CN101684451A - 一种水解紫杉烷类的7-木糖基团及13-侧链的微生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从土壤中发现的菌种保藏号为CGMCC No.2487的阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae或其功能等同的静息细胞、变异体和突变体及其生产的酶；还提供了紫杉烷的制备方法，即利用阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae在麦麸培养基里水解7－木糖紫杉烷分子中的7－木糖基团，在蛋白胨牛肉膏培养基里能水解带13－侧链紫杉烷分子中的13－侧链；生产出的紫杉烷可用于制备抗肿瘤药物，如紫杉醇、多西紫杉醇或其他紫杉烷类药物的中间体。

Description

一种水解紫杉烷类的7-木糖基团及13-侧链的微生物

技术领域：

本发明涉及一种菌种保藏号为CGMCC No.2487的阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)或其功能等同的静息细胞、变异体和突变体及其生产的酶和紫杉烷的制备方法，具体讲，涉及一种既可在麦麸培养基里水解7-木糖紫杉烷的7-木糖基，又可在蛋白胨牛肉膏培养基中水解带13-侧链紫杉烷分子中的13-侧链的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，及一种利用阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)制备紫杉烷的方法。

背景技术：

紫杉醇是1971年Wani等从红豆科红豆杉属植物短叶红豆杉树皮中分离出的一个具有独特抗癌活性的二萜生物碱。其化学结构式为：

紫杉醇自1992年被FDA批准用于治疗卵巢癌和转移性乳腺癌以来，已在40多个国家获准上市。另外还发现它们对非小细胞肺癌、***癌等也具有良好的疗效，需求量越来越大，其资源匮乏问题仍为全世界医药研究与工业界关注的热点。由于紫杉醇在红豆杉中含量较低，且红豆杉为生长缓慢的裸子植物，故目前紫杉醇在临床应用上供不应求，资源极其匮乏。

目前，获得紫杉醇的手段主要有：

(1)从红豆杉树皮中直接提取：红豆杉属植物生长缓慢，树皮中紫杉醇的含量仅占0.01％～0.02％，从树皮中提取紫杉醇造成了红豆杉资源的极大破坏。但是至今，这仍然是临床紫杉醇的主要来源途径。

(2)化学全合成：美国、日本、法国等国家进行全化学合成紫杉醇的研究小组有30多个，经过二十多年的努力终于获得成功。1993年，美国的一些科学家们用廉价的樟脑作为起始物，经30步左右的复杂化学反应得到了紫杉醇。但由于其全合成路线较长、得率低、成本昂贵，目前仅有理论意义，尚无实际应用价值。

(3)化学半合成：从可以再生的植物枝叶中提取本身并无活性的紫杉醇类似物(如巴卡亭III和10-去乙酰巴卡亭III)作为中间体，通过化学方法合成紫杉醇。这也是目前生产紫杉醇的途径之一。

(4)细胞培养法生产紫杉醇：利用离体培养的红豆杉细胞生产紫杉醇及其合成前体，但由于红豆杉细胞生产能力不稳定尚不能工业化生产。

(5)内生真菌发酵：1993年美国蒙大拿州立大学有机化学家Stierle等从短叶红豆杉茎中分离到一株内生真菌(安德列紫杉菌)，该菌株三周的发酵液每升含几个纳克的紫杉醇。后来他们又从西藏红豆杉细枝中分离到一株内生真菌——小孢盘多毛孢菌，其发酵水平又比前者略高。由于含量极低，尚不能实际应用。

综上所述，寻找不破坏资源且能生产紫杉醇的新方法是紫杉醇研究领域的重要问题之一，也是本领域研究的热点之一。

众多研究表明，在紫杉醇的提取与分离过程中，紫杉醇类似物常作为副产品而废弃，并给分离纯化带来一些困难，造成极大的资源浪费与环境污染。这些类似物包括：7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，7-木糖紫杉醇，7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III，7-木糖巴卡亭III，7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱，7-木糖三尖杉宁碱，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C，7-木糖紫杉醇C；以及C-13位连有侧链的紫杉烷类化合物如10-去乙酰紫杉醇，10-去乙酰三尖杉宁碱，三尖杉宁碱，10-去乙酰紫杉醇C，紫杉醇C。利用化学方法对这些紫杉醇类似物的结构改造从而获得紫杉醇已有报道，但存在选择性低、容易生成异构体、副产物多且反应步骤长、产率低、造成环境污染等问题。而通过生物催化手段将这些“废物”加以利用，用于生产紫杉烷类药物重要中间体并进行化学半合成，此法不仅可充分利用资源，而且不会破坏环境。

特别地，众多文献表明，生长在中国的红豆杉如中国红豆杉、云南红豆杉、曼地亚红豆杉的可再生枝叶中的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量特别高，约为紫杉醇含量的10倍，如何将这一化合物加以利用是一个具有重大意义的课题。本发明采用了微生物及其酶生物转化的方法对这类化合物进行定向生物转化，如水解7-木糖紫杉烷类的7-木糖基团，获得生产抗肿瘤药物紫杉醇、多西紫杉醇等的中间体，不仅可解决此类药物的药源匮乏问题，而且，所用方法还具有环保等优点，具有较大的社会及经济效益。

