol/L Tris-HCL，pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5的溶液中，在37℃进行孵育30分钟。取10μl加于活性测定平板小孔中，以上述纤维蛋白平板法分别测定其酶活力，发现在pH7.0～9.5范围内，此酶都保持有较高的酶活力，其最适pH为8.0。说明柞蚕蛋白酶为一种较适应弱碱性pH的蛋白酶，见附图3。

3、蛋白酶抑制剂及金属离子对蛋白酶活性的影响

(1)、金属离子抑制剂对于蛋白酶活性的影响。

在100微升的2％人纤维蛋白原溶液中分别加入10微升0.1mg/ml蛋白酶溶液(0.1mol/L Tris-HCL，pH 8.0)，同时分别加入7种金属离子(Fe⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，K⁺，Cu²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺)，最终浓度为10mM，以不加金属离子为对照，将各组混合好的样品在37℃培育，分别在4小时和24小时取各组样品进行SDS-PAGE电泳测定。结果经过Bandscan软件进行分析表明，Fe²⁺和Cu²⁺离子是该酶的强抑制剂，可以明显降低蛋白酶的溶纤活力，而Ca²⁺，K⁺则轻微抑制酶活，Mg²⁺，Mn²⁺离子对于酶活的影响并不显著，见附图4。

(2)、蛋白酶抑制剂对于蛋白酶活性的影响

在100微升的2％人纤维蛋白原溶液中分别加入10微升0.1mg/ml蛋白酶溶液(0.1mol/L Tris-HCL，pH 8.0)，同时分别加入4种蛋白酶抑制剂10微升(0.1mM PMSF，1mM DTT，10mMβ-ME，10mM EDTA)，不加抑制剂为对照，将各组混合好的样品在37℃培育。分别在4小时和24小时取样进行SDS-PAGE电泳测定。结果表明，柞蚕蛋白酶的活性能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF显著抑制，表明此酶为丝氨酸蛋白酶家族。该酶可被半胱氨酸还原性变性剂DTT显著抑制，但还原剂β-mercaptoethanol等对其酶活性无明显抑制作用，而金属离子螯合剂EDTA对其抑制作用不明显，说明该酶并非含金属酶。

实施例三：蛋白酶的体外溶血栓作用分析

1、溶栓作用检测

将昆明鼠用***麻醉后，心脏穿刺取血。待血液凝固后，切割成均匀的小块，称重。将血液凝块加入到0.5mL的柞蚕蛋白酶(0.02mmol/L NaAC-HAC)溶液中，以0.02mmol/L NaAC-HAC为对照，置37℃恒温水浴。每隔10min，轻微振荡，定时观察、记录、拍照。结果发现对照上部溶液较清，血栓溶解不明显，溶液中含有极少量的红细胞，柞蚕蛋白酶组中，上部溶液浑浊，血栓溶解明显，溶液中含有大量从血栓中溶解释放出来的细胞，见附图5。

2、溶栓效率检测

将昆明鼠用***麻醉后，心脏穿刺取血，制成实验性血栓。将血栓切割成相等的3份，称重后加500μL(0.173mg/mL，0.02mmol/LNaAC-HAC)柞蚕蛋白酶，以同体积的0.02mmol/L NaAC-HAC为对照，进行血栓溶解实验。37℃恒温水浴4h后小心地取出血栓，并用滤纸条轻轻吸干血栓表面水分后，称重，代入下面公式中计算血栓溶解率。

血栓溶解率＝(W-G)/W*100％

W试验前血栓重量

G试验后血栓重量

结果发现柞蚕蛋白酶处理中血栓的溶解率为92.9％，对照为5.4％。

3、酶对细胞损伤的显微镜观察

取出血栓后的液体，涂片后在显微镜下观察血细胞释放及形态变化情况。结果显示，柞蚕蛋白酶处理组细胞形态完整，与对照组比无差异。说明柞蚕蛋白酶对鼠血栓具有溶解作用的同时，对细胞无不良影响，见附图6。

实施例四：蛋白酶的N端氨基酸序列测定及基因克隆与序列分析

1、蛋白酶的N端氨基酸序列分析

将分离的样品经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转移到PVDF膜，按照Edman降解法进行蛋白质的氨基酸序列分析.通过与标准品进行比对分析，所测得的蛋白质N端的15个氨基酸序列为：IVGGYSVTIDKAPYQ

