CN101683165B

CN101683165B - 用于抑制血糖值上升的组合物以及饮食品

Info

Publication number: CN101683165B
Application number: CN2009102042116A
Authority: CN
Inventors: 宫田裕次; 寺井清宗; 玉屋圭; 前田正道; 林田诚刚; 德嶋知则; 田中隆; 田中一成; 西园祥子; 松井利郎
Original assignee: Juristic Person Of Nagasaki Public University; Kyushu University NUC; Nagasaki Prefectural Government; Nagasaki Prefectural University Corp
Current assignee: Juristic Person Of Nagasaki Public University; Kyushu University NUC; Nagasaki Prefectural Government; Nagasaki Prefectural University Corp
Priority date: 2006-02-02
Filing date: 2007-02-01
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2027-02-01
Also published as: CN101683165A; CN101011091B; CN101011091A

Abstract

本发明提供对于维持或改善健康具有有效的药效的新型发酵茶叶、发酵茶叶提取物、用于抑制血糖值上升的组合物以及使用这些的饮食品。即，提供含有混合、揉捏茶的叶子和枇杷叶并进行发酵的发酵茶叶、提取该发酵茶叶而得到的发酵茶叶提取物、用于抑制血糖值上升的组合物、含有该发酵茶叶和/或该发酵茶叶提取物的饮食品、以及含有用于抑制血糖值上升的组合物的饮食品。

Description

用于抑制血糖值上升的组合物以及饮食品

本案是申请日为2007年2月1日、中国申请号为200710003049.2、发明名称为“发酵茶叶、发酵茶叶提取物、用于抑制血糖值上升的组合物以及饮食品”的发明申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及混合使用茶的叶子和枇杷叶并将其发酵而形成的发酵茶叶、发酵茶叶提取物以及使用这些的饮食品。另外，本发明提供用于抑制血糖值上升的组合物以及含有该组合物的饮食品。

背景技术

已知茶具有抗氧化作用、抗癌作用、预防癌症、降低血中胆固醇作用、抑制血压上升作用等效果(例如，下述非专利文献1)。在下述专利文献1中，提出了使用番石榴叶的提取液中含有的抑制α-淀粉酶的物质的饮食品。

另外，现在对因不规则的饮食生活或运动不足等原因而引起的生活习惯病的关心很高，其中，糖尿病有大幅度增加的倾向。即使不引发糖尿病，高的血糖值也成为各种生活习惯病的信号，另外，由于肥胖被认为容易引起生活习惯病，因此，抑制血糖值上升的饮食品受到瞩目。

除了在下述专利文献1中记载的番石榴叶提取液以外，作为具有稳定地进行糖的吸收的作用的特定保健用食品，已知有以难消化性糊精、小麦白蛋白、L-***糖、豆豉抽提物作为有效成分的饮食品。

[专利文献1]特开平7-59539号公报

[非专利文献1]“茶的化学”村松敬一郎编(朝仓书店)p124-191

发明内容

发明要解决的问题

茶的原料或制法多种多样，对于药效成分仍有很多未知的部分。

由于茶是安全性高的食品，可以习惯性地摄取，因此，期待开发对维持或改善健康发挥有效的药效的新型的茶。

另外，近年来，对抑制血糖值上升的饮食品的关注在提高，因此要求更加有效的用于抑制血糖值上升的组合物以及饮食品。

本发明就是鉴于上述情况而作成的，其目的在于，提供一种对维持或改善健康具有有效的药效的新型的发酵茶叶、发酵茶叶提取物以及使用其的饮食品。

解决问题的方法

本发明提供一种发酵茶叶，其特征在于，混合、揉捏茶的叶子和枇杷叶，并进行发酵。

本发明提供一种发酵茶叶，其特征在于，混合茶的叶子和枇杷叶，并破坏组织，再进行发酵。

本发明提供一种发酵茶叶，其特征在于，混合茶的叶子和枇杷叶，并且磨碎，再进行发酵。

本发明提供一种发酵茶叶，其特征在于，在茶的叶子和枇杷叶中加入水并粉碎搅拌混合，再进行发酵。

本发明提供一种提取本发明的发酵茶叶而得到的发酵茶叶提取物。

本发明提供一种含有本发明的发酵茶叶的饮食品。

本发明提供一种含有本发明的发酵茶叶提取液的饮食品。

本发明的饮食品适合作为抑制血糖值上升的饮食品。

本发明的饮食品适合作为用于预防或改善糖尿病的饮食品。

本发明的饮食品适合作为用于降低中性脂肪的饮食品。

本发明的饮食品适合作为用于降低胆固醇的饮食品。

本发明的饮食品适合作为用于降低血清过氧化脂质的饮食品。

本发明的饮食品适合作为用于抑制体内脂肪蓄积的饮食品。

本发明的饮食品适合作为用于抑制血压上升的饮食品。

另外，本发明人等发现，以茶的叶子和枇杷叶作为原料制造的混合发酵茶叶的作为抑制血糖值上升作用指标的AGH抑制性(麦芽糖酶抑制性和蔗糖酶抑制性)高，并且在使用小鼠的实验中发挥优异的抑制血糖值上升的效果，对这样的带来优异的抑制血糖值上升效果的有效成分的特定进行深入研究的结果发现，茶多酚(theasinensin)A、具有棓酰基的茶黄素衍生物、以表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素、以及儿茶素棓酸酯类氧化缩合的多酚P等各成分分别显示高的AGH抑制性，所述多酚P在¹³C-NMR谱图中显示来自儿茶素A环的间苯三酚的信号和来自棓酰基的信号，其乙酰化物的分子量为1000～15000，并以2000为极大，以至完成本发明。

即，本发明提供一种用于抑制血糖值上升的组合物，其中含有选自下述物质中的1种以上：茶多酚A、具有棓酰基的茶黄素衍生物、以表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素、以及儿茶素棓酸酯类氧化缩合的多酚P，该多酚P在¹³C-NMR谱图中显示来自儿茶素A环的间苯三酚的信号和来自棓酰基的信号，其乙酰化物的分子量为1000～15000，并以2000为极大。

优选的用于抑制血糖值上升的组合物中，还含有枇杷原花青素。

另外，本发明提供一种用于抑制血糖值上升的组合物，其中包含发酵茶叶，所述发酵茶叶含有选自下述物质中的1种以上：茶多酚A、具有樯酰基的茶黄素衍生物、以表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素、以及儿茶素棓酸酯类氧化缩合的多酚P，该多酚P在¹³C-NMR谱图中显示来自儿茶素A环的间苯三酚的信号和来自棓酰基的信号，其乙酰化物的分子量为1000～15000，并以2000为极大。

优选的用于抑制血糖值上升的组合物中，上述发酵茶叶还含有枇杷原花青素。

另外，本发明提供一种用于抑制血糖值上升的组合物，其中包含发酵茶叶提取物，所述发酵茶叶提取物含有选自下述物质中的1种以上：茶多酚A、具有棓酰基的茶黄素衍生物、以表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素、以及儿茶素棓酸酯类氧化缩合的多酚P，该多酚P在¹³C-NMR谱图中显示来自儿茶素A环的间苯三酚的信号和来自棓酰的信号，其乙酰化物的分子量为1000～15000，并以2000为极大。

优选的用于抑制血糖值上升的组合物中，上述发酵茶叶提取物还含有枇杷原花青素。

另外，本发明提供一种含有本发明的用于抑制血糖值上升的组合物的饮食品。

发明的效果

按照本发明，可以得到具有抑制血糖值上升的效果、预防或改善糖尿病的效果、降低中性脂肪的效果、降低胆固醇的效果、降低血清过氧化脂质的效果、抑制体内脂肪蓄积的效果、或抑制血压上升的效果这样的对于维持/改善健康有效的效果的新型的发酵茶叶、发酵茶叶提取物以及使用这些的饮食品。

另外，按照本发明，可以得到具有良好的抑制血糖值上升作用的组合物以及含有该组合物的饮食品。

附图说明

图1是示出本发明涉及的混合发酵茶叶提取物的高速液相色谱分析结果的图。

图2是示出本发明涉及的混合发酵茶叶的成分分离操作的例子的流程图。

图3是示出本发明涉及的混合发酵茶叶中含有的多酚的例子的图。

图4是示出用本发明涉及的混合发酵茶叶的成分分离操作得到的级分的高速液相色谱分析结果的图。

图5是示出用本发明涉及的混合发酵茶叶的成分分离操作得到的级分中含有的原花青素的推测结构和硫醇分解物的例子的图。

图6是示出本发明涉及的混合发酵茶叶提取物以及作为比较例的单独发酵茶叶提取物的水溶性级分的高速液相色谱分析结果的图。

图7是示出本发明涉及的混合发酵茶叶提取物以及作为比较例的单独发酵茶叶提取物的乙酸乙酯可溶级分的高速液相色谱分析结果的图。

图8是示出从本发明涉及的混合发酵茶叶中分离的氧化型高分子多酚级分及其硫醇分解物的高速液相色谱分析结果的图。

图9是示出从本发明涉及的混合发酵茶叶中分离的氧化型高分子多酚级分和枇杷原花青素的¹³C-NMR谱图的图。

图10是示出实验例2的结果的曲线图。

图11是示出实验例3的结果的曲线图。

图12是示出实验例4的结果的曲线图。

图13是示出实验例8的结果的曲线图。

图14是示出实验例13的结果的曲线图。

图15是示出实验例13的结果的曲线图。

图16是示出实验例13的结果的曲线图。

图17是示出实验例13的结果的曲线图。

图18是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图19是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图20是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图21是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图22是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图23是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图24是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图25是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图26是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图27是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图28是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图29是示出临床试验例1的结果的曲线图。

图30是示出临床试验例2的结果的曲线图。

具体实施方式

[I]首先，对本发明的发酵茶叶、发酵茶叶提取物、以及含有它们的饮食品进行说明。

<发酵茶叶的原料>

在本发明中，作为原料使用的茶的叶子，是所说的山茶科的常绿灌木Thea sinensis L.的叶子。作为该叶子，除最初摘的新茶以外，还可以使用第二次摘的茶、第三次摘的茶、秋冬摘的茶、收割的茶等，优选含有比较多的多酚类的第二次摘的茶以后的廉价的茶的叶子。另外，这些迟割的粗茶现在价格低廉，相当一部分被废弃，可以有效地利用该粗茶。

特别是，在后述的实验例和分析试验例中使用的长崎东彼杵产的中国种的茶叶，优选在薮北茶树(ヤブキタ)种的茶叶中，由于含有在天然中被确认只存在很少的具有表阿夫儿茶精-3-O-樯酸酯为结构单元的原花青素，故优选。另外，作为可能含有具有表阿夫儿茶精-3-O-棓酸酯为结构单元的原花青素的茶叶，可以举出用于制造印度产的大吉岭红茶和中国产的祁门(キ一モン)红茶的茶叶。

如后面所述，该具有表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素具有高的AGH抑制性(麦芽糖酶抑制性和蔗糖酶抑制性)。

在本发明中，作为原料使用的枇杷叶是蔷薇科、植物名“枇杷”的叶子，可以没有特别限制地使用。

<发酵茶叶的制造方法>

本发明的发酵茶叶(以下，也称为混合发酵茶叶)如下所述进行制造。

首先，作为前处理，优选根据需要将枇杷叶和茶的叶子干燥，制成含水率为50～60质量％左右。另外，优选切成适当的尺寸，例如1～10mm见方左右的大小。

然后，将茶的叶子干燥，使水分量减少，并使之凋萎。在该工序中，可以使用如下方法，例如，使用粗揉机、直接用火或用电进行加热的锅或板状的器具一边搅拌茶的叶子，一边将温度为40～150℃的加热空气接触茶的叶子的方法；将茶叶投入到密闭搅拌的容器内并抽吸容器内的空气，使内部成为减压的状态并进行搅拌来干燥的方法；使用凋萎槽并从散布在网上的茶叶的下方通气的方法等。

通过该凋萎，如果使原料茶的叶子的含水率减少到45～65质量％、优选为50～60质量％左右，由于在下面的揉捏工序中难以从茶的叶子中揉出水分，因此可以防止有效成分的流失，同时可以抑制品质的降低。另外，在可以缩短后面的干燥工序这点上，也是优选的。

接着，将经过了凋萎工序的原料的茶的叶子边加压边揉搓(操捏)，同时，在揉捏时添加枇杷叶，将两者一起揉捏，枇杷叶可以在开始揉捏茶的叶子的同时添加，或者也可以在进行了一段时间的仅揉捏茶的叶子之后，添加枇杷叶再进行揉捏。优选从揉捏开始经过总揉捏时间的0～40％的时间之后再添加枇杷叶。更加优选从揉捏工序的最初添加枇杷叶。

枇杷叶的添加量优选枇杷叶/茶的叶子的干透质量比为5/95～35/65的范围，更加优选8/92～30/70的范围。如果枇杷叶的添加量为上述范围内，通过混合茶的叶子和枇杷叶，可以良好地获得抑制血糖值上升作用的提高效果。

揉捏可以适当采用使用在茶的叶子的揉捏中使用的通常的揉捏机的方法等公知的方法。

揉捏时间为15～25分钟。通过设定为该范围，可以使抑制血糖值上升的作用良好。

另外，揉捏时的原料的温度为20～40℃。低于20℃发酵不足，超过40℃时，品质降低显著。

通过该揉捏，茶的叶子和枇杷叶的组织被破坏，茶的叶子中含有的多酚氧化酶等氧化酶将茶的叶子和枇杷叶中含有的多酚氧化、聚合，生成氧化聚合物。

接着，将该状态的混合原料转移到发酵工序中。即，将揉捏后的混合原料以堆积成几cm厚的状态在温度20～27℃、湿度30～60％RH的发酵室内等环境下静置。另外，在茶类的制造工序中所说的“发酵”，是指通过叶中的氧化酶进行氧化反应的意思。

发酵时间为0～4小时。这里，发酵时间为0小时是由于在先前的操捏工序中在开始揉捏的同时开始发酵，不将揉捏工序的时间包含在发酵工序中时，也可以称发酵时间为0小时，实质上即使是0小时也进行发酵。发酵时间超过4小时时，得到的混合发酵茶叶或其提取物的味道、香气有降低的倾向。为了得到特别优异的AGH抑制性，发酵时间优选1小时以下，最为优选0小时。

接着，经过规定的发酵时间后，加热原料，停止发酵并进行干燥。例如，将原料投入到连续式干燥机中，并向其中吹入温度80～120℃的热风，使排气温度为50～60℃地进行操作。加热时间为10～30分钟左右就是充分的，由此，可以使原料中的含水率为5质量％左右。

