CN101679935A - 从新鲜蜂蜜或蜜蜂的产蜜道中分离的新细菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的分离的乳酸杆菌和双歧杆菌菌株，所述菌株已从具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜或从至少一只蜜蜂的产蜜道分离。所述细菌菌株具有独特的性能，使得它们用于诸如食品、饮品、饲养产品和药品等许多产品中。

Description

从新鲜蜂蜜或蜜蜂的产蜜道中分离的新细菌
技术领域
本发明涉及新分离的乳酸杆菌和双歧杆菌菌株。本发明进一步涉及包括这些菌株的组合物和产品。
背景技术
从远古时代以来，蜂蜜，用于医药中的神秘食品以其对人类伤口的愈合作用已困惑了人们数百年，埃及人公元前2000年就已记载了这种作用。
蜂蜜由诸如蜂蜜蜜蜂产蜜蜜蜂(Apis mellifera)等蜜蜂生产。蜜蜂从植物采集的花蜜是主要由蔗糖组成的甜液。当蜜蜂回到蜂巢时，许多蔗糖已转变成葡萄糖和果糖。蜂蜜进一步包含蛋白质、维生素和矿物质。
目前，除渗透性和酸度外，蜂蜜的治疗性能用被解释为由于：作为过氧化物酶氧化物酶作用的过氧化氢含量(White，et al.1963 Biochem BiophysActa 73，57-70)、含有不同的类黄酮和酚酸含量的花蜜来源(Taormina，et al.2001.lnt J Food Microbiol 69(3)，217-225；Wahdan，H.A.1998.Infection 26(1)，26-31)和未确定组分(Molan，P.C.2001.World Wide Wounds(online)；可从以下网址得到：http://www.worldwidewounds.com/2001/november/Molan/honey-as-topical-agent.html)解释；尽管在过去30年期间进行了科学探索(Lusby，P.E.，et al.2005 Arch Med Res 36(5)，464-467；Molan，P.C.2006.lnt JLow Extrem Wounds 5(1)，40-54 lnt J Low Extrem Wounds 5(2)，122；Mundo，M.A.，et al.2004 lnt J Food Microbiol 1，97(1)，1-8)，关于许多蜂蜜作用模式的秘密仍有待解答。
蜂蜜具有的抗菌性能使得蜂蜜适宜用于伤口包扎，其中它协助预防感染、坏死组织的清除、恶臭伤口的除臭以及瘢痕形成最小化。包含蜂蜜的伤口和皮肤养护产品由WO2004000339和WO03047642公知。
在今天的医疗实践中，抗生素最常用于治疗感染。但是，抗生素的滥用已导致正成为大问题的耐抗生素病原菌的产生。食品工业中，为了延长食品贮藏寿命并防止有害致病微生物生长滥用防腐剂。但是人们正开始意识到食品中添加剂的副作用，诸如***反应，并对更天然的食品的需求增加。这些因素已导致对传统医学的兴趣，并急需在旧学识的基础上发现新治疗方案和预防性治疗以及添加剂。
本发明的目的是获得从蜂蜜获得其有益性能的药物、食品和喂养产品。
另一个目的是合成制造蜂蜜。
又一个目的是得到具有抗菌活性的新细菌菌株。
发明内容
根据本发明，通过提供新分离的乳酸杆菌和双歧杆菌菌株和包括这些菌株的组合物和产品以及制造蜂蜜的方法现已实现了上述目的，这些菌株已从含有高于18wt％水含量的新鲜蜂蜜中分离或者从至少一只蜜蜂的产蜜道中分离。本发明进一步提供分离细菌菌株的方法。
因此，发明人已发现了蜂蜜产品中封闭包含着的细菌菌株。该细菌菌株具有独特性能，该性能使得它们可用在诸如药品、食品、饮品和喂养产品等许多产品中。分离的细菌菌株在低温和酸性环境中快速生长并能在高浓度的糖溶液中生长。细菌菌株能有效地抗击其它生物体，特别是损害食品和对人类(诸如利斯特菌(Listeria)、杆菌(Bacillus)和葡萄球菌(Staphylococcus))和蜜蜂(诸如幼虫芽孢杆菌(paenibacillus larvae))致病的生物体。由于其唯一的蜂蜜相关的来源，该细菌菌株非常适用于含蜂蜜的产品中。这些产品具有独特的改善健康的性质。
直至如今，还未从新鲜蜂蜜或蜜蜂的产蜜道中分离出细菌菌株。蜜蜂的产蜜道包括诸如Apis spp等产蜜蜜蜂的躯干、嘴、食道和蜜囊。因此，消化道或肠不是蜜蜂产蜜道的一部分。新鲜蜂蜜是具有18wt％以上、优选20wt％以上水含量的蜂蜜。具有18wt％以上水含量的蜂蜜是成熟的蜂蜜，即正常使用的蜂蜜。
昆氏乳酸杆菌(Lactobacillus kunkeei)已在与蜜蜂有关的文献中出现。一个报告涉及群居黄蜂德国黄胡峰(Vespula germanica)幼虫内脏的微生物生态学的研究(Reeson，A.F.，et al.2003 Insect MoI Biol 12(1)，85-91)，第二个报告涉及作为独居蜂独栖蜜蜂(osmia bicornis)幼虫肠菌中的单克隆(Mohr，K.I.and Tebbe，CC.2006.Environ Microbiol 8(2)，258-272)。这两种生物体缺少产蜜道，不产出蜂蜜，因此不是蜜蜂(honey bee)。
蜜蜂疾病是有关巨大农业经济损失的感染和寄生病。导致美国幼虫腐臭病(AFB)的幼虫芽孢杆菌被认为是许多国家中导致被感染菌落破坏的对于蜜蜂的最危险的病原体之一(Genersch，E.，et al.2005.Appl Environ Microbiol71(11)，7551-7555)。JP2222654提议为了提高蜜蜂的免疫功能在饲料中使用来自蜜蜂肠道的乳酸杆菌菌种。这些菌种由蜜蜂的肠道分离，因而不适于类似蜂蜜的环境。
JP2222654公开了由蜜蜂的肠道分离的比菲德氏乳酸杆菌(Lactobacillusbifidus)。该文件进一步公开了蜜蜂的饲料，所述饲料包含该细菌以及乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)(即animalis)、乳链球菌(Streptococcus lactis)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)以刺激蜜蜂肠道。
本发明的第一方案涉及乳酸杆菌属或双歧杆菌属的分离的细菌菌株，所述细菌菌株从具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜中分离，或者从至少一只蜜蜂的产蜜道中分离。
本发明的第二方案涉及包括乳酸杆菌属或双歧杆菌属的分离的细菌菌株的组合物，所述细菌菌株从具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜中分离，或者从至少一只蜜蜂的产蜜道中分离，其中所述组合物可以是药物组合物。
第三方案涉及包括以上概述的药物组合物的药品。
本发明的第四方案涉及包括乳酸杆菌属或双歧杆菌属的分离的细菌菌株的食品或喂养产品，所述细菌菌株由具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜中分离，或者从至少一只蜜蜂的产蜜道中分离。
本发明的第五方案涉及乳酸杆菌属或双歧杆菌属的分离的细菌菌株的用途，所述细菌菌株由具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜中分离，或者从至少一只蜜蜂的产蜜道中分离，该用途为用于制造药品、食品、饮品或用于预防和/或治疗感染或胃肠疾病的药物组合物。
本发明的第六方案涉及细菌菌株，所述细菌菌株选自由如下菌株构成的组中：乳酸杆菌菌株Biut2(LMG P-24094)、乳酸杆菌菌株Hma2(LMGP-24093)、乳酸杆菌菌株Hma8(LMG P-24092)、乳酸杆菌菌株Bma5(LMGP-24090)、乳酸杆菌菌株Hon2(LMG P-24091)，所述菌株在2007年4月3日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心；双歧杆菌菌株Bin7(LMG P-23986)、双歧杆菌菌株Hma3(LMG P-23983)、双歧杆菌菌株Bin2(LMGP-23984)、双歧杆菌菌株Bma6(LMG P-23985)和昆氏乳酸杆菌Fhon2(LMGP-23987)，所述菌株于2007年1月15日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心；和菌株Hma11，所述菌株保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心。
第七方案涉及制造蜂蜜的方法，所述方法包括将乳酸杆菌属或双歧杆菌属中的至少一种细菌菌株添加到糖源中，所述细菌菌株由具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜或由至少一只蜜蜂的产蜜道分离。
本发明的第八方案涉及分离根据本发明的细菌菌株的方法，包括：a)对具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜取样，或从蜜蜂分离出产蜜道并将产蜜道在无菌培养基中振荡；b)来自a)的样品在适宜的培养基上的细菌培养；c)b)中得到的细菌菌株在适宜的培养基上的纯种培养和分离。
下面将特别参照附图更详细地说明本发明的其它优点和目的。
附图说明
图1说明了包括根据本发明的细菌菌株的***树。
图2说明了昆氏乳酸杆菌(样品1)和昆氏乳酸杆菌Fhon2(样品2)类型菌株的RAPD图。
图3说明了在包含65％蔗糖和35％水的65％糖溶液中不同菌株的耐糖性。
图4说明了在包含19％果糖、19％葡萄糖、37％蔗糖和25％水的70％糖溶液中不同菌株的耐糖性。
具体实施方式
定义
在本申请和发明的全文中，使用以下定义：
术语“蜂蜜”的意思是由花的花蜜在多只蜜蜂的产蜜道中制造的甜的粘性液体。
术语“细菌素”涉及细菌产生的抗菌物质。细菌素是显示对密切相关的微生物作用的抑菌模式的生物活性蛋白或蛋白复合体(蛋白聚集体、脂碳水化合物蛋白质、糖蛋白，等等)。乳酸菌产生的几种细菌素具有抗食物腐败和抗食物携带的致病微生物的活性。
术语“糖源”总体意思是甜的可溶性二糖或小低聚糖碳水化合物。糖源实例为蜂蜜、糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖。
术语“CFU”的意思是菌落形成单元。
术语“乳酸菌，LAB”涉及产生乳酸的细菌，诸如属于乳酸杆菌属、乳球菌属和双歧杆菌属的细菌。
术语“益生微生物”是指形成至少一部分瞬时或内源菌群从而呈现出对宿主生物体有利的预防和/或治疗作用的微生物。
术语“分子标记物”拟指核苷酸序列的链，用于确定细菌菌株或相关的细菌菌株。分子标记物可用于杂交法以及诸如PCR中的扩增法。
术语“赋形剂”的意思是加到产品或组合物中的任何非活性成分。
在本申请文件中，除非另作规定，“一个”(″a″or″an″)是指“一个或多个”。
蜜蜂特异性细菌菌株
本发明涉及乳酸杆菌属或双歧杆菌属的分离的细菌菌株，所述细菌菌株由至少一只蜜蜂的产蜜道或从具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜中分离。分离的细菌菌株包括至少一个菌株，从而可包括一个或多个细菌菌株。蜜蜂的产蜜道可进一步限定为由躯干、嘴、食道和蜜囊，从而不包括消化道或肠。蜜蜂优选产蜜的蜜蜂Apis spp，优选产蜜蜜蜂(Apis mellifera)。术语“新鲜蜂蜜”可定义为蜜蜂采集花蜜至蜂房后不久于三天的蜂蜜。此外，“新鲜蜂蜜”可优选具有约20wt％以上的水含量并可存在于仍未蜡封的蜂房中。蜜蜂采集的用于制造天然蜂蜜的原材料花蜜的水含量可为至多93wt％。正常地，花蜜中的水含量可为约30～50wt％。相反，熟化的蜂蜜具有低于约18wt％的水含量。
菌株优选具有至少在65wt％糖溶液中存活8天，优选至少在70wt％的糖溶液中存活8天的能力，这在许多工业应用中极为重要。根据本发明的细菌菌株可具有抑制食物腐败和致病微生物生长的能力，诸如葡萄球菌种、利斯特菌种、梭状芽孢杆菌种、假单胞菌种、大肠杆菌、酿酒酵母和幼虫芽孢杆菌。