在对现有文献的分析中，目前有公开发表的有关此类研究的报道，但涉及的微生物菌株仅能催化一种反应，即C-7位木糖水解或C-13位侧链水解。而目前还未见具有双重功能的菌株，造成紫杉烷的制备过程复杂、成本高，紫杉烷的产率较低。

发明内容：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有双重功能的微生物及其酶；

本发明的另一个发明目的是提供这种微生物的用途；

本发明的再一个发明目的是提供一种紫杉烷的制备方法。

本发明涉及了一种菌种保藏编号为CGMCC No.2487的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)及其功能等同的静息细胞、变异体和突变体及其所生产的酶；所述的阴沟肠杆菌已于2008年5月9日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为：CGMCC No.2487。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心位于北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。这种阴沟肠杆菌为阴沟肠杆菌属阴沟肠杆菌，为生物学纯的。阴沟肠杆菌可保藏在麦麸或蛋白胨牛肉膏固体培养基斜面上，保藏温度为4℃左右，亦可保藏在加有甘油的液体培养基里，保藏温度为-20～-80℃。

阴沟肠杆菌是通过对来源于东北红豆杉树木生长周围地表5cm以下的土壤样品的200余株微生物进行7-木糖-10-去乙酰紫杉醇木糖基团水解能力的筛选而得到的。

当利用阴沟肠杆菌时，可以使用完整的湿细胞或干细胞，如冻干的、喷雾干燥的或加热干燥的细胞形式存在的细胞；或者以处理过的细胞材料，如破裂的细胞或细胞提取物形式存在的细胞；也包括通过物理、化学等方法诱变而获得的变异体、突变体细胞；以及使用遗传工程获得的工程菌株的细胞，宿主细胞可以是任何细胞，如经改良的含有一种或多种用于表达能够进行本发明所述催化反应的一种或多种酶基因的大肠埃希氏菌、啤酒酵母菌或毕赤酵母菌等细胞。

本发明还涉及了阴沟肠杆菌或其功能等同的静息细胞、变异体和突变体及其生产的酶的用途，在麦麸培养基中水解底物紫杉烷类化合物中的7-木糖紫杉烷的7-木糖基团，在蛋白胨牛肉膏培养基中水解底物紫杉烷类化合物中带13-侧链紫杉烷的13-侧链。

本发明的阴沟肠杆菌或其功能等同的静息细胞、变异体和突变体及其生产的酶水解底物紫杉烷类化合物的酶促反应条件为：浓度为0.01～1.0mol/L的Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液；优选缓冲液为磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的优选浓度为0.5mol/L；pH为4.5～8.0，优选为6.5；温度为15～50℃，优选37℃。

本发明还涉及阴沟肠杆菌所生产的酶，通过多种方法提取、纯化的酶，包括粗酶和单一酶。

本发明还涉及了一种紫杉烷的制备方法，利用阴沟肠杆菌或与其功能等同的静息细胞、变异体和突变体在麦麸培养基中水解底物紫杉烷类化合物中的7-木糖紫杉烷的7-木糖基团。

在本发明提供的紫杉烷的制备方法中，阴沟肠杆菌或与其功能等同的静息细胞、变异体和突变体在麦麸培养基中的反应温度为15～50℃，优选为20～35℃，最优选28℃。

其中，麦麸液体培养基中含有麦麸10～100g/L，(NH₄)₂HPO₃ 1～5g/L，K₂HPO₄ 0.05～1.0g/L，MgSO₄7H₂O 0.01～0.5g/L；优选为：麦麸20～60g/L，(NH₄)₂HPO₃ 1～3g/L，K₂HPO₄ 0.08～0.3g/L，MgSO₄7H₂O 0.08～0.3g/L；最优选为：麦麸40g/L，(NH₄)₂HPO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 0.1g/L，MgSO₄7H₂O 0.1g/L。

其中，麦麸固体培养基中含有麦麸10～100g/L，(NH₄)₂HPO₃ 1～5g/L，K₂HPO₄0.05～1.0g/L，MgSO₄7H₂O 0.01～0.5g/L，琼脂10～20g/L；优选为：麦麸20～60g/L，(NH₄)₂HPO₃ 1～3g/L，K₂HPO₄ 0.08～0.3g/L，MgSO₄7H₂O0.08～0.3g/L，琼脂12～18g/L；最优选为：麦麸40g/L，(NH₄)₂HPO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 0.1g/L，MgSO₄7H₂O 0.1g/L，琼脂15g/L。