在上述制造工序中，揉捏时间、发酵时间越长，AGH抑制性变得越低。另外，抗氧化作用(1，1-二苦基-2-苯基肼基(DPPH)消去活性)也变低。关注功能性来进行制造时，理想的是揉捏时间设定为15～25分钟，并且发酵时间尽量短。

另外，关于味道，发酵时间越长苦涩感越变强，香气也变差，发酵时间越短，味道、香气也越优异。

这样，可以得到混合发酵茶叶。加热工序后的茶叶是所谓的粗茶(荒茶)，根据需要还可以对其实施精加工，制成精加工茶。精加工可以适当采用再干燥、加热、筛分、整形、分选等与以往的茶叶制造中的精加工同样的工序。上述加热是进行再次加热来谋求增加香味的工序。通过进行精加工，可以提高贮存性、香气等品质，从而可以使商品性提高。另外，还可以将粗茶或精加工茶制成适当的大小的粉末状。

另外，如上所述，上述揉捏工序可以破坏茶的叶子和枇杷叶的组织，除了使用揉捏机的方法以外，还可以使用例如用手揉搓的方法、磨碎的方法、加入水进行粉碎的方法等来进行。

使用用手揉搓的方法时，通常可以适当使用揉混茶的叶子时使用的方法。例如，可以采用在被称为“大张草席(ねこぶき)”的用粗绳编织的具有凹凸的铺垫织物上用手揉混的方法等，也可以使用除此之外的方法。具体地，通过用手揉搓经过了凋萎工序的原料的茶的叶子的方法进行揉捏，同时在揉捏时添加枇杷叶，将两者一起揉捏。此时的揉捏时间优选20～30分钟，低于20分钟或超过30分钟时，得到的发酵茶的抑制血糖值上升的作用变低。其他条件等与上述相同。发酵工序可以与上述同样地进行。

在本方法中，揉捏时间、发酵时间越长AGH抑制性变得越低。另外，抗氧化作用(DPPH消去活性)也变低。关注功能性来进行制造时，理想的是揉捏时间设定为20～30分钟，并且发酵时间尽量短。

使用磨碎的方法时，可以采用使用茶的叶子的磨碎中使用的通常的乳钵的方法等，也可以使用除此之外的磨碎方法。具体地，磨碎经过了凋萎工序的原料的茶的叶子，同时在该磨碎混入时添加枇杷叶，磨碎混入两种原料。此时的磨碎时间优选15～25分钟，低于15分钟或超过25分钟时，得到的发酵茶的抑制血糖值上升的作用变低。磨碎时的原料的温度为20～40℃。低于20℃发酵不充分，超过40℃时，品质降低。另外，枇杷叶的添加时间可以在茶的叶子开始磨碎的同时添加，或者也可以在进行一定时间的只磨碎茶的叶子之后，添加枇杷叶再进行磨碎。可以在从磨碎开始经过总磨碎时间的0～40％的时间之后再添加枇杷叶。其他条件等与上述相同。

这样，通过磨碎，茶的叶子和枇杷叶的原料的组织被破坏，茶的叶子中含有的多酚氧化酶等氧化酶将茶的叶子和枇杷叶中含有的多酚氧化、聚合，生成氧化聚合物。发酵工序可以与上述同样地进行。

在本方法中，磨碎时间、发酵时间越长AGH抑制性变得越低。另外，抗氧化作用(DPPH消去活性)也变低。关注功能性来进行制造时，理想的是磨碎时间设定为15～25分钟，并且发酵时间尽量短。

另外，关于味道，发酵时间越长苦涩感变得越强，香气也变差，发酵时间越短，味道、香气也越优异。

使用加入水进行粉碎的方法时，可以通过向茶的叶子和枇杷叶中加入水并进行粉碎搅拌来将它们混合，同时破坏茶的叶子和枇杷叶的原料的组织。粉碎搅拌可以采用使用在茶的叶子的粉碎搅拌中使用的通常的混合器等的方法，也可以使用除此之外的粉碎搅拌方法。具体地，向经过了凋萎工序的原料的茶的叶子和枇杷叶中加入水并进行粉碎搅拌。茶的叶子和枇杷叶的混合比例与上述同样。相对于茶的叶子和枇杷叶的总量100质量份，加入的水的量优选20～200质量份，更加优选50～150质量份。

粉碎搅拌时间为5～15分钟，低于5分钟或超过15分钟时，得到的发酵茶的抑制血糖值上升的作用变低。粉碎搅拌时的原料的温度与上述相同，为20～40℃。

枇杷叶的添加时间可以在开始粉碎搅拌的同时添加，或者也可以在进行一定时间的仅粉碎搅拌茶的叶子之后，添加枇杷叶再进行粉碎搅拌。优选在从粉碎搅拌开始经过总粉碎搅拌时间的0～50％的时间之后再添加枇杷叶。

这样，通过粉碎搅拌，茶的叶子和枇杷叶被混合，同时，这些的原料组织被破坏，茶的叶子中含有的多酚氧化酶等氧化酶将茶的叶子和枇杷叶中含有的多酚氧化、聚合，生成氧化聚合物。

接着，在将通过粉碎搅拌得到的混合原料发酵的工序中，将粉碎搅拌后的混合原料以堆积成几cm厚的状态在温度20～27℃、湿度30～60％RH的发酵室内等环境下静置。发酵时间优选4～12小时。发酵时间低于4小时时，由于不进行发酵，因此抑制血糖值上升的作用低，并有青草味儿。发酵时间超过12小时时，得到的发酵茶的味道、香气有降低的倾向。在重视药效的情况下，优选4～12小时。即，发酵时间4～12小时的AGH抑制性特别高。另外，抗氧化作用(DPPH消去活性)也变高。关注功能性来进行制造时，理想的是粉碎搅拌时间保持在10～15分钟，发酵时间保持在4～12小时。另外，关于味道，如果在该时间以外，则苦涩感变强，香气也变差。

接着，经过规定的发酵时间后，加热原料，停止发酵并进行干燥。例如，将灌入了原料的容器放入到干燥机中，并吹入温度为80～120℃的热风，使排气温度为50～60℃地进行操作。加热时间优选60～120分钟左右，由此，可以使原料中的水分量为5％左右。这样，可以得到本发明的发酵茶，加热工序后的发酵茶可以粉碎成粉末状，也可以不进行粉碎而作为固体物使用。

<混合发酵茶叶中含有的成分>

作为这样得到的混合发酵茶叶中含有的成分，可以举出在后述的分析试验例中分离的成分。

对于通过本发明的混合发酵茶叶而发挥的有助于药效的有效成分的全部虽然还不明确，但通过后述的实验例和分析试验例可知，下述(1)～(4)的各成分显示高的AGH抑制性(麦芽糖酶抑制性和蔗糖酶抑制性)。

(1)茶多酚A(以下，有时也简记为TS-A)、

(2)具有樯酰基的茶黄素衍生物、

(3)具有表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素、

(4)儿茶素樯酸酯类氧化缩合的多酚P，该多酚P在¹³C-NMR谱图中显示来自儿茶素A环的间苯三酚的信号和来自樯酰基的信号，其乙酰化物的分子量为1000～15000，并以2000为极大(以下，有时也简记为多酚P)。

<成分(1)～(4)>

(1)茶多酚A是具有图3所示结构的化合物。

(2)具体地，具有樯酰基的茶黄素衍生物是选自茶黄素-3-O-棓酸酯(3-TFG)、茶黄素-3’-O-棓酸酯(3’-TFG)、茶黄素-3，3’-二-O-棓酸酯(3，3’-TFGG)中的1种以上。它们的结构示于图3。这些当中，特别是，茶黄素-3，3’-二-O-棓酸酯的AGH抑制性更强。

(3)具有表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素包含在后述的分析试验例3中的Fr.7中，通过采用巯基乙醇进行的硫醇分解，生成选自表儿茶酸(EC)、表棓儿茶酚(EGC)、表棓儿茶酚-3-O-棓酸酯(EGCg)、以及表儿茶酸-3-O-棓酸酯(ECg(以下，有时也记为ECG))中的1种以上、选自EGC-ME(以下，“-ME”表示“4-(2’-羟乙基硫代)醚”，例如，EGC-ME表示EGC的4-(2’-羟乙基硫代)醚，以下相同)、EC-ME、EGCg-ME以及ECg-ME中的1种以上、和表阿夫儿茶精-3-O-棓酸酯-ME。这样的原花青素的硫醇分解前的结构推定为例如图4所示结构。另外，(3)成分中的表阿夫儿茶精棓酸酯是指表阿夫儿茶精-3-O-棓酸酯。

该成分(3)来自于原料的茶的叶子，作为原料的茶的叶子，包含在使用含有(3)具有表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素的茶的叶子制造的混合发酵茶叶中。

上述(4)多酚P如例如后述的分析试验例5所示，通过下述方法得到：在室温下用60％乙醇(浓度60体积％的乙醇水溶液，下同)提取含有多酚P的发酵茶叶，将提取液依次用***、乙酸乙酯、正丁醇进行溶剂分配，将可以溶解在正丁醇中的部分溶解在60％甲醇中，并将得到的物质用SephadexLH-20柱以60％甲醇、80％甲醇、100％甲醇、接着是甲醇-水-丙酮(8∶1∶1)混合溶液、甲醇-水-丙酮(6∶2∶2)混合溶液、水-丙酮(1∶1)混合溶液依次洗脱，再将得到的洗脱液进行薄层层析(甲苯-甲酸乙酯-甲酸、1∶7∶1)分析，只收集含有不从原点移动的物质的级分并进行浓缩。

<枇杷原花青素>

另外，本发明的混合发酵茶叶的特征是，含有枇杷原花青素。如后述的分析试验例3所示，可以认为，在由AGH抑制性高的混合发酵茶叶的提取物得到的多个级分中，枇杷原花青素包含在AGH抑制性最高的级分(Fr.7)中，因此，有助于AGH抑制性。

<茶黄素类>

另外，本发明的混合发酵茶叶的特征是，通过添加枇杷叶，可以促进茶黄素类(茶黄素(TF)、茶黄素-3-O-棓酸酯(3-TFG)、茶黄素-3’-O-棓酸酯(3’-TFG)、茶黄素-3，3’-二-O-樯酸酯(3，3’-TFGG))的生成。

即，混合发酵茶叶中含有的茶黄素类的总的含量比除了未加入枇杷叶以外在相同条件下制造的茶的叶子的单独发酵茶叶中含有的茶黄素类的总含量多，例如，为1.5倍以上，优选2倍以上，更加优选2.5倍以上。上限虽然没有限制，但推测不能多于4倍。

例如，在后述的分析试验例4以及图7(发酵茶叶抽提物的乙酸乙酯可溶性级分的高速液相色谱(以下，有时简记为HPLC)分析结果)中，混合发酵茶叶抽提物与单独发酵茶叶抽提物相比，茶黄素类的峰面积的总计增加到约2.7倍，可知通过添加枇杷叶大幅促进了茶黄素类的生成。

<多酚P>

另外，本发明的混合发酵茶叶的特征是，通过添加枇杷叶促进了上述(4)成分(多酚P)的生成。

即，混合发酵茶叶中含有的多酚P的含量比除了未加入枇杷叶以外在相同条件下制造的茶的叶子的单独发酵茶叶中含有的多酚P的含量多。例如，为1.2倍以上，优选2倍以上，更加优选3倍以上。上限虽然没有限制，但推测不能多于4倍。

例如，在后述的分析试验例4以及图6(发酵茶叶抽提物的水溶性级分的HPLC分析结果)中，混合发酵茶叶抽提物与单独发酵茶叶抽提物相比，作为基线的凸起而被检测出的物质的峰面积增加到约1.59倍(159％)，可以认为该增加的部分来自通过添加枇杷叶而促进生成的儿茶酸氧化生成物。在分析试验例5中，该儿茶酸氧化生成物相当于作为上述多酚P的特定的成分。

<香气成分>

另外，本发明的混合发酵茶叶具有如下特征的香气成分组成：含有1-己醇、反-2-己烯醛、乙酸3-己烯-1-醇酯、3-己烯-1-醇、里哪醇、苯甲醛、水杨酸甲酯、香叶醇、以及橙花叔醇的香气成分，在固相微提取法中，反-2-己烯醛、乙酸3-己烯-1-醇酯、3-己烯-1-醇、里哪醇、苯甲醛、水杨酸甲酯、香叶醇、以及橙花叔醇的香气成分的各峰面积均比1-己醇的峰面积大。

上述举出的香气成分中，如后述的分析试验例10所示，里哪醇、苯甲醛、水杨酸甲酯、香叶醇、以及橙花叔醇在红茶等发酵茶中含有较多，在绿茶等非发酵茶以及发酵的枇杷叶中是少的香气成分。另外，反-2-己烯醛、乙酸3-己烯-1-醇酯以及3-己烯-1-醇是在发酵的枇杷叶中较多含有的香气成分。本发明的混合发酵茶叶以比较多的含量具有这些香气成分，由此，可以品味到作为发酵茶的特有的香气。

<效果>

本发明的混合发酵茶叶，如后述的实验例所示，显示高的AGH抑制性，通过摄取该混合发酵茶叶，可以得到抑制血糖值上升的作用，并可以获得预防或改善糖尿病的效果、降低中性脂肪的效果、降低胆固醇的效果、降低血清过氧化脂质的效果、抑制体内脂肪蓄积的效果、或抑制血压上升的效果。优选同时获得这些效果的2种以上，还可以同时得到全部的效果。

<发酵茶叶提取物>

本发明的发酵茶叶提取物(以下，有时也称为混合发酵茶叶提取物)是用提取溶剂将发酵茶叶的可溶性成分提取而得到的提取物。提取溶剂可以是水(包含温水或热水)，也可以是有机溶剂。作为有机溶剂的具体例子，可以举出甲醇、乙醇、丙酮等。作为本发明的用于抑制血糖值上升的组合物的发酵茶叶提取物的形态，没有特别限定，可以是溶液状，也可以是其浓缩物，还可以是通过冷冻干燥等干燥的固体。固体的情况下，可以是块状，还可以是将其粉碎成适当的大小的粉末状。将发酵茶叶提取物以含有有机溶剂的形态用于饮食品中时，可以使用乙醇作为有机溶剂。