2、基因的克隆与序列分析

采集成熟柞蚕蛾羽化前2-3天上颚组织(约200mg)，用RNA提取试剂盒

Reagent(Invitrogen)提取总RNA，并用紫外可见分光光度计进行定量。约为360μg的总RNA用于分离mRNA，用mRNA分离试剂盒(Oligotex^TM-dT30<Super>mRNA Purification Kit，TaKaRa)进行mRNA的纯化并定量。取5μg的mRNA为模板，用cDNA文库试剂盒(cDNA LibraryConstruction Kit，TaKaRa)进行cDNA文库的建立。方法参照试剂盒的说明书，文库中最终的阳性转化率为78％。随机选取10个含有700bp以上片段大小的阳性克隆进行序列分析，结果有4个基因的序列中含有IVGGYSVTIDKAPYQ序列。进一步的序列对比分析结果证实，该蛋白酶由一个786bp的基因编码，共编码261个氨基酸，推测拥有酶活性部分的蛋白酶是由228个氨基酸组成，理论上的分子量为23858.91道尔顿。见附表1。

附表1：

ATGTACAAGTATTATTTTTTACTATTGGCTTGTGCCATTTTTTGGAAAGATGGTAGCTGTAAGAAAAGTAGTCAA

m  y  k  y  y  f  l  l  l  a  c  a  i  f  w  k  d  g  s  c  k  k  s  s  q

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L  A  V  N  V  P  T  L  S  V  A  E  C  K  K  S  V  S  N  F  S  D  R  M  L

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C  A  G  V  S  Q  G  G  K  D  A  C  Q  G  D  S  G  G  P  A  V  S  N  N  V

CAATTGGGAGTTGTCTCATTTGGAAGTGGCTGTGCCCGTCCTGGAAACCCTGGTGTATATGCAAATGTCACAGCA

Q  L  G  V  V  S  F  G  S  G  C  A  R  P  G  N  P  G  V  Y  A  N  V  T  A

CTCCGTGGTTGGATACGAAAGACTGCAGGAGTTTAA

L  R  G  W  I  R  K  T  A  G  V  ＊

实施例五：临床应用剂型

取0.1mg/ml蛋白酶溶液(0.1mol/L NaAC-HAC，pH 8.0)，分别加右旋糖酐-40使成不同浓度(15、30、45、60mg/ml)，分别分装在西林瓶中，每瓶2ml，高度约为0.8cm，放置冻干箱中，预冻至-20℃保持3小时，待样品温度达-30℃时，开始真空泵抽真空升华干燥，约15h，真空度≤20Pa，30℃再干燥5h，封盖即得.冻干过程中，真空度保持不变，凝结器保持-40℃，干燥至残留水分≤5.0％.进行冻干操作，对冻干后样品检查外观性状和制剂溶解性.试验结果表明，右旋糖酐-40的用量在45mg/ml时，制剂的成型和溶解性最好，从而确定处方中右旋糖酐-40的使用量为45mg/ml，即90mg/瓶(附表2).

表2蛋白酶冻干赋形剂右旋糖酐-40用量筛选试验结果

右旋糖酐-40(mg/ml)	15	30	45	60
					外观性状	塌陷	松散块状	疏松块状	块状
制剂溶解性	溶解	易溶	易溶	溶解

SEQUENCE LISTING

<110>辽宁省农业科学院大连生物技术研究所

<120>一种蛋白酶、该蛋白酶的制备方法及其应用和药用剂型

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>786

<212>DNA

<213>柞蚕(Antheraea pernyi)

