JP7303369B2 - 腫瘍溶解性ウイルス、その使用、およびがんを治療する医薬品 - Google Patents
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Description
本開示は、2019年07月16日に中国特許庁に提出された出願番号2019106428044の「腫瘍溶解性ウイルス、その使用、およびがんを治療する医薬品」という名称の中国特許出願の優先権を主張するものであり、その内容のすべては本明細書に参照として取り込まれる。
腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに第2の制御エレメントがさらに挿入され、第2の制御エレメントに、細胞外トラクションシグナルペプチドをコードするための第2の核酸配列および特異的切断部位をコードするための第3の核酸配列が含まれ、特異的切断部位が、特異的プロテアーゼによって認識され、切断され、
第2の制御エレメントが、腫瘍溶解性ウイルスの必須遺伝子の5’末端に位置している。
特異的プロテアーゼがトロンビンである場合、特異的切断部位のアミノ酸配列がLVPRGSであり、
特異的プロテアーゼがXa因子プロテアーゼである場合、特異的切断部位のアミノ酸配列がIE/DGR(IEDGR or IDGR)であり、
特異的プロテアーゼがタバコエッチウイルスプロテアーゼである場合、特異的切断部位の配列がENLYFQGであり、
特異的プロテアーゼが組換えPreScissionプロテアーゼである場合、特異的切断部位の配列がLEVLFQGPである。
或いは、腫瘍溶解性ウイルスがアデノウイルスである場合、必須遺伝子は、初期タンパク質1A、初期タンパク質1B 19K、初期タンパク質1B 55K、カプセル化されたタンパク質Iva2、DNAポリメラーゼ、末端タンパク質前駆体pTP、カプセル化されたタンパク質52K、キャプシドタンパク質前駆体pIIIa、ペントンマトリックス、コアタンパク質pVII、コアタンパク質前駆体pX、コアタンパク質前駆体pVI、ヘキソン、プロテアーゼ、一本鎖DNA結合タンパク質、ヘキサマーアセンブリタンパク質100K、タンパク質33K、カプセル化されたタンパク質22K、キャプシドタンパク質前駆体、タンパク質U、フィブリン、調節タンパク質E4オープンリーディングフレーム6/7、調節タンパク質E4 34K、調節タンパク質E4オープンリーディングフレーム4、調節タンパク質E4オープンリーディングフレーム3、調節タンパク質E4オープンリーディングフレーム2および調節タンパク質E4オープンリーディングフレーム1から選択される1種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスがウシポックスウイルスである場合、必須遺伝子は、ヌクレオチド還元酵素小サブユニット、セリン/トレオニンキナーゼ、DNA結合ウイルスコアタンパク質、ポリメラーゼ大サブユニット、RNAポリメラーゼサブユニット、DNAポリメラーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、仮想的DNA結合ウイルス核タンパク質、DNA結合リンタンパク質、ウイルスコアシステインプロテアーゼ、RNAヘリカーゼNPH-II、仮想的メタロプロテアーゼ、転写伸長因子、グルタチオン様タンパク質、RNAポリメラーゼ、仮想的ウイルス核タンパク質、後期転写因子VLTF-1、DNA結合ウイルス核タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ小サブユニット、DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットrpo22、DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットrpo147、セリン/トレオニンプロテインホスファターゼ、IMVヘパリン結合性表面タンパク質、DNA依存性RNAポリメラーゼ、後期転写因子VLTF-4、DNAトポイソメラーゼ1型、mRNAキャッピング酵素大サブユニット、ウイルスコアタンパク質107、ウイルスコアタンパク質108、ウラシル-DNAグリコシラーゼ、トリホスファターゼ、初期遺伝子転写因子VETFの70 kDa小サブユニット、DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットrpo18、ヌクレオシド三リン酸加水分解酵素-I、mRNAキャッピング酵素小サブユニット、リファンピシンターゲット、後期転写因子VLTF-2、後期転写因子VLTF-3、ジスルフィド結合形成経路、コアタンパク質4b前駆体p4b、コアタンパク質39kDa、DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットrpo19、初期遺伝子転写因子VETFの82kDa大サブユニット、転写因子VITF-3の32kDa小サブユニット、IMV膜タンパク質128、コアタンパク質4a前駆体P4a