提取条件没有特别限制，但在用水进行提取时，优选将发酵茶叶浸在温度为40～100℃的温水或热水中3分钟～60分钟左右来进行提取。水和发酵茶叶的比例优选相对于100质量份水，发酵茶叶(含水率5质量％)为0.5～20质量份左右，更加优选0.5～5质量份左右。

用有机溶剂进行提取时，优选相对于100质量份有机溶剂使用0.1～20质量份左右的发酵茶叶(含水率5质量％)，并在常压或加压下、在温度-20～60℃、时间1～60分钟的条件下进行，但并不限定于该范围，可以适当变更。

提取处理后，通过过滤、离心分离等除去固体成分，得到提取液。

在混合发酵茶叶提取物中含有混合发酵茶叶的可溶性成分，如后述的实验例和分析试验例所示，显示高的AGH抑制性。另外，如后述的实验例和分析试验例所示，通过摄取该混合发酵茶叶提取物，可以得到抑制血糖值上升的效果、预防或改善糖尿病的效果、降低中性脂肪的效果、降低胆固醇的效果、降低血清过氧化脂质的效果、抑制体内脂肪蓄积的效果、或抑制血压上升的效果。优选的是同时获得这些效果的2种以上，还可以同时得到全部的效果。

<饮食品>

本发明的饮食品是含有混合发酵茶叶的饮食品、或者是含有混合发酵茶叶提取物的饮食品，并且只要是可以口服摄取形态的饮食品，则没有特别限定。还可以含有混合发酵茶叶和混合发酵茶叶提取物两者。

本发明的饮食品是例如含有混合发酵茶叶提取物的各种饮料。另外，混合发酵茶叶提取物是用水提取混合发酵茶叶而得到的提取物，如果具有可以直接饮用的风味，还可以将该提取物制成茶饮料。

另外，是将混合发酵茶叶和/或混合发酵茶叶提取物添加到各种食品原材料中的食品。作为食品原材料，没有特别限定，涉及纳豆、豆乳、酱、酱油等大豆食品；鱼肉山芋丸子、鱼糕、圆筒状鱼糕等熬炼的膏状制品；火腿、香肠等肉制加工品；饴糖、奶糖、豆馅糯米点心、羊羹等点心类等多种食品原材料。

本发明的饮食品中的混合发酵茶叶和/或混合发酵茶叶提取物的含量是任意的，可以根据想要获得的药效的程度、以及期望的风味和摄取量适当设定。

例如，用于抑制血糖值上升的食品的情况下，可以以添加的混合发酵茶叶和混合发酵茶叶提取物各自的AGH抑制性(例如IC₅₀)为基准，根据想要获得的抑制血糖值上升效果、以及期望的风味和摄取量适当设定。

将用水提取发酵茶叶而得到的提取物直接制成茶饮料时，水和发酵茶叶的比例优选相对于100质量份的水，发酵茶叶(含水率5质量％)为0.5～20质量份左右。另外，提取方法优选浸在温度为40～100℃的温水或热水中3分钟～60分钟的方法。

将发酵茶叶添加到食品原材料中的情况下，例如，相对于100质量份的食品原材料，发酵茶叶(含水率5质量％)在0.1～200质量份的范围适当决定。

这样的本发明的饮食品含有混合发酵茶叶和/或混合发酵茶叶提取物，通过摄取该物质，可以得到抑制血糖值上升的效果、预防或改善糖尿病的效果、降低中性脂肪的效果、降低胆固醇的效果、降低血清过氧化脂质的效果、抑制体内脂肪蓄积的效果、或抑制血压上升的效果。优选的是同时获得这些效果的2种以上，还可以同时得到全部的效果。

[II]接着，对本发明的用于抑制血糖值上升的组合物以及含有该组合物的饮食品进行说明。

本发明的用于抑制血糖值上升的组合物含有选自：

(1)茶多酚A(以下，有时也简记为TS-A)、

(2)具有棓酰基的茶黄素衍生物、

(3)具有表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素、

(4)儿茶素棓酸酯类氧化缩合的多酚P，该多酚P在¹³C-NMR谱图中显示来自儿茶素A环的间苯三酚的信号和来自棓酰基的信号，其乙酰化物的分子量为1000～15000，并以2000为极大(以下，有时也简记为多酚P)中的1种或2种以上的成分。含有2种以上时的组合是任意的，更加优选含有全部4种。

如后述的实验例和分析试验例所示，这些(1)～(4)成分任何一种都是显示高的AGH抑制性(麦芽糖酶抑制性和蔗糖酶抑制性)的成分。

含有这样的成分的本发明的用于抑制血糖值上升的组合物，通过口服摄取，可以得到抑制血糖值上升的效果。

(1)～(4)成分的说明与上述<成分(1)～(4)>相同。

本发明的用于抑制血糖值上升的组合物的优选的实施方式是含有上述(1)～(4)成分的1种以上的发酵茶叶或发酵茶叶提取物。

所谓发酵茶叶，是不进行采用加热的氧化酶失活而是经过将作为原料的叶子进行揉捏的工序而得到的发酵茶叶，在制造过程中产生由于氧化酶产生的成分的氧化。作为本发明的用于抑制血糖值上升的组合物的发酵茶叶的形态，没有特别限定，可以是将产生发酵的茶叶加热来停止发酵，并进行干燥的茶叶(所谓的粗茶)，另外，也可以是根据需要实施了精加工的精加工茶。另外，还可以将粗茶或加工茶制成适当大小的粉末状。

所谓的发酵茶叶提取物，是用提取溶剂将发酵茶叶的可溶性成分提取而得到的提取物。提取溶剂可以是水(包含温水或热水)，也可以是有机溶剂。作为有机溶剂的具体例子，可以举出甲醇、乙醇、丙酮等。作为本发明的用于抑制血糖值上升的组合物的发酵茶叶提取物的形态，没有特别限定，可以是溶液状，也可以是其浓缩物，还可以是通过冷冻干燥等干燥的固体。固体的情况下，可以是块状，还可以是将其粉碎成适当的大小的粉末状。将发酵茶叶提取物以含有有机溶剂的形态用于饮食品中时，可以使用乙醇作为有机溶剂。

提取条件没有特别限制，但在用水进行提取时，优选将发酵茶叶浸在温度为40～100℃的温水或热水中3分钟～60分钟来进行提取。水和发酵茶叶的比例优选相对于100质量份水，发酵茶叶(含水率5质量％)为0.5～20质量份左右，更加优选0.5～5质量份左右。

用有机溶剂进行提取时，优选相对于100质量份有机溶剂，使用0.1～20质量份左右的发酵茶叶(含水率5质量％)，并在常压或加压下、在温度-20～60℃、时间1～60分钟的条件下进行，但并不限定于该范围，可以适当变更。

本发明中的发酵茶叶优选混合茶的叶子和枇杷叶并进行揉捏、发酵而形成的混合发酵茶叶。在该混合发酵茶叶中含有上述(1)茶多酚A、(2)具有棓酰基的茶黄素衍生物、以及(4)上述多酚P。

另外，作为原料的茶的叶子，由于在使用含有上述(3)具有表阿夫儿茶精樯酸酯为结构单元的原花青素的茶的叶子制造的混合发酵茶叶中含有全部上述(1)～(4)的成分，故更加优选。

在上述混合发酵茶叶的特征是，含有枇杷原花青素。

枇杷原花青素的说明与上述<枇杷原花青素>相同。

另外，在上述混合发酵茶叶中，与茶的叶子和枇杷叶分别单独同样地揉捏、发酵而得到的单独发酵茶叶相比，茶黄素类(茶黄素(TF)、茶黄素-3-O-樯酸酯(3-TFG)、茶黄素-3’-O-棓酸酯(3’-TFG)、茶黄素-3，3’-二-O-棓酸酯(3，3’-TFGG))的总含量更多。

另外，在上述混合发酵茶叶中，与茶的叶子和枇杷叶分别单独同样地揉捏、发酵而得到的发酵茶叶相比，(4)上述多酚P的含量更多。

上述混合发酵茶叶可以用以下的方法制造。

作为原料使用的茶的叶子和枇杷叶的说明与上述<发酵茶叶的原料>相同。

制造混合发酵茶叶的方法与上述<发酵茶叶的制造方法>相同。

本发明的用于抑制血糖值上升的组合物中的上述(1)茶多酚A、(2)具有棓酰基的茶黄素衍生物、(3)具有表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素、(4)多酚P的各成分的含量没有特别的限定。可以以各成分具有的AGH抑制性(例如IC₅₀)为基准，根据想要获得的抑制血糖值上升效果、以及该用于抑制血糖值上升的组合物的摄取量适当设定。

本发明的饮食品含有本发明的用于抑制血糖值上升的组合物，并且，只要是可以口服摄取的形态的饮食品即可，没有特别限定。

例如，含有作为本发明的用于抑制血糖值上升的组合物的发酵茶叶提取物的各种饮料。另外，该发酵茶叶提取物是用水提取发酵茶叶而得到的提取物，如果具有可以直接饮用的风味，还可以将该提取物制成茶饮料。

另外，是将作为本发明的用于抑制血糖值上升的组合物的发酵茶叶或发酵茶叶提取物添加到各种食品原材料中的食品。作为食品原材料，没有特别限定，涉及纳豆、豆浆、豆酱、酱油等大豆食品；鱼肉山芋丸子、鱼糕、圆筒状鱼糕等熬炼的膏状制品；火腿、香肠等肉制加工品；饴糖、奶糖、豆馅糯米点心、羊羹等点心类等多种食品原材料。

本发明的饮食品中的用于抑制血糖值上升的组合物的含量是任意的，可以以用于抑制血糖值上升的组合物本身具有的AGH抑制性(例如IC₅₀)为基准，根据想要获得的抑制血糖值上升的效果、以及期望的风味和摄取量适当设定。

例如，将用水提取发酵茶叶而得到的提取物直接制成茶饮料时，水和发酵茶叶的比例优选相对于100质量份的水，发酵茶叶(含水率5质量％)为0.5～20质量份左右。另外，提取方法优选浸在温度40～100℃的温水或热水中3分钟～60分钟的方法。

另外，将发酵茶叶添加到食品原材料中时，例如，相对于100质量份的食品原材料，发酵茶叶(含水率5质量％)可以在0.1～200质量份的范围适当决定。

这样的含有本发明的用于抑制血糖值上升的组合物的饮食品，可以通过摄取该用于抑制血糖值上升的组合物而获得抑制血糖值上升的效果。

实施例

在以下的实验例和分析试验例中，只要没有特别说明，“％”为“质量％”。

以下的实验例和分析试验例中使用的原料的“茶的叶子”，均为长崎县综合农林试验场东彼杵茶叶支场栽培的ヤブキタ种的第三次摘的茶的叶子。另外，只要没有特别说明，揉捏是使用揉捏机进行。

另外，实施例1、分析试验例1～5中的AGH抑制性的评价依照由松井等人提出的使用了游离AGH的方法(J.Agric.Food Chem.，47，550-553，(1999))进行，并且用α-葡糖苷酶(AGH)酶活性的抑制率(单位：％)来表示测定结果。

[实验例1]

(混合发酵茶叶的制造)

将枇杷叶投入到茶的叶子中，用揉捏机揉混。茶的叶子和枇杷叶的混合比例为茶的叶子∶枇杷叶的质量比为90∶10(枇杷投入比例为10％)和75∶25(枇杷投入比例为25％)2种。揉混时间为20分钟和40分钟两种。

此后，经过0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、24小时的6种发酵工序，得到24种混合发酵茶叶。另外，发酵工序0小时的茶叶是揉混刚结束时得到的混合发酵茶叶。

(感观审查)

由具有绿茶的感观审查经验的3名参加者按照绿茶的审查方法对上述得到的24种混合发酵茶叶进行香气和味道的评判。审查时，是在审查茶碗中加入3g混合发酵茶叶并注入180ml热水，在注入热水后对香气进行评判，在5分钟后对味道进行审查，结果示于表1。

[表1]

·香气、味道分别以5分为满分

·绿茶的感观审查中，最初摘的新茶为6～7分、第二次摘的茶为稍低于5分、第三次摘的茶为5分

如表1的结果所示，关于味道、香气，在揉捏时间20分钟、发酵时间0～4小时时，香气浓，并且后味清爽，优异。揉捏时间为40分钟时，味道降低，发酵时间为6小时以上时，香气的恶化明显。

(AGH活性的测定)

在上述得到的24种混合发酵茶叶中，对除了发酵时间为6小时和24小时的混合发酵茶叶以外的16种，测定在100℃的热水中提取10分钟而得到的提取液(混合发酵茶叶使用量：2.0mg/ml)的AGH抑制性。结果示于表2。

另外，将市售的绿茶、枇杷茶、番石榴茶、红茶分别同样地用热水提取，并对提取液同样地测定AGH抑制性。结果示于表3。

[表2]

[表3]

试料	麦芽糖酶抑制率(％)	蔗糖酶抑制率(％)
			绿茶	61.2	61.3
枇杷叶	55.4	58.5
			番石榴茶	48.3	38.3
红茶	55.6	52.7

如表2所示，AGH抑制性为，枇杷叶相对于茶的叶子的配合比例变多时，抑制率变低，即使揉捏时间长也变低。另外，随着发酵时间变长，抑制率有变低的倾向。

另外，由表2、3的结果可知，特别是在枇杷叶的配合比例为10质量％、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0～1小时，以及枇杷叶的配合比例为25质量％、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时的条件下，可以得到比绿茶优异的AGH抑制性。

[分析试验例1]

在室温下用70％丙酮(浓度70体积％的丙酮水溶液，下同)提取在表2中显示优异的AGH抑制性的混合发酵茶叶(茶的叶子和枇杷叶的配合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时)，将提取液浓缩制成水溶液后，加入***进行溶剂分配，除去叶绿素等脂溶性成分。得到的水层用高速液相色谱(HPLC)进行分析，结果示于图1。

如图1所示，除了作为绿茶成分的咖啡因、表儿茶酸(EC)、表樯儿茶酚(EGC)、表棓儿茶酚-3-O-樯酸酯(EGCg)、以及表儿茶酸-3-O-棓酸酯(ECg)以外，还检测出了由这些儿茶素的氧化而生成的二聚体茶多酚C、茶多酚E、茶多酚A、茶多酚D(与EGCg重合)、茶黄素类(包含茶黄素(TF)、茶黄素-3-O-棓酸酯(3-TFG)、茶黄素-3’-O-棓酸酯(3’-TFG)、茶黄素-3，3’-二-O-棓酸酯(3，3’-TFGG))的峰。另外，还发现了作为基线的凸起被检测出的儿茶素氧化生成物的存在。

