CN107907619A - 一种黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法。所述方法包括如下步骤：S1：制备线性梯度溶液、质控品溶液和内标溶液，建立标准曲线；S2：血浆样品处理；S3：采用HPLC‑MS进行测定；其中，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件为：0.0～5.0 min：A流动相：85%→50%；5.0～9.0 min：A流动相：50%→30%；9.0～9.5 min：A流动相：30%→10%；9.5～12.5 min：A流动相：10%；12.5～13 min：A流动相：10%→85%，并控制质谱参数。本发明提供的定量分析方法通过对特定的HPLC‑MS的选择，可同时实现多种活性成分的血药浓度定量检测，检出限在0.30～0.33ng/ml范围内，灵敏度高，方便快捷，可应用在黄芪破壁饮片多种活性成分在体内的吸收特征的药代动力学研究中。

Description

一种黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法

技术领域

本发明涉及黄芪破壁饮片活性成分检测的技术领域，特别涉及一种黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法。

背景技术

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。黄芪味甘，性微温，归肺、脾经，具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌和利水退肿等功效；临床用于脾肺气虚、中气下陷、表虚自汗、气血不足、痈疽难溃、久溃不敛、气虚血滞、浮肿尿少、半身不遂和痹痛麻木等症。

黄芪所含化学成分主要分为三类，即黄芪皂苷、黄酮类成分以及黄芪多糖，此外还有氨基酸、微量元素等，其中黄芪皂苷以及黄酮类成分是黄芪中最为重要的有效成分。

中药破壁饮片是将符合法定标准要求并具有细胞结构的植物类中药饮片，经现代粉碎技术加工至D90﹤45μm(300目以上)的粉体，通过诱发自身物质的粘合性，制成30～100目的原饮片全成分的均匀干燥颗粒状饮片。相比传统饮片，中药破壁饮片具有质量均一，药物利用率高、稳定性好及应用方便快捷的优势。但是由于破壁饮片粉体粒径小，其有效成分的体外溶出速度和溶出量以及体内生物利用度也将高于传统饮片，活性成分的药代动力学PK参数和行为和传统饮片相比也将存在差异。

目前，现有技术中涉及到的黄芪活性成分的药代动力学研究，多集中在黄芪单个成分药代动力学分析方法方面；若要全面同时反映黄芪多种主要活性成分的体内药动学规律，进行黄芪破壁饮片多种活性成分在体内的吸收特征的药代动力学研究，必须要实现黄芪破壁饮片多种活性成分的同时检测，目前关于同时对多种活性成分检测的方法鲜有报道。

因此，开发一种灵敏度高、快捷方便的黄芪破壁饮片多种活性成分检测方法具有重要的研究意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的检测方法不能同时检测黄芪破壁饮片多种活性成分的含量的缺陷，提供一种黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法。本发明提供的定量分析方法可同时实现五种活性成分血药浓度定量分析，检出限在0.30～0.33ng/ml范围内，灵敏度高，方便快捷。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法，所述方法包括如下步骤：

S1：制备线性梯度溶液、质控品溶液和内标溶液，建立标准曲线；

S2：血浆样品处理；

S3：采用HPLC-MS进行测定；其中，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件为：0.0～5.0min：A流动相：85％→50％；5.0～9.0min：A流动相：50％→30％；9.0～9.5min：A流动相：30％→10％；9.5～12.5min：A流动相：10％；12.5～13min：A流动相：10％→85％。

本发明通过对流动相和梯度洗脱参数进行多次试验发现，采用上述流动相组成和梯度洗脱条件时，可同时实现多种黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量检测，灵敏度高，操作快速方便。

优选地，所述活性成分为黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮或芒柄花素中的一种或数种。

优选地，所述流动相A和流动相B中甲酸的体积分数为0.1％。

优选地，所述线性梯度溶液中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的浓度依次为0.91～468.00ng/mL、0.98～504.00ng/mL、0.94～482.90ng/mL、0.95～489.00ng/mL和0.97～499.80ng/mL范围内的至少5个不同浓度。

更为优选地，所述线性梯度溶液中黄芪甲苷的浓度为468.00ng/mL、234.00ng/mL、117.00ng/mL、58.50ng/mL、29.25ng/mL、14.63ng/mL、7.31ng/mL、3.66ng/mL、1.82ng/mL和0.91ng/mL。

更为优选地，所述线性梯度溶液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的浓度为504.00ng/mL、252.00ng/mL、126.00ng/mL、63.00ng/mL、31.50ng/mL、15.75ng/mL、7.88ng/mL、3.94ng/mL、1.96ng/mL和0.98ng/mL。