、IMV膜タンパク質131、ホスホネート化IMV膜タンパク質、IMV膜タンパク質A17L、DNAヘリカーゼ、ウイルスDNAポリメラーゼプロセシング因子、IMV膜タンパク質A21L、パルミトイル化タンパク質、中間遺伝子転写因子VITF-3の45kDa大サブユニット、DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットrpo132、DNA依存性RNAポリメラーゼrpo35、IMVタンパク質A30L、仮想的ATPアーゼ、セリン/トレオニンキナーゼ、EEV成熟タンパク質、パルミトイル化EEV膜糖タンパク質、IMV表面タンパク質A27L、EEV膜リン酸糖タンパク質、IEVおよびEEV膜糖タンパク質、EEV膜糖タンパク質、ジスルフィド結合形成経路タンパク質、仮想的ウイルス核タンパク質、IMV膜タンパク質I2L、ポックスウイルスミリストイルタンパク質、IMV膜タンパク質L1R、後期16kDa仮想的膜タンパク質、仮想的ウイルス膜タンパク質H2R、IMV膜タンパク質A21L、ケモカイン結合タンパク質、表皮成長因子様タンパク質およびIL-18結合タンパク質から選択される1種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルスである場合、必須遺伝子は、タンパク質Vpg、コアタンパク質2A、タンパク質2B、RNAヘリカーゼ2C、タンパク質3A、プロテアーゼ3C、逆転写酵素3D、コートタンパク質Vp4およびタンパク質Vp1から選択される1種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスが麻疹ウイルスである場合、必須遺伝子は、核タンパク質N、リンタンパク質P、マトリックスタンパク質M、膜貫通糖タンパク質F、膜貫通糖タンパク質HおよびRNA依存性RNAポリメラーゼLから選択される1種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスが耳下腺炎ウイルスである場合、必須遺伝子は、核タンパク質N、リンタンパク質P、融合タンパク質F、RNAポリメラーゼLから選択される1種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスが水疱性口内炎ウイルスである場合、必須遺伝子は、糖タンパク質G、核タンパク質N、リン酸タンパク質PおよびRNAポリメラーゼLから選択される1種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスがポリオウイルスである場合、必須遺伝子は、キャプシドタンパク質VP1、キャプシドタンパク質VP2、キャプシドタンパク質VP3、システインプロテアーゼ2A、タンパク質2B、タンパク質2C、タンパク質3A、タンパク質3B、プロテアーゼ3C、タンパク質3DおよびRNAガイドRNAポリメラーゼから選択される1種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスがインフルエンザウイルスである場合、必須遺伝子は、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、膜タンパク質M1、膜タンパク質M2、ポリメラーゼPA、ポリメラーゼPB1-F2およびポリメラーゼPB2から選択される1種または複数種である。
テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 4に示されており、
ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 5に示されており、
ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 6に示されており、
インターフェロンα2シグナルペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 7に示されており、第2の核酸配列のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 8に示されており、
第3の核酸配列のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 9に示されている。
ここで、親ウイルスのゲノム配列が、野生型ウイルスのゲノム配列に対して、必須遺伝子が欠失するものであり、
相補的宿主細胞に必須遺伝子を発現させる発現配列が含まれる。
本開示による医薬品を被験者または患者に投与することを含み、
ここで、疾患は、肺がん、胃がん、肝臓がん、直腸がん、乳がん、前立腺がん、脳腫瘍、結腸がん、子宮頸がん、腎臓がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、膵臓がん、または食道がんである。
本実施例による腫瘍溶解性ウイルスは、野生型の単純ヘルペスウイルス1型KOSを形質転換することにより得られ、該組換え腫瘍溶解性ウイルスのゲノムは、以下の構成を有する(図1のBを参照)。