[分析试验例2]

使在表2中显示优异的AGH抑制性的混合发酵茶叶(茶的叶子和枇杷叶的配合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时)干燥，并将该干燥发酵茶叶按照图2所示的程序分级。

<操作(1)>将125g干燥发酵茶叶(含水率5质量％)与2L 70％的丙酮一起在破碎机(制品名；旋转混合机7011S型，FMI(エフ·エム·アイ)公司制造)中破碎，过滤。用3L 70％的丙酮提取残渣，得到丙酮提取液，然后，用3L甲醇提取残渣，得到甲醇提取液。将上述过滤得到的滤液、上述丙酮提取液、上述甲醇提取液合并，用旋转式蒸发器浓缩后，干燥，得到59.9g提取物(干燥物)。

<操作(2)>将得到的提取物悬浮在水中，加入***进行溶剂分配，除去叶绿素等脂溶性成分。

<操作(3)>将操作(2)得到的水层灌入到用水制备的Sephadex LH-20柱(フアルマシアフアインケミカル公司制造，4cm×28cm)中，依次用水(500mL)、40％甲醇(200mL)、60％甲醇(300mL)、80％甲醇(300mL)、甲醇(300mL)、60％丙酮(500mL)洗脱。

将洗脱液浓缩，分级成级分Fr.1(18.66g)、Fr.2(5.79g)、Fr.3(3.12g)、Fr.4(4.87g)、Fr.5(6.01g)、Fr.6(3.55g)、Fr.7(2.07g)。

对各级分测定AGH抑制活性时，如下述表4所示，Fr.6和Fr.7显示非常高的抑制率。

[表4]

	麦芽糖酶抑制率(％)	蔗糖酶抑制率(％)
			Fr.6	94.2	89.1
Fr.7	96.3	91.3

因此，再用图2所示的操作对Fr.6和Fr.7进行分离纯化。

<操作(4)>对Fr.6和Fr.7，分别加载在MCIgelCHP20P(三菱化学公司制造，3cm×28cm)，依次用20％甲醇(100mL)、30％甲醇(100mL)、40％甲醇(100mL)、50％甲醇(100mL)、60％甲醇(100mL)、70％甲醇(100mL)、80％甲醇(100mL)、90％甲醇(100mL)、甲醇(200mL)洗脱。

浓缩得到的洗脱液，由Fr.6得到Fr.6-1(899mg)、Fr.6-2(2.16g)、Fr.6-3(282mg)的级分。另外由Fr.7得到Fr.7-1(67mg)、Fr.7-2(1.17g)、Fr.7-3(600mg)的级分。

其中，Fr.6-1和Fr.7-1测定氢核磁共振(¹H-NMR)谱图，通过与标准品的谱图进行比较，分别鉴定为茶多酚A和茶多酚D。由HPLC和薄层层析的结果，Fr.6-3和Fr.7-3均鉴定为茶黄素类。

<操作(5)>将Fr.6-2和Fr.7-2合并的物质加载在ChromatorexODS(富士シリシア公司制造，3cm×30cm)，依次用10％甲醇(100mL)、20％甲醇(100mL)、30％甲醇(100mL)、40％甲醇(100mL)、50％甲醇(100mL)、60％甲醇(100mL)、甲醇(200mL)洗脱。

将得到的洗脱液浓缩，分级成Fr.721(179mg)、Fr.722(1.10g)、Fr.723(530mg)、Fr.724(1.27g)。

其中，Fr.721测定¹H-NMR谱图，鉴定为EGCg和茶多酚A的混合物。

<操作(6)>将Fr.722和723合并的物质灌入到Sephadex LH-20柱(3cm×20cm)中，依次用乙醇(500mL)、90％乙醇(200mL)、20％甲醇(300mL)、60％丙酮(400mL)洗脱。

将得到的洗脱液浓缩，分级成Fr.7221(3.7mg)、Fr.7222(41.3mg)、Fr.7223(47.0mg)、Fr.7224(166.2mg)、Fr.7225(458mg)、Fr.7226(657.5mg)。

其中，Fr.7221、Fr.7222、Fr.7223、Fr.7224测定¹H-NMR谱图，通过与标准品的谱图进行比较，分别鉴定为没食子酸、ECg、EGCg、表棓儿茶酚-3，3’(4’)-O-棓酸酯。

<操作(7)>将Fr.7225加载在DiaionHP20SS(三菱化学公司制造，2cm×20cm)，依次用20％甲醇(100mL)、25％甲醇(100mL)、30％甲醇(100mL)、35％甲醇(100mL)、40％甲醇(100mL)、45％甲醇(100mL)、50％甲醇(100mL)、60％甲醇(100mL)、甲醇(200mL)洗脱。

将得到的洗脱液浓缩，分级成Fr.72251(39.6mg)、Fr.72252(320mg)、Fr.72253(47.7mg)。

其中，Fr.72251测定¹H-NMR谱图，通过与标准品的谱图进行比较，鉴定为乌龙茶氨酸(ウ一ロンテアニン)。

<操作(8)>将Fr.72252加载在ChromatorexODS(富士シリシア公司制造，2cm×20cm)，依次用10％甲醇(100mL)、20％甲醇(100mL)、30％甲醇(100mL)、40％甲醇(100mL)、50％甲醇(100mL)、60％甲醇(100mL)、甲醇(200mL)洗脱。

将得到的洗脱液浓缩，分级成Fr.722521(10.5mg)、Fr.722522(38.3mg)、Fr.722523(60mg)。

其中，Fr.722521测定¹H-NMR谱图，鉴定为表棓儿茶酚-3，3’(4’)-O-棓酸酯。

<操作(9)>将Fr.722523灌入到Sephadex LH-20柱(1.5cm×20cm)中，依次用80％甲醇(200mL)、90％甲醇(200mL)、甲醇(200mL)、60％丙酮(200mL)洗脱。

将得到的洗脱液浓缩，分级成Fr.7225231(14.4mg)、Fr.7225232(16.1mg)、Fr.7225233(15.5mg)。

其中，Fr.7225232测定¹H-NMR谱图，通过与标准品的谱图进行比较，鉴定为棓酰基乌龙茶氨酸。

由这些结果可知，AGH抑制活性高的Fr.6和7的下述级分中分别含有下述化合物。下述化合物的结构示于图3。

Fr.6-1：茶多酚A(TS-A)、

Fr.6-3、7-3：茶黄素(TF)混合物(包含茶黄素、茶黄素-3-O-棓酸酯、茶黄素-3’-O-棓酸酯、茶黄素-3，3’-二-O-樯酸酯)、

Fr.7-1：茶多酚D(TS-D)、

Fr.7221：没食子酸、

Fr.7222：表儿茶酸-3-O-棓酸酯(ECg)、

Fr.7223：表棓儿茶酚-3-O-樯酸酯(EGCg)、

Fr.7224和Fr.722521：表棓儿茶酚(EGC)-3，3’(4’)-二-O-棓酸酯、

Fr.72251：乌龙茶氨酸、

Fr.7225232：棓酰基乌龙茶氨酸。

另外，将上述各化合物的含量定量的结果示于图2中。由该结果可知，AGH抑制活性高的Fr.6的主要成分为茶多酚A。另外可知，AGH抑制活性高的Fr.7的主要成分为茶黄素(TF)混合物。分别测定该茶黄素混合物中含有的上述茶黄素类的AGH抑制活性时，特别是，茶黄素-3，3’-O-棓酸酯显示强的酶抑制活性。这可由后述的分析试验例5、6的结果知道。

[分析试验例3]

对在上述分析试验例2中显示非常高的AGH抑制活性的Fr.7进行HPLC分析，结果示于图4A。分析条件为：

柱：Cosmosil 5C₁₈ ARII(ナカライテスク公司制造，4.6×250mm)

柱温度：35℃

移动相：A；50mM磷酸、B；CH₃CN、B 4％到30％(39分钟)、30％到75％(15分钟)

流速：0.8ml/min

检测：采用光电二极管阵列检测(Max absorbance)。

(另外，在以下的分析试验例中的HPLC分析条件，只要没有特别说明，与本试验例相同)。

由该图的结果可以明确：在Fr.7中，除了在上述分析试验例2中确定存在的茶黄素混合物以及上述化合物以外，还含有相当多的在薄层层析(TLC)分析中作为原点检测出的、以及在HPLC分析中作为基线的凸起检测出的物质。这些物质主要被分级在图2中的Fr.724中。

由于这些物质在各种柱色谱中的行为以及紫外可见吸收光谱与EGCg类似，并且对氯化铁试剂和香草醛盐酸试剂为阳性，因此，推测为分子量比上述分析试验例2中确定存在的儿茶素类大的儿茶素氧化生成物。

通常已知，在茶所含有的高分子多酚的典型的物质中存在原花青素，在枇杷叶中含有以表儿茶精为结构单元的原花青素(枇杷原花青素)，因此，推测在上述Fr.7中的“分子量大的儿茶素氧化生成物”中含有原花青素。

原花青素是以儿茶素或儿茶素衍生物为结构单元的二聚体或聚合物，构成其的儿茶素或儿茶素衍生物的4位的碳(C-4)和8位的碳(C-8)、或4位的碳(C-4)和6位的碳(C-6)进行碳-碳结合。

因此，为了明确上述Fr.7中含有的构成原花青素的单元，按照下述方法对Fr.7进行了采用巯基乙醇的硫醇分解。

即，在0.2mL的Fr.7的60％乙醇溶液(Fr.7的浓度：10mg/mL)中加入1.8mL巯基乙醇试液(混合了2.5mL巯基乙醇、4mL的0.1％盐酸、27.5mL乙醇、16mL水的溶液)，在60℃下加热6小时，用HPLC分析20μL的反应液。分析条件与获得图4A时相同。这样得到的硫醇分解后的谱图示于图4B。

如该图4B所示，将Fr.7进行硫醇分解时，出现了很多在分解前(图4A)中没有发现的峰。对于在分解前未发现的峰以及比分解前增大的峰，进行与标准品(Tanaka，T.et.al.，J.Chem.Soc.Perkin Trans 1，1994，3013)的保持时间和紫外线吸收光谱的比较的结果，鉴定了EGC、EC、EGCg、ECg、EGC-ME、EC-ME、EGCg-ME、ECg-ME。

另外，在图4B中，将Fr.7(500mg)溶解在10mL巯基乙醇试液中，加热6小时后，用Chromatorex ODS(富士シリシア公司制造)(水-甲醇洗脱液)柱色谱、接着用Sephadex LH-20(EtOH洗脱液)柱色谱分离纯化，通过¹H-NMR谱图的分析结果可以明确，在39分钟检测出的峰是表阿夫儿茶精-3-O-樯酸酯-ME。表阿夫儿茶精-3-O-棓酸酯-ME的结构式示于图5。

即，在¹H-NMR谱图中，虽然A环、C环、棓酰基以及羟乙基硫基的信号与EGCg-ME的信号几乎相同，但观察到B环的信号为在d7.40和6.81处均为积分面积相当于2H的双重峰(J＝8Hz)，这表示B环为对羟基苯酚。另外，在TOF(飞行时间型)质谱分析中，在m/z 503处显示[M+H]⁺峰也支持该结论。

这些鉴定的结构单元中，EGC、EGCg、ECg来自于高分子化合物的末端单元，硫醚化合物来自于延长单元。因此，硫醇分解前的高分子化合物的结构，即推测上述Fr.7中含有的原花青素的结构为具有例如图5所示的结构。

迄今为止，以表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素只知道1种从乌龙茶得到的二聚体(Hashimoto，F.et.al.，Chem.Pharm.Bull.，1989，37，3255-3263)。通常，二聚体虽然在HPLC中作为明确的峰被检测出，但在Fr.7的HPLC中，由于未发现相当于可以说明表阿夫儿茶精-3-O-棓酸酯-ME的生成量的程度的二聚体的峰，因此，Fr.7通过硫醇分解而生成的表阿夫儿茶精-3-O-棓酸酯-ME可以说是来自于三聚体以上的原花青素低聚物或聚合物。该“以表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素(三聚体以上的低聚物或聚合物)”是迄今为止未知的新型的化合物。

另外，对于除了不加入枇杷叶而只使用茶的叶子以外同样地制造的发酵茶叶进行同样的分析试验，比较硫醇分解后得到的硫醚化合物时，混合枇杷叶的情况、不混合枇杷叶的情况，以几乎同样的大小检测出表阿夫儿茶精-3-O-棓酸酯-ME的峰。另外，即使将从枇杷叶中提取的原花青素进行硫醇分解，也未检测出表阿夫儿茶精-3-O-棓酸酯-ME。由此可知，Fr.7中含有的“以表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素”来自于茶的叶子。

另外，与不混合枇杷叶的情况相比，混合枇杷叶时的EC-ME的峰明显大。由此可知，枇杷叶中含有的“以表儿茶精为结构单元的原花青素(枇杷原花青素)”包含在AGH抑制性高的Fr.7中。

[分析试验例4]

如图4B所示，将AGH抑制性高的Fr.7进行硫醇分解后，仍残留基线的凸起。

这显示出，在Fr.7中，除了上述分析试验例3所述的“以表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素”和“枇杷原花青素”以外，还存在HPLC分析中作为基线的凸起被检测出的物质。

因此，比较了在混合了茶的叶子和枇杷叶的情况下的混合发酵茶叶和除了不混合枇杷叶以外在同样情况下的发酵茶叶(以下，有时称为单独发酵茶叶)中，在HPLC分析中作为基线的凸起被检测出的物质的生成量是否相同。另外，混合发酵茶叶的制造条件与分析试验例1、2相同，茶的叶子和枇杷叶的混合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时。

对于混合发酵茶叶和单独发酵茶叶，分别在室温下用100mL 70％的丙酮提取3g茶叶(含水率5质量％)(提取时间为18小时)，然后进行过滤。将滤液浓缩制成水溶液(20mL)，然后，用***、乙酸乙酯各进行2次溶剂分配。

将残留的水层浓缩后，用70％乙醇制成30mL，用HPLC对其10μL进行分析。该水层的HPLC分析结果示于图6。

如该图所示，与单独发酵茶叶相比，混合发酵茶叶的作为基线凸起被检测出的物质的量明显多。比较峰面积时，在混合发酵茶叶中作为基线凸起被检测出的物质的量估计为单独发酵茶叶的159％。该增加部分虽然也包含来自枇杷叶的原花青素，但由于在混合发酵茶叶中的枇杷叶的添加量只为茶的叶子的十分之一的量，因此不能说明只是因原本包含在枇杷叶中的成分就增加59％。因此，该增加部分显示出由于添加枇杷叶而促进生成，不添加枇杷叶时就不会生成的儿茶素氧化生成物的存在。

