CN101664421A - 一种防治畜禽腹泻的中药生物制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治畜禽腹泻的中药生物制剂及其制备方法。本发明将传统方剂与现代微生物转化技术相结合,利用微生物的强大转化能力,对传统的白头翁散进行发酵代谢制备了一种中药生物制剂。它是将白头翁散粉碎,加入麸皮、葡萄糖、尿素、无机盐、水作为发酵培养基,调节pH值,灭菌后,加入一定比例的菌种培养液,进行发酵,成熟的固态发酵物加入乙醇进行浸提,分离,过滤,浓缩,制备成各种剂型。白头翁散经酵母菌发酵代谢后所制备的中药生物制剂,对畜禽腹泻性疾病的治疗效果大大优于白头翁散及其煎剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治畜禽腹泻的中药生物制剂及其制备方法,属于兽药领域。
背景技术
痢疾和腹泻是兽医临床上常见的消化道疾病,多数是由大肠杆菌、沙门氏菌、球菌等引起的,在畜禽各种疾病中发病率很高,一年四季均可发病。兽医临床上对畜禽腹泻的治疗主要采用抗生素或化学药物,治疗效果不佳,致病菌的耐药性越来越严重。治疗此病的中药有止痢散、雏痢净、白头翁散、乌梅散等,这些药物剂型主要是传统散剂,技术含量低,质量粗糙,用量大,适口性差,见效慢,生物利用度低,因此防治畜禽腹泻性疾病效果不理想,同时造成了中药资源的极大浪费。
现代中药发酵制药技术是在继承传统中药炮制学发酵法的基础上,吸取了微生态学研究成果,结合现代生物工程发酵技术而形成的高科技中药制药新技术,是从中药(天然药物)制药方面寻找药物的新疗效,具有很大的研究价值和市场开发意义。研究表明,微生物生长代谢过程中可以产生丰富而强大的酶系,可以将中药的药物成分分解转化,将不能被人体或动物体吸收的有效组分降解成小分子活性物质,而被机体直接吸收利用,或产生新的活性组分,改变药性,降低毒副作用,从而大大提高药物疗效和治疗范围。
由白头翁、黄柏、黄连、秦皮组成的中药方剂,为古代药学名著《伤寒论》中的治痢名方,组方严谨,被称为“白头翁汤”,主要功能为清热解毒,凉血止痢。后世常变通应用于多种病证。《中国兽药典》中收录了白头翁散,用来治疗畜禽腹泻性疾病。目前,国内外未见将白头翁散全方进行微生物转化并制成相应制剂的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种见效快、效果明确的防治畜禽腹泻的中药生物制剂。
本发明的另一个目的是提供该防治畜禽腹泻的中药生物制剂的制备方法。
本发明还提供了包含该防治畜禽腹泻的中药生物制剂的饲料。
本发明的中药生物制剂是利用微生物对白头翁散进行发酵代谢后制备而成,实现了传统中药方剂与现代生物技术的有机结合。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
本发明提供一种防治畜禽腹泻的中药生物制剂,此制剂是将微生物接种到包含白头翁散的培养基中进行发酵制备而成。
本发明所述的白头翁散包括如下组分和重量份数:
白头翁20~80份、黄柏30~60份、秦皮20~80份、黄连10~50份。
其中,所述的微生物为酵母菌。
所述的酵母菌为产朊假丝酵母和/或酿酒酵母。
本发明的防治畜禽腹泻的中药生物制剂可为口服液、粉剂、片剂、颗粒剂、缓释制剂、丸剂、微囊剂、注射剂或其他药剂学上可接受的剂型。
本发明还提供了该防治畜禽腹泻的中药生物制剂的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)制备菌种培养液
将酵母菌菌种接种到YPD培养基中,28~32℃,150~200rpm摇床培养生产一级种子液,当活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时转接到二级种子液发酵罐扩大培养,接种量为3~8%,培养温度28~32℃,搅拌转速180~220rpm,二级种子液活菌含量在1.0×108~9cfu/ml时,停止培养,备用;
(2)培养基的制备:取配方量的中药材,粉碎成80~120目的药材细粉,装入发酵罐中,加入占中药重量5~10%的麸皮、1~5%葡萄糖、0.1~1.0%尿素、0.5~2.0%K2HPO4,加水至含水量在40~60%,调节pH至4~5,灭菌20~25min;
(3)冷却后,按发酵物总重量的5~10%将(1)中的菌种发酵液接入到(2)的培养基中,于28~37℃恒温培养24~72h,搅拌转速150~250rpm,当活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时停止发酵;
(4)将成熟的固态发酵物用乙醇进行浸提,分离,过滤,滤液精制,发酵液减压浓缩至相对密度为1.0~1.2,加入药学上常用辅料制成相应剂型。
进一步,本发明的防治畜禽腹泻的中药生物制剂的制备方法还可包括如下步骤:步骤(4)得到的浓缩发酵液经过喷雾干燥或冷冻干燥后,加入辅料制成预混剂。
本发明的防治畜禽腹泻的中药生物制剂还可以直接添加到饲料中,制成包含该中药生物制剂的饲料。