LEVLFQGPであり、
特異的切断部位配列のコード配列である第3の核酸配列は、
TTAGAAGTTCTTTTTCAAGGTCCTである。
(a)野生型ヘルペスウイルス1型KOSのDNAをテンプレートとして用いて、ICP27遺伝子のコード領域をPCRで増幅し、増幅した断片を、ネオマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドpcDNA3.1-EGFP(図2を参照)のHindIIIとXbaサイトの間に挿入してEGFPを置き換えた。該組換えプラスミドはICP27発現プラスミドと名付けられ、ICP27遺伝子はCMVプロモーターの駆動下で発現された。
親ウイルスは野生型ヘルペスウイルス1型KOSを基礎材料として構築され、EGFPでICP27遺伝子を置き換えて得られた組換えウイルスを移行型ヘルペスウイルスとし、親ウイルスと名付けた。具体的な方法は以下のとおりである。
1-6番目:無関係な配列、末端の長さを長くすると酵素的切断が容易になり、
7-12番目:Xho1サイト、C/TCGAG、
13-575番目:ICP27 5’末端配列、
576-1163番目:CMVプロモーター、
1164-1174番目:スペーサー配列、
1175-1180番目:Kozak配列、タンパク質の発現を増強させ、
1181-1900番目:EGFPコーディングフレーム、
1901-2144番目:BGH Poly(A)、
2145-2667番目:ICP27 3’末端配列、
2668-2673番目:HindIIIサイトA/AGCTT、
2674-2679番目:無関係な配列、末端の長さを長くすると酵素的切断が容易になる。
(a)マルチクローニングサイトにXhoIサイトのみを含むようにTAクローニングプラスミドに対して遺伝子操作しておき、TA-XhoIプラスミドと名付けた。
1-6番目:Xho 1サイト、
7-677番目:天然ICP27プロモーターを含むICP27 5’末端の非コード領域配列、
678-746番目:インターフェロンα2シグナルペプチドをコードする第2の核酸配列、
747-770番目:HRV-3Cプロテアーゼによって切断される特異的切断部位配列をコードする第3の核酸配列、
771-2306番目:ICP27オープンリーディングフレーム配列(開始コドンATGなし)、
2307-2753番目:SV40 Poly(A)、
2754-2759番目:HindIIIサイト、
2760-3279番目:ICP27 3’末端の非コード領域配列、
3280-3285番目:Xho 1サイト。
7-432番目:hTERTプロモーター、
433-527番目:CMVエンハンサー、
528-539番目:Kozak配列、
540-1088番目:HRV-3Cプロテアーゼをコードする核酸配列、
1089-1544番目:SV40 Poly(A)、
1545-1550番目:HindIIIサイト。
(a)3.5×105個/ウェルの量で、上記の相補的細胞CICP27を6ウェル細胞培養プレートに播種し、抗生物質を含まない培地で一晩培養した。
正常細胞Veroにおける実施例1による組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスoHSV-BJSのICP27の発現の検出
方法:それぞれ野生型KOSおよび組換え腫瘍溶解性ウイルスoHSV-BJSでVero(3 MOI)に感染させ、1日後、細胞を収集し、RNAを単離してタンパク質を抽出し、逆転写と半定量PCRの結合によりICP27 mRNAの発現レベルを検出し、ウエスタンブロット(Western blotting)でICP27によってコードされたタンパク質の発現レベルを検出した。mRNAおよびタンパク質の検出は、いずれもβ-アクチン(β-actin)をローディングコントロールとして用いた。
がん細胞におけるHRV-3CプロテアーゼおよびICP27の発現の検出
方法:3 MOI組換え腫瘍溶解性ウイルスoHSV-BJSまたはKOSを4種の異なるがん細胞に感染させ、24時間後、全RNAおよびタンパク質を単離した。半定量PCRによりHRV-3C mRNAの発現を分析し、ウエスタンブロット法によりICP27タンパク質の量を検出した。mRNAおよびタンパク質の検出は、いずれもβ-アクチンをローディングコントロールとして用いた。
組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスoHSV-BJSの増殖動態
方法:それぞれ0.1 MOIのKOSおよびoHSV-BJSを異なるがん細胞に感染させ、異なる日経った後に、細胞と培地を回収し、3回の凍結融解サイクルで細胞内に残されたウイルスを培地に放出した。ウイルスを相補的細胞CICP27に感染し、プラーク法でウイルス力価(プラーク形成単位/ミリリットル、PFU/ml)を測定した。
組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスoHSV-BJSのがん細胞に対する死滅能力