根据本发明的细菌菌株可优选选自由如下菌株构成的组中：乳酸杆菌菌株Biut2(LMG P-24094)、乳酸杆菌菌株Hma2(LMG P-24093)、乳酸杆菌菌株Hma8(LMG P-24092)、乳酸杆菌菌株Bma5(LMG P-24090)、乳酸杆菌菌株Hon2(LMG P-24091)，所述菌株在2007年4月3日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心(Universiteit Gent，K.L.Ledeganckstraat 35，B-0999Gent，BELGIUM)；双歧杆菌菌株Bin7(LMG P-23986)、双歧杆菌菌株Hma3(LMG P-23983)、双歧杆菌菌株Bin2(LMG P-23984)、双歧杆菌菌株Bma6(LMG P-23985)和昆氏乳酸杆菌Fhon2(LMG P-23987)，在本申请递交前所述菌株于2007年1月15日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心；和菌株Hma11，保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心。
根据本发明的组合物包括乳酸杆菌属或双歧杆菌属的分离的细菌菌株，所述细菌菌株由具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜分离或由至少一只蜜蜂的产蜜道分离。所述组合物包括至少一种细菌菌株或几种细菌菌株的混合物。组合物可进一步包括糖源，优选选自由蜂蜜、白糖(sugar)、果糖、蔗糖、糊精、麦芽糖或葡萄糖构成的组中。该组合物可以是能预防胃肠疾病的食品，诸如通过使用根据本发明的菌株制造的合成制得的蜂蜜；或者是诸如饮品等包括该菌株的食品。这种食品或饮料可用作益生菌(probiotic)、益生元(prebiotic)或共生组合物或产品。该组合物可进一步是诸如蜂饲养产品等喂养产品。
该组合物可以是能预防和/或治疗感染或胃肠疾病的药物组合物，其包括可药用的载体和/或稀释剂。该药物组合物可以是以混悬剂、凝胶剂、霜剂、粉剂或胶囊剂的形式。
根据本发明的药物产品包括乳酸杆菌属或双歧杆菌属的分离的细菌菌株，所述细菌菌株由具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜分离或由至少一只蜜蜂的产蜜道分离，所述药物产品可预防和/或治疗感染或胃肠疾病，并可以是敷料、绷带或喷雾的形式。
制造根据本发明的组合物的方法包括将至少一种根据本发明的细菌菌株添加到糖源中。糖源可优选选自由蜂蜜、白糖、果糖、蔗糖、糊精、麦芽糖或葡萄糖构成的组中。这种方法可以制造合成蜂蜜，其中所述至少一种菌株允许使至少部分糖源发酵。
上述这些组合物和产品可包含活的、冷冻干燥的或被杀死的上述细菌。此外，它们可包含该细菌产生的代谢物和/或细菌素。包含冷冻干燥的细菌菌株的产品可通过加入水激活。
分离根据本发明的细菌菌株的方法包括：a)对具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜取样，或从蜜蜂分离产蜜道并将产蜜道在无菌培养基中振荡；b)来自a)的样品在适宜的培养基上的细菌培养；c)b)中得到的细菌菌株在适宜的培养基上的纯种培养和分离。为了避免受到消化道或肠道污染，产蜜道优选在食道之后前胃之前分离。该方法可进一步包括：d)评价菌株抑制食品腐烂和致病微生物的能力。
培养用的培养基可选自蜂蜜类琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤琼脂(TSB)(诸如来自英国汉普郡贝辛斯托克的Oxoid)、番茄汁琼脂(TJ)(例如来自Oxoid)，含有吐(APT)的通用培养基(诸如来自德国达姆施塔特的默克)和Rogosa琼脂(例如来自默克)。
根据本发明的优选细菌菌株在表1中公开。遵照乳酸杆菌种和双歧杆菌种的分类命名，该细菌菌株是过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性、不形成孢子和产生乳酸的杆菌。它们也快速生长并具有强大的病原体抑制性质。此外，根据本发明的细菌菌株对人体无害。
表1：分离的细菌菌株
  菌种   菌株   BCCM/LMG登记号
  昆氏乳杆菌   Fhon2   LMG P-23987
  乳杆菌种   Hon2   LMG P-24091
  乳杆菌种   Biut2   LMG P-24094
  乳杆菌种   Hma2   LMG P-24093
  乳杆菌种   Hma8   LMG P-24092
  乳杆菌种   Bma5   LMG P-24090
  乳杆菌种   Hma11   LMG P-........
  双歧杆菌种   Bin7   LMG P-23986
  双歧杆菌种   Hma3   LMG P-23983
  双歧杆菌种   Bin2   LMG P-23984
  双歧杆菌种   Bma6   LMG P-23985
根据布达佩斯条约规定的国际保藏法，表1中列出的细菌菌株保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心。菌株的16S rRNA序列与其它乳酸菌菌株比较的***发生分析证实了分离的菌株属于乳酸杆菌属和双歧杆菌属。如实施例中进一步说明，测定出了几乎完整的16S rRNA序列，且这些序列用于数据库Ribosomal Database Project(RDP)中16S rRNA序列相似性的研究(Cole，J.R.，et al.2005.Nucleic Acids Res 1，33)。该数据库用于通过它们的16S rRNA基因的细菌鉴定。大量存在于所有生物体中的16S rRNA序列的对照可用于评估生物体之间的******。
图1公开了基于16S rRNA基因中约1400个位点的距离矩阵分析的***发生树。这种树用邻接法构建并用PAUP中的Log Det/侧线法(LogDet/Paralinear method)来估算进化距离。缩写：(B.)双歧杆菌属，(L.)乳酸杆菌属，(P.)小球菌属，(Paral.)侧乳酸杆菌属(ParaLactobacillus)。菌株种类编号：布氏乳杆菌(L.buchneri)JCM 1115、瑞士乳杆菌(L.helveticus)DSM20075、卷曲乳杆菌(L.crispatus)ATCC 33820、格氏乳杆菌(L.gasseri)ATCC33323、文氏乳杆菌(L.versmoldensis)KU-3、卡氏乳杆菌(L.kalixensis)DSM16043、赛氏侧乳酸杆菌(Paral.Selangorensis)LMG 17710、小片球菌(P.parvulus)JCM 5889、意外片球菌(P.inopinatus)DSM 20285、肉汤乳杆菌(L.kitasatonis)JCM 1039，哈氏乳杆菌(L.hamsteri)DSM 5661、溶淀粉乳杆菌(L.amylolyticus)DSM 1664、昆氏乳杆菌YH-15、嗜酸耐热双歧杆菌(B.thermacidophilum)猪亚种P3-14、星状双歧杆菌(B.asteroides)ATCC 25910、棒状双歧杆菌(B.coryneforme)ATCC 25911、嗜酸性乳杆菌(L.acidophilus)DSM 20079、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)JCM 1136、植物乳杆菌(L.plantarum)JCM 1149、干酪乳杆菌(L.casei)JCM 1134、发酵乳杆菌(L.fermentum)ATCC 14931、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM 20016、动物双歧杆菌乳酸亚种(B.animalis subsp.Lactis)DSM 10140、短双歧杆菌(B.breve)ATCC15700、婴儿双歧杆菌(B.infantis)ATCC 15697。
乳酸杆菌菌株Biut2、Hma2、Hma8和Bma5是***发生树描述的乳酸杆菌属内的新品种。这些细菌菌株不与乳酸杆菌属中的其它紧密相关物构成簇。该簇位于德氏乳杆菌(L.delbrueckii)***发生组中。
乳酸杆菌Hon2与乳酸杆菌属中的新品种构成第二簇。但是，这个簇位于干酪乳杆菌-小球菌***发生组与德氏乳杆菌***发生组之间。昆氏乳酸杆菌Fhon2的16S rRNA基因序列与前述昆氏乳酸杆菌类菌株相同并位于干酪乳杆菌-小球菌***发生组中。但是，当比较微生物体的整个DNA时，参见图2，显而易见这两种生物体不相互对应。双歧杆菌Bin2、Hma3和Bin7与双歧杆菌属星形线同源并分为该种类中的菌株或作为双歧杆菌属中的新品种。双歧杆菌Bma6与棒状双歧杆菌紧密同源。
Hma11也是乳酸杆菌属中的新品种。
已确定表1中的细菌菌株是蜜蜂的产蜜道中或新鲜蜂蜜中发现的蜜蜂特有的。在蜂蜜制造过程中将这些菌株转移到来自蜜蜂产蜜道的蜂蜜中。双歧杆菌属菌株Bin2、乳酸杆菌属菌株Hon2和昆氏乳酸杆菌Fhon2也已在新鲜蜂蜜中发现。当蜂蜜中的水含量降低至低于约18％时，没有未形成孢子的细菌存活，从而不可能将细菌分离。3～7天后，该蜂蜜将包含死的细菌和诸如细菌素和代谢物等细菌组分。
根据本发明的细菌菌株具有较低的最佳生长温度范围，约20～35℃之间，例如约21～32℃之间，这是蜜蜂采集花蜜时蜜囊中的温度。此外，与许多其他乳酸细菌相比，这些细菌菌株生长快速。它们还能耐诸如pH2～5之间的酸性环境，这是自然出现蜂蜜的pH值。
分离的昆氏乳酸杆菌Fhon2是兼性厌氧菌，弱过氧化氢酶阳性，由葡萄糖产生气体，在葡萄糖存在下利用柠檬酸或苹果酸，并由果糖产生甘露醇。另外，大多数时间它不会由精氨酸产生氨也不会还原硝酸盐。此外，它使果糖、葡萄糖、蔗糖和棉子糖发酵。
参见实施例，根据本发明的细菌菌株能在诸如带有可能加入的APT琼脂、Rogosa琼脂和胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)琼脂中的一种或多种的番茄汁琼脂等培养基中生长。这些种类培养基的应用对细菌菌株的生长极其重要。细菌菌株的生长还可在蜂蜜基琼脂板上实现。
表1中列出的细菌菌株是二乙酰、过氧化氢和诸如乳酸和乙酸等有机酸的制造者。已显示所有这些分子都存在于蜂蜜中，从而可能有利于蜂蜜抗菌性、味道和质量。这些抑制剂与细菌菌株产生的细菌素和其它抗菌物质一起暗示了抗其它种类的细菌和酵母的广谱蛋白拮抗剂的产生。这些细菌菌株是蜂蜜中通常发现的属于酵母属的酵母的非常有效的抑制剂。因为蜂蜜对酵母极度敏感，预计如果蜂蜜水含量高于约18％，即使只有1孢子/g蜂蜜的酵母存在，蜂蜜也会发酵。因此，用所述细菌菌株的蜂蜜保存对蜂蜜的长期储存至关重要。表1中列出的细菌菌株的保存能力使得它们用于许多保存应用，不仅用于蜂蜜保存还通常用于食品和饮料的保存。细菌抑制对抗许多细菌有效，诸如抗食物腐败和食物携带的致病微生物，包括酪丁酸梭菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和荧光假单胞菌、清酒乳杆菌、蜡状芽孢杆菌、无害利斯特菌、粪肠球菌、酿酒酵母、幼虫芽孢杆菌。
本发明还涉及表1中提供的细菌菌株的分离的纯种培养。这种精制培养可在琼脂板上作为菌落提供，作为液体细胞悬液或作为冷冻、喷雾干燥制剂或冷冻干燥制剂提供。这种培养在任何应用中可单独或组合使用，诸如在食品或饮品、喂养产品或药物产品中。此外，这种培养可包含并可用于制造代谢物、抗菌化合物和/或细菌素，它们能在诸如以上例举的多种产品或组合物中应用。
另外，根据本发明的产品或组合物可包括表1中列出的细菌的两种或更多种不同菌株。通过结合至少两种或更多种菌株，细菌的作用将以协同方式应用使得能对抗更多种类的病原体。此外，由于将产生许多不同的细菌素，将增强这些产品的功效。因此，将得到如蜜胃和新鲜蜂蜜中自然出现的混合物的更自然出现的细菌菌株混合物。