麦麸培养基的又一优选方案为：培养基中还可以添加重量百分比为0.01％～1％木聚糖；优选0.03～0.1％；最优选0.06％。所述的木聚糖选自燕麦木聚糖，桦木木聚糖。当添加了木聚糖后，底物的转化率可提高10～40％。

麦麸培养基的再一优选方案为：麦麸培养基中还可以添加重量百分比为0.01～1.0％的硫酸铵；优选0.2～0.5％；最优选0.4％。硫酸铵对于阴沟肠杆菌的对底物的水解反应具有促进作用，添加硫酸铵后，底物的转化率提高20～40％。

麦麸培养基的再一优选方案为：液体麦麸培养基中还包括大孔树脂5～40g/L；优选为10～30g/L，最优选为20g/L。

其中，麦麸培养基pH值为5.0～8.0；优选为6.0～7.0；最优选为6.5。

所述紫杉烷类化合物选自从红豆杉提取获得的单体紫杉烷类化合物或其粗提取物、通过红豆杉组织细胞培养获得的单体紫杉烷类化合物或其粗提取物。其中：7-木糖紫杉烷选自：7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，7-木糖紫杉醇，7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III，7-木糖巴卡亭III，7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱，7-木糖三尖杉宁碱，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C，7-木糖紫杉醇C。

本发明还涉及了另一种紫杉烷的制备方法，利用阴沟肠杆菌或与其功能等同的静息细胞、变异体和突变体在蛋白胨牛肉膏培养基中水解底物紫杉烷类化合物中带13-侧链紫杉烷的13-侧链。

在本发明提供的紫杉烷的制备方法中，阴沟肠杆菌或与其功能等同的静息细胞、变异体和突变体在蛋白胨牛肉膏培养基中的反应温度为15～50℃，优选25℃。

其中，蛋白胨牛肉膏液体培养基中含有蛋白胨2～20g/L，牛肉提取物1～5g/L，NaCl 1～10g/L；优选为：蛋白胨5～15g/L，牛肉提取物1～3g/L，NaCl 3～6g/L；最优选为：蛋白胨10g/L，牛肉提取物2g/L，NaCl 5g/L。

其中，蛋白胨牛肉膏固体培养基中含有蛋白胨2～20g/L，牛肉提取物1～5g/L，NaCl 1～10g/L，琼脂10～20g/L；优选为：蛋白胨5～15g/L，牛肉提取物1～3g/L，NaCl 3～6g/L，琼脂12～18g/L；最优选为：蛋白胨10g/L，牛肉提取物2g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L。

蛋白胨牛肉膏培养基的优选方案为：液体蛋白胨牛肉膏培养基中还包括大孔树脂5～40g/L；优选为10～30g/L，最优选为20g/L。

其中，蛋白胨牛肉膏培养基的pH值为5.0～8.0，优选为6.5。

本发明中的底物紫杉烷类化合物选自从红豆杉提取获得的单体紫杉烷类化合物或其粗提取物、通过红豆杉组织细胞培养获得的单体紫杉烷类化合物或其粗提取物。其中：C-13位连有侧链的紫杉烷选自：10-去乙酰紫杉醇，紫杉醇，10-去乙酰三尖杉宁碱，三尖杉宁碱，10-去乙酰紫杉醇C，紫杉醇C。

底物中的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇和产物中的10-去乙酰紫杉醇均具有很强地抑制细胞***作用。为了加大底物的投入量，在培养基中加入少量大孔树脂可以提高产率。大孔树脂可以吸附底物和产物，在转化过程中起到化合物缓控释的作用。大部分化合物被树脂吸附而没有进入反应体系当中，当底物反应后，反应体系中的底物含量减少，这时部分底物会进入体系继续进行酶催化作用，而生成的产物可以被大孔树脂吸附脱离反应体系，从而减少产物对微生物的作用。

底物紫杉烷类化合物可以环糊精包合、聚乙烯吡咯烷酮助溶、吐温助溶以及制成脂质体等方式加入培养基。

与阴沟肠杆菌功能等同的静息细胞、变异体和突变体或工程菌株，以及所生产的酶，可以在培养基、缓冲液中进行反应，也可以加入树脂、海藻酸钠、膨润土等固定化的细胞或酶物质来进行固定化反应。在培养基中加入少量固定的试剂可以提高产率。

阴沟肠杆菌或其功能等同的静息细胞、变异体和突变体或工程菌株，以及所生产的酶可以液液两相如水/乙酸乙酯等的形式进行两相生物转化反应。

本发明制备的紫杉烷化合物可用于治疗癌症和制备抗肿瘤药物：紫杉醇、多西紫杉醇或其他紫杉烷类药物的中间体。

本发明具有的有益的技术效果为：

1.本发明的阴沟肠杆菌具有双重的功能，即在麦麸培养基里既能水解7-木糖紫杉烷类化合物分子中的7-木糖基，又可以在蛋白胨牛肉膏培养基里水解带13-侧链紫杉烷分子中的13-侧链。从而简化了紫杉烷的制备工艺。