方法:0.25または0.5 MOIのKOSまたはoHSV-BJSを異なるがん細胞に感染させ、異なる日経った後、細胞の生存率を測定した。結果を表1~4に示す。
組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスoHSV-BJSの、正常細胞の生存率に対する影響
方法:腫瘍溶解性ウイルスoHSV-BJS(2 MOI)および野生ウイルスKOS(0.5 MOI)でVero細胞または初代ヒト角膜上皮細胞に感染させた。oHSV-BJSで感染した細胞と未処理の細胞の活性を3日後に測定し、野生ウイルスKOSで感染した細胞の活性を2日後に測定した。KOSで感染した細胞は、2日後、Vero細胞または初代ヒト角膜上皮細胞がすべて死亡したが、腫瘍溶解性ウイルスoHSV-BJSで感染した細胞は、生存率が無処理の場合とほぼ同じであった(表5)。結果から、腫瘍溶解性ウイルスoHSV-BJSが正常細胞に対して安全であることがわかった。
in vivoでの組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスoHSV-BJSの腫瘍抑制効果の検出
方法:体重14~16グラムの4~8週齢の雄マウスを利用して腫瘍モデルを構築した。ヒト肺がん、胃がん、肝臓がんのマウスの癌モデルは、それぞれin vitroで培養されたヒト非小細胞肺がんA549細胞、胃がんNCI-N87細胞、肝臓がんSK-HEP-1細胞をBALb/c(肺がんおよび胃がん)またはNPGマウス(肝臓がん)に皮下接種し、腫瘍が所定のサイズまで成長したとき、腫瘍を取り出して小さく切り、相応のマウスに移植して40~120mm3まで成長させた後、腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍内に注射した。3日に1回、合計3回、毎回1.2×107感染ユニット(40μlのPBSに懸濁)を複数の箇所に注射するように腫瘍内に注射した。ネガティブコントロールとしてPBS(腫瘍溶解性ウイルスを含まず)を注入した。各実験群あたり8匹の動物であった。腫瘍溶解性ウイルス注射後、腫瘍サイズを週に2回測定した(1回目の注射時の腫瘍の相対的なサイズは1と定義されている)、合計17~32日間測定した(ネガティブコントロール動物を安楽死させる必要がある時間によって決める)。腫瘍の大きさに基づいて腫瘍の成長曲線を作成した、試験終了時の試験群の腫瘍の大きさとネガティブコントロールを比較、分析して、相対的阻害率を計算した。
Claims (18)
- ゲノムに第1の制御エレメントが挿入され、前記第1の制御エレメントに、がん細胞特異的プロモーター配列および前記がん細胞特異的プロモーターによって駆動されて標的がん細胞において特異的プロテアーゼを発現させる第1の核酸配列が含まれ、
ゲノムに第2の制御エレメントがさらに挿入され、前記第2の制御エレメントに、細胞外トラクションシグナルペプチドをコードするための第2の核酸配列および特異的切断部位をコードするための第3の核酸配列が含まれ、前記特異的切断部位が、特異的プロテアーゼによって認識され、切断され、
前記第2の制御エレメントが、腫瘍溶解性ウイルスの必須遺伝子の5’末端に位置しており、
前記第2の制御エレメントは、前記腫瘍溶解性ウイルスの必須遺伝子のオープンリーディングフレームの開始コドンと第2のトリプレットコドンの間に位置しており、
前記第1の制御エレメントの挿入位置は、前記腫瘍溶解性ウイルスの2つの遺伝子の間に位置する、
腫瘍溶解性ウイルス。 - 前記特異的プロテアーゼは、ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ、トロンビン、Xa因子プロテアーゼ、タバコエッチウイルスプロテアーゼまたは組換えPreScissionプロテアーゼであり、
好ましくは、前記特異的プロテアーゼがヒトライノウイルス3Cプロテアーゼである場合、前記特異的切断部位のアミノ酸配列がLEVLFQGPであり、
前記特異的プロテアーゼがトロンビンである場合、前記特異的切断部位のアミノ酸配列がLVPRGSであり、
前記特異的プロテアーゼがXa因子プロテアーゼである場合、前記特異的切断部位のアミノ酸配列がIE/DGRであり、
前記特異的プロテアーゼがタバコエッチウイルスプロテアーゼである場合、前記特異的切断部位の配列がENLYFQGであり、
前記特異的プロテアーゼが組換えPreScissionプロテアーゼである場合、前記特異的切断部位の配列がLEVLFQGPである、
請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。 - 前記細胞外トラクションシグナルペプチドは、インターフェロンα2、インターロイキン2、ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン重鎖、または海洋カイアシ類動物由来のルシフェラーゼ細胞外分泌シグナルペプチドである、