上述产品可包含糖源，其中糖源选自包括蜂蜜、白糖、果糖、蔗糖、糊精、麦芽糖或葡萄糖的组中。通过产生包含根据本发明的细菌菌株与蜂蜜结合的产品，细菌菌株将以与蜂蜜协同的方式履行它们的功能。因此，理想的是将蜂蜜与加入的根据本发明的细菌菌株的作用结合。
食品或饮品
本发明的产品或组合物至少包括一种根据本发明的菌株，并可通过使用适宜的食物或饮料组成或营养素以食品或饮品的形式制造。这种食物或饮料可用作益生菌、益生元或共生组合物或产品。
通过添加一种或更多种根据本发明的细菌菌株，得到改进了的新产品。这些产品可包含活的、冷冻干燥的或被杀死的细菌。此外，该产品可包含细菌产生的代谢物和/或细菌素。包含冷冻干燥菌株的产品可通过加入水来激活。
通过使用根据本发明的细菌菌株，可制造出高度天然的产品。通过结合至少两种或更多种本发明的细菌菌株，细菌的作用可以协同方式利用。通过这种方式，可得到与蜂蜜中一样的更自然出现的细菌菌株的混合物。细菌菌株混合物的应用还增大了破坏多种不利病原体的机会。
产品可包括选自包括蜂蜜或例如糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和葡萄糖的组中的糖源。通过制造包含至少一种根据本发明的细菌菌株与诸如蜂蜜等糖源结合的产品或组合物，细菌菌株将以与糖源协调的方式履行它们的功能。理想的是将蜂蜜与加入的根据本发明的细菌菌株的作用结合。根据本发明的一个实施方式，可制得包含蜂蜜和细菌的诸如蜂蜜水饮料等饮料。蜂蜜水饮料可通过混合水、蜂蜜、根据本发明的细菌菌株和诸如柠檬汁、梨莓汁、橙汁或苹果汁等果汁来制造。饮料中细菌菌株的浓度可为约101～1014CFU/g产品，例如101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1013CFU/g产品。该细菌菌株的浓度还可用在未加蜂蜜的饮品中。约1015CFU/g产品的浓度可用于模仿新鲜蜂蜜中细菌菌株天然出现的浓度的产品中。蜂蜜水饮料还可以具有更小水含量或不含水并含有冷冻干燥的细菌菌株和前述果汁的浓缩物的形式制造。
蜂蜜食品可进一步用作制造其它食品的组分。
本发明的目的是利用包含将更易接近、频繁并常用于任何消费者的细菌菌株的食物或饮料的用途，用于增加、补充和平衡肠菌类的目的的用途，它们会产生日常健康和运动活力方面的益处。
根据另一个实施方式，提供包含细菌菌株混合物的功能性食物或饮料，它们能以活体形式或能生存的形式以及它们的细菌素和/或代谢物到达肠道，停留在细菌丛中，影响或生长，从而履行对人体健康重要而有益的作用。到达肠道的细菌菌株还可以非活体状态，然后通过它们产生的细菌素和/或代谢物履行有益的作用。上述食物或饮料可用于预防和/或治疗胃肠疾病。
饮料实例为牛奶制品、果汁制品、葡萄酒、醋、瑞典Glogg、啤酒、苏打水、柠檬水和苹果汁制品。包括根据本发明的一种或多种细菌菌株并加入蜂蜜的饮料可以是抗冷或咽喉发酸的蜂蜜水形式，如用于运动员、抑郁人群的康复，或用于免疫抑制的住院病人的康复。饮料的特征可以是其包括矿物质和提供与新鲜蜂蜜中一样的所需天然作用的其它物质的特殊构成。
加有根据本发明的细菌菌株的饮料或食物将受益于上述细菌菌株的保存作用。强力抑制了酵母发酵。此外，细菌菌株可用于葡萄酒酿造以结束酵母发酵。细菌将作为自然来源的对健康有利的细菌保持在产品中。
食物或饮料还可包含诸如示例性的维生素、矿物质、抗氧化剂、酚类、纤维、低聚糖、蔗果低聚糖或菊粉(innulin)等添加剂。
食品实例为肉制品、乳制品、水果制品、鱼制品、面包店产品或蔬菜制品。食品可包含诸如蜂蜜等糖源。食品可以是新鲜蜂蜜或加入有根据本发明的细菌菌株的成熟蜂蜜。蜂蜜食品可通过将根据本发明的细菌菌株或根据本发明的细菌菌株混合物添加至蜂蜜或其它产品中制造。可适宜选择细菌菌株的浓度以实现约101～1014CFU/g产品的浓度，例如101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1013CFU/g产品。
根据本发明的细菌菌株还可用作食物和饮料发酵的发酵剂。食物和饮料的实例为面包、酪乳、可可豆、香草、咖啡、奶酪、新鲜奶酪、黄瓜、饲料添加剂、发酵鱼制品、发酵牛奶、橄榄油、泡菜、香肠、酸奶、葡萄酒、啤酒、苹果酒和蜂蜜。
药品
根据本发明的细菌菌株对预防或治疗感染很有用，因为它抑制了病原微生物的生长。菌株和包含它们的产品可以诸如软膏、霜、喷雾、凝胶和液体溶液等形式转移到人类或动物皮肤。细菌菌株还可以在产品的多种部分中包含在诸如敷料剂、皮肤修复(dermal patches)、凝胶或绷带等包含有效量细菌菌株的产品中以实现预防或抑制感染的理想结果。这些产品可用于伤口、伤处、烧伤、瘢痕、褥疮、糖尿病病变、痤疮、湿疹、皮炎、癌症、粘膜炎、皮疹、酵母菌感染、中毒性休克综合症、霉菌感染、滤过性毒菌感染和溃疡的治疗。
上述产品可用于细菌感染、病毒感染、酵母菌感染或霉菌感染的治疗。所关心的病毒感染可以是包括唇疱疹的疱疹病毒感染。将用根据本发明的细菌菌株对抗的细菌感染可以是选自包括葡萄球菌种、梭状芽孢杆菌种、芽孢杆菌种、肠球菌种、假单胞菌种、利斯特菌种和大肠杆菌的组中的种的感染。
药品可包括根据本发明的细菌菌株与诸如蜂蜜或合成蜂蜜的组合。然后该产品将受益于蜂蜜的作用与细菌菌株的作用的组合。该产品可包括不同重量百分比的霜状或结晶状蜂蜜，喷雾干燥、冷冻干燥、风干蜂蜜和/或液体蜂蜜。所述蜂蜜可以是新鲜蜂蜜或成熟蜂蜜。
药品可包括由根据本发明的细菌菌株产生的代谢物和/或细菌素。为了实现无菌产品而不含任何能存活的细菌，该产品可另外以已知方式杀菌。所述产品将受益于细菌菌株预先产生的细菌素和/或代谢物。
活性组分，即活的或死的细菌菌株和细菌素和/或代谢物可包括最终产品的约0.1wt％～约100wt％，例如1wt％～70wt％，例如5wt％～50wt％。一克剂量中常规产品将包含101～1014CFU的浓度，例如101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1013CFU的能存活的或被杀死了的细菌。
药品可包括至少一种或多种本发明的细菌菌株或由一种或多种根据本发明的细菌菌株产生的细菌素。细菌菌株或来自不同细菌菌株的细菌素的混合物可对病原体抑制功效有利。
药品还可包括口香糖中的细菌菌株。该产品可用于例如龈炎和牙斑的治疗。口香糖产品的成分可以是蜂蜜、蜂蜡、树胶和其它本领域已知成分中的一种或多种。
药品中的可选成分包括诸如抗生素、杀真菌剂和其它抗菌剂等药剂、维生素、缓冲剂、着色剂、矿物质、调味料、香料、胶凝剂或诸如抗氧化剂等其它化学化合物或钙。
药品可包括膜、敷料、层化的片敷料、片、带、绳构型或包套(wrap)形式的基材。适于基材的选择包括琼脂凝胶膜、海藻酸敷料、水解胶质、泡沫敷料，等等。此外，产品可包括根据本发明的细菌菌株与可药用的和生理可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂一起。干制剂的载体可以是海藻糖、麦芽糊精、米粉、微晶纤维素、硬脂酸镁、肌醇和其它。液体或凝胶类载体可以是水、盐溶液、醇等。然后药品可通过将细菌菌株应用到吸收剂等中形成。
药品可以是使用可药用的载体与根据本发明的细菌一起的药剂产品的形式。可药用载体的实例包括多种稀释剂和赋形剂，例如填料、增量剂、粘结剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂和本领域已知的其它载体。配药形式可以是丸剂、片剂、粉剂、溶液、混悬剂、乳剂或颗粒。片剂可涂覆有标准涂覆材料。该药剂产品中的细菌菌株的量可选自约105～1014CFU/剂量的产品，诸如105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1013CFU。所述药品可用于肠胃疾病的预防和/或治疗。
饲养产品
根据本发明的细菌菌株在蜜蜂和蜜蜂幼虫的饲养产品中颇有价值。这些产品可以是以用于加强或重建蜜蜂或蜜蜂幼虫中微生物菌丛的益生菌饲料形式。所用的细菌菌株是蜜蜂的产蜜道中自然出现的细菌菌株。因而，根据本发明的细菌菌株不会破坏产蜜道小生境中的任何自然出现的细菌菌株。其它非产蜜道产生的有益细菌菌株在相似产品中的使用能改变阴性物质中蜜蜂的自然细菌菌丛。因此，根据本发明的这种饲养产品将尤其有意义。
上述饲养产品可包括表1中列出的一种或多种细菌菌株。细菌菌株的混合物可对治疗功效有利。
细菌菌株的浓度可适宜选择以实现约101～1014CFU/g产品的浓度，例如101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1013CFU/g产品。
饲养产品可用于保护蜜蜂或蜜蜂幼虫不受病原体细菌、病毒、真菌或螨的侵袭。通常导致致死感染并被上述产品对抗的生物体为幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂球囊菌、狄氏瓦螨、羽翼畸形病毒或微孢子虫。
细菌菌株或细菌菌株混合物可以粉剂、溶液或以固体对蜜蜂或蜜蜂幼虫给药。粉剂可以是以冷冻干燥、喷雾干燥或风干形式。粉剂易于处理、运输、储存并具有更长的有效期。粉剂或溶液可撒在或喷在蜜蜂或幼虫上。还可通过直接在蜜蜂巢上喷雾或洒粉剂或溶液来实现有效给药。
饲养产品还可包含糖源。糖源可以是蜂蜜、糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、糊精、麦芽糖或其它形式的糖。蜜蜂或蜜蜂幼虫可将糖源用作能源。通过使用蜂蜜的糖溶液，得到多种优势。首先，与简单的含蔗糖的溶液相比，蜜蜂更渴望使用含蜂蜜的溶液。其次，蜂蜜包含其它有益组分，例如矿物质、维生素和蛋白质。
当使用根据本发明的细菌菌株时，包含他们的蜂蜜饲料将受益于细菌素和代谢物的细菌和酵母菌抑制性能。因此，糖溶液像正常在糖溶液的情况下一样不会发酵。
饲养产品还可包含秋天、冬天和春天期间为蜜蜂和蜜蜂幼虫的重要食物来源的花粉、大豆、蜂粮或合成蜂粮。饲养产品还可包含其它添加剂，例如维生素、矿物质、脂肪、碳水化合物和蛋白质。
当蜂蜜群虚弱和休眠时，细菌菌株的给药在秋天或冬天特别重要。细菌菌株还将用作社会中存在的蜂蜜或糖的防腐剂。在秋天、冬天和早春期间，当没有花蜜可用时，蜜蜂和蜜蜂幼虫特别易受细菌、病毒、霉菌和寄生感染损坏。通过根据本发明的细菌菌株对蜜蜂和蜜蜂幼虫的给药，当细菌到达蜜蜂产蜜道(它们的原始自然环境)时，它们将生长成能存活的状态。因此，蜜蜂和幼虫将得到对蜜蜂和幼虫病原体的更有效的保护。
以下实施例期望以任何方式、形状或形式，或明确地或含蓄地说明，但不限制本发明。
实施例
实施例1-蜂箱收获
将有约12000只蜜蜂的小蜂箱运到位于瑞典南部斯葛纳西北部的Kullaberg自然保护区的野生树莓花区域。在此期间该紧邻区域中没有其它的花开花，且当实验开始时，蜂箱的蜂蜜被清空。在第二个星期，在蜂箱周围的新鲜树莓花上进行采样，采集出入工蜂和来自蜂巢的新鲜树莓花蜂蜜。除了那些样品以外，保存收获的树莓蜂蜜并在储存两个月后分析。为了所有细菌目的以及实验室选择，将这些样品在四种不同类型的培养培养基中培养。细菌确定通过用克隆和纯种培养的16S rRNA的分析实现。
实施例2-来自蜜蜂的细菌的分离
在含有5ml无菌生理盐水(0.9％w/v NaCI，0.1％w/v 80～0.1％w/v之间的胨)的不同10ml无菌试管中选择并分类20朵树莓花、10只进来和10只出去的工蜂以及10只保育蜂。此外，分别在包含0.9ml生理盐水的1.5ml无菌微试管中单独收集0.5ml新鲜蜂蜜、五只蜂蜜幼虫(2～5天大)、五只蜜蜂头、五只蜜蜂蜜胃和一只蜜蜂消化道。将头与身体分离用无菌解剖刀和镊子进行蜜蜂嘴和躯干的分析。在用细菌培养后将头在无菌稀释培养基中振动。蜜蜂胃的分析通过在食道后并在前胃前用无菌解剖刀和镊子切成装满花蜜的蜜蜂胃进行，该切除保证没有肠道部分污染样品。震荡试管并立即转移到实验室。将装有0.5ml悬浮液的试管在-20℃冷冻和储存用于16S rRNA基因分析。
从健康的蜜蜂分离出能存活的表1中所列的细菌菌株。发现产生最大量根据本发明的细菌的花蜜源的花是树莓花。细菌菌株的肠道样本证明了没有根据本发明的菌株。