另一方面，将上述得到的乙酸乙酯层浓缩后，用80％甲醇制成30mL后，将其中1mL在ODS短柱(TOYOPAK ODS M、TOSO、東ソ一公司制造)中用80％甲醇导通，将洗脱液制成5.0mL，将其中5μL用HPLC进行分析。该乙酸乙酯层的HPLC分析结果示于图7。

如该图所示，与单独发酵茶叶相比，混合发酵茶叶的茶黄素类的峰面积合计增加到2.7倍。另一方面，儿茶素类的峰面积减少，具体地，EGC减少到0.24倍、EC减少到0.44倍、EGCg减少到0.57倍、ECg减少到0.64倍。

这显示出，在混合发酵茶叶中，通过在茶叶中添加揉混枇杷叶，生成大量高分子的儿茶素氧化生成物。

[分析试验例5]

由分析试验例4的结果可知，在混合发酵茶叶中，通过在茶叶中添加揉混枇杷叶，大量生成高分子的儿茶素氧化生成物，其在HPLC分析中作为基线凸起被检测出，即，在薄层层析(TLC)分析中作为原点被检测出。

因此，为了鉴定在这样的混合发酵茶叶中特异地增加的成分，按照以下的方法，在混合发酵茶叶(茶的叶子和枇杷叶的混合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时)中含有的成分中，分离在薄层层析(TLC)分析中作为原点被检测出氧化型高分子多酚。

即，在室温下用3L 60％乙醇提取228g混合发酵茶叶(含水率为5质量％)3次，将3次的提取液合并减压浓缩。将得到的水溶液(1.5L)依次用***、乙酸乙酯、正丁醇进行溶剂分配，得到***可溶部分(4.03g)、乙酸乙酯可溶部分(9.8g)、正丁醇可溶部分(22.1g)。

将15g正丁醇可溶部分溶解在60％甲醇中，并加载在用60％乙醇调湿的Sephadex LH-20柱上，依次用60％甲醇、80％甲醇、100％甲醇、接着是甲醇-水-丙酮(8∶1∶1)混合溶液、甲醇-水-丙酮(6∶2∶2)混合溶液、水-丙酮(1∶1)混合溶液进行洗脱。将洗脱液进行TLC(甲苯-甲酸乙酯-甲酸、1∶7∶1)分析，只收集含有未离开原点的物质的级分并进行浓缩，得到1.4g聚合物状的物质(氧化型高分子多酚级分)。其HPLC分析结果示于图8A中。

在图8A中，从其UV吸收看，在45分钟附近的小峰表示混合存在茶黄素类，但峰面积为基线凸起全部的2％以下。

对这样得到的聚合物状物质(氧化型高分子多酚级分)测定AGH抑制性。其结果示于表5。

另外，对于茶黄素-3，3’-二-O-棓酸酯的AGH抑制性的测定结果也合并示于表5中。

[表5]

	麦芽糖酶抑制率(％)	蔗糖酶抑制率(％)
			氧化型高分子多酚	49.5	66.5
茶黄素-3，3’-二-O-棓酸酯	53.8	93.0

如表5所示，用上述方法从混合发酵茶叶中分离的氧化型高分子多酚级分，即，在混合发酵茶叶中特异地增加的高分子多酚显示与茶黄素-3，3’-二-O-棓酸酯同等强度的麦芽糖酶和蔗糖酶抑制活性。从含量考虑，该活性不是来自于混入的茶黄素类(45分钟附近的峰)，而是来自于高分子多酚。

另外，对于上述得到的氧化型高分子多酚级分，按照下述方法进行采用巯基乙醇的硫醇分解。

即，将0.2mL使上述得到的氧化型高分子多酚溶解在60％乙醇中的溶液(氧化型高分子多酚的浓度：10mg/mL)和0.8mL巯基乙醇试液混合，在60℃下反应5小时，用HPLC分析其中5μL。其结果示于图8B。

在上述分析试验例3中，与将Fr.7硫醇分解得到的物质进行HPLC分析时同样地，检测出以表阿夫儿茶精-3-O-棓酸酯-ME为首的硫醚化合物和儿茶素类的峰。另外，在图8B中，在硫醇分解后还观察到基线的凸起。

从该情况暗示了，在上述得到的氧化型高分子多酚级分中含有上述的具有表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素，但其含有比例少，含有相当量的未被硫醇分解的物质。

因此，测定该氧化型高分子多酚级分的¹³C-NMR谱图，并将其与在枇杷叶中含有的“以表儿茶精为结构单元的原花青素(枇杷原花青素)”的¹³C-NMR谱图进行比较。其结果示于图9。图9A为枇杷原花青素的谱图，图9B是上述氧化型高分子多酚级分的谱图。

由图9的结果可知，在枇杷原花青素中观察到来自儿茶酚环型B环(Bc)的信号，与此相反，在从混合发酵茶叶中分离的氧化型高分子多酚中几乎未观察到来自B环的信号，但观察到来自对应于儿茶素的A环的间苯三酚(1，3，5-三羟基苯)的信号、以及来自于棓酰基的焦棓酚1，2，3-三羟基苯)的信号，虽然小但也确认到部分来自C环的信号。

由此可知，用上述方法从混合发酵茶叶中分离的氧化型高分子多酚的主要成分不是枇杷原花青素，而是在B环部分具有各种结构的儿茶素衍生物氧化缩合而高分子化的物质。

这样的高分子多酚的结构虽然还不明确，但由图3所示的化合物类推，可以认为主要是儿茶素棓酸酯类的B环彼此氧化缩合而高分子化的结构。作为B环的结合方式，可以推测有图3所示的茶多酚、茶黄素、乌龙茶氨酸等各种类型，但现在其具体情况还不明确。

另外，将该氧化型高分子多酚进行元素分析的结果，碳为57.06％、氢为4.51％、氮为0.35％。

与EGCg的计算值(C₂₂H₁₈O₁₁：碳为57.65％、氢为3.96％；C₂₂H₁₈O₁₁·2H₂O：碳为53.44％、氢为4.49％)相比，含氢率高，由于在通常的氧化中含氢率应该减少，因此，暗示在儿茶素氧化的过程中，有混入其他的代谢产物的可能性。

另外，将得到的氧化型高分子多酚进行乙酰化之后，通过凝胶渗透色谱测定分子量时，峰顶分子量为2000(数均分子量为1400，质量平均分子量为3200)，分子量分布宽，为1000～15000左右。

凝胶渗透色谱的测定条件如下。

柱：TSK-gel G 4000H₆，直径4.6mm×长度250mm，東ソ一公司制造

泵：TOSO DP8020，東ソ一公司制造

检测器：JASCO UV970日本分光公司制造，254nm

移动层：四氢呋喃

温度：室温

流速：1.0mL/min

通过与标准聚苯乙烯的比较的分子量计算：JASCO 807IT积分仪，日本分光公司制造。

另外，从儿茶素类推，由于乙酰化引起的分子量增加部分为1.5倍时，分子量为以1330为极大值的670～10000。如果假定只由儿茶素棓酸酯生成，则含有相当于二聚体的物质(茶黄素)到相当于20聚体的物质。

[分析试验例6]

将EC、ECG、EGC、EGCg、茶黄素(TF)、3-TFG、3’-TFG、3，3’-TFGG以及茶多酚A(TS-A)的纯品(市售品)溶解在由DMSO(二甲亚砜)∶水＝1∶9制成的混合溶剂中，制备试样溶液，对各试样溶液进行AGH抑制活性测定。

本试验例和分析试验例7中的AGH抑制性的评价按照使用了将大鼠小肠AGH固定化的载体的pseudo-in vivo法(T.Oki.et.al.，Biol.Pharm.Bull.，23，1084-1087(2000))进行，酶活性以50％抑制的终浓度(IC₅₀值，单位：mM)表示。其结果示于表6。

[表6]

由表6的结果可以明确，麦芽糖酶抑制性强的是ECG、EGCG、3-TFG、3，3’-TFGG，蔗糖酶抑制性强的是ECG、EGCG、3，3’TFGG。即，儿茶素中的酯型、茶黄素中具有包含棓酰基的多取代OH基的分子结构的物质的AGH抑制性更强。

[分析试验例7]

用1000mL 100℃的热水将20g混合发酵茶叶(茶的叶子和枇杷叶的混合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时，含水率为5质量％)提取10分钟，将离心分离而得到的上清液冷冻干燥，并将冷冻干燥得到的物质作为试料，调查AGH抑制性。

将试料溶解在DMSO∶水＝1∶9的混合溶剂中，制备试样溶液，关于该试样溶液，采用上述的pseudo-in vivo法测定AGH抑制性。另外，测定该试样溶液中含有的儿茶素类(EC、ECG、EGC、EGCg)以及茶黄素类(TF、3-TFG、3’-TFG、3，3’-TFGG)的含量。然后，基于在上述分析试验例6中测定的IC₅₀值，求出将由混合发酵茶叶发挥的AGH抑制性作为100％时的由各成分发挥的AGH抑制性的比例(活性贡献率，单位：％)。麦芽糖酶抑制性的结果示于表7，蔗糖酶抑制性的结果示于表8。

[表7]

(1)麦芽糖酶抑制性

[表8]

(2)蔗糖酶抑制性

[分析试验例8]

用1L 100℃的热水将20g与分析试验例7同样的混合发酵茶叶提取10分钟。将提取液过滤，用蒸发器将得到的滤液浓缩后，冷冻干燥。在干燥后的粉末10mg中添加1ml水，搅拌后，进行离心处理(3000rpm，10分钟)，得到上清、即水溶性级分。测定该水溶性级分的AGH抑制性。其结果示于表9。

另外，本分析试验例中的AGH抑制性的测定采用使用了上述游离AGH的in vitro法(Oki.T.et.al.，J.Agric.Food Chem，47，550-553(1999))进行。

[表9]

	麦芽糖酶抑制性IC₅₀(mg/ml)	蔗糖酶抑制性IC₅₀(mg/ml)
			热水提取物的水溶性级分	0.05	0.29

由表9的结果可知，混合发酵茶叶的热水提取物的水溶性级分显示高的AGH抑制性。

因此，再用下述方法对该显示高的AGH抑制性的热水提取物的水溶性级分进行成分分离操作。

即，将该热水提取物的水溶性级分供给到使用了SephadexLH-20(Amersham Biosciences制造)的吸附色谱法中。洗脱以水、50％甲醇、100％甲醇、70％丙酮的顺序进行，对于将得到的各种级分进行冷冻干燥得到的物质，与上述同样地进行AGH抑制性测定。各级分的收率和AGH抑制性示于下述表10。另外，在表10中还合并示出表9的测定结果。

[表10]

	收率(％)	麦芽糖酶抑制性IC₅₀(mg/ml)	蔗糖酶抑制性IC₅₀(mg/ml)
				(热水提取物的水溶性级分)	(100)	(0.05)	(0.29)
水溶性级分	53.7	无抑制	无抑制
				50％甲醇洗脱级分	9.6	0.32	1.03
100％甲醇洗脱级分	17.9	0.21	0.26
				70％丙酮洗脱级分	18.8	0.05	0.12

如表10所示，混合发酵茶叶热水提取物的水溶性级分中，特别是70％丙酮洗脱级分和100％甲醇洗脱级分的AGH抑制性高。

因此，通过凝胶渗透色谱法对该70％丙酮洗脱级分和100％甲醇洗脱级分测定分子量时，明确了这些AGH抑制性特别高的两级分中含有的成分处于分子量100～1500的范围。

这里的凝胶渗透色谱法的测定条件如下。

柱：TSK-gel G2500PWXL，直径7.8mm×长度250mm

泵：岛津制作所制造，LC-10Avp

检测器：SPD-10AV，254nm

移动层：0.1M，磷酸缓冲液(pH7.2，含有0.1M氯化钠)

温度：室温

流速：0.3mL/min

通过与标准聚乙二醇的比较进行分子量计算

[分析试验例9]

与上述分析试验例8同样地，用1L 100℃的热水将20g与分析试验例7同样的混合发酵茶叶提取10分钟，过滤得到的提取液，得到滤液。将该滤液供给到填充了Porapack Q(制品名，Waters公司制造)的柱中。然后，用100ml水、接着用100ml 50％甲醇洗脱柱中的水溶性成分。将这样得到的水洗脱级分、以及50％甲醇洗脱级分分别浓缩并干燥后，测定AGH抑制活性。其结果示于下述表11。

本分析试验例中的AGH抑制性的测定按照由松井等人提出的使用了游离AGH的方法进行，用抑制率(单位：％)的值表示。

[表11]

	麦芽糖酶抑制率(％)	蔗糖酶抑制率(％)
			水洗脱级分	71.3	41.9
50％甲醇洗脱级分	97.2	93.9

如表11所示，混合发酵茶叶热水提取物的水洗脱级分和50％甲醇洗脱级分的任何一种都显示高的AGH抑制性。

另外，对该水洗脱级分和50％甲醇洗脱级分在与上述分析试验例8同样的条件下通过凝胶渗透色谱法测定分子量时，明确了这些AGH抑制性特别高的两级分中含有的成分处于分子量100～1900的范围。

由分析试验例8、9的结果可知，混合发酵茶叶的热水提取物的水溶性级分显示高的AGH抑制性，并且对该AGH抑制性的贡献大的成分的分子量为100～1900左右的比较低的分子量。

[实验例2]

让正常大鼠摄取混合发酵茶叶的热水提取物(冷冻干燥品)，研究对耐糖能力带来的影响。

准备混合发酵茶叶(茶的叶子和枇杷叶的混合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时)、粗茶、使枇杷叶干燥并粉碎的枇杷叶、以及不混合枇杷叶而只将茶的叶子揉捏20分钟而得到的单独发酵茶叶作为试料茶叶。另外，上述粗茶使用与作为混合发酵茶叶的原料而使用的相同的茶的叶子，是按照通常的绿茶的制造法制造的粗茶(不使茶的叶子发酵而制造的粗茶)。

让各种试料茶叶(含水率为5质量％)20g用1000ml的100℃热水提取10分钟后，过滤。将滤液干燥，得到粉末状的提取物。

使4周龄的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠分别自由摄食如下获得的饲料(4种)：将不含胆固醇的AIN-76组成为基本组成的食饵中添加上述制备的热水提取物并使含有率为1质量％。