2.本发明的阴沟肠杆菌的生物活性强，对于传代和培养要求条件低，适于大规模的工业生产。

3.本发明的紫杉烷的制备方法，充分的利用了已有技术中提取紫杉醇的废弃物，变废为宝，产生巨大的经济效益，保护了生态环境。

4.本发明的紫杉烷的制备方法针对不同的底物紫杉烷类化合物进行定向的水解，可直接获得紫杉醇或合成紫杉醇及多西紫杉醇的中间体。

缩写和术语

XDT：7-木糖-10-去乙酰紫杉醇

DT：10-去乙酰紫杉

PDA：马铃薯葡萄糖琼脂培养基

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

TLC：薄层色谱

NMR：核磁共振波谱法

HPLC：高效液相色谱法

MS：质谱法

附图说明：

图1标准品(上图)与阴沟肠杆菌反应液(下图)的液相色谱图

图2阴沟肠杆菌反应液中色谱峰P的一级质谱和二级质谱图

图3乙酸乙酯残渣硅胶柱层析梯度洗脱流程图

图410-去乙酰紫杉醇的¹H-NMR图谱

图510-去乙酰紫杉醇的¹³C-NMR图谱

图6不同浓度的(NH₄)₂SO₄对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇转化的影响

图7木聚糖对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇转化的影响

图8温度对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇转化的影响

图9阴沟肠杆菌转化7-木糖-10-去乙酰紫杉醇生成10-去乙酰紫杉醇的动态曲线

图10 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇液固两相生物转化

具体实施方式：

为了进一步理解本发明，下面的实施例仅用来进一步说明本发明，但并不意味着对本发明的任何限制。

实施例1：阴沟肠杆菌的筛选及鉴定

对来源于东北红豆杉树木生长周围地表5cm以下的土壤样品的200余株微生物进行了7-木糖-10-去乙酰紫杉醇木糖基团水解能力的筛选，结果表明菌株阴沟肠杆菌具有7-木糖-10-去乙酰紫杉醇木糖基团水解能力。

将分离出的单株微生物保存于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上。在进行微生物初筛时将每一株菌株培养在2个盛装麦麸培养基的三角瓶内，培养2天后，一瓶仅加入DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶剂作为空白对照，另一瓶加入底物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的DMF溶液。继续培养7天后，过滤后的培养液用乙酸乙酯萃取。萃取液减压浓缩后通过薄层层析、高效液相层析、液相质谱联用等分析技术检测确认产物。随后，进行制备生物转化，通过反复柱层析获得产物，并通过核磁共振波谱技术确认。

1.阴沟肠杆菌对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解

挑取上步骤得到的阴沟肠杆菌的菌落于麦麸液体培养基中，培养条件为：110转/分钟，室温培养两天，作为转化微生物的种子。麦麸培养基食物配方为：麦麸50g，(NH₄)₂HPO₃ 2g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄7H₂O 0.1克，用蒸馏水补足到1000ml，pH值为6.5。

(1)、实验组：用无菌吸管吸取1ml(2％接种量)种子，加入到盛有50ml麦麸培养基的250ml三角瓶中，继续培养48小时。在菌的生长对数期加入30mg/ml的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的溶液0.5ml。继续培养7天。

(2)、对照组：用无菌吸管吸取1ml(2％接种量)种子，加入到盛有50ml麦麸培养基的250ml三角瓶中，继续培养48小时。在菌的生长对数期加入DMF0.5ml。继续培养7天。

2.对产物10-去乙酰紫杉醇的TLC(薄层色谱)检测

通过大量筛选之后，发现阴沟肠杆菌的反应液中除了7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的棕色斑点(比移值＝0.3)外，在极性较小处(比移值＝0.5)还存在另一棕色斑点，而且该斑点的位置与对照品10-去乙酰紫杉醇位置、颜色一致。

3.对产物10-去乙酰紫杉醇的HPLC(高效液相色谱)检测

将阴沟肠杆菌的反应液提取物用甲醇溶解定容到1ml，用0.22μm滤膜过滤后作为供试液待分析检测用。

分析条件：以Apollo C₁₈(5μm，250mm×4.6mm i.d.)作为分析柱，乙腈/水＝1/1(V/V)作为流动相，检测波长设为230nm，流速为1ml/min，进样体积为10μl；HPLC色谱仪为Agilent 1100型HPLC色谱仪。10-去乙酰紫杉醇为实验室保存标准品。在标准品与阴沟肠杆菌反应液的液相色谱图中可以看出阴沟肠杆菌的反应液在与标准品相同的保留时间(t_R15.5min)时有吸收峰P出现，紫外全波长扫描也表明它们有相同的紫外吸收光谱。见附图1。