請求項1または2に記載の腫瘍溶解性ウイルス。 - 前記第1の制御エレメントは、エンハンサー配列をさらに含み、前記エンハンサー配列が前記がん細胞特異的プロモーター配列と前記特異的プロテアーゼコード配列の間に位置し、前記エンハンサー配列が前記特異的プロテアーゼの発現を増強するためのものであり、
好ましくは、前記エンハンサー配列が、CMVエンハンサー配列またはSV40エンハンサー配列である、
請求項1~3のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。 - 前記標的がん細胞は、肺がん細胞、肝臓がん細胞、乳がん細胞、胃がん細胞、前立腺がん細胞、脳腫瘍細胞、ヒト結腸がん細胞、子宮頸がん細胞、腎臓がん細胞、卵巣がん細胞、頭頸部がん細胞、黒色腫細胞、膵臓がん細胞または食道がん細胞である、
請求項1~4のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。 - 前記がん細胞特異的プロモーターは、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、ヒト上皮成長因子受容体-2プロモーター、E2F1プロモーター、オステオカルシンプロモーター、癌胎児性抗原プロモーター、サバイビン(Survivin)プロモーターおよびセルロプラスミンプロモーターから選択されるいずれか1種である、
請求項1~5のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。 - 前記腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ウシポックスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスから選択されるいずれか1種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスが単純ヘルペスウイルスである場合、必須遺伝子は、エンベロープ糖タンパク質L、ウラシルDNAグリコシラーゼ、キャプシドタンパク質、スパイラルエンザイムプロ酵素サブユニット、DNA複製開始結合ヘリカーゼ、ミリスチン酸誘導体タンパク質、デオキシリボヌクレアーゼ、外被セリン/トレオニンプロテインキナーゼ、DNAパッケージング末端酵素サブユニット1、コートタンパク質UL16、DNAパッケージングタンパク質UL17、キャプシドの3本鎖サブユニット2、主要なキャプシドタンパク質、エンベロープタンパク質UL20、核タンパク質UL24、DNAパッケージングタンパク質UL25、キャプシド成熟プロテアーゼ、キャプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質B、一本鎖DNA結合タンパク質、DNAポリメラーゼ触媒サブユニット、核外輸送層タンパク質、DNAパッケージングタンパク質UL32、DNAパッケージングタンパク質UL33、核外輸送膜タンパク質、大キャプシドタンパク質、キャプシドの3本鎖サブユニット1、リボヌクレオチド還元酵素サブユニット1、リボヌクレオチド還元酵素サブユニット2、エンベロープ宿主閉鎖タンパク質、DNAポリメラーゼ加工性サブユニット、膜タンパク質UL45、コートタンパク質VP13/14、トランス活性化タンパク質VP16、コートタンパク質VP22、エンベロープ糖タンパク質N、コートタンパク質UL51、ヘリカーゼ-プライマーゼプライマーゼサブユニット、エンベロープ糖タンパク質K、ICP27、核タンパク質UL55、核タンパク質UL56、転写調節因子ICP4、調節タンパク質ICP22、エンベロープ糖タンパク質Dおよび膜タンパク質US8Aから選択される1種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスがアデノウイルスである場合、必須遺伝子は、初期タンパク質1A、初期タンパク質1B 19K、初期タンパク質1B 55K、カプセル化されたタンパク質Iva2、DNAポリメラーゼ、末端タンパク質前駆体pTP、カプセル化されたタンパク質52K、キャプシドタンパク質前駆体pIIIa、ペントンマトリックス、コアタンパク質pVII、コアタンパク質前駆体pX、コアタンパク質前駆体pVI、ヘキソン、プロテアーゼ、一本鎖DNA結合タンパク質、ヘキサマーアセンブリタンパク質100K、タンパク質33K、カプセル化されたタンパク質22K、キャプシドタンパク質前駆体、タンパク質U、フィブリン、調節タンパク質E4オープンリーディングフレーム6/7、調節タンパク質E4 