更为优选地，所述线性梯度溶液中芒柄花苷的浓度为482.80ng/mL、241.40ng/mL、120.70ng/mL、60.35ng/mL、30.18ng/mL、15.09ng/mL、7.54ng/mL、3.77ng/mL、1.88ng/mL和0.94ng/mL。

更为优选地，所述线性梯度溶液中毛蕊异黄酮的浓度为489.00ng/mL、244.50ng/mL、122.25ng/mL、61.13ng/mL、30.56ng/mL、15.28ng/mL、7.64ng/mL、3.82ng/mL、1.90ng/mL和0.95ng/mL。

更为优选地，所述线性梯度溶液中芒柄花素的浓度为499.80ng/mL、249.90ng/mL、124.95ng/mL、62.48ng/mL、31.24ng/mL、15.62ng/mL、7.81ng/mL、3.90ng/mL、1.94ng/mL和0.97ng/mL。

优选地，所述质控品溶液中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的浓度依次为4.68～468.00ng/mL、5.04～504ng/mL、4.83～482.80ng/mL、4.89～489.00ng/mL、4.89～489.00ng/mL和5.00～499.80ng/mL范围内的至少3个不同浓度。

更为优选地，所述质控品溶液中黄芪甲苷的浓度为468.00ng/mL、46.80ng/mL和4.68ng/mL。

更为优选地，所述质控品溶液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的浓度为504.00ng/mL、50.40ng/mL、5.04ng/mL。

更为优选地，所述质控品溶液中芒柄花苷的浓度为482.8ng/mL、48.280ng/mL、4.83ng/mL。

更为优选地，所述质控品溶液中毛蕊异黄酮的浓度为489.00ng/mL、48.90ng/mL、4.89ng/mL。

更为优选地，所述质控品溶液中芒柄花素的浓度为499.80ng/mL、49.98ng/mL、5.00ng/mL。

优选地，所述内标溶液为柚皮素甲醇溶液，所述内标溶液中柚皮素的浓度为294ng/mL。

优选地，所述血浆样品制备步骤如下：

S1：向黄芪破壁饮片中加入水，研磨均匀得供试药液；

S2：将供试药液灌胃于动物体内，眼眶取血，分离血浆，得供试血浆，冷冻

备用；

S3：内标溶液置于离心管中，吹干后再加入解冻后血浆、蛋白沉淀剂，混合、超声、离心后取上清液吹干，复溶，混合、超声、离心后所得上清液即为所述血浆样品。

优选地，S1供试药液中黄芪破壁饮片的质量浓度为0.14～0.21g/ml。

优选地，S2中所述动物为大鼠，所述灌胃前12h禁食、自由饮水，所述供药试液的用量为2.5ml/100g，灌胃后于5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h或72h眼眶取血0.5ml，所述冷冻保存条件为-20℃。

优选地，S3中混合、超声和离心条件为：涡旋混合2min，超声4min，13000rpm离心5min；所述蛋白沉淀剂为体积分数为0.1％的甲酸溶液。

优选地，色谱条件为：流速为0.2mL/min；进样体积为2μL；进样温度为20℃；色谱柱为Agilent XDB-C18；柱温箱为30℃；运行时间为13min；洗针液为50％甲醇。

优选地，质谱***为美国安捷伦三重四级杆质谱***。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方通过对特定的流动相和梯度浓度条件的选择，可同时实现多种活性成分的血药浓度定量检测，检出限在0.30～0.33ng/ml范围内，灵敏度高，方便快捷，可应用在黄芪破壁饮片多种活性成分在体内的吸收特征的药代动力学研究中。

附图说明

图1为空白血浆总离子流图结果；

图2～5为空白血浆+对照品离子流图；

图6～9为血浆样品离子流图；

其中，A为黄芪甲苷，B为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，C为芒柄花苷，D为毛蕊异黄酮，E为芒柄花素，F为柚皮素。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

实施例1一种黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法

本实施例提供的黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法包括如下步骤：黄芪破壁饮片5种活性成分的血药浓度定量分析方法，包括以下步骤：

(1)线性梯度溶液、质控品溶液和内标溶液制备，标准曲线的建立；

(2)血浆样品处理；

(3)采用HPLC-MS进行测定；

步骤(1)中线性梯度溶液、质控品溶液和内标溶液制备及标准曲线的建立包括以下步骤和方法：

对照品储备液的制备：精密称取黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素适量于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各对照品储备液，对应浓度分别为23.4μg·mL^-1、33.6μg·mL^-1、28.4μg·mL^-1、32.6μg·mL-1、29.4μg·mL^-1的对照品储备液。

内标溶液的制备：取柚皮素适量，精密称定，至50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为29.4μg·mL^-1的内标储备液，再精密吸取内标储备液1.00mL于100mL容量瓶中，加甲醇定容，即得浓度为294ng·mL^-1内标溶液。