4.对产物10-去乙酰紫杉醇的液相色谱质谱联用(LC/MS/MS)检测

HPLC条件：以乙腈/水/甲酸＝50/50/0.1(V/V/V)作为流动相，进样体积为0.1μl，供试样品、分析色谱柱、检测波长、流速同上。

MS条件：以N₂作为载气，流速6v/min；压力30.0psi，裂解温度设为325℃；

正离子扫描，扫描范围设在m/z 750-1050。

对反应液HPLC图谱中色谱峰P进行LC-MS分析检测，见附图2。在一级质谱中明显检测到m/z 812[M+H]⁺，m/z 834[M+Na]⁺，m/z 859[M+K]⁺准分子离子峰，表明该化合物的分子量为811，这与10-去乙酰紫杉醇的分子量吻合。进一步进行二级质谱检测，可以发现有m/z 268，286，527，794，751等分子碎片峰。而这些也都与10-去乙酰紫杉醇的质谱裂解特征相吻合。

5.10-去乙酰紫杉醇的制备与分离

主要材料与方法同步骤1。将500mg 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇溶于17mlDMF中，制成底物的DMF溶液。向35个装有350ml麦麸培养基的1000ml三角瓶内加入底物DMF溶液0.5ml；室温条件下转化培养7天后，过滤。菌液用乙酸乙酯萃取4次，减压蒸去乙酸乙酯得残渣4.78g。硅胶柱层析，梯度洗脱。详细流程见乙酸乙酯残渣硅胶柱层析梯度洗脱流程图，见附图3。

经过反复柱层析后，得到10-去乙酰紫杉醇92.4mg，得率为18.8％。未发生反应的底物经回收后共162.5mg，约占投入量的32.5％。目的产物紫杉醇的结构经¹H-NMR和¹³C-NMR得以确认，其¹H-NMR和¹³C-NMR谱图分别见附图4和附图5。

6)、转化产物10-去乙酰紫杉醇的核磁共振谱数据

白色粉末。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.11(2H，d，J＝7.6Hz，o-H of OBz)，7.75(2H，d，J＝7.6Hz，o-H of NH-Bz)，7.61(1H，m，p-H of OBz)，7.50(2H，m，m-H of OBz)，7.48(1H，m，p-H of NH-Bz)，7.45(2H，m，o-H of 3′-C₆H₅)，7.40(2H，m，m-H of3′-C₆H₅)，7.37(2H，m，m-H of NH-Bz)，7.33(1H，m，p-H of 3′-C₆H₅)，7.17(1H，d，J＝8.8Hz，NH-CO)，6.18(1H，t，J＝8.8Hz，H-13)，5.77(1H，dd，J＝9.2，2.0Hz，H-3′)，5.66(1H，d，J＝7.2Hz，H-2)，5.18(1H，s，H-10)，4.92(1H，d，J＝8.8Hz，H-5)，4.77(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，4.30(1H，d，J＝8.8Hz，H-20a)，4.20(1H，d，J＝8.8Hz，H-20b，overlapped)，4.20(1H，m，H-7，overlapped)，3.88(1H，d，J＝6.8Hz，H-3)，2.55(1H，ddd，J＝14.8，9.7，6.7Hz，H-6a)，2.37(3H，s，H-4OCOCH ₃)，2.29(2H，m，H-14)，1.85(1H，m，H-6b)，1.75(3H，s，H-18)，1.74(3H，s，H-19)，1.19(3H，s，H-16)，1.10(3H，s，1.10，H-17)。

¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ207.1(C-9)，172.5(C-1′)，170.5(4-COCH₃)，167.1(NH-CO)，167.0(2-COC₆H₅)，138.1(C-12)，137.9(quaternary C of 3-COC ₆H₅)，136.1(C-11)，133.7(p-C of 2-COC ₆H₅)，133.6(quaternary C of 3′-C ₆H₅)，131.9(p-Cof 3′-C ₆H₅)，130.2(o-C of 2-COC ₆H₅)，129.17(quaternary C of 2-COC ₆H₅)，128.96(m-C of NH-COC ₆H₅)，128.71(m-C of 2-COC₆H₅)，128.68(m-C of 3′-C ₆H₅)，128.3(p-C of NH-COC ₆H₅)，127.05(o-C of 3′-C ₆H₅)，127.02(o-C of NH-COC ₆H₅)，84.1(C-5)，81.1(C-4)，78.7(C-1)，76.7(C-20)，74.8(C-10)，74.5(C-2)，73.2(C-2′)，72.4(C-13)，72.0(C-7)，57.7(C-8)，55.0(C-3′)，46.4(C-3)，43.0(C-15)，36.9(C-14)，35.9(C-6)，26.5(C-17)，22.5(4-COCH₃)，20.6(C-16)，14.3(C-18)，9.8(C-19)。

实施例2：不同培养基对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇转化的影响

使用以下4种培养基作为微生物的转化体系：

培养基A：麦麸50g，K₂HPO₄ 2g，(NH₄)₂HPO₃ 2克，MgSO₄7H₂O，0.1克，蒸馏水定容至1000ml；

培养基B：牛肉膏提取物10g，NaCl 5g，蛋白胨10g，水1000ml；

培养基C：葡萄糖(或α-乳糖、半乳糖、蔗糖、甘露醇、果糖、甘油、肌醇、山梨醇、D-木糖中的一种)20g，蛋白胨2g，酵母提取物2g，K₂HPO₄ 1g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，NaCl 0.01g，MnSO₄·4H₂O 0.01g；