34K、調節タンパク質E4オープンリーディングフレーム4、調節タンパク質E4オープンリーディングフレーム3、調節タンパク質E4オープンリーディングフレーム2および調節タンパク質E4オープンリーディングフレーム1から選択される1種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスがウシポックスウイルスである場合、必須遺伝子は、ヌクレオチド還元酵素小サブユニット、セリン/トレオニンキナーゼ、DNA結合ウイルスコアタンパク質、ポリメラーゼ大サブユニット、RNAポリメラーゼサブユニット、DNAポリメラーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、仮想的DNA結合ウイルス核タンパク質、DNA結合リンタンパク質、ウイルスコアシステインプロテアーゼ、RNAヘリカーゼNPH-II、仮想的メタロプロテアーゼ、転写伸長因子、グルタチオン様タンパク質、RNAポリメラーゼ、仮想的ウイルス核タンパク質、後期転写因子VLTF-1、DNA結合ウイルス核タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ小サブユニット、DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットrpo22、DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットrpo147、セリン/トレオニンプロテインホスファターゼ、IMVヘパリン結合性表面タンパク質、DNA依存性RNAポリメラーゼ、後期転写因子VLTF-4、DNAトポイソメラーゼ1型、mRNAキャッピング酵素大サブユニット、ウイルスコアタンパク質107、ウイルスコアタンパク質108、ウラシル-DNAグリコシラーゼ、トリホスファターゼ、初期遺伝子転写因子VETFの70 kDa小サブユニット、DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットrpo18、ヌクレオシド三リン酸加水分解酵素-I、mRNAキャッピング酵素小サブユニット、リファンピシンターゲット、後期転写因子VLTF-2、後期転写因子VLTF-3、ジスルフィド結合形成経路、コアタンパク質4b前駆体p4b、コアタンパク質39kDa、DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットrpo19、初期遺伝子転写因子VETFの82kDa大サブユニット、転写因子VITF-3の32kDa小サブユニット、IMV膜タンパク質128、コアタンパク質4a前駆体P4a、IMV膜タンパク質131、ホスホネート化IMV膜タンパク質、IMV膜タンパク質A17L、DNAヘリカーゼ、ウイルスDNAポリメラーゼプロセシング因子、IMV膜タンパク質A21L、パルミトイル化タンパク質、中間遺伝子転写因子VITF-3の45kDa大サブユニット、DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットrpo132、DNA依存性RNAポリメラーゼrpo35、IMVタンパク質A30L、仮想的ATPアーゼ、セリン/トレオニンキナーゼ、EEV成熟タンパク質、パルミトイル化EEV膜糖タンパク質、IMV表面タンパク質A27L、EEV膜リン酸糖タンパク質、IEVおよびEEV膜糖タンパク質、EEV膜糖タンパク質、ジスルフィド結合形成経路タンパク質、仮想的ウイルス核タンパク質、IMV膜タンパク質I2L、ポックスウイルスミリストイルタンパク質、IMV膜タンパク質L1R、後期16kDa仮想的膜タンパク質、仮想的ウイルス膜タンパク質H2R、IMV膜タンパク質A21L、ケモカイン結合タンパク質、表皮成長因子様タンパク質およびIL-18結合タンパク質から選択される1種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルスである場合、必須遺伝子は、タンパク質Vpg、コアタンパク質2A、タンパク質2B、RNAヘリカーゼ2C、タンパク質3A、プロテアーゼ3C、逆転写酵素3D、コートタンパク質Vp4およびタンパク質Vp1から選択される1種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスが麻疹ウイルスである場合、必須遺伝子は、核タンパク質N、リンタンパク質P、マトリックスタンパク質M、膜貫通糖タンパク質F、膜貫通糖タンパク質HおよびRNA依存性RNAポリメラーゼLから選択される1種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスが耳下腺炎ウイルスである場合、必須遺伝子は、核タンパク質N、リンタンパク質P、融合タンパク質F、RNAポリメラーゼLから選択される1種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスが水疱性口内炎ウイルスである場合、必須遺伝子は、糖タンパク質G、核タンパク質N、リン酸タンパク質PおよびRNAポリメラーゼLから選択される1種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスがポリオウイルスである場合、必須遺伝子は、キャプシドタンパク質VP1、キャプシドタンパク質VP2、キャプシドタンパク質VP3、システインプロテアーゼ2A、タンパク質2B、タンパク質2C、タンパク質3A、タンパク質3B、プロテアーゼ3C、タンパク質3DおよびRNAガイドRNAポリメラーゼから選択される1種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスがインフルエンザウイルスである場合、必須遺伝子は、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、膜タンパク質M1、膜タンパク質M2、ポリメラーゼPA、ポリメラーゼPB1-F2およびポリメラーゼPB2から選択される1種または複数種である、