线性梯度溶液及质控溶液的制备：分别精密量取对照品储备液适量，加甲醇稀释配制成如表1所示线性梯度溶液和质控品溶液，冰箱4℃下保存，备用。

表1线性梯度溶液及质控溶液浓度表(ng/ml)

将上述梯度对照品溶液注入液质联用仪，按步骤(3)项下质谱和色谱条件进样检测，以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积比为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。

步骤(2)血浆样品的制备包括以下步骤和方法：

A：称取黄芪破壁饮片，置于研钵中，慢慢加入水，研磨均匀，使成0.14～0.21g/ml。

B：取健康大鼠，实验前12h禁食，自由饮水，将配置好供试药液2.5ml/100g灌胃给药，给药后4h后内禁食禁水，给药前采集空白血样(空白血浆，可冷冻备用)，灌胃后于5min、15min、30min、1h、2h，3h，4h，6h，8h，12h，24h,，36h，48h，72h眼眶取血0.5ml，置EDTA管中，5000rpm离心10min，分离血浆，得供试血浆，-20℃冷冻保存备用。

C：室温解冻样品后，精密吸取100.0μL内标溶液置于5mL离心管中，N2吹干，再吸取100μL供试血浆，涡旋混合，加入400μL蛋白沉淀剂(0.1％甲酸)，涡旋混合2min，超声4min，13000rpm离心5min，分离上清液400μL于N2吹干，残渣用150μL甲醇复溶，涡旋混合2min，超声4min，13000rpm离心5min，取上清液即为血浆样品。

另外，室温解冻空白血浆，精密吸取100.0μL内标溶液置于5mL离心管中，N2吹干，再吸取100μL黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素，浓度依次在4.68～468.00ng/mL、5.04～504ng/mL、4.83～482.80ng/mL、4.89～489.00ng/mL和5.00～499.80ng/mL范围内，涡旋混合，加入400μL蛋白沉淀剂(0.1％甲酸)，涡旋混合2min，超声4min，13000rpm离心5min，分离上清液400μL于N2吹干，残渣用150μL甲醇复溶，涡旋混合2min，超声4min，13000rpm离心5min，取上清液即为对照品血浆样品。

步骤(3)采用液质联用法进行测定，具体条件如表2～4：

表2色谱条件

选用采用美国安捷伦三重四级杆质谱***(6470Triple Quad)。

表3质谱源参数

表4质谱参数

运用上述定量分析方法对黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度进行定量分析。

测定结果：

(1)特异性考察

通过血浆样品制备步骤中制备得到的空白血浆(检测结果如图1)、含对照品血浆(检测结果如图2～5)和含药血浆(检测结果如图6～9)各取样2μL，注入液相-质谱联用仪进行检测。如图1～9结果显示，在该检测条件下中内源性物质均不干扰目标化合物和内标物质的测定，含药血浆中5种成分及内标物质保留时间分别为5.566min(黄芪甲苷)、3.142min(毛蕊异黄酮葡萄糖苷)、5.137min(毛蕊异黄酮)、4.314min(芒柄花苷)、6.756min(芒柄花素)、5.916min(柚皮素)。

(2)线性关系及定量限、检测限考察

将表1所示线性梯度溶液注入液质联用仪，按本实施例提供的定量分析方法进样检测，以线性梯度溶浓度为横坐标(X)，峰面积比为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算得到线性回归方程(如表5)：将混合线性梯度溶不断稀释进样，根据质谱检测规定，信噪比(S/N)的3倍为检测限，信噪比的10倍为定量限。

结果表明，黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的浓度依次在0.91～468.00、0.98～504.00、0.94～482.90、0.95～489.00、0.97～499.80ng·mL^-1线性关系良好，相关系数r均大于等于0.9954。

黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素定量限依次为0.91ng·mL^-1、0.98ng·mL^-1、0.94ng·mL^-1、0.95ng·mL^-1、0.97ng·mL^-1；检测限依次为0.30ng·mL^-1、0.33ng·mL^-1、0.31ng·mL^-1、0.32ng·mL^-1、0.32ng·mL^-1。

表5五种成分线性回归方程及定量限、检测限表格(n＝3)

(3)基质效应与回收率考察

取高、中、低三个浓度的质控样品溶液及内标各100μl于5ml离心管中，N₂吹干后直接加150μl甲醇复溶，按本实施例提供的定量分析方法中的质谱和色谱条件进样检测，测得响应值A。每个浓度平行6份。

取100μl空白血浆置于5mL离心管中，N₂吹干，再吸取100μL供试血浆，涡旋混合，加入400μL蛋白沉淀剂(0.1％甲酸)，涡旋混合2min，超声4min，13000rpm离心5min，分离上清液400μL于N2吹干，残渣加入高、中、低三个浓度的质控样品溶液及内标各100μl氮气吹干，残渣加150μl甲醇复溶，按本实施例提供的定量分析方法中的质谱和色谱条件进样检测，测得响应值B。每个浓度平行6份。