实施例3-来自蜜胃的细菌的培养
由实施例2中说明的样品，制作含有无菌生理盐水的稀释系列并在不同生长培养基中涂布0.1ml的体积的稀释液。生长和纯种培养在不同培养基上(参见表2)由含有胰蛋白胨大豆肉汤琼脂(TSB)(英国汉普郡贝辛斯托克的Oxoid)、番茄汁琼脂(TJ)(Oxoid)、吐
Figure A20088001463800211
(APT)的所有通用培养基(默克，德国达姆施塔特)和Rogosa琼脂(默克)的不同稀释剂得到。根据生产说明制造培养基。表明了单独培养基的所用组合对细菌的生长至关重要。除Bma5生长有限和Fhon2在Rogosa上几乎不生长以外，所有分离物在Rogosa上都生长得非常好。相反，Fhon2(昆氏乳杆菌)与属于双歧杆菌属的菌株(Bin2、Bin7、Bma6和Hma3)一起在番茄汁琼脂上生长得非常好。其它乳酸杆菌种(Biut2、Hon2、Hma2、Hma8、Hma11和Bma5)在番茄汁琼脂上有限生长。将分离物在37℃下需氧培养和厌氧培养2～3天。从使用的各包含30～300个菌落的所有培养基中随机选择10～30个菌落并再培养以提纯(分离物)。
表2：在特定培养基上的细菌生长
  菌种   培养基
  双歧杆菌菌株Bin2   番茄，APT，Rogosa，TSB
  双歧杆菌菌株Bin7   番茄，APT，Rogosa，TSB
  乳杆菌菌株Biut2   番茄，APT，Rogosa，TSB
  双歧杆菌菌株Hma3   番茄，Rogosa
  乳杆菌菌株Hon2   番茄，APT，Rogosa
  乳杆菌菌株Hma8   番茄，Rogosa，APT
  双歧杆菌菌株Bma6   番茄，TSB，Rogosa
  乳杆菌菌株Bma5   番茄，Rogosa，APT
  乳杆菌菌株Hma2   番茄，Rogosa，APT
  Kunkeii乳杆菌Fhon2   番茄，APT，TSB，Rogosa
  乳杆菌菌株Hma11   番茄，Rogosa，APT
实施例4-克隆和PCR-扩增
在一起装有0.1ml无菌水和玻璃微珠(0.106mm，美国，St Louis，Sigma-Aldrich)的0.2Thermo-Strips(英国萨里，Abgene)中放置来自纯化的分离物的一个菌落。通过在MS1迷你振动机(美国伟明顿，IKA Work公司)中振动45分钟来分解细胞。离心分离后，在Galaxy迷你离心机(美国宾夕法尼亚州，VWR)中20200×g离心分离5分钟，在随后的PCR反应中使用1μl的上清液。
用设计用于对细菌16S rRNA基因的保守区域退火的引物进行扩增。上游引物ENV1(5′-AGA GTT TGA TII TGG CTC AG-3′)对应于位点8～27为大肠杆菌16S rRNA，以及下游引物ENV2(5′-CGG ITA CCT TGT TAC GACTT-3′)对应于位点1511～1492(Brosius等，1978)。PCR反应包含5μl 10×PCR缓冲液(100mM Tris-HCI，15mM MgCl2，500mM KCI，pH 8.3)200μmol.l-1的各脱氧核糖核苷三磷酸、2.5U的Taq DNA聚合酶(德国曼海姆，Roche Diagnostics)、10pmol的各引物和1～10μl模板，总体积为50μl。扩增用Mastercycler(德国汉堡，Eppendorf)进行如下：95℃15秒、48℃30秒和72℃90秒30个循环，随后在72℃进行延伸步骤10分钟。在-20℃保存PCR产品用于测序。
根据用于EZ1 DNA试剂盒(德国希尔顿，Qiagen)的程序，将190μl缓冲液G2和10μl蛋白酶K加入到颗粒中并用MS 1迷你振动机混合2分钟。将样品在56℃的水浴(Julabo SW1，德国)中培养直至颗粒溶解。每隔15分钟混合样品1分钟以加速该过程。加入玻璃微珠(0.106mm)并在MS1迷你振动机中通过振动分离细胞。在Galaxy迷你离心机中20200×g离心分离5分钟后，在BioRobot EZI version 1.3(Qiagen Instruments AG，德国)中根据用于EZ1 DNA Tissue Kit的程序用来自Qiagen的组织卡进一步处理0.1ml的上清液。过程结束时，在200μl无菌水中洗提DNA。
在四个重复样中进行PCR扩增，用于对各个样品最小化PCR-引入的偏差。对于分离物以相同的方法进行扩增，只是退火温度为50℃。将来自各个DNA制备的四个PCR产物一起冷却并通过在1.5％(w/v)琼脂糖凝胶(III型，高EEO，Sigma，ST.Louis，美国)上电泳它们来检测。凝胶用溴化乙锭染色并在紫外光中显像。
收集的PCR产物用GFXTM PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Biosciences，英国)纯化。根据生产者的说明，将纯化的产物连接到TOPO TA克隆载体中(Invitrogen，美国)中并转化到感受态的pCRM-TOPO大肠杆菌细胞中。菌落在具有卡那霉素(Sigma)和X-gal(Promega)的LB琼脂上进行蓝色/白色筛选。从各个样品中随机选择24个白色菌落并再培养。
为了回收复制的DNA，用设计为在载体的开始或结束处退火的通用引物：M13上游引物(5′-GTA AAA CGA CGG CCA G-3′)和M13下游引物(5′-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3′)进行扩增。PCR反应包含：5μl 10×PCR缓冲液(100mM Tris-HCI，15mM MgCl2，500mM KCI，pH 8.3)200μmol.l-1的各脱氧核糖核苷三磷酸、2.5U的Taq DNA聚合酶(德国曼海姆，Roche Diagnostics)、10pmol的各引物和1～10μl模板，总体积为50μl。扩增用Mastercycler(德国汉堡，Eppendorf)进行如下：在94℃用一个变性步骤进行10分钟，随后在94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟28个循环，接着在72℃进行伸长步骤保持10分钟。在-20℃保存PCR产品用于测序。
实施例5-16S rRNA测序和***发生分析
通过测序公司(MWG Biotech AB，德国埃伯斯贝格)用通用引物ENV1和ENV2将由分离的细菌产生的PCR产物测序。用高级BLAST相似性研究选项(Altschul，S.F.，et al.Nucleic Acids Res 25，3389-3402)通过GenBank(National Centre for Biotechnology Information，Rockville Pike，Bethesda，MD)研究这些部分16S rRNA序列，从生物技术信息国家中心的主页登陆(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。为了比较，还通过另一种软件，RibosomalDatabase Project II研究序列，由主页(http://rdp.cme.msu.edu)登陆。这些部分序列为约1400碱基对(范围50～1500bp)。
用以下计算机软件程序：Clustal X(版本1.81)(Thompson，J.D.等，1997.Nucleic Acids Res 24，4876-4882)用于排列、BioEdit(版本6.0.7)(Hall，T.，BioEdit Sequence Alignment Editor，lsis Pharmaceuticals，Inc)用于编辑以及PAUP(版本4.0beta)(由D.Swofford编写)用于计算***发生树得到图1中的***发生树。该树在PAUP中用邻接法(Saitou，N.and Nei，M.1987.MoI Biol Evol 4，406-425)采用进化距离估算Log Det/侧线模型构建。
实施例6-发酵模式
参见表3，API 50CHL(BioMerieux SA，法国)***用于通过其发酵方式实验性地确定细菌菌株。收集番茄汁琼脂上的菌落，并在试剂盒提供的悬浮培养基中再悬浮。根据生产者说明接种并分析(48和82小时后)API带。
表3：发酵模式
  API编号 活性组分 Hon2 Hma2 Biut2* Hma8 Bma5 Fhon2 Hma3 Bin2 Bin7 Bma6
  0   对照   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  1   甘油   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  2   赤藻糖醇   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  3   D-树胶醛醣   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  4   L-树胶醛醣   +   -   -   -   -   -   +   +   +   -
  5   D-核糖   +   -   -   +/-   -   -   +   +   +   +
  6   D-木糖   -   +/-   -   -   -   -   +   +   +   -
  7   L-木糖   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  8   D-核糖醇   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
9   甲基-βD-吡喃木糖苷 - - - - - - - - - -
  10   D-半乳糖   -   -   +   -   -   -   +   +   +   -
  11   D-葡萄糖   +   -   +   +   +   +   +   -   +   +
  12   D-果糖   +   -   +   +/-   +   +   +   -   -   -
  13   D-甘露糖   -   -   -   +/-   +   -   -   -   -   +
  14   L-山梨糖   -   -   -   -   +   -   -   -   -   -
  15   L-鼠李糖   +   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  16   己六醇   -   -   -   -   +/-   -   -   -   -   -
  17   纤维醇   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  18   D-甘露醇   +   -   -   -   -   +/-   -   -   -   -
  19   D-山梨醇   -   -   -   -   +   -   -   -   -   -
20   甲基-αD-吡喃糖甘露糖苷   -   -   -   - - - - - - -
21   甲基-αD-吡喃葡萄糖苷   -   - + - - - - - - -
22   N-乙酰-葡萄糖胺 + + + + + - - -   -   -
  23   苦杏苷   -   -   -   -   +   -   -   -   -   +/-
  24   熊果苷   +/-   -   +   -   +   -   +/-   -   +   +/-
25   七叶灵柠檬酸铁 + + - - + - + + + +
  26   水杨苷   -   -   +   -   +/-   -   +   +   +   +/-
  27   D-纤维二糖   -   -   +/-   -   +   -   +   -   +   +