請求項1~6のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。 - 前記腫瘍溶解性ウイルスの1つまたは複数の必須遺伝子の5’末端に前記第2の制御エレメントが挿入される、
請求項1~7のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。 - 前記腫瘍溶解性ウイルスが単純ヘルペスウイルス1型であり、必須遺伝子がICP27であり、前記がん細胞特異的プロモーターがテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターであり、前記特異的プロテアーゼがヒトライノウイルス3Cプロテアーゼであり、前記細胞外トラクションシグナルペプチドがインターフェロンα2シグナルペプチドであり、前記特異的切断部位のアミノ酸配列がLEVLFQGPであり、前記第2の制御エレメントが前記必須遺伝子のオープンリーディングフレームの開始コドンATGと第2のトリプレットコドンの間に位置し、前記第1の制御エレメントが前記必須遺伝子の下流に位置している、
請求項1~7のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。 - 前記テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 4に示されており、
前記ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 5に示されており、
前記ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 6に示されており、
前記インターフェロンα2シグナルペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 7に示されており、前記第2の核酸配列のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 8に示されており、
前記第3の核酸配列のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 9に示されている、
請求項9に記載の腫瘍溶解性ウイルス。 - 前記2つの遺伝子は、2つの必須遺伝子であるか、または2つの非必須遺伝子であるか、またはそのうちの1つが必須遺伝子であり、もう1つが非必須遺伝子である、
請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。 - 腫瘍溶解性ウイルスの標的部位に挿入される挿入配列を有し、
前記挿入配列が、前記第1の制御エレメントおよび前記第2の制御エレメントを含み、前記第1の制御エレメントの標的部位が前記腫瘍溶解性ウイルスの2つの遺伝子の間に位置し、前記第2の制御エレメントが前記腫瘍溶解性ウイルスの必須遺伝子の5’末端に位置している、
請求項1~11のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを調製するための核酸分子。 - 前記挿入配列の5’末端に前記の標的部位の上流配列に相同である5’末端相同性アーム配列を有し、前記挿入配列の3’末端に前記の標的部位の下流配列に相同である3’末端相同性アーム配列を有する、
請求項12に記載の核酸分子。 - 請求項12または13に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項14に記載のベクターを親ウイルスおよび相補的宿主細胞と共培養し、培養物から前記腫瘍溶解性ウイルスを収集することを含み、
前記親ウイルスのゲノム配列が、野生型ウイルスのゲノム配列に対して、前記必須遺伝子が欠失するものであり、
前記相補的宿主細胞に前記必須遺伝子を発現させる発現配列が含まれる、
請求項1~11のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを調製する方法。 - がんを治療する医薬品の調製における、請求項1~11のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルスの使用。
- 請求項1~11のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、および薬学に許容されるアジュバントを含む、
がんを治療する医薬品。 - 遺伝子治療薬またはワクチンがさらに含まれる、
請求項17に記載の医薬品。
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