取高、中、低三个浓度的质控样品溶液及内标各100μl置于5ml离心管中，N₂吹干后加入100μl空白血浆置于5mL离心管中，N₂吹干，再吸取100μL供试血浆，涡旋混合，加入400μL蛋白沉淀剂(0.1％甲酸)，涡旋混合2min，超声4min，13000rpm离心5min，分离上清液400μL于N2吹干，残渣加150μl甲醇复溶，按本实施例提供的定量分析方法中的质谱和色谱条件进样检测，测得响应值C。每个浓度平行6份。

基质效应＝B/A；回收率＝C/B。

由表中数据可知，五种成分的基质效应以及回收率值均在80％～120％之间，RSD均小于15％，符合生物样品定量分析指导原则的要求。

表6基质效应和回收率(n＝6)

(4)精密度与准确度试验

取低、中、高三个浓度的质控品(QC)样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定三天，并与标准曲线同批测定，以当日的标准曲线计算QC样品的测得浓度，与配制的浓度对照，求得本实施例提供的方法的精密度和准确度(见表7)。

表7精密度与准确度结果(n＝6)

(5)稳定性试验

室温稳定性

取高、中、低三个浓度的对照品溶液各1份，按“供试品处理办法”项下处理和“色谱及质谱条件”项下条件分析，分别于0、1、2、4、8、12、18、24h进样，每次2μL，结果得到RSD，结果见表8。如表中数据所示，所有成分24h内响应值RSD均小于15％，符合生物样品检测要求。

表8短期稳定性实验结果(n＝8)

冻融稳定性

将质控样品-20℃保存，再经过3次冻融循环后按项下处理和“标准曲线绘制”项下配制的高、中、低三个浓度的对照品溶液各6份，结果见表9。

表9五种化合物冻融稳定性实验结果(n＝6)

Claims (9)

1.一种黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1：制备线性梯度溶液、质控品溶液和内标溶液，建立标准曲线；

S2：血浆样品处理；

S3：采用HPLC-MS进行测定；其中，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件为： 0.0～5.0 min：A流动相： 85%→50%；5.0～9.0 min：A流动相： 50%→30%；9.0～9.5 min：A流动相： 30%→10%；9.5～12.5 min：A流动相：10%；12.5～13 min：A流动相：10%→85%；质谱参数为：离子源为：电喷雾离子源（ESI），检测方式为正离子，毛细管电压为3500V，扫描方式为MRM，氮气温度300℃，氮气流速5L/min，鞘气温度250℃，鞘气流速11L/min，喷嘴电压500V。

2.根据权利要求1所述黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法，其特征在于，所述活性成分为黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮或芒柄花素中的一种或数种。

3.根据权利要求1所述黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法，其特征在于，所述流动相A和流动相B中甲酸的体积分数为0.1%。

4.根据权利要求2所述黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法，其特征在于，所述线性梯度溶液中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的浓度依次为0.91~468.00ng/mL、0.98~504.00ng/mL、0.94~482.90ng/mL、0.95~489.00ng/mL和0.97~499.80ng/mL范围内的至少5个不同浓度。

5.根据权利要求2所述黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法，其特征在于，所述质控品溶液中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的浓度依次为4.68~468.00ng/mL、5.04~504ng/mL、4.83~482.80ng/mL、4.89~489.00ng/mL和5.00~499.80ng/mL范围内的至少3个不同浓度。

6.根据权利要求1所述黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法，其特征在于，所述内标溶液为柚皮素甲醇溶液，所述内标溶液中柚皮素的浓度为294ng/mL。

7.根据权利要求1所述黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法，其特征在于，所述血浆样品制备步骤如下：

S1：向黄芪破壁饮片中加入水，研磨均匀得供试药液；

S2：将供试药液灌胃于动物体内，眼眶取血，分离血浆，冷冻备用；

S3：内标溶液置于离心管中，吹干后再加入解冻后血浆、蛋白沉淀剂，混合、超声、离心后取上清液吹干，复溶，混合、超声、离心后所得上清液即为所述血浆样品。

8.根据权利要求1所述黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法，其特征在于，所述血浆样品的质量浓度为0.14～0.21g/ml。

9.根据权利要求1所述黄芪破壁饮片活性成分的血药浓度定量分析方法，其特征在于，色谱条件为：流速为0.2mL/min；进样体积为2µL；进样温度为20℃；色谱柱为Agilent XDB-C18；柱温箱为30℃；运行时间为13min；洗针液为50%甲醇。