  28   D-麦芽糖   +   -   +   +/-   -   -   +   -   -   +
29   D-乳糖(牛来源)   - + - - - - + - - -
  30   D-蜜二糖   -   -   -   -   -   -   -   +   +   -
  31   D-蔗糖   +   -   -   -   +/-   +   +/-   -   +/-   -
  32   D-海藻糖   +   -   +   -   -   +   +   -   -   -
  33   菊粉   -   +   -   -   -   -   -   -   -   -
  34   D-松三糖   +/-   -   -   - -   -   -  -   -   -
  35   D-蜜三糖   -   +/-   -   - -   -   +  -   +   -
  36   淀粉   -   -   +/-   - -   -   - -   -   -
  37   肝糖   -   -   -   - -   -   - -   -   -
  38   木糖醇   -   -   -   - -   -   - -   -   -
  39   龙胆二糖   -   -   +   - -   -   - -   -   +
  40   D-松二糖   +   -   -   - -   -   - -   -   -
  41   D-来苏糖   -   -   -   - -   -   - -   -   -
  42   塔格糖   -   -   +   +/- -   -   - -   -   -
  43   D-海藻糖   -   -   -   - -   -   - -   -   -
  44   L-海藻糖   -   -   -   - -   -   - -   -   -
  45   D-***糖   -   +/-   -   - -   -   - -   -   -
  46   L-***糖   -   -   -   - -   -   - -   -   -
  47   葡糖酸钾   -   -   -   - -   +/-   - -   -   -
  48   2-酮-葡糖酸钾   -   -   +/-   - -   -   - -   -   -
  49   5-酮-葡糖酸钾   -   +/-    -   - -   +/-  - -   -  -
*＝CHL培养基用悬浮在无菌水中并无菌过滤的5％W/V酪蛋白氨基酸补充。
实施例7-昆氏乳杆菌型菌株和昆氏乳杆菌菌株Fhon2的发酵模式和DNA-“指纹”
采用API 50CHL(BioMerieux，法国)***通过它们的碳水化合物发酵模式来比较菌株Fhon2和昆氏乳杆菌菌株YH-15。收集番茄汁琼脂上的培养菌并再悬浮在试剂盒提供的悬浮培养基中。根据生产者说明用API条带接种并分析(48和82小时后)。结果有区别，昆氏乳杆菌型菌株YH-15能使Fhon2不能使之发酵的D-棉子糖发酵，而Fhon2能使昆氏乳杆菌型菌株YH-15不能使之发酵的D-海藻糖、葡萄糖酸钾和5-酮葡萄糖酸钾发酵。证明了包括昆氏乳杆菌Fhon2的根据本发明的细菌菌株不同于昆氏乳杆菌菌株型。
随机扩增的多态DNA(RAPD)分析用于使昆氏乳杆菌Fhon2区分于昆氏乳杆菌型菌株。实验过程根据Jansson DS等，2004.J Med Microbiol.53，293-300进行，采用引物1254(51-CCGCAGCCAA-31)。由引物1254得到的RAPD模式的结果示于图2中。证明了包括昆氏乳杆菌Fhon2的根据本发明的细菌菌株不同于昆氏乳杆菌菌株。相同的细菌菌株应在琼脂糖凝胶中表现出有关细菌染色体组合物的相同模式。图2中用数字1表示的昆氏乳杆菌菌株表现出9个DNA-带，而用数字2表示的昆氏乳杆菌Fhon2表现出6个DNA-带。这些菌株具有不同的带编号以及不同的带图形，这意味着它们在整个DNA基因组的组成上不同。
如上所述，即使在图1的***发生树上显示的昆氏乳杆菌Fhon2与该型菌株之间有高16S rRNA相似性，昆氏乳杆菌Fhon2是新的昆氏乳杆菌菌株。
实施例8-蜂箱感染
将一个蜂箱受幼虫病原体幼虫芽孢杆菌感染。受该病原体的感染正常将导致发生致命的美国幼虫腐臭病(AFB)。感染后，蜂箱放置在树莓花和菩提树场旁边，它们的花蜜用作根据本发明的细菌的益生元。此时，幼虫芽孢杆菌的数量从其记录的最大值8亿CFU每幼虫开始减少并在三周后消失，未发生AFB。该结果非常清楚地表明：当用比其它花蜜含有更多果糖的来自树莓和菩提树花的花蜜饲养根据本发明的细菌菌株时，它们一起可对抗这种病原体。
实施例9-秋季蜜蜂和蜜蜂幼虫的益生菌饲料
包括根据本发明的冷冻干燥的细菌和糖源的秋季蜜蜂饲养产品(蜜蜂冬天休息)通过将细菌与包含19％果糖、19％葡萄糖、37％蔗糖和25％水的糖溶液混合制备。所用产品总量为16kg/蜜蜂群，且该产品包含105CFU细菌/g产品。将这些成分混合并喂给蜜蜂群顶部瓶子中的蜜蜂群。蜜蜂吸入该溶液并将它储存在它们的蜂巢单元中用蜡密封。
在第二应用中，将冷冻干燥的细菌与1kg蜂蜜混合导致107每克产品的细菌CFU浓度。将1kg蜂蜜与13kg蔗糖和14kg水混合。该产品具有与花蜜一样的约50％的糖含量以及与蜜胃中的相近的细菌CFU。将糖溶液在喂给蜜蜂前放置一天。通过该方式，冷冻干燥的细菌有机会复苏并开始增殖，并在使用前产生有益的代谢物和细菌素。与使用未添加细菌的糖溶液时的正常情况一样，该糖溶液未酵母菌发酵。通过在糖溶液中使用蜂蜜得到诸多优点。首先，与普通蔗糖相比，蜜蜂更渴望使用上述糖溶液。其次，蜂蜜包含其它组分，例如矿物质、维生素和蛋白质。
实施例10-保存研究
将4×107CFU的昆氏乳杆菌菌株Fhon2与200ml水、5ml柠檬汁和17ml蜂蜜混合。将蜂蜜水放置在冰箱中3个星期。三星期后，尝该水的味道，没有发酵或细菌的味道。昆氏乳杆菌的量翻倍，而酵母菌未测出。
实施例11-耐糖性研究
将根据本发明的细菌菌株和商购产品菌株嗜酸性乳杆菌DSM 20079、干酪乳杆菌JCM 1134、罗伊氏乳杆菌DSM 20016、动物型乳酸杆菌乳酸亚种DSM 10140和德氏乳杆菌保加利亚亚种DSM 20081在单独的瓶中与包含65％蔗糖和35％水的糖溶液混合。最终糖浓度为65％。将这些瓶在22℃培养，并进行能存活的计数。参见图3，结果证明了根据本发明的细菌菌株比商购产品菌株(8天后它们全部死亡)的耐糖性高得多(8天后所有细菌菌株仍然存活的cfu数量为102～105cfu每ml)。
重复第一次实验，只是使用包含19％果糖、19％葡萄糖、37％蔗糖和25％水的不同糖溶液进行第二次实验。在该溶液中，糖浓度为70％，这对于细菌来说是非常高的糖浓度。参见图4，结果再次证明了根据本发明的细菌菌株比商购产品菌株(8天后它们全部死亡)的耐糖性高得多(8天后所有细菌菌株仍然存活的cfu数量为103～106cfu每ml)。
实施例12病原体-微生物和食物变坏-微生物抑制研究
针对下列细菌筛选根据本发明的细菌菌株：使食物和蜂蜜变坏的酵母菌酿酒酵母、食物变坏的细菌荧光假单胞菌和酪丁酸梭菌、清酒乳杆菌、蜡状芽孢杆菌、无害利斯特菌和人体病原体大肠杆菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌，还有当假单胞菌表示为属时，这种情况下作为荧光假单胞菌，即使这种种类不是病原体和蜜蜂病原体幼虫芽孢杆菌。将根据本发明的细菌菌株在35℃在包含0.5％L-半胱氨酸的MRS肉汤上厌氧培养(除了Fhon2是在包含2％果糖的MRS肉汤上培养)三天，并在35℃在包含0.5％L-半胱氨酸的MRS琼脂板的中心上(除了Fhon2是在番茄汁琼脂板上培养)分别得到厌氧持续生长一天。根据表4，将表4中的试验菌株在液体培养基上培养，然后在42℃的温度下与含有0.8％琼脂的新培养基混合。将培养基与细菌混合并倒在有培养出的根据本发明的细菌菌株的板上。然后将这些板在35℃培养3天并对抑制区域进行分析，其中测定该区域直径单位为cm。
表4：病原体-微生物和食物变坏-微生物的抑制
菌株   培养基 Bin2   Hma2   Hon2   Hma3   Hma8 Bin7   Bma6   Biut2   Bma5   Fhon2   Hma11
  酿酒酵母   MRS   2cm   *2cm 2cm 2cm
  荧光假单胞菌 BHI 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 1cm
  大肠杆困 BHI 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm
  酪丁酸梭菌   RCM   2cm   2cm   2cm   2cm   2cm   2cm   2cm   2cm   1cm   1cm
  金黄色葡萄球菌 BHI 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 2cm 1cm 2cm 2cm 1cm
  粪肠球菌 M17 1cm 1cm 1cm 1cm
  清酒乳杆菌   MRS   1cm   1cm   1cm   1cm   1cm
  蜡状芽孢杆菌 BHI 1cm
  无害利斯特菌 M17 1cm
  幼虫芽孢杆菌   MYPGP 1cm 4cm 2cm 2cm 4cm 3cm 3cm 4cm 2cm 2cm
*...cm表示当在它们顶部培养试验细菌时，根据本发明的细菌菌株周围的抑制区域。
其结果清楚地证明了食物腐败或致病细菌的抑制几乎通常具有2.0cm的区域，意思是那些细菌死亡或不能在根据本发明的细菌菌株周围的这一球形区域生长。当对昆氏乳杆菌Fhon2和昆氏乳杆菌型菌株测试蜜蜂病原体幼虫芽孢杆菌时，只有昆氏乳杆菌Fhon2抑制了该病原体(表4)，但昆氏乳杆菌型菌株(表4中未显示)根本没有抑制住幼虫芽孢杆菌。这一结果再次证明了昆氏乳杆菌Fhon2是新的昆氏乳杆菌菌株。
实施例13-给药研究
将根据本发明的细菌菌株对没有任何感染或任何肠道疾病的不同年龄的10个健康个体给药。当未服用益生菌产品时，给药前他们有一星期的清洗时间。每天给药，进行10天。摄入的饮品，20ml燕麦乳包含浓度等于约109CFU每菌株的由新鲜培养菌制得的细菌。志愿者交付***物样品，该样品中给药前、给药10天后以及给药终止后7天时直接取得。将一克***物逐次稀释并涂在Rogosa琼脂上。随机选择***物样品的六个菌落并根据视觉外观选择六个。通过RAPD实现分离鉴定。
实施例14-合成蜂蜜
合成蜂蜜通过以与天然花蜜中7～80％一样的多种最终浓度将表1中各个含量的菌株与氨基酸、维生素、矿物质和水一起添加到包含糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和松三糖(例如由糖甜菜、糖甘蔗或高果糖玉米糖浆产生)的糖溶液中制造。在35℃细菌使该产品发酵3天。在该过程中水含量降至与天然蜂蜜一样的低于18％。
实施例15-合成蜂粮
合成蜂粮通过混合实施例14制造并包含表1中菌株的合成蜂蜜与花粉或大豆粉，烘烤蜂粮至与蜜蜂的蜂蜜和花粉制得的天然蜂粮相似来制造。
实施例16-用于伤口处理的合成蜂蜜
与实施例14一样制造合成蜂蜜，包含表1中的菌株，以药品用于所述伤口等。合成蜂蜜可无菌化使用或含有能存活的细菌使用。
PCT/RO/134表
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
Figure A20088001463800311
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-238第1页...........................原始保藏时的收据
                                                                             