<400>1

atgtacaagt attatttttt actattggct tgtgccattt tttggaaaga tggtagctgt     60

aagaaaagta gtcaaagaac gaatgatgtt ggggggaaaa ttgttggcgg atacagcgtt    120

acaatcgata aagctcctta ccaagcgtac ttgcttttag aaaagggtaa ggagtattac    180

caatgtgggg gatccatcat cagcaaaagg catattttaa ccgctgctca ttgtcttgtt    240

gataatatat cacaagtaca cgcaagagtt ggtagtacga ataacgataa aggcggtaaa    300

gtgtattcga ccaaatcgat gactatacac cccaattata attctcgaac ttacgattat    360

gatgtggcta ttttgacatt ctcacaagat atagcaatcg acggtgtcaa cactaaaatc    420

gtaacactac cgagtgaaaa caatggggct gtacctgcga agacaacatt atttgtcacc    480

ggttggggag ctacatcgga aggcggtgat tcctcaaaaa cattgttggc agttaatgtt    540

cctactctat ccgtagcaga atgcaaaaaa agtgtgtcaa acttttctga cagaatgctt    600

tgtgcaggcg tctctcaagg aggaaaagat gcttgccagg gagactctgg tggtccggct    660

gttagcaata atgtacaatt gggagttgtc tcatttggaa gtggctgtgc ccgtcctgga    720

aaccctggtg tatatgcaaa tgtcacagca ctccgtggtt ggatacgaaa gactgcagga    780

gtttaa                                                               786

<210>2

<211>261

<212>PRT

<213>柞蚕(Antheraea pernyi)

<400>2

MYKYYFLLLA CAIFWKDGSC KKSSQRTNDV GGKIVGGYSV TIDKAPYQAY

LLLEKGKEYY    60

QCGGSIISKR HILTAAHCLV DNISQVHARV GSTNNDKGGK VYSTKSMTIH

PNYNSRTYDY    120

DVAILTFSQD IAIDGVNTKI VTLPSENNGA VPAKTTLFVT GWGATSEGGD

SSKTLLAVNV    180

PTLSVAECKK SVSNFSDRML CAGVSQGGKD ACQGDSGGPA

VSNNVQLGVV SFGSGCARPG    240

NPGVYANVTA LRGWIRKTAG V    261

Claims (5)

1.一种蛋白酶，其完整的DNA序列为：

ATGTACAAGTATTATTTTTTACTATTGGCTTGTGCCATTTTTTGGAAAGATGGTAGCTGTAAGAAAAG

TAGTCAAAGAACGAATGATGTTGGGGGGAAAATTGTTGGCGGATACAGCGTTACAATCGATAAAGCTC

CTTACCAAGCGTACTTGCTTTTAGAAAAGGGTAAGGAGTATTACCAATGTGGGGGATCCATCATCAGC

AAAAGGCATATTTTAACCGCTGCTCATTGTCTTGTTGATAATATATCACAAGTACACGCAAGAGTTGG

TAGTACGAATAACGATAAAGGCGGTAAAGTGTATTCGACCAAATCGATGACTATACACCCCAATTATA

ATTCTCGAACTTACGATTATGATGTGGCTATTTTGACATTCTCACAAGATATAGCAATCGACGGTGTC

AACACTAAAATCGTAACACTACCGAGTGAAAACAATGGGGCTGTACCTGCGAAGACAACATTATTTGT

CACCGGTTGGGGAGCTACATCGGAAGGCGGTGATTCCTCAAAAACATTGTTGGCAGTTAATGTTCCTA

CTCTATCCGTAGCAGAATGCAAAAAAAGTGTGTCAAACTTTTCTGACAGAATGCTTTGTGCAGGCGTC

TCTCAAGGAGGAAAAGATGCTTGCCAGGGAGACTCTGGTGGTCCGGCTGTTAGCAATAATGTACAATT

GGGAGTTGTCTCATTTGGAAGTGGCTGTGCCCGTCCTGGAAACCCTGGTGTATATGCAAATGTCACAG

CACTCCGTGGTTGGATACGAAAGACTGCAGGAGTTTAA。

2.如权利要求1所述的蛋白酶的制备方法，包括：

收集柞蚕蛹羽化时分泌的吐出液，用缓冲液0.02mol/L HAC-NaAC(pH6.0)调整pH至6.0，12000r/min离心10min，取上清，用阳离子柱(HiTrap^TM SP-FF)进行纯化。

3.如权利要求1所述的蛋白酶用于人类血栓类疾病的预防与治疗。

4.如权利要求1所述的蛋白酶的剂型，为粉针剂。

5.如权利要求4所述的蛋白酶的剂型，所述的粉针剂每瓶含0.2mg柞蚕蛋白酶，90mg右旋糖酐-40。

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