本发明的原料含有白头翁、黄柏、秦皮、黄连四味药,现代研究表明,白头翁含有原白头翁素、白头翁皂苷;黄连、黄柏含有小檗碱、药根碱;秦皮含有七叶苷、七叶内酯等活性成分,通过微生物发酵后使药物更容易吸收,药效更充分。
本发明的中药生物制剂与传统中兽药比较有如下优点:
1、传统中兽药散剂适口性差、内服后有效成分不易从植物细胞中游离出来被机体充分吸收,生物利用度低,而煎剂在制备过程中对中药有效成分破坏性大,降低了药物应有的疗效。微生物发酵转化中药,反应条件温和,可以最大限度的保护中药有效成分免遭破坏,同时,可使某些有效成分含量增加及产生新的药物成分,从而提高药物疗效、扩大适应症、减少服用剂量;
2、白头翁散经过微生物代谢后制备的中药生物制剂,在畜禽腹泻性疾病的治疗效果上大大优于传统的白头翁散及其煎剂。
通过以下实施例将更具体的说明本发明,但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明,而不是以任何方式限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明中药生物制剂的制备
白头翁散组成:白头翁60份、黄柏50份、秦皮60份、黄连30份
制备方法:
(1)将酵母菌菌种接种到YPD培养基中,30℃,180rpm摇床培养生产一级种子液,当活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时转接到二级种子液发酵罐扩大培养,接种量为6%,培养温度30℃,搅拌转速220rpm,二级种子液活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时,停止培养,备用;
(2)取上述配方量的中药材,粉碎成120目的药材细粉,加入占中药重量10%的麸皮、2%葡萄糖、0.5%尿素、1.0%K2HPO4,加水至含水量为50%,调节pH至4,灭菌20min;
(3)冷却后,按发酵物总重量的10%将(1)中的菌种培养液接入到(2)的培养基中,于30℃恒温培养72h,搅拌转速250rpm,当活菌含量达到1.0×109cfu/ml时停止发酵;
(4)将成熟的固态发酵物用乙醇进行浸提,分离,过滤,滤液精制,发酵液减压浓缩相对密度为1.0;
(5)浓缩后的发酵液加水至200份,过滤,分装,灭菌,即制成口服液,1ml溶液相当于原生药1g。
实施例2本发明中药生物制剂的制备
白头翁散组成:白头翁80份、黄柏60份、秦皮80份、黄连50份
制备方法:
(1)将酵母菌菌种接种到YPD培养基中,30℃,180rpm摇床培养生产一级种子液,当活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时转接到二级种子液发酵罐扩大培养,接种量为8%,培养温度30℃,搅拌转速220rpm,二级种子液活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时,停止培养,备用;
(2)取上述配方量的中药材,粉碎成100目的药材细粉,加入占中药重量8%的麸皮、3%葡萄糖、0.7%尿素、1.5%K2HPO4加水至含水量为60%,调节pH至4.5,灭菌25min;
(3)冷却后,按发酵物总重量的8%将(1)中的菌种培养液接入到(2)的培养基中,于32℃恒温培养48h,搅拌转速180rpm,当活菌含量达到1.0×109cfu/ml时停止发酵;
(4)将成熟的固态发酵物用乙醇进行浸提,分离,过滤,滤液精制,发酵液减压浓缩至相对密度为1.1,再加入适量蔗糖、糊精,制软材并过筛制粒;湿颗粒干燥、整粒,检测,分装,即制备成颗粒剂,每1g相当于原生药1g。
实施例3本发明中药生物制剂的制备
白头翁散组成:白头翁50份、黄柏45份、秦皮50份、黄连45份
制备方法:
(1)将酵母菌菌种接种到YPD培养基中,29℃,190rpm摇床培养生产一级种子液,当活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时转接到二级种子液发酵罐扩大培养,接种量为5%,培养温度29℃,搅拌转速200rpm,二级种子液活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时,停止培养,备用;
(2)取上述配方量的中药材,粉碎成90目的药材细粉,加入占中药重量9%的麸皮、4%葡萄糖、0.8%尿素、0.7%K2HPO4,加水至含水量为55%,调节pH至5,灭菌25min;
(3)冷却后,按发酵物总质量的9%将(1)中的菌种培养液接入到(2)的培养基中,于29℃恒温培养60h,搅拌转速200rpm,当活菌含量达到1.0×109cfu/ml时停止发酵;
(4)将成熟的固态发酵物用乙醇进行浸提,分离,过滤,滤液精制,发酵液减压浓缩至相对密度为1.2,再喷雾干燥得到固体粉末,加入适量乙醇作润湿剂制软材,制粒,干燥,再加入硬脂酸镁混合均匀,压片,即制成片剂,每片相当于原生药0.5g。