培养基D：土豆200g(煮沸20min后过滤)，葡萄糖20g，水1000ml；

配制上述4种培养基各50ml装入250ml三角瓶内，调节pH值至6.0。无菌条件下，向各瓶加入1ml已培养2天阴沟肠杆菌悬液。培养条件为：28℃，200rpm。继续培养2天，加入250μl底物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的DMF溶液。继续培养转化7天后用等体积的乙酸乙酯萃取各瓶反应液3次，合并有机相，减压浓缩后进行TLC以及HPLC分析。每个处理为2个平行。

结果显示：菌株只有在培养基A中经发酵后才能水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的木糖基团，而在培养基B中主要发生侧链水解反应，在培养基C中底物几乎不发生作用。在培养基A中加入不同的碳源(如果糖和半乳糖等)时发现，10-去乙酰紫杉醇的产率却几乎没有提高。见表1。

表1：阴沟肠杆菌在4种培养基中对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的转化

实施例3：不同浓度的硫酸铵对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇木糖基团水解的影响

配制麦麸培养基：麦麸50g，K₂HPO₄ 2g，(NH₄)₂HPO₃ 2克，MgSO₄7H₂O，0.1克，蒸馏水定容至1000ml；在麦麸培养基中加入硫酸铵，采用5个(NH₄)₂SO₄浓度分别为0、0.4％、1％、2％、3％，并相应编号为N₀、N₁、N₂、N₃、N₄。将配制好的各(NH₄)₂SO₄浓度的培养基，每250ml三角瓶内装入50ml麦麸培养基。操作方法同实施例2。转化产物的含量通过HPLC检测。将浓缩后得到的残渣用甲醇溶解并定容至10ml，过滤后作为HPLC供试液。每一浓度梯度作3次平行。

1)、标准溶液制备：分别精密称取7-木糖-10-去乙酰紫杉醇6.1mg，10-去乙酰紫杉醇9.7mg，7-木糖-10-去乙酰巴可亭III 1.6mg，用甲醇溶解并定容到5ml。分别精密吸取3种溶液10μl、20μl、50μl、100μl、150μl并定容到2ml作为不同浓度的标准溶液。

2)、液相分析条件：分析柱为BDS HYDERSIL C18，柱温为30℃，检测波长为230nm，流速为1.0ml/min，进样量5μl，水和乙腈作为流动相梯度洗脱。梯度条件表2：

表2水和乙腈的流动相梯度表

3)、上述3种物质在该条件下的回归方程及线性范围见表3：

表3

4)、含量检测结果：

麦麸培养基中的(NH₄)₂SO₄对产物的产率有促进作用。含量为0.4％时，转化产物的产量最高达到9.4mg/L，转化率也达到52.8％。见附图6。

实施例4：木聚糖对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇木糖基团水解的影响

配制麦麸培养基：麦麸50g，K₂HPO₄ 2g，(NH₄)₂HPO₃ 2克，(NH₄)₂SO₄ 4克，MgSO₄7H₂O 0.1克，蒸馏水定容至1000ml；再加入不同浓度的木聚糖，使加入的浓度分别为0、0.04％、0.06％、0.08％、0.16％，对应编号为A-E。加热使木聚糖完全溶解之后湿热灭菌。转化培养、底物和产物的提取分析过程同实施例1。每个处理作3次平行。DT和XDT的含量通过HPLC分析而得。

实验结果：在一定浓度范围内，木聚糖能增强选择性水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C-7木糖基团的能力。当木聚糖的浓度为0.06％时，DT的产量达到了12.69mg/L，转化率高达73.7％。继续增加木聚糖，DT的产量开始下降。见附图7。

实施例5：温度对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇木糖基团水解的影响

配制麦麸培养基：麦麸50g，K₂HPO₄ 2g，(NH₄)₂HPO₃ 2克，(NH₄)₂SO₄ 4克，MgSO₄7H₂O 0.1克，木聚糖0.6克，蒸馏水定容至1000ml。灭菌后向每三角瓶中加入1ml已培养2天的种子，在24℃下继续培养2天后加入底物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇。在不同的温度条件下进行转化。温度设置为24℃，28℃，37℃。转化方法、底物和产物的提取分析过程同实施例1。每个处理平行3次。10-去乙酰紫杉(DT)的产量和7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)的剩余量通过HPLC检测。结果显示，在所试验的温度范围内，温度越高，水解反应进行得也越彻底。在37℃条件下转化7天，转化率为18.1％，见附图8。