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则7.1由国际保藏授权机构BCCM/LMG在下页底部证明出具
的原始保藏时的收据
国际表BCCM/LMG/BP/4/......07-238..................
                                                                             
致：保藏者姓名：托比亚斯·奥洛夫松
地址：瑞典赫尔辛堡25439卡姆潘尼噶坦
      (kompanigatan)12号
I.微生物的认定
I.1保藏者给出的认定编号：
  Biut2
I.2国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24094
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-238第2页............原始保藏时的收据
                                                                 
II.科学说明和/或建议分类学名称
以上I中认定的微生物附有：
(在适用的方框中用叉标记)
Figure A20088001463800331
科学说明
建议分类学名称
III.收到并接受
本国际保藏授权机构接受了以上I中认定的微生物，该微生物的接收日期(原始保藏日期)为：
                       2007年4月3日
IV.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：               2007年5月10日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-238第1页..................存活能力报告
                                                                
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则10.2由国际保藏授权机构BCCM/LMG后续页中证明出具
存活能力报告
国际表BCCM/LMG/BP/9/......07-238..................
                                                                     
致：存活报告出具对象
姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
地址：瑞典赫尔辛堡25225纳罗斯噶坦(Rōnnowsgatan)
      6号隆德大学赫尔辛堡学院交叉微生物组
I.保藏者
I.1姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
I.2地址：瑞典赫尔辛堡25439卡姆潘尼噶坦
         (kompanigatan)12号
II.微生物的认定
II.1国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24094
II.2：原始保藏的日期(或者已进行新保藏或转移时，最近的相关日期)：
         2007年4月3日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-238第2页..................存活能力报告
                                                                 
III.存活能力报告
以上II中证明的微生物的存活能力测试日期为：
(指定日期。参照细则10.2(a)(ii)和(iii)中的情况，是指最近的存活能力测试)
                 2007年4月3～5日
在测试日当天，所述微生物为：(在适用的方框内打叉)
Figure A20088001463800351
能存活
□不能存活
IV.存活能力测试进行的条件：
(请求信息以及测试结果不好时填写)
V.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
           S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：          2007年5月10日
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
Figure A20088001463800361
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-237第1页...........................原始保藏时的收据
                                                                              
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则7.1由国际保藏授权机构BCCM/LMG在下页底部证明出具
的原始保藏时的收据
国际表BCCM/LMG/BP/4/......07-237..................
                                                   
致：保藏者姓名：托比亚斯·奥洛夫松
地址：瑞典赫尔辛堡25439卡姆潘尼噶坦
     (kompanigatan)12号
I.微生物的认定
I.1保藏者给出的认定编号：
  Hma2
I.2国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24093
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-237第2页............原始保藏时的收据
                                                       
II.科学说明和/或建议分类学名称
以上I中认定的微生物附有：
(在适用的方框中用叉标记)
Figure A20088001463800381
科学说明
Figure A20088001463800382
建议分类学名称
III.收到并接受
本国际保藏授权机构接受了以上I中认定的微生物，该微生物的接收日期(原始保藏日期)为：
                       2007年4月3日
IV.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：              2007年5月10日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-237第1页..................存活能力报告
                                                                 
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则10.2由国际保藏授权机构BCCM/LMG后续页中证明出具
存活能力报告
国际表BCCM/LMG/BP/9/......07-237..................
                                                            
致：存活报告出具对象
姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
地址：瑞典赫尔辛堡25225纳罗斯噶坦(Rōnnowsgatan)
      6号隆德大学赫尔辛堡学院交叉微生物组
I.保藏者
I.1姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
I.2地址：瑞典赫尔辛堡25439卡姆潘尼噶坦
         (kompanigatan)12号
II.微生物的认定
II.1国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24093
II.2：原始保藏的日期(或者已进行新保藏或转移时，最近的相关日期)：
        2007年4月3日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-238第2页..................存活能力报告
                                                           
III.存活能力报告
以上II中证明的微生物的存活能力测试日期为：
(指定日期。参照细则10.2(a)(ii)和(iii)中的情况，是指最近的存活能力测试)
                 2007年4月3～5日
在测试日当天，所述微生物为：(在适用的方框内打叉)
Figure A20088001463800401
能存活
□不能存活
IV.存活能力测试进行的条件：
(请求信息以及测试结果不好时填写)
Figure A20088001463800402
V.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
           S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：           2007年5月10日
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
Figure A20088001463800411
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-236第1页...........................原始保藏时的收据
                                                                           
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则7.1由国际保藏授权机构BCCM/LMG在下页底部证明出具
的原始保藏时的收据
国际表BCCM/LMG/BP/4/......07-236..................
                                                       
致：保藏者姓名：托比亚斯·奥洛夫松
地址：瑞典赫尔辛堡25439卡姆潘尼噶坦
      (kompanigatan)12号
I.微生物的认定
I.1保藏者给出的认定编号：
  Hma8
I.2国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24092
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-236第2页............原始保藏时的收据
                                                           
II.科学说明和/或建议分类学名称
以上I中认定的微生物附有：
(在适用的方框中用叉标记)
Figure A20088001463800431
科学说明
建议分类学名称
III.收到并接受
本国际保藏授权机构接受了以上I中认定的微生物，该微生物的接收日期(原始保藏日期)为：
                     2007年4月3日
IV.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：              2007年5月10日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-236第1页..................存活能力报告
                                                             
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则10.2由国际保藏授权机构BCCM/LMG后续页中证明出具
存活能力报告
国际表BCCM/LMG/BP/9/......07-236..................
                                                           
致：存活报告出具对象
姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
地址：瑞典赫尔辛堡25225纳罗斯噶坦(Rōnnowsgatan)
      6号隆德大学赫尔辛堡学院交叉微生物组
I.保藏者
I.1姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
I.2地址：瑞典赫尔辛堡25439卡姆潘尼噶坦
         (kompanigatan)12号
II.微生物的认定
II.1国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24092
II.2：原始保藏的日期(或者已进行新保藏或转移时，最近的相关日期)：
        2007年4月3日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-236第2页..................存活能力报告
                                                                
III.存活能力报告
以上II中证明的微生物的存活能力测试日期为：
(指定日期。参照细则10.2(a)(ii)和(iii)中的情况，是指最近的存活能力测试)
                 2007年4月3～5日
在测试日当天，所述微生物为：(在适用的方框内打叉)
Figure A20088001463800451
能存活
□不能存活
IV.存活能力测试进行的条件：
(请求信息以及测试结果不好时填写)
Figure A20088001463800452
V.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：                2007年5月10日
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
Figure A20088001463800461
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-234第1页...........................原始保藏时的收据
                                                            
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则7.1由国际保藏授权机构BCCM/LMG在下页底部证明出具
                     的原始保藏时的收据
国际表BCCM/LMG/BP/4/......07-234..................
                                                
致：保藏者姓名：托比亚斯·奥洛夫松
地址：瑞典赫尔辛堡25439卡姆潘尼噶坦
      (kompanigatan)12号
I.微生物的认定
I.1保藏者给出的认定编号：
  Bma5
I.2国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24090
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-234第2页............原始保藏时的收据
                                                       
II.科学说明和/或建议分类学名称
以上I中认定的微生物附有：
(在适用的方框中用叉标记)
Figure A20088001463800481
科学说明
Figure A20088001463800482
建议分类学名称
III.收到并接受
本国际保藏授权机构接受了以上I中认定的微生物，该微生物的接收日期(原始保藏日期)为：
2007年4月3日
IV.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：               2007年5月10日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-234第1页..................存活能力报告
                                                                
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则10.2由国际保藏授权机构BCCM/LMG后续页中证明出具
                      存活能力报告
国际表BCCM/LMG/BP/9/......07-234..................
                                                                  
致：存活报告出具对象
姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
地址：瑞典赫尔辛堡25225纳罗斯噶坦(Rōnnowsgatan)
6号隆德大学赫尔辛堡学院交叉微生物组
I.保藏者
I.1姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
I.2地址：瑞典赫尔辛堡25439卡姆潘尼噶坦
         (kompanigatan)12号
II.微生物的认定
II.1国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24090
II.2：原始保藏的日期(或者已进行新保藏或转移时，最近的相关日期)：
        2007年4月3日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-234第2页..................存活能力报告
                                                                
III.存活能力报告
以上II中证明的微生物的存活能力测试日期为：
(指定日期。参照细则10.2(a)(ii)和(iii)中的情况，是指最近的存活能力测试)
                 2007年4月3～5日
在测试日当天，所述微生物为：(在适用的方框内打叉)
Figure A20088001463800501
能存活
□不能存活
IV.存活能力测试进行的条件：
(请求信息以及测试结果不好时填写)
Figure A20088001463800502
V.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：              2007年5月10日
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
Figure A20088001463800511
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-235第1页...........................原始保藏时的收据
                                                                        
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则7.1由国际保藏授权机构BCCM/LMG在下页底部证明出具
的原始保藏时的收据
国际表BCCM/LMG/BP/4/......07-235..................
                                                    
致：保藏者姓名：托比亚斯·奥洛夫松
地址：瑞典赫尔辛堡25439卡姆潘尼噶坦
      (kompanigatan)12号
I.微生物的认定
I.1保藏者给出的认定编号：
  Hon2
I.2国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24091
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-235第2页............原始保藏时的收据
                                                             
II.科学说明和/或建议分类学名称
以上I中认定的微生物附有：
(在适用的方框中用叉标记)
科学说明
Figure A20088001463800532
建议分类学名称
III.收到并接受
本国际保藏授权机构接受了以上I中认定的微生物，该微生物的接收日期(原始保藏日期)为：
                         2007年4月3日
IV.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：               2007年5月10日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-235第1页..................存活能力报告
                                                       
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则10.2由国际保藏授权机构BCCM/LMG后续页中证明出具
存活能力报告
国际表BCCM/LMG/BP/9/......07-235..................
                                                   
致：存活报告出具对象
姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
地址：瑞典赫尔辛堡25225纳罗斯噶坦(Rōnnowsgatan)
      6号隆德大学赫尔辛堡学院交叉微生物组
I.保藏者
I.1姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
I.2地址：瑞典赫尔辛堡25439卡姆潘尼噶坦
        (kompanigatan)12号
II.微生物的认定
II.1国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24091
II.2：原始保藏的日期(或者已进行新保藏或转移时，最近的相关日期)：
         2007年4月3日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-235第2页..................存活能力报告
                                                                
III.存活能力报告
以上II中证明的微生物的存活能力测试日期为：
(指定日期。参照细则10.2(a)(ii)和(iii)中的情况，是指最近的存活能力测试)
                 2007年4月3～5日
在测试日当天，所述微生物为：(在适用的方框内打叉)
Figure A20088001463800551
能存活
□不能存活
IV.存活能力测试进行的条件：
(请求信息以及测试结果不好时填写)
Figure A20088001463800552
V.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
           S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：                 2007年5月10日
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-229第1页........................原始保藏时的收据
                                                               