另外，作为对照，让同样的大鼠自由摄取在食饵中未添加热水提取物的对照食物。

大鼠在室温22±1℃、湿度55±5％、8:00～20:00点灯的光循环的动物饲养室内饲养。4周后，在禁食6小时后，口服给药1g/kg体重的麦芽糖。给药后，在0、10、20、30以及60分钟后，分别从尾静脉采血，使用血糖试验测定医用安全管(メデイセ一フチップ)(テルモ公司制造)测定血糖值。

其结果示于图10。

在图10中，横轴表示麦芽糖给药后的经过时间，纵轴表示血糖值的值。另外，血糖值的值是将麦芽糖给药时的血糖值做为0mg/dl来表示的。

如该图所示，摄取了混合发酵茶叶的热水提取物的大鼠的血糖值在比任意一种试料茶叶都低的水平上推移。

由此可知，通过摄取混合发酵茶叶的热水提取物，可以得到优异的抑制血糖值上升的效果。另外可知，该效果比只干燥枇杷叶得到的枇杷叶、只使茶的叶子干燥而得到的茶叶所得到的效果优异，通过使茶的叶子和枇杷叶混合、揉捏、发酵，可以得到协同效果。

[实验例3]

让患有2型糖尿病的大鼠摄取混合发酵茶叶的粉末，研究对血糖值带来的影响。

使用食品加工机将混合发酵茶叶(茶的叶子和枇杷叶的混合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时，含水率5质量％)进行粉碎加工，直到成为60～100目大小的粉末状态，得到粉末状混合发酵茶叶。

大鼠使用1个月龄的自然发病2型糖尿病的雄性Otuka Long-EvansTokushima Fatty大鼠(以下，称为OLETF大鼠)、和作为其对象模型动物的未患糖尿病的雄性Long-Evans Tokushima Otsuka大鼠(以下，称为LETO大鼠)。大鼠在室温22±1℃、湿度55±5％、8:00～20:00开灯的光循环的动物饲养室内饲养。

最初的3个月期间对LETO和OLETF大鼠给药MF固态饲料(オリエンタル酵母工业(株)制造)进行预备饲养。由于OLETF大鼠通常在5个月龄到8个月龄发病2型糖尿病，从具有发病可能性的1个月前的4个月龄起，与LETO大鼠一起开始摄食试验食物。

即，在4个月龄时禁食6小时(9:00～15:00)后，从尾静脉采血，测定血糖值，按照体重和血糖值相等地以每组6只来进行分组，使其自由摄食以下试验食物5个月。

试验食物是以基于AIN-76的纯化食物作为对照食物，让LETO大鼠-对照组和OLETF大鼠-对照组摄食。对照食物的组成(g/kg)为酪蛋白200、色拉油100、矿物混合(AIN-76-MX)35、维生素混合(AIN-76-VX)10、纤维素50、重酒石酸胆碱2、DL-蛋氨酸3、玉米淀粉150以及蔗糖450。

在OLETF大鼠-混合发酵茶叶添加组中，在上述对照食物中添加饲料总质量5％的粉末状混合发酵茶叶，并减去其添加量部分的蔗糖量。

任何一组在喂养期间中，摄食量每天测定，体重和摄水量每隔1天进行测定。

从给药试验食物开始，在1、2、3、4以及5个月后，禁食6小时后从尾静脉采血并使用血糖试验测定医用安全管(テモル公司制造)测定血糖值。摄取试验食物5个月间的大鼠血糖值的变化示于图11。

在图11中，横轴表示从给药试验食物开始后的经过时间(单位：月)，纵轴表示血糖值的值。

如该图所示，摄取了对照食物的未患糖尿病的LETO大鼠的血糖值在整个喂养期间均为低值。另一方面，摄取了对照食物的患有糖尿病的OLETF大鼠的血糖值随时间而上升，被看作糖尿病发病。

与此相反，使患有2型糖尿病的OLETF大鼠摄取了添加了混合发酵茶叶的粉末的饲料的组中，即使经过长时间血糖值也不上升，是与未发病糖尿病的LETO大鼠同等程度的低水平。由此可知，混合发酵茶叶的粉末具有优异的抑制血糖上升的效果。

[实验例4]

让患有2型糖尿病的大鼠摄取混合发酵茶叶的热水提取物(冷冻干燥品)，研究对血糖值带来的影响。

将20g混合发酵茶叶(茶的叶子和枇杷叶的混合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时，含水率5质量％)用1000mL 100℃的热水提取10分钟，并将过滤得到的滤液进行冷冻干燥，得到粉末状的混合发酵茶叶提取物。

作为比较例，在同样的条件下提取按照通常的绿茶的制造方法制造的粗茶(不使茶的叶子发酵而制造的粗茶)，过滤、干燥，得到粉末状的粗茶提取物。另外，在同样的条件下提取干燥成同样的含水率的枇杷叶，过滤、干燥，得到粉末状的枇杷叶提取物。

大鼠使用与上述实验例3同样的大鼠，直到4个月龄的喂养条件也相同。

在4个月龄时禁食6小时(9:00～15:00)后，从尾静脉采血，测定血糖值，按照体重和血糖值相等地以每组6只来进行分组，使其自由摄食以下的试验食物5个月。

对于LETO大鼠和OLETF大鼠的对照食物组，摄食与实验例3同样的对照食物。

在OLETF大鼠-混合发酵茶叶添加组中，在上述对照食物中添加饲料总质量5％的粉末状混合发酵茶叶提取物，并减去其添加量部分的蔗糖量。

在OLETF大鼠-粗茶添加组中，在上述对照食物中添加饲料总质量5％的粉末状的粗茶提取物，并减去其添加量部分的蔗糖量。

在OLETF大鼠-枇杷叶添加组中，在上述对照食物中添加饲料总质量5％的粉末状枇杷叶提取物，并减去其添加量部分的蔗糖量。

在喂养期间中，摄食量每天测定，体重和摄水量每隔1天进行测定。

从给药试验食物开始，在1、2、3、4以及5个月后，与实验例3同样地测定血糖值。摄取试验食物5个月的大鼠血糖值的变化示于图12。

图12中的横轴和纵轴与图11同样。如该图所示，摄取了对照食物的未患糖尿病的LETO大鼠的血糖值在整个喂养期间均为低值。另一方面，摄取了对照食物的患有糖尿病的OLETF大鼠的血糖值随时间而上升，被看作糖尿病发病。

与此相反，让患有2型糖尿病的OLETF大鼠摄取了添加有混合发酵茶叶的热水提取物(冷冻干燥品)的饲料的组中，即使经过长时间血糖值也不上升，是与未发病糖尿病的LETO大鼠同等程度的低水平。由此可知，混合发酵茶叶的热水提取物具有优异的抑制血糖上升的效果。

[实验例5]

研究让患有2型糖尿病的大鼠摄取混合发酵茶叶的粉末时的其它效果。

与上述实验例3同样地制造粉末状混合发酵茶叶。

作为比较例，制造使用与作为混合发酵茶叶的原料使用的茶的叶子同样的茶的叶子制造的粗茶(不使茶的叶子发酵而制造的粗茶)，同样地进行粉碎加工，得到粉末状的粗茶。另外，将干燥成同样含水率的枇杷叶进行粉碎加工处理，得到粉末状的枇杷叶。

大鼠使用与上述实验例3同样条件的大鼠，直到4个月龄的喂养条件也相同。

在OLETF大鼠-粗茶添加组中，在上述对照食物中添加饲料总质量5％的粉末状的粗茶，并减去其添加量部分的蔗糖量。

在OLETF大鼠-枇杷叶添加组中，在上述对照食物中添加饲料总质量5％的粉末状枇杷叶，并减去其添加量部分的蔗糖量。

给药试验食物开始5个月后，禁食6小时后，宰杀并采取血清、肝脏、以及肾脏和睾丸周边的脂肪组织。

在下表中分别示出了血清胰岛素浓度、血清过氧化脂质浓度、脂肪组织质量、血清胆固醇、血清甘油三酸酯、肝脏胆固醇、肝脏甘油三酸酯的测定结果。

[表12]

试料	胰岛素浓度(ng/ml)
		LETO-对照食物	7.30
OLETF-对照食物	3.68
		OLETF-粉末粗茶食物	8.18
OLETF-粉末枇杷叶食物	3.12
		OLETF-粉末混合发酵茶叶食物	7.75

由表12的结果，使OLETF大鼠摄取对照食物或枇杷叶的组发现胰岛素的降低。另外，通过血糖值测定可知，这些组处于糖尿病发病的状态。与此相反，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，让其摄取粉末状混合发酵茶叶的组的胰岛素浓度上升到未发病糖尿病的LETO大鼠的水平。由此可以确认，混合发酵茶叶具有改善由于糖尿病发病引起的胰岛素分泌降低的效果。

[表13]

试料	血清过氧化脂质浓度(nmol/ml)
		LETO-对照食物	11.86
OLETF-对照食物	63.78
		OLETF-粉末粗茶食物	92.83
OLETF-粉末枇杷叶食物	78.57
		OLETF-粉末混合发酵茶叶食物	35.23

由表13的结果，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，让其摄取粉末状混合发酵茶叶的组的血清过氧化脂质浓度与其它的OLETF大鼠组相比也低。由此可以确认，混合发酵茶叶具有降低血清过氧化脂质浓度的效果。

[表14]

试料	脂肪组织质量(g)
		LETO-对照食物	38.2
OLETF-对照食物	131.1
		OLETF-粉末粗茶食物	77.1
OLETF-粉末枇杷叶食物	80.1
		OLETF-粉末混合发酵茶叶食物	76.8

由表14的结果，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，让其摄取粉末状混合发酵茶叶的组的肾脏和睾丸周边的脂肪组织质量，也比摄取对照食物的OLETF大鼠组有意义地低。由此可以明确，混合发酵茶叶具有抑制体内脂肪蓄积的效果。

[表15]

试料	血清胆固醇(mg/dl)	血清甘油三酸酯(mg/dl)	肝脏胆固醇(mg/g)	肝脏甘油三酸酯(mg/g)
					LETO-对照食物	147	55.6	3.28	9.78
OLETF-对照食物	253	234	5.98	49.5
					OLETF-粉末粗茶食物	183	127	3.43	16.9
OLETF-粉末枇杷叶食物	238	237	4.90	34.1
					OLETF-粉末混合发酵茶叶食物	177	139	3.08	12.6

由表15的结果，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，摄取粉末状混合发酵茶叶的组的血清和肝脏的胆固醇浓度和中性脂肪浓度，也比摄取对照食物的OLETF大鼠组降低。由此可以明确，混合发酵茶叶具有降低胆固醇的效果和降低中性脂肪的效果。

[实验例6]

研究使发病2型糖尿病的大鼠摄取混合发酵茶叶的热水提取物(冷冻干燥物)时的其它效果。

与上述实验例4同样地，使LETO大鼠和OLETF大鼠自由摄食试验食物5个月。

投喂试验食物开始5个月后，禁食6小时后，宰杀并采取血清、肝脏、以及肾脏和睾丸周边的脂肪组织。

在下表中分别示出了血清胰岛素浓度、脂肪组织质量、血清甘油三酸酯、肝脏甘油三酸酯的测定结果。

[表16]

试料	胰岛素浓度(ng/ml)
		LETO-对照食物	7.82
OLETF-对照食物	3.10
		OLETF-粗茶提取物食物	2.75
OLETF-枇杷叶提取物食物	2.55
		OLETF-混合发酵茶叶提取物食物	8.33

由表16的结果，让OLETF大鼠摄取对照食物、粗茶提取物或枇杷叶提取物的组发现胰岛素的降低。另外，通过血糖值测定可知，这些组处于糖尿病发病的状态。与此相反，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，摄取混合发酵茶叶提取物的组的胰岛素浓度上升到未发病糖尿病的LETO大鼠的水平。由此可以确认，混合发酵茶叶的热水提取物具有改善由于糖尿病发病引起的胰岛素分泌降低的效果。

[表17]

试料	脂肪组织质量(g)
		LETO-对照食物	37.0
OLETF-对照食物	125.0
		OLETF-粗茶提取物食物	115.8
OLETF-枇杷叶提取物食物	110.2
		OLETF-混合发酵茶叶提取物食物	94.7

由表17的结果，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，摄取混合发酵茶叶提取物的组的肾脏和睾丸周边的脂肪组织质量，也比摄取对照食物的OLETF大鼠组低。由此可以明确，混合发酵茶叶的热水提取物具有抑制体内脂肪蓄积的效果。

[表18]

试料	血清甘油三酸酯(mg/dl)	肝脏甘油三酸酯(mg/g)
			LETO-对照食物	70.1	12.4
OLETF-对照食物	290	88.8
			OLETF-粗茶提取物食物	278	105.5
OLETF-枇杷叶提取物食物	312	74.3
			OLETF-混合发酵茶叶提取物食物	170	43.9

由表18的结果，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，摄取混合发酵茶叶提取物的组的血清和肝脏的中性脂肪浓度，也比摄取对照食物的OLETF大鼠组降低。由此可以明确，混合发酵茶叶的热水提取物具有降低中性脂肪的效果。

[实验例7]

研究让正常大鼠摄取混合发酵茶叶的热水提取物(冷冻干燥品)时的其它效果。

即，在与实验例2同样的条件下，让4周龄的Sprague-Dawley(SD)大鼠自由摄食与上述实验例2同样地分别添加了将试料茶叶(粗茶、单独发酵茶叶、枇杷茶、混合发酵茶叶)的热水提取物冷冻干燥而得到的物质的4种饲料、以及对照食物来进行喂养。

4周后，禁食6小时后，宰杀并采取血清、肝脏、以及脂肪组织。

在下表中分别示出了血清过氧化脂质浓度、脂肪组织质量、血清中性脂肪(甘油三酸酯)、肝脏中性脂肪(甘油三酸酯)的测定结果。

[表19]

试料	血清过氧化脂质浓度(nmol/ml)
		对照	61.7
粗茶提取物	30.5
		单独发酵茶叶提取物	38.2
枇杷茶提取物	64.1
		混合发酵茶叶提取物	36.5

由表19的结果，在正常大鼠中，通过摄取混合发酵茶叶的热水提取物，与摄取对照食物的情况相比，血清过氧化脂质浓度降低。由此可以确认，混合发酵茶叶的热水提取物即使在正常的健康状态，也发挥降低血清过氧化脂质的效果。