实施例6：7-木糖-10-去乙酰紫杉醇木糖基团水解生成10-去乙酰紫杉醇的动态曲线

配制麦麸培养基：麦麸50g，K₂HPO₄ 2g，(NH₄)₂HPO₃ 2克，(NH₄)₂SO₄4克，MgSO₄7H₂O 0.1克，木聚糖0.6克，蒸馏水定容至1000ml。每个250ml三角瓶内装入量为50ml。培养、转化操作方法同实施例1。底物加入之后将各三角瓶转入37℃进行转化培养。转化产物10-去乙酰紫杉醇(DT)的含量和底物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)的剩余量通过高效液相色谱法检测。用等量乙酸乙酯萃取各瓶发酵液3次，减压浓缩除去有机溶剂。将浓缩后得到的残渣用甲醇溶解并定容至10ml，溶液经0.45μm滤膜过滤后作为HPLC供试液。本次实验仅作一次处理。

在确定了培养转化的基本条件以后，我们为确定阴沟肠杆菌转化7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的最佳反应时间，在转化过程中每24小时取样，用高效液相色谱法分析底物XDT的消耗和主要产物DT的生成，以乙腈-水***梯度洗脱。

用阴沟肠杆菌对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇进行生物转化的过程中，共发生了两个反应：C-7木糖水解和C-13侧链水解，本实验中考察了主要反应C-7木糖水解的动态变化。XDT的剩余量在第7天达到了最低值为12.82mg/L，此时DT也处于比较高的水平，产量达到3.78mg/L，转化率达到25.53％。见附图9。在反应7天后，上升的趋势处于平缓。

实施例7：7-木糖-10-去乙酰紫杉醇液固两相生物转化

配制麦麸培养基：麦麸50g，K₂HPO₄ 2g，(NH₄)₂HPO₃ 2克，MgSO₄7H₂O，0.1克，(NH₄)₂SO₄ 4克，木聚糖0.6克，蒸馏水定容至1000ml；每个250ml三角瓶内装入量为50ml。再向每个三角瓶内放入装有1g大孔树脂的布袋。培养转化操作方法同实施例1的步骤1。本次实验使用5个处理，底物加入浓度为50mg、100mg、200mg、500mg、1000mg并分别对应编号A-E。转化产物10-去乙酰紫杉(DT)的含量和底物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)的剩余量通过高效液相色谱法检测。在转化7天之后取出口袋内大孔树脂并用乙醇反复冲洗，发酵液用乙酸乙酯萃取3次，合并2部分有机溶剂。将浓缩后得到的残渣用甲醇溶解并定容至10ml，溶液经0.45μm滤膜过滤后作为HPLC供试液。

7-木糖-10-去乙酰紫杉醇和10-去乙酰紫杉醇均具有很强地抑制细胞***作用。为了加大底物的投入量，我们研究了液固两相生物转化情况。培养基中加入少量大孔树脂可以吸附底物和产物，在转化过程中起到化合物缓控释的作用。大部分化合物被树脂吸附而没有进入反应体系当中，当底物反应后，反应体系中的底物含量减少，这时部分底物会进入体系继续进行酶催化作用，而生成的产物可以被大孔树脂吸附脱离反应体系，从而减少产物对微生物的作用。

在本实验中，加入不同浓度的底物对转化率没有较大影响，但相比以前的实验研究转化率要低。但当向每升发酵液中投入底物500mg时，DT产量获得了提高，达到43.63mg/L，提示两相发酵在某种程度上可以提高目的产物的产量。

在E处理中，底物XDT的剩余量和DT的产量与D处理中大致相当，但是XDT的投入量却是D处理的2倍。原因可能是在E处理中XDT加入量过大，大孔树脂吸附不完全使底物在发酵液中大量存在。又因底物在乙酸乙酯中溶解度不大，造成萃取不完全。见附图10。

实施例8：

使用静息细胞菌体和无细胞***作为转化的体系，试验步骤如下：

1)收集已在麦麸培养基中生长2天的阴沟肠杆细胞悬液1L；

2)将菌悬液在20,000×g条件下离心20min。倾倒出上清(细胞外液)，沉淀部分(活细胞体)重新悬浮于50mmol，pH为6.0的磷酸钾缓冲液中；

3)在上清和沉淀部分均加入底物DMF溶液。在37℃，200rpm条件下振荡24h，TLC检测酶活；

4)将离心得到的活细胞体用双蒸水冲洗几遍以确保无细胞外液残留。将细胞重新悬浮于双蒸水中，冷冻干燥；

5)收集干细胞，用50mmol pH 6.0的磷酸钾缓冲液重新悬浮，超声破碎。条件：220V，超声2s，间隔8s，处理80次，冰浴。其过程中间断性晃动。

6)将破碎的细胞在20,000×g条件下离心20min，倾出上清(细胞质)，沉淀部分(大的细胞膜碎片和未破碎的细胞)；

7)在上清和沉淀部分均加入底物DMF溶液。在37℃，200rpm条件下振荡24h，TLC检测酶活；

通过TLC检测了各个部分木糖苷酶活性，结果表明仅2次离心后的沉淀部分显示有木糖苷酶活性。这说明木糖苷酶是一个胞内酶，而且不游离在细胞质中。

Claims (19)