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则7.1由国际保藏授权机构BCCM/LMG在下页底部证明出具
                   的原始保藏时的收据
国际表BCCM/LMG/BP/4/......07-229..................
                                                               
致：保藏者姓名：托比亚斯·奥洛夫松
地址：瑞典赫尔辛堡25439艾斯彻堡格(Aschebergsg)
      1:G
I.微生物的认定
I.1保藏者给出的认定编号：
  Bin7
I.2国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-23986
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-229第2页............原始保藏时的收据
                                                           
II.科学说明和/或建议分类学名称
以上I中认定的微生物附有：
(在适用的方框中用叉标记)
Figure A20088001463800581
科学说明
建议分类学名称
III.收到并接受
本国际保藏授权机构接受了以上I中认定的微生物，该微生物的接收日期(原始保藏日期)为：
                       2007年1月15日
IV.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：               2007年2月20日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-229第1页..................存活能力报告
                                                       
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则10.2由国际保藏授权机构BCCM/LMG后续页中证明出具
存活能力报告
国际表BCCM/LMG/BP/9/......07-229..................
                                                              
致：存活报告出具对象
姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
地址：瑞典赫尔辛堡25225纳罗斯噶坦(Rōnnowsgatan)
      6号隆德大学赫尔辛堡学院交叉微生物组
I.保藏者
I.1姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
I.2地址：瑞典赫尔辛堡25439艾斯彻堡格(Aschebergsg)
         1:G
II.微生物的认定
II.1国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-23986
II.2：原始保藏的日期(或者已进行新保藏或转移时，最近的相关日期)：
         2007年1月15日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-229第2页..................存活能力报告
                                                                  
III.存活能力报告
以上II中证明的微生物的存活能力测试日期为：
(指定日期。参照细则10.2(a)(ii)和(iii)中的情况，是指最近的存活能力测试)
                2007年1月15～18日
在测试日当天，所述微生物为：(在适用的方框内打叉)
能存活
□不能存活
IV.存活能力测试进行的条件：
(请求信息以及测试结果不好时填写)
Figure A20088001463800602
V.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
           S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：                2007年2月20日
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-226第1页........................原始保藏时的收据
                                                                 
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则7.1由国际保藏授权机构BCCM/LMG在下页底部证明出具
的原始保藏时的收据
国际表BCCM/LMG/BP/4/......07-226..................
                                                               
致：保藏者姓名：托比亚斯·奥洛夫松
地址：瑞典赫尔辛堡25439艾斯彻堡格(Aschebergsg)
      1:G
I.微生物的认定
I.1保藏者给出的认定编号：
  Hma3
I.2国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-23983
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-226第2页............原始保藏时的收据
                                                  
II.科学说明和/或建议分类学名称
以上I中认定的微生物附有：
(在适用的方框中用叉标记)
科学说明
Figure A20088001463800632
建议分类学名称
III.收到并接受
本国际保藏授权机构接受了以上I中认定的微生物，该微生物的接收日期(原始保藏日期)为：
                       2007年1月15日
IV.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：               2007年2月20日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-226第1页..................存活能力报告
                                                            
     国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则10.2由国际保藏授权机构BCCM/LMG后续页中证明出具
存活能力报告
国际表BCCM/LMG/BP/9/......07-226...............
                                                
致：存活报告出具对象
姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
地址：瑞典赫尔辛堡25225纳罗斯噶坦(Rōnnowsgatan)
6号隆德大学赫尔辛堡学院交叉微生物组
I.保藏者
I.1姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
I.2地址：瑞典赫尔辛堡25439艾斯彻堡格(Aschebergsg)
         1:G
II.微生物的认定
II.1国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-23983
II.2：原始保藏的日期(或者已进行新保藏或转移时，最近的相关日期)：
         2007年1月15日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-226第2页..................存活能力报告
                                                         
III.存活能力报告
以上II中证明的微生物的存活能力测试日期为：
(指定日期。参照细则10.2(a)(ii)和(iii)中的情况，是指最近的存活能力测试)
                2007年1月15～18日
在测试日当天，所述微生物为：(在适用的方框内打叉)
Figure A20088001463800651
能存活
□不能存活
IV.存活能力测试进行的条件：
(请求信息以及测试结果不好时填写)
Figure A20088001463800652
V.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：               2007年2月20日
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-227第1页........................原始保藏时的收据
                                                                  
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则7.1由国际保藏授权机构BCCM/LMG在下页底部证明出具
的原始保藏时的收据
国际表BCCM/LMG/BP/4/......07-227..................
                                                               
致：保藏者姓名：托比亚斯·奥洛夫松
地址：瑞典赫尔辛堡25439艾斯彻堡格(Aschebergsg)
      1:G
I.微生物的认定
I.1保藏者给出的认定编号：
  Bin2
I.2国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-23984
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-227第2页............原始保藏时的收据
                                                        
II.科学说明和/或建议分类学名称
以上I中认定的微生物附有：
(在适用的方框中用叉标记)
科学说明
建议分类学名称
III.收到并接受
本国际保藏授权机构接受了以上I中认定的微生物，该微生物的接收日期(原始保藏日期)为：
                      2007年1月15日
IV.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：             2007年2月20日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-227第1页..................存活能力报告
                                                       
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则10.2由国际保藏授权机构BCCM/LMG后续页中证明出具
存活能力报告
国际表BCCM/LMG/BP/9/......07-227..................
                                                      
致：存活报告出具对象
姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
地址：瑞典赫尔辛堡25225纳罗斯噶坦(Rōnnowsgatan)
      6号隆德大学赫尔辛堡学院交叉微生物组
I.保藏者
I.1姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
I.2地址：瑞典赫尔辛堡25439艾斯彻堡格(Aschebergsg)
         1:G
II.微生物的认定
II.1国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-23984
II.2：原始保藏的日期(或者已进行新保藏或转移时，最近的相关日期)：
          2007年1月15日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-227第2页..................存活能力报告
                                                            
III.存活能力报告
以上II中证明的微生物的存活能力测试日期为：
(指定日期。参照细则10.2(a)(ii)和(iii)中的情况，是指最近的存活能力测试)
                 2007年1月15～18日
在测试日当天，所述微生物为：(在适用的方框内打叉)
Figure A20088001463800701
能存活
□不能存活
IV.存活能力测试进行的条件：
(请求信息以及测试结果不好时填写)
V.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：               2007年2月20日
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
Figure A20088001463800711
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-228第1页........................原始保藏时的收据
                                                                    
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则7.1由国际保藏授权机构BCCM/LMG在下页底部证明出具
的原始保藏时的收据
国际表BCCM/LMG/BP/4/......07-228..................
                                                             
致：保藏者姓名：托比亚斯·奥洛夫松
地址：瑞典赫尔辛堡25439艾斯彻堡格(Aschebergsg)
      1:G
I.微生物的认定
I.1保藏者给出的认定编号：
  Bma6
I.2国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-23985
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-228第2页............原始保藏时的收据
                                                               
II.科学说明和/或建议分类学名称
以上I中认定的微生物附有：
(在适用的方框中用叉标记)
Figure A20088001463800731
科学说明
Figure A20088001463800732
建议分类学名称
III.收到并接受
本国际保藏授权机构接受了以上I中认定的微生物，该微生物的接收日期(原始保藏日期)为：
                             2007年1月15日
IV.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
           S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：                2007年2月20日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-228第1页..................存活能力报告
                                                            
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则10.2由国际保藏授权机构BCCM/LMG后续页中证明出具
                    存活能力报告
国际表BCCM/LMG/BP/9/......07-228..................
                                                            
致：存活报告出具对象
姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
地址：瑞典赫尔辛堡25225纳罗斯噶坦(Rōnnowsgatan)
      6号隆德大学赫尔辛堡学院交叉微生物组
I.保藏者
I.1姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
I.2地址：瑞典赫尔辛堡25439艾斯彻堡格(Aschebergsg)
         1:G
II.微生物的认定
II.1国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-23985
II.2：原始保藏的日期(或者已进行新保藏或转移时，最近的相关日期)：
              2007年1月15日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-228第2页..................存活能力报告
                                                          
III.存活能力报告
以上II中证明的微生物的存活能力测试日期为：
(指定日期。参照细则10.2(a)(ii)和(iii)中的情况，是指最近的存活能力测试)
                 2007年1月15～18日
在测试日当天，所述微生物为：(在适用的方框内打叉)
能存活
□不能存活
IV.存活能力测试进行的条件：
(请求信息以及测试结果不好时填写)
Figure A20088001463800752
V.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
           S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：                 2007年2月20日
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
Figure A20088001463800761
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-230第1页.....................原始保藏时的收据
                                                                 
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则7.1由国际保藏授权机构BCCM/LMG在下页底部证明出具
                    的原始保藏时的收据
国际表BCCM/LMG/BP/4/......07-230..................
                                                                
致：保藏者姓名：托比亚斯·奥洛夫松
地址：瑞典赫尔辛堡25439艾斯彻堡格(Aschebergsg)
      1:G
I.微生物的认定
I.1保藏者给出的认定编号：
  Fhon2
I.2国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-23987
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......07-230第2页............原始保藏时的收据
                                                             
II.科学说明和/或建议分类学名称
以上I中认定的微生物附有：
(在适用的方框中用叉标记)
Figure A20088001463800781
科学说明
Figure A20088001463800782
建议分类学名称
III.收到并接受
本国际保藏授权机构接受了以上I中认定的微生物，该微生物的接收日期(原始保藏日期)为：
                         2007年1月15日
IV.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
           S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：                2007年2月20日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-230第1页..................存活能力报告
                                                           
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则10.2由国际保藏授权机构BCCM/LMG后续页中证明出具
                 存活能力报告
国际表BCCM/LMG/BP/9/......07-230..................
                                                       
致：存活报告出具对象
姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
地址：瑞典赫尔辛堡25225纳罗斯噶坦(Rōnnowsgatan)
      6号隆德大学赫尔辛堡学院交叉微生物组
I.保藏者
I.1姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
I.2地址：瑞典赫尔辛堡25439艾斯彻堡格(Aschebergsg)
         1:G
II.微生物的认定
II.1国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-23987
II.2：原始保藏的日期(或者已进行新保藏或转移时，最近的相关日期)：
             2007年1月15日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......07-230第2页..................存活能力报告
                                                                    
III.存活能力报告
以上II中证明的微生物的存活能力测试日期为：
(指定日期。参照细则10.2(a)(ii)和(iii)中的情况，是指最近的存活能力测试)
                 2007年1月15～18日
在测试日当天，所述微生物为：(在适用的方框内打叉)
Figure A20088001463800801
能存活
□不能存活
IV.存活能力测试进行的条件：
(请求信息以及测试结果不好时填写)
Figure A20088001463800802
V.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：                2007年2月20日
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
Figure A20088001463800811
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则第13条之二)
Figure A20088001463800821
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月再版)
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......08-251第1页..................原始保藏时的收据
                                                             
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则7.1由国际保藏授权机构BCCM/LMG在下页底部证明出具
                    的原始保藏时的收据
国际表BCCM/LMG/BP/4/......08-251..................
                                                          
致：保藏者姓名：托比亚斯·奥洛夫松
地址：瑞典赫尔辛堡25438卡姆潘尼噶坦
      (kompanigatan)12号
I.微生物的认定
I.1保藏者给出的认定编号：
  Hma11
I.2国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24612
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/4/......08-251第2页...............始保藏时的收据
                                                               
II.科学说明和/或建议分类学名称
以上I中认定的微生物附有：
(在适用的方框中用叉标记)
Figure A20088001463800841
科学说明
Figure A20088001463800842
建议分类学名称
III.收到并接受
本国际保藏授权机构接受了以上I中认定的微生物，该微生物的接收日期(原始保藏日期)为：
                       2008年4月28日
IV.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：               2008年6月2日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......08-251第1页..................存活能力报告
                                                     