[表20]

试料	脂肪组织质量(g)
		对照	12.7
粗茶提取物	6.87
		单独发酵茶叶提取物	8.71
枇杷茶提取物	10.8
		混合发酵茶叶提取物	8.20

由表20的结果，在正常大鼠中，通过摄取混合发酵茶叶的热水提取物，与摄取对照食物的情况相比，脂肪组织质量低。由此可以确认，混合发酵茶叶的热水提取物即使在正常的健康状态，也发挥抑制体内脂肪蓄积的效果。

[表21]

试料	血清中性脂肪浓度(mg/dL)	肝脏中性脂肪浓度(mg/g)
			对照	87.7	37.0
粗茶提取物	75.8	19.7
			单独发酵茶叶提取物	77.8	26.1
枇杷茶提取物	62.9	31.0
			混合发酵茶叶提取物	55.2	18.6

由表21的结果，在正常大鼠中，通过摄取混合发酵茶叶的热水提取物，与摄取对照食物的情况相比，血清和肝脏的中性脂肪浓度也低。由此可以确认，混合发酵茶叶的热水提取物即使在正常的健康状态，也发挥降低中性脂肪的效果。

[实验例8]

研究通过摄取混合发酵茶叶的热水提取物对1型糖尿病带来的影响。

即，在以不含胆固醇的AIN-76组成为基本组成的食饵中添加1质量％的与实验例2同样的混合发酵茶叶的热水提取物(冷冻干燥品)，并让4周龄的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠自由摄食。作为比较例，对SD大鼠投喂在同样的食饵中不添加混合发酵茶叶提取物的对照食物。喂养条件为与实验例2同样的条件。

在摄食开始日和摄食开始14天后，禁食6小时后，由尾静脉采血，使用血糖试验测定医用安全管(テモル公司制造)测定血糖值。

另外，摄食开始14天后的上述采血后，再继续禁食，9小时后(禁食总时间：15小时)，给药30mg/kg体重的链脲霉素(STZ)。该STZ是具有下述作用的药剂：破坏胰脏胰岛β细胞，引起胰岛素分泌损害，从而引发1型糖尿病。给药STZ后，再自由摄食食物。

从再摄食开始7天后和14天后(从最初的摄食开始3周后和4周后)，禁食6小时后，由尾静脉采血，使用血糖试验测定医用安全管(テモル公司制造)测定血糖值。

另外，从再摄食开始2周后(从最初的摄食开始4周后)，禁食6小时后(上述采血后)宰杀，采取血清和胰脏胰岛。对取出的胰脏胰岛给予葡萄糖刺激，测定胰岛素的分泌。

摄食开始后的血糖值的变化示于图13。另外，在下述表中示出胰岛素分泌的测定结果、以及血清胆固醇浓度和血清中性脂肪浓度的测定结果。

在图13中，横轴表示经过时间，纵轴表示血糖值的值。另外，血糖值的值是将摄食开始目的血糖值表示为100mg/dL。

如该图所示，摄取对照食物的大鼠的血糖值在给药STZ14天以后，随时间而上升，被看作1型糖尿病发病。与此相反，摄取了混合发酵茶叶的热水提取物的大鼠，14天以后的血糖值的上升被抑制得很小。

[表22]

	来自胰岛的胰岛素分泌(μU/mL/islet)
		对照	3.48
混合发酵茶叶提取物	5.96

由表22的结果，从摄食开始4周后(从给药STZ2周后)的由于葡萄糖的刺激引起的来自胰脏胰岛的胰岛素分泌，摄取了混合发酵茶叶的热水提取物的大鼠比摄取了对照食物的大鼠高。由此明确了混合发酵茶叶的热水提取物由于保护胰脏胰岛而可以维持胰岛素分泌功能，并暗示了混合发酵茶叶的热水提取物对预防1型糖尿病是有效的。

[表23]

	血清胆固醇浓度(mg/dL)	血清中性脂肪浓度(mg/dL)
			对照	124	336
混合发酵茶叶提取物	89	138

由表23的结果，从摄食开始4周后(从给药STZ2周后)的血清胆固醇浓度和血清中性脂肪浓度，摄取了混合发酵茶叶的热水提取物的大鼠显示比摄取了对照食物的大鼠低的值。由此明确了混合发酵茶叶的热水提取物在1型糖尿病中具有降低血清脂质浓度的作用。

[实验例9]

为了确认发酵茶叶的安全性，进行动物实验。

即，使用食品加工机将混合发酵茶叶(茶的叶子和枇杷叶的混合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时)进行粉碎加工，直到成为60～100目大小的粉末状态，得到粉末状混合发酵茶叶，将该混合发酵茶叶以每天5000mg/kg体重的用量对4周龄的雄性Sprague-Dawley系雄性大鼠口服投喂。在温度22±1℃、湿度55±5％、自由摄取饲料和水的条件下喂养4周时，未发现死亡，也未发现异常的体重变化，在喂养结束后的解剖检查中也未观察到脏器的异常。

因此，推定发酵茶对于大鼠的致死量(LD₅₀)比5000mg/kg体重多，判断为安全性相当高。

[实验例10]

(混合发酵茶叶的制造-用手揉捏的方法)

将枇杷叶投入到茶的叶子中，采用用手揉捏的方法进行揉捏。茶的叶子和枇杷叶的混合比例为茶的叶子∶枇杷叶的质量比为90∶10(枇杷投入比例为10％)和75∶25(枇杷投入比例为25％)2种。揉入时间(用手揉捏的时间)为25分钟和50分钟两种。

此后，经过0小时、1小时、2小时、4小时4种发酵工序，得到16种混合发酵茶叶。另外，发酵工序0小时的茶叶是揉入刚结束时得到的混合发酵茶叶。

对于得到的混合发酵茶叶，与实验例1同样地，用100℃的热水提取10分钟，得到提取液(混合发酵茶叶的使用量：2.0mg/ml)，对于该提取液，与实施例1同样地测定AGH抑制性(麦芽糖酶抑制性和蔗糖酶抑制性)，另外，用下述的方法测定DPPH(1，1-二苦基-2-苯基肼基)消去活性。各自的结果示于表24、25。另外，DPPH消去活性的测定值越大，表示抗氧化作用越高。另外，与实验例1同样地进行感观审查。结果示于表26。

(DPPH消去活性的测定方法)

DPPH消去活性(单位：μmol-Trolox/mg)的测定按照以下的方法进行(下同)。

将混合发酵茶叶粉碎，并将粉碎后的茶叶溶解在80％乙醇溶液中，使用同样的80％乙醇溶液稀释成0.5mg/ml。制作12ml的400μM DPPH、12ml的200mM MES缓冲液(pH6.0)和12ml的20％乙醇的混合溶液，使用エッペンドルフマルチピペット将该混合溶液分别注入到试管(a)～(f)各0.9ml，向试管(a)～(f)的每一个中加入(300-x)μl的80％乙醇(x为分析试料的添加量，具体地，在试管(a)～(f)中的x依次为0、30、60、120、180、240)。另外，向试管(a)～(f)中分别加入(x)μl分析试料并进行搅拌，添加20分钟后，测定在520nm下的吸光度。

具体地，从开始时间的测定30秒钟后，向试管(b)中加入30μl分析试料，60秒钟后向试管(c)中加入60μl分析试料，120秒钟后向试管(d)中加入120μl分析试料，180秒钟后向试管(e)中加入180μl分析试料，240秒钟后向试管(f)中加入240μl分析试料。然后，从开始时间的测定20分钟后测定试管(a)的吸光度，20分钟30秒后测定试管(b)的吸光度，21分钟后测定试管(c)的吸光度，这样每隔30秒进行吸光度的测定。

另一方面，使用Trolox作为标准试料制作标准曲线。标准曲线的横轴为试料添加量(单位：μmol)，纵轴为520nm下的吸光度。

以横轴作为试料添加量(单位：μl)、以纵轴作为520nm下的吸光度，描绘出分析试料的测定值，在吸光度持续直线减少的范围内求出相对于添加量(x’μl)的吸光度(ΔA520)的值。接着，求出在标准曲线中得到相同的(ΔA520)时的Trolox添加量(单位：μmol)。从这样得到的Trolox相当量(单位：μmol)求出每1mg混合发酵茶叶的消去活性的值(单位：μmol-Trolox/mg)。

[表24]

[表25]

[表26]

[实验例11]

(混合发酵茶叶的制造-磨碎方法)

在乳钵中加入茶的叶子和枇杷叶并磨碎。茶的叶子和枇杷叶的混合比例为茶的叶子∶枇杷叶的质量比为90∶10(枇杷投入比例为10％)和75∶25(枇杷投入比例为25％)2种。磨碎时间为20分钟和40分钟两种。

此后，经过0小时、1小时、2小时、4小时4种发酵工序，得到16种混合发酵茶叶。另外，发酵工序0小时的茶叶是磨碎刚结束时得到的混合发酵茶叶。

对于得到的混合发酵茶叶，与实验例1同样地测定AGH抑制性，另外，测定DPPH消去活性。各自的结果示于表27、28。另外，与实验例1同样地进行感观审查。结果示于表29。

[表27]

[表28]

[表29]

[实验例12]

(混合发酵茶叶的制造-粉碎搅拌的方法)

在混合器(制品名：ミルアンドミキサ一，テスコム公司制造)中加入茶的叶子和枇杷叶并进行粉碎搅拌。茶的叶子和枇杷叶的混合比例为茶的叶子∶枇杷叶的质量比为90∶10(枇杷投入比例为10％)和75∶25(枇杷投入比例为25％)2种。相对于茶的叶子和枇杷叶总计100质量份，水的添加量为100质量份。粉碎搅拌时间为10分钟和20分钟两种。

此后，经过1小时、4小时、8小时、12小时、16小时5种发酵工序，得到20种混合发酵茶叶。

对于得到的混合发酵茶叶，与实验例1同样地测定AGH抑制性，另外，测定DPPH消去活性。各自的结果示于表30、31。另外，与实验例1同样地进行感观审查。结果示于表32。

[表30]

[表31]

[表32]

[分析试验例10]

(香气成分的分析)

将仅干燥枇杷叶得到的材料、仅发酵枇杷叶得到的材料、市售的红茶(大吉岭红茶和阿萨姆红茶)、使用在长崎县综合农林试验场东彼杵茶叶支场栽培的茶的叶子进行发酵的红茶、使用相同的茶的叶子但不进行发酵而制造的绿茶(粗茶)、以及混合发酵茶叶(茶的叶子和枇杷叶的混合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时)等各种作为试样，进行香气成分的定量分析。

茶类的香气成分的前处理通常采用柱浓缩法等来进行。这里，作为简易/迅速的试料的提取、浓缩、色谱导入法，采用固相微提取法进行。定量通过如下方法求出：在作为测定对象的试料中添加作为内标物的环己醇，求出个香气成分的峰面积相对于内标物的相对峰面积比。

具体地，按照以下的方法进行。试料的调整如下进行：在200mL的三角烧瓶中加入20g试样、1mL的30％氯化钠水溶液、50μL作为内标物的1％环己醇，密封后在80℃下加热5分钟，使三角烧瓶内稳定后，***收集管20分钟，收集产生的香气成分。将收集了香气成分的收集管***到加热到250℃的气相色谱仪的注入口，将香气成分导入到气相色谱仪的柱中3分钟，进行分析。收集管使用SUPELCO公司制造的聚二甲基环己烷/carboxen/二乙烯基苯。对于气相色谱的分析条件，柱为Reapect公司制造的stabil-WAX(聚乙二醇类)60m×0.25mm，膜厚使用0.25μm，柱温在70℃保持3分钟后，以10℃/分升温到250℃。注入口温度为250℃，氦压力设定为120kPa。用于成分鉴定的气相色谱质谱分析在I/F温度250℃、离子化电压70eV、离子化电流60μA下进行。对于1-己醇、反-2-己烯醛、乙酸3-己烯-1-醇酯、3-己烯-1-醇、里哪醇、苯甲醛、水杨酸甲酯、香叶醇、橙花叔醇9种成分，测定相对于内标物的相对峰面积比。其结果示于表33。

[表33]

	枇杷叶(干燥)	枇杷叶(发酵)	市售红茶(阿萨姥)	市售红茶(大吉岭)	红茶(试验场)	混合发酵茶叶	绿茶
								1-己醇	1.16	0.47	-	-	0.06	0.14	0.02
反-2-己烯醛	3.13	1.81	1.10	1.05	1.14	5.09	0.01
								乙酸3-己烯-1-醇酯	tr.	1.33	-	-	tr.	0.41	tr.
3-己烯-1-醇	2.91	2.51	0.12	0.00	0.39	0.49	0.12
								里哪醇	0.22	0.08	1.67	0.97	2.27	1.84	0.13
苯甲醛	0.12	0.69	1.05	1.04	1.05	4.26	0.02
								水杨酸甲酯	0.20	0.03	1.73	1.83	2.67	1.52	0.01
香叶醇	0.00	0.00	0.87	0.97	3.01	3.37	0.04
								橙花叔醇	0.06	0.12	0.21	0.17	3.68	2.20	0.06

注)相对于内标物的相对面积

tr：虽然可以检测，但为最小面积以下

由表的结果，在混合发酵茶叶中含有表中列举的所有9种成分。这些当中，里哪醇、苯甲醛、水杨酸甲酯、香叶醇、以及橙花叔醇在使试验场的茶的叶子发酵的红茶中含有比较多，在市售的2种红茶中也含有，但在绿茶和发酵的枇杷叶中的含量比较少。另外，反-2-己烯醛、乙酸3-己烯-1-醇酯、3-己烯-1-醇在发酵的枇杷叶中含有特别多。将1-己醇以外的8种成分的峰面积(相对于内标物的相对面积的值)与1-己醇的峰面积(相对于内标物的相对面积的值)相比较时，只有混合发酵茶叶中8种成分所有的各峰面积都比1-己醇的峰面积大。

另外，在混合发酵茶叶中，即使改变茶的叶子和枇杷叶的混合比例、揉捏时间、发酵时间等制造条件，也一定能够检测出1-己醇，并且是检测出的量比表1记载的其他8种成分少的香气成分。

[实验例13]

让自然发病2型糖尿病的KK-A^y小鼠分别摄取混合发酵茶叶的热水提取物(冷冻干燥品)、含有大量茶多酚的级分(以下，称为TS级分)、以及含有大量茶黄素的级分(以下，称为TF级分)，并研究对血糖值带来的影响。