1.一种菌种保藏号为CGMCC No.2487阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或其功能等同的静息细胞、变异体和突变体及其生产的酶。

2.如权利要求1所述的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或其功能等同的静息细胞、变异体和突变体及其生产的酶的用途，其特征在于，在麦麸培养基在麦麸培养基在麦麸培养基中水解底物紫杉烷类化合物中的7-木糖紫杉烷的7-木糖基团，在蛋白胨牛肉膏培养基中水解底物紫杉烷类化合物中带13-侧链紫杉烷的13-侧链。

3.一种紫杉烷的制备方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或与其功能等同的静息细胞、变异体和突变体在麦麸培养基中水解底物紫杉烷类化合物中的7-木糖紫杉烷的7-木糖基团。

4.如权利要求3所述的紫杉烷的制备方法，其特征在于，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或与其功能等同的静息细胞、变异体和突变体在麦麸培养基中水解7-木糖紫杉烷的反应温度为15～50℃。

5.如权利要求3所述的紫杉烷的制备方法，其特征在于，液体麦麸培养基中含有麦麸10～100g/L，(NH₄)₂HPO₃ 1～5g/L，K₂HPO₄ 0.05～1.0g/L，MgSO₄7H₂O0.01～0.5g/L，pH值为5.0～8.0。

6.如权利要求3所述的紫杉烷的制备方法，其特征在于，液体麦麸培养基中还包括大孔树脂5～40g/L，pH值为5.0～8.0。

7.如权利要求3所述的紫杉烷的制备方法，其特征在于，固体麦麸培养基中含有麦麸10～100g/L，(NH₄)₂HPO₃ 1～5g/L，K₂HPO₄ 0.05～1.0g/L，MgSO₄7H₂O0.01～0.5g/L，琼脂10～20g/L，pH值为5.0～8.0。

8.如权利要求5、6、7中所述的任一紫杉烷的制备方法，其特征在于，所述的培养基中还包括重量百分比为0.01％～1.0％的木聚糖。

9.如权利要求8所述紫杉烷的制备方法，其特征在于，所述的木聚糖选自燕麦木聚糖、桦木木聚糖。

10.如权利要求5、6、7中所述任一紫杉烷的制备方法，其特征在于，所述的麦麸培养基中还包括重量百分比为0.01～1.0％的硫酸铵。

11.如权利要求3所述的紫杉烷的制备方法，其特征在于，底物7-木糖紫杉烷选自7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、7-木糖紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III、7-木糖巴卡亭III、7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱、7-木糖三尖杉宁碱、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C或7-木糖紫杉醇C。

12.一种紫杉烷的制备方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或与其功能等同的静息细胞、变异体和突变体在蛋白胨牛肉膏培养基中水解底物紫杉烷类化合物中带13-侧链紫杉烷的13-侧链。

13.如权利要求12所述的紫杉烷的制备方法，其特征在于，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或其功能等同的静息细胞、变异体和突变体在蛋白胨牛肉膏培养基中水解带13-侧链紫杉烷的反应温度为15～50℃。

14.如权利要求12所述的紫杉烷的制备方法，其特征在于，液体蛋白胨牛肉膏培养基中含有蛋白胨2～20g/L，牛肉提取物1～5g/L，NaCl 1～10g/L，pH值为5.0～8.0。

15.如权利要求12所述的紫杉烷的制备方法，其特征在于，液体蛋白胨牛肉膏培养基中还包括大孔树脂5～40g/L，pH值为5.0～8.0。

16.如权利要求12所述的紫杉烷的制备方法，其特征在于，固体蛋白胨牛肉膏培养基中含有蛋白胨2～20g/L，牛肉提取物1～5g/L，NaCl 1～10g/L，琼脂10～20g/L，pH值为5.0～8.0。

17.如权利要求12所述的紫杉烷的制备方法，其特征在于，C-13位连有侧链的紫杉烷类化合物选白10-去乙酰紫杉醇、紫杉醇、10-去乙酰三尖杉宁碱、三尖杉宁碱、10-去乙酰紫杉醇C或紫杉醇C。

18.一种紫杉烷的制备方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或与其功能等同的静息细胞、变异体和突变体及其生产的酶，水解底物紫杉烷类化合物中的7-木糖基团和13-侧链的酶促反应条件为：浓度为0.01mol/L～1.0mol/L的Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液，pH为4.5～8.0，温度为15～50℃。

19.如权利要求3或12所述的紫杉烷的制备方法，其特征在于，所述底物紫杉烷类化合物选自从红豆杉提取获得的单体紫杉烷类化合物或其粗提取物、通过红豆杉组织细胞培养获得的单体紫杉烷类化合物或其粗提取物。

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