      国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
根据细则10.2由国际保藏授权机构BCCM/LMG后续页中证明出具
                   存活能力报告
国际表BCCM/LMG/BP/9/......08-251..................
                                                          
致：存活报告出具对象
姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
地址：瑞典赫尔辛堡25225纳罗斯噶坦(Rōnnowsgatan)
      6号隆德大学赫尔辛堡学院交叉微生物组
I.保藏者
I.1姓名：托比亚斯·奥洛夫松博士
I.2地址：瑞典赫尔辛堡25438卡姆潘尼噶坦
         (kompanigatan)12号
II.微生物的认定
II.1国际保藏机构给出的登记号：
  LMG P-24612
II.2：原始保藏的日期(或者已进行新保藏或转移时，最近的相关日期)：
               2008年4月28日
比利时微生物保藏中心/微生物菌种保藏实验中心
-BCCM/LMG保藏中心
表BCCM/LMG/BP/9/......08-251第2页..................存活能力报告
                                                            
III.存活能力报告
以上II中证明的微生物的存活能力测试日期为：
(指定日期。参照细则10.2(a)(ii)和(iii)中的情况，是指最近的存活能力测试)
                2008年4月28～30日
在测试日当天，所述微生物为：(在适用的方框内打叉)
Figure A20088001463800861
能存活
□不能存活
IV.存活能力测试进行的条件：
(请求信息以及测试结果不好时填写)
Figure A20088001463800862
V.国际保藏授权机构
比利时微生物保藏中心(BCCM)
微生物菌种保藏实验中心(LMG)
根特大学
比利时根特B-9000里德甘克街(K.L.Ledeganckstraat)35号
有权利代表国际保藏授权机构或授权机构的人员签名：
          S.万川朋博士，库雷特(Curator)专利保藏中心
日期：                  2008年6月2日
权利要求书(按照条约第19条的修改)
请见所附附件：3页权利要求书，第32～34页，它们应替换原始递交文件的32～34页。其权利要求书已修改如下：
新权利要求1已通过删除“具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜或”来修改；
此外，已将“其中所述蜜蜂的产蜜道由躯干、嘴、食道和蜜囊组成”从原权利要求2***新权利要求1；
将“其中所述菌株具有抑制食物腐败和病原微生物生长的能力”从原权利要求6***新权利要求1。
新权利要求2为原权利要求3。
新权利要求3为原权利要求5。
新权利要求4为原权利要求8。
新权利要求5为原权利要求9。
新权利要求6为原权利要求10。
新权利要求7为原权利要求11。
新权利要求8为原权利要求12。
新权利要求9为原权利要求13。
新权利要求10为原权利要求14。
新权利要求11为原权利要求15。
新权利要求12为原权利要求16。
新权利要求13为原权利要求17。
新权利要求14为原权利要求18，并通过增加原权利要求19中的“d)评价所述菌株抑制食品腐烂和致病微生物的能力”和原权利要求20“其中为了避免来自消化道或肠道的污染，所述产蜜道在食道之后前胃之前分离”的特征而修改。该权利要求的主题通过增加符合权利要求1的“乳酸杆菌属或双歧杆菌属的”而变得清楚。
新权利要求15为原权利要求21。
1、一种乳酸杆菌属或双歧杆菌属的分离的细菌菌株，所述菌株从至少一只蜜蜂的产蜜道分离，其中所述蜜蜂的产蜜道由躯干、嘴、食道和蜜囊组成，其中所述菌株具有抑制食物腐败和病原微生物生长的能力。
2、根据权利要求1所述的细菌菌株，其中所述蜜蜂的产蜜道不包括消化道或肠道。
3、根据权利要求1或2所述的细菌菌株，其中所述菌株具有在65wt％糖溶液中至少存活8天的能力，优选在70wt％糖溶液中至少存活8天的能力。
4、根据权利要求1～3中任意一项所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株选自由下列菌株构成的组中：乳酸杆菌菌株Biut2(LMG P-24094)、乳酸杆菌菌株Hma2(LMG P-24093)、乳酸杆菌菌株Hma8(LMG P-24092)、乳酸杆菌菌株Bma5(LMG P-24090)、乳酸杆菌菌株Hon2(LMG P-24091)，所述菌株在2007年4月3日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心；双歧杆菌菌株Bin7(LMG P-23986)、双歧杆菌菌株Hma3(LMG P-23983)、双歧杆菌菌株Bin2(LMG P-23984)、双歧杆菌菌株Bma6(LMG P-23985)和昆氏乳酸杆菌Fhon2(LMG P-23987)，所述菌株于2007年1月15日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心；和菌株Hma11，所述菌株保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心。
5、一种组合物，包括根据权利要求1～4中任意一项所述的细菌菌株。
6、根据权利要求5所述的组合物，包括糖源，优选所述糖源选自由蜂蜜、白糖、果糖、蔗糖、糊精、麦芽糖或葡萄糖构成的组中。
7、一种药物组合物，包括根据权利要求1～4中任意一项所述的细菌菌株和可药用的载体和/或稀释剂。
8、根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述药物组合物为混悬剂、凝胶、霜剂、粉剂或胶囊。
9、一种药物产品，包括根据权利要求7或8所述药物组合物，所述药物产品具有敷料、绷带或喷剂的形式。
10、一种食品或饲养产品，包括根据权利要求1～4中任意一项所述的细菌菌株。
11、根据权利要求10所述的食品或饲养产品，其中所述产品是蜜蜂饲养产品。
12、一种制造蜂蜜的方法，包括：
将至少一种根据权利要求1～4中任意一项所述的细菌菌株添加到糖源。
13、根据权利要求1～4中任意一项所述细菌菌株在制备预防和/或治疗感染或肠胃疾病的药品、食品、饮品或药物组合物中的用途。
14、一种分离乳酸杆菌属或双歧杆菌属的细菌菌株的方法，包括：
a)从蜜蜂分离出产蜜道并将所述产蜜道在无菌培养基中振荡，其中为了避免来自消化道或肠道的污染，所述产蜜道在食道之后前胃之前分离；
b)来自a)的样品在适宜的培养基上的细菌培养；
c)b)中得到的细菌菌株在适宜的培养基上的纯种培养和分离。
d)评价所述菌株抑制食品腐烂和致病微生物的能力。
15、一种细菌菌株，选自由如下菌株组成的组中：乳酸杆菌菌株Biut2(LMG P-24094)、乳酸杆菌菌株Hma2(LMG P-24093)、乳酸杆菌菌株Hma8(LMG P-24092)、乳酸杆菌菌株Bma5(LMG P-24090)、乳酸杆菌菌株Hon2(LMG P-24091)，所述菌株在2007年4月3日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心；双歧杆菌菌株Bin7(LMG P-23986)、双歧杆菌菌株Hma3(LMG P-23983)、双歧杆菌菌株Bin2(LMG P-23984)、双歧杆菌菌株Bma6(LMG P-23985)和昆氏乳酸杆菌Fhon2(LMG P-23987)，所述菌株于2007年1月15日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心；和菌株Hma11，所述菌株保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心。

Claims (21)

1、一种乳酸杆菌属或双歧杆菌属的分离的细菌菌株，所述菌株从具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜或从至少一只蜜蜂的产蜜道分离。
2、根据权利要求1所述的细菌菌株，其中所述蜜蜂的产蜜道由躯干、嘴、食道和蜜囊组成。
3、根据权利要求1或2所述的细菌菌株，其中所述蜜蜂的产蜜道不包括消化道或肠道。
4、根据权利要求1～3中任意一项所述的细菌菌株，其中所述新鲜蜂蜜具有20wt％以上的水含量。
5、根据权利要求1～4中任意一项所述的细菌菌株，其中所述菌株具有在65wt％糖溶液中至少存活8天的能力，优选在70wt％糖溶液中至少存活8天的能力。
6、根据权利要求1～5中任意一项所述的细菌菌株，其中所述菌株具有抑制食物腐败和病原微生物生长的能力。
7、根据权利要求1～6中任意一项所述的细菌菌株，其中所述蜜蜂选自蜜蜂属Apis spp，优选产蜜蜜蜂Apis mellifera。
8、根据权利要求1～7中任意一项所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株选自由下列菌株构成的组中：乳酸杆菌菌株Biut2(LMG P-24094)、乳酸杆菌菌株Hma2(LMG P-24093)、乳酸杆菌菌株Hma8(LMG P-24092)、乳酸杆菌菌株Bma5(LMG P-24090)、乳酸杆菌菌株Hon2(LMG P-24091)，所述菌株在2007年4月3日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心；双歧杆菌菌株Bin7(LMG P-23986)、双歧杆菌菌株Hma3(LMG P-23983)、双歧杆菌菌株Bin2(LMG P-23984)、双歧杆菌菌株Bma6(LMG P-23985)和昆氏乳酸杆菌Fhon2(LMG P-23987)，所述菌株于2007年1月15日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心；和菌株Hma11，所述菌株保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心。
9、一种组合物，包括根据权利要求1～8中任意一项所述的细菌菌株。
10、根据权利要求9所述的组合物，包括糖源，优选所述糖源选自由蜂蜜、白糖、果糖、蔗糖、糊精、麦芽糖或葡萄糖构成的组中。
11、一种药物组合物，包括根据权利要求1～8中任意一项所述的细菌菌株和可药用的载体和/或稀释剂。
12、根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述药物组合物为混悬剂、凝胶、霜剂、粉剂或胶囊。
13、一种药物产品，包括根据权利要求11或12所述药物组合物，所述药物产品具有敷料、绷带或喷剂的形式。
14、一种食品或饲养产品，包括根据权利要求1～8中任意一项所述的细菌菌株。
15、根据权利要求14所述的食品或饲养产品，其中所述产品是蜜蜂饲养产品。
16、一种制造蜂蜜的方法，包括：
将至少一种根据权利要求1～8中任意一项所述的细菌菌株添加到糖源。
17、根据权利要求1～8中任意一项所述细菌菌株在制备预防和/或治疗感染或肠胃疾病的药品、食品、饮品或药物组合物中的用途。
18、一种分离根据权利要求1～8中任意一项所述的细菌菌株的方法，包括：
a)对具有18wt％以上水含量的新鲜蜂蜜取样，或从所述蜜蜂分离出所述产蜜道并将所述产蜜道在无菌培养基中振荡；
b)来自a)的样品在适宜的培养基上的细菌培养；
c)b)中得到的细菌菌株在适宜的培养基上的纯种培养和分离。
19、根据权利要求18所述的方法，进一步包括：
d)评价所述菌株抑制食品腐烂和致病微生物的能力。
20、根据权利要求18或19所述的方法，其中为了避免来自消化道或肠道的污染，所述产蜜道在食道之后前胃之前分离。
21、一种细菌菌株，选自由如下菌株组成的组中：乳酸杆菌菌株Biut2(LMG P-24094)、乳酸杆菌菌株Hma2(LMG P-24093)、乳酸杆菌菌株Hma8(LMG P-24092)、乳酸杆菌菌株Bma5(LMG P-24090)、乳酸杆菌菌株Hon2(LMG P-24091)，所述菌株在2007年4月3日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心；双歧杆菌菌株Bin7(LMG P-23986)、双歧杆菌菌株Hma3(LMG P-23983)、双歧杆菌菌株Bin2(LMG P-23984)、双歧杆菌菌株Bma6(LMG P-23985)和昆氏乳酸杆菌Fhon2(LMG P-23987)，所述菌株于2007年1月15日保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心；和菌株Hma11，所述菌株保藏在比利时BCCM/LMG菌种中心。
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