混合发酵茶叶的热水提取物使用如下得到的提取物：用1000ml 100℃的热水提取混合发酵茶叶(茶的叶子和枇杷叶的混合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时，含水率5质量％)10分钟后，过滤，将滤液冷冻干燥病制成粉末状的物质。

作为TS级分，使用将上述分析试验例2中得到的Fr.6冷冻干燥制成粉末状的物质。

作为TF级分，使用将上述分析试验例2中得到的Fr.7冷冻干燥制成粉末状的物质。

小鼠在室温22±1℃、湿度55±5％、8:00～20:00开灯的光循环的动物饲养室内饲养。

使用5周龄的KK-A^y小鼠，最初的2周投喂MF固态饲料(オリエンタル酵母工业(株)制造)进行预备饲养。由于KK-A^y小鼠在7～8周龄左右自然发病糖尿病，因此，从具有发病可能性的7周龄起，开始摄食试验食物。即，在7周龄时禁食6小时(9:00～15:00)后，从尾静脉采血，测定血糖值，按照体重和血糖值相等地以每组7只来进行分组，让其自由摄食下述试验食物6周。

试验食物为以下的7种。

·对照食物：将基于AIN-76组成的纯化食物作为对照食物。对照食物的质量组成(g/kg)为：酪蛋白200g/kg、玉米油100g/kg、矿物混合物(AIN-76-MX)35g/kg、维生素混合物(AIN-76-VX)10g/kg、纤维素50g/kg、重酒石酸胆碱2g/kg、DL-蛋氨酸3g/kg、玉米淀粉150g/kg以及蔗糖450g/kg。

·提取物添加食物：在100质量份上述对照食物中添加1质量份上述粉末状的热水提取物(冷冻干燥品)，并从对照食物中减去其添加量部分的蔗糖。

·TS添加食物：由于上述热水提取物(冷冻干燥品)中含有5.4质量％的茶多酚，因此，在对照食物中添加上述TS级分，并使之与上述提取物添加试验食物中的茶多酚的含量相等，再从对照食物中减去其添加量部分的蔗糖。

·2倍TS添加食物：在对照食物中添加上述TS级分，并使茶多酚的含量为上述提取物添加试验食物的2倍，再从对照食物中减去其添加量部分的蔗糖。

·TF添加食物：由于上述热水提取物(冷冻干燥品)中含有4.8质量％的茶黄素，因此，在对照食物中添加上述TF级分，并使之与上述提取物添加试验食物中的茶黄素的含量相等，再从对照食物中减去其添加量部分的蔗糖。

·2倍TF添加食物：在对照食物中添加上述TF级分，并使茶黄素的含量为上述提取物添加试验食物的2倍，再从对照食物中减去其添加量部分的蔗糖。

·TS+TF添加食物：在对照食物中添加上述TS级分和上述TF级分，并使之分别与上述提取物添加试验食物中的茶多酚含量和茶黄素含量相等，再从对照食物中减去它们的添加量的总计部分的蔗糖。

在饲养期间，摄食量每天测定，体重和摄水量隔天测定。

在开始摄食试验食物2、4、6周后，在禁食6小时后，从尾静脉采血，并使用血糖试验测定医用安全管(テルモ公司制造)测定血糖值。摄取试验食物的6周的小鼠的血糖值的变化示于图14至图17。

如图14所示，摄取了对照食物的小鼠的血糖值随时间而上升，在6周后超过300mg/dl。另外，由于摄水量也同样增加，摄取了对照食物的小鼠被看作糖尿病发病。另一方面，摄取了提取物添加食物的小鼠的血糖值存在随时间而减小的倾向，6周后的值降低到摄取了对照食物的小鼠的大约一半。

如图15所示，摄取了TS添加食物的小鼠的血糖值在6周后降低，摄取了2倍TS添加食物的情况下，更加有效地降低。

如图16所示，摄取了TF添加食物的小鼠的血糖值在6周后降低，摄取了2倍TF添加食物的情况下，从4周后降低。

如图17所示，摄取了TS+TF添加食物的小鼠的血糖值在4周以后与摄取了提取物添加食物的小鼠几乎为同一水平。

由以上的结果可以明确，混合发酵茶叶的热水提取物的抑制血糖值上升的作用主要由茶多酚和茶黄素发挥。

[临床实验例1]

研究摄取含有混合发酵茶叶的提取物的饮料对成人的血糖值、血清中性脂肪、血清胆固醇、体内脂肪率和血压带来的影响。另外，本试验得到县立长崎西博尔特大学研究伦理委员会的承认，并遵守赫尔辛基宣言的精神来实施。

被试验者是在长崎县厅内招募的长崎县厅职员，与健康的人进行同样的日常生活，未接受医生的服药指导，是未怀孕者并且是医生判断为适合的人，对于本试验的内容，接受充分的说明，并按照本人的自由意愿由本人提出同意书，共28人。

试验饮料使用如下制作的饮料：相对于100质量份90℃的热水，添加0.83质量份将混合发酵茶叶焙煎而得到的物质(茶的叶子和枇杷叶的混合比例为9∶1、揉捏时间为20分钟、发酵时间为0小时，含水率1质量％)，提取4分钟后过滤，在每个纸包装中各填充200ml滤液，密封。

使被实验者在早餐或中餐和晚餐时分别饮用1瓶，1天饮用2瓶，共饮用3个月。在摄取试验饮料前、摄取开始1个月后、2个月后以及3个月后的早晨空腹时采血，进行体重测定、体内脂肪率测定以及血压(收缩压和舒张压)测定。另外，采血前一天晚上9点以后禁食。对于试验期间的3个月的饮食没有特别限制，指导其按照与日常相同的生活进行。

作为对于血液成分的测定项目，测定了总蛋白质、A/G比、总胆固醇、HDL-胆固醇、中性脂肪、游离脂肪酸、尿酸、尿素氮、肌酸内酰胺、Na、Cl、K、GOT、GPT、γ-GTP、磷脂、Ca、无机磷、胆碱酯酶、LDH、ALP、白蛋白、直接胆红素、间接胆红素、胰岛素、血糖、血红蛋白Alc、白血球数、红血球数、血色素量、血细胞比容、MCV、MCH、MCHC、血小板数。

摄取试验饮料的3个月期间，28名试验者的平均值在所有的测定项目中均为正常范围内。

图18、19是示出血糖值的测定结果的曲线图，图18表示所有28人的平均值，图19表示摄取试验饮料开始前的血糖值(初期值)为110mg/dL以上的人(10名)的平均值相对于初期值的变化率。该变化率是由(测定值的平均值-初期值)/初期值×100(单位：％)算出的值，图中的“*”表示相对于初期值有有意义的差(以下相同)。

图20、21是示出血清中性脂肪浓度的测定结果的曲线图，图20表示所有28人的平均值，图21表示摄取试验饮料开始前的血清中性脂肪浓度(初期值)为150mg/dL以上的人(9名)的平均值相对于初期值的变化率。

图22、23是示出血清胆固醇浓度的测定结果的曲线图，图22表示所有28人的平均值，图23表示摄取试验饮料开始前的血清胆固醇浓度(初期值)为220mg/dL以上的人(11名)的平均值相对于初期值的变化率。

图24、25是示出体内脂肪率的测定结果的曲线图，图24表示所有28人的平均值，图25表示摄取试验饮料开始前的体内脂肪率(初期值)为25％以上的人(15名)的平均值相对于初期值的变化率。

图26、27是示出最高血压的测定结果的曲线图，图26表示所有28人的平均值，图27表示摄取试验饮料开始前的最高血压(初期值)为140mmHg以上的人(14名)的平均值相对于初期值的变化率。

图28、29是示出最低血压的测定结果的曲线图，图28表示所有28人的平均值，图29表示摄取试验饮料开始前的最低血压(初期值)为90mmHg以上的人(10名)的平均值相对于初期值的变化率。

由这些结果可知，对于血糖值，虽然所有人的平均值在试验期间中未变动，但初期值高的人在摄取开始2个月后和3个月后，与摄取前相比，有意义地降低。

对于血清中性脂肪浓度，虽然所有人的平均值在试验期间中未变动，但初期值高的人在摄取开始2个月后和3个月后，与摄取前相比，降低40％左右。

对于血清胆固醇浓度，虽然所有人的平均值在试验期间中未变动，但初期值高的人在摄取开始2个月后和3个月后，与摄取前相比，有意义地降低。

对于体内脂肪率，虽然所有人的平均值在试验期间中未变动，但初期值高且稍有肥胖倾向的人在摄取开始3个月后，与摄取前相比，有意义地降低。

对于最高血压，虽然所有人的平均值在试验期间中未变动，但初期值高的人在摄取开始1个月后、2个月后和3个月后，与摄取前相比，有意义地降低。

对于最低血压，虽然所有人的平均值在试验期间中未变动，但初期值高的人在摄取开始2个月后和3个月后，与摄取前相比，有意义地降低。

由这些结果可以明确，通过摄取含有混合发酵茶叶的提取物的饮料，在血糖值、血清中性脂肪、血清胆固醇、最高血压、最低血压分别有高倾向的人中，可以得到改善这些值的效果。另外，还可以明确，可以得到使稍微有肥胖倾向的人的体内脂肪率降低的效果。另外，由于不使正常的人的上述各测定值降低，因此评价为安全性高的饮料。

[临床试验例2]

研究摄取含有混合发酵茶叶的提取物的饮料对年轻女子的体内脂肪率带来的影响。另外，本试验得到县立长崎西博尔特大学研究伦理委员会的承认，并遵守赫尔辛基宣言的精神来实施。

被试验者是在县立长崎西博尔特大学内招募的本校女学生，与健康的人进行同样的日常生活，未接受医生的服药指导，是未怀孕者并且是医生判断为适合的人，对于本试验的内容，接受充分的说明，并按照本人的自由意愿由本人提出同意书，共54名成人女学生。

试验饮料使用与上述临床试验例1同样的饮料。另外，作为对照饮料，使用市售的200ml纸包装的绿茶饮料。

使27名被实验者饮用试验饮料、27名被实验者饮用对照饮料，在早餐或中餐和晚餐时分别饮用1瓶，1天饮用2瓶，共饮用3个月。

在开始摄取前测定所有人的血糖值和体内脂肪率，在试验饮料饮用组和对照饮料饮用组分别按照平均值几乎相等地进行分组。试验饮料和对照饮料的外观相同，从外观上不能识别。在摄取试验饮料前、摄取开始1个月后、2个月后以及3个月后的早晨空腹时采血，进行体重测定、体内脂肪测定以及血压测定。另外，采血前一天晚上9点以后禁食。对于试验期间的3个月的饮食没有特别限制，指导其按照与日常相同的生活进行。

血液成分的测定项目与上述临床试验例1相同。

摄取试验饮料的3个月期间，54名试验者的平均值在所有的测定项目中均为正常范围内。另外，在该3个月期间，在摄取试验饮料的27名被试验者和摄取对照饮料的27名被试验者之间，对于所有的测定项目均未观察到差别。

图30表示试验开始前的体内脂肪率(初期值)为25％以上的人(摄取试验饮料者11名，摄取对照饮料者13名)的体内脂肪率相对于初期值的变化率。

如该图所示，在体内脂肪率的初期值为25％以上的稍微有肥胖倾向的人中，摄取了试验饮料的组与摄取对照饮料的组相比，3个月后的体内脂肪率有意义地降低。

由这些结果可以明确，通过摄取含有混合发酵茶叶的提取物的饮料，可以得到使稍微有肥胖倾向的年轻女子的体内脂肪率降低的效果。另外可以确认，即使正常的年轻女子摄取也是安全的。

工业实用性

按照本发明，可以得到对于预防或改善上述的糖尿病或高血脂症具有有效的药效的发酵茶叶、发酵茶叶提取物以及饮食品。

而且，本发明的发酵茶叶具有下述优点：可以有效利用至今为止未被有效利用的枇杷叶，作为原料的茶的叶子，还可以使用到现在仍被割掉丢弃的茶叶。

Claims

1.一种用于抑制血糖值上升的组合物，其是通过包含下述(1)～(4)中任意制造方法的方法制造的用于抑制血糖值上升的组合物，

(1)包含在使用揉捏机对茶的叶子进行揉捏的同时添加枇杷叶将两者混合并进行揉捏的揉捏工序、以及在该揉捏工序后立即进行加热以停止发酵的工序的制造方法；

(2)包含在使用用手揉搓的方法对茶的叶子进行揉捏的同时添加枇杷叶将两者混合并进行揉捏的揉捏工序、以及在该揉捏工序后立即进行加热以停止发酵的工序的制造方法；

(3)包含在将茶的叶子磨碎的同时添加枇杷叶将两者混合并进行磨碎的磨碎工序、以及在该磨碎工序后立即进行加热以停止发酵的工序的制造方法；

(4)包含在向茶的叶子中加入水进行粉碎搅拌的同时添加枇杷叶将两者混合并进行粉碎搅拌的粉碎搅拌工序、该粉碎搅拌工序之后的发酵工序、以及进行加热以停止发酵的工序的制造方法，

其中，该组合物含有选自下述物质中的1种以上：茶多酚A、具有以表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素、以及儿茶素棓酸酯类氧化缩合的多酚P，该多酚P在¹³C-NMR谱图中显示来自儿茶素A环的间苯三酚的信号和来自棓酰基的信号，其乙酰化物的分子量为1000～15000，并以2000为极大，

所述茶多酚A为以下化合物：

2.权利要求1所述的用于抑制血糖值上升的组合物，其中还含有枇杷原花青素。

3.一种饮食品，其中含有权利要求1或2所述的用于抑制血糖值上升的组合物。

4.一种用于抑制血糖值上升的组合物，其是通过包含下述(1)～(4)中任意制造方法的方法制造的用于抑制血糖值上升的组合物，

其中，该组合物含有选自下述物质中的2种以上：茶多酚A、具有棓酰基的茶黄素衍生物、具有以表阿夫儿茶精棓酸酯为结构单元的原花青素、以及儿茶素棓酸酯类氧化缩合的多酚P，该多酚P在¹³C-NMR谱图中显示来自儿茶素A环的间苯三酚的信号和来自棓酰基的信号，其乙酰化物的分子量为1000～15000，并以2000为极大，

所述茶多酚A为以下化合物：

5.权利要求4所述的用于抑制血糖值上升的组合物，其中还含有枇杷原花青素。

6.一种饮食品，其中含有权利要求4或5所述的用于抑制血糖值上升的组合物。