实施例4本发明中药生物制剂的制备
白头翁散组成:白头翁70份、黄柏40份、秦皮40份、黄连40份
制备方法:
(1)将酵母菌菌种接种到YPD培养基中,30℃,200rpm摇床培养生产一级种子液,当活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时转接到二级种子液发酵罐扩大培养,接种量为4%,培养温度30℃,搅拌转速220rpm,二级种子液活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时,停止培养,备用;
(2)取上述配方量的中药材,粉碎成100目的药材细粉,加入占中药重量7%的麸皮、5%葡萄糖、0.6%尿素、0.5%K2HPO4,加水至含水量为45%,调节pH至4,灭菌20min;
(3)冷却后,按发酵物总重量的7%将(1)中的菌种培养液接入到(2)的培养基中,于28℃恒温培养36h,搅拌转速150rpm,当活菌含量达到1.0×109cfu/ml时停止发酵;
(4)将成熟的固态发酵物用乙醇进行浸提,分离,过滤,滤液精制,发酵液减压浓缩至相对密度为1.2,喷雾干燥,再加入适量辅料玉米芯粉后混合均匀,即制备成预混剂。
实施例5本发明中药生物制剂的制备
白头翁散组成:白头翁20份、黄柏30份、秦皮20份、黄连10份
制备方法:
(1)将酵母菌菌种接种到YPD培养基中,29℃,200rpm摇床培养生产一级种子液,当活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时转接到二级种子液发酵罐扩大培养,接种量为7%,培养温度29℃,搅拌转速200rpm,二级种子液活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时,停止培养,备用;
(2)取上述配方量的中药材,粉碎成100目的药材细粉,加入占中药重量5%的麸皮、1%葡萄糖、0.4%尿素、1.2%K2HPO4,加水至含水量为40%,调节pH至4,灭菌20min;
(3)冷却后,按发酵物总重量的5%将(1)中的菌种培养液接入到(2)的培养基中,于31℃恒温培养24h,搅拌转速220rpm,当活菌含量达到1.0×109cfu/ml时停止发酵;
(4)将成熟的固态发酵物用乙醇进行浸提,分离,过滤,滤液精制,发酵液减压浓缩至相对密度为1.2,再加入适量可溶性淀粉、糊精后混合均匀,烘干,粉碎,过筛,即制成粉剂,每1g相当于原生药5g。
以下通过具体试验例来说明本发明的中药生物制剂的有益效果。
试验例1
本试验例是按实施例1的方法制备的口服液对人工发病仔猪白痢的临床治疗试验。
1、材料与方法
1.1供试药物 白头翁散煎剂(生药含量为1g/ml)、本发明的口服液。
1.2菌种 大肠杆菌O139,中国兽药监察所提供。
1.3受试动物 200头体重约为22±1kg左右的健康断奶仔猪。
1.4试验方法
1.4.1动物分组 将200头仔猪随机分成5组,每组40头,其中1,2,3,4组为药物治疗组,5组为阳性对照组。
1.4.2人工发病
先将保存菌种接种于普通营养平板,37℃恒温培养18小时,然后挑取典型菌落接种于普通肉汤中,37℃恒温培养18小时取出,以生理盐水稀释至浓度为5×108cfu/ml,经预试验后,除空白对照组外,其它各组攻毒量为每头猪肌注5ml菌液。待仔猪出现腹泻、排白色粥样粪便、食欲减退等典型症状时开始用药。
1.4.3用药方法
1组为白头翁散煎剂(1g/ml)治疗组,灌服给药,每头猪3~5ml/次,一天2次,连用3天;2组为本发明口服液高剂量组(1g/ml),灌服给药,每头猪3~5ml/次,一天2次,连用3天;3组为本发明口服液中剂量组(0.5g/ml),灌服给药,每头猪3~5ml/次,一天2次,连用3天;4组为本发明口服液低剂量组(0.25g/ml),灌服给药,每头猪3~5ml/次,一天2次,连用3天;5组为阳性对照组,感染发病后不给药。各组试验猪均饲喂不含药物的全价饲料。
1.5疗效评价指标
治愈率:经用药治疗后临床症状完全消失,精神及饮食欲恢复正常为治愈,统计治愈数,计算治愈率。
有效率:经用药治疗后临床症状明显减轻,精神及饮食欲好转者或治愈的,均视为有效,统计有效数,计算有效率。
死亡率:治疗期间因用药无效而死亡,统计死亡数,计算死亡率。
1.6数据分析与处理
生物统计用t检验和卡方检验进行数据分析。试验结果见表1。
2、结果
表1对人工发病仔猪白痢的治疗效果
组别 | 治疗数/头 | 治愈数/头 | 治愈率(%) | 有效率(%) | 死亡率(%) |
1 | 40 | 35 | 87.5 | 95.0 | 0 |
2 | 40 | 38 | 95.0 | 100 | 0 |
3 | 40 | 34 | 85.0 | 94.5 | 0 |
4 | 40 | 30 | 75.0 | 87.5 | 2.5 |
5 | 40 | 0 | 0 | 0 | 15 |
本发明的中药口服液高、中、低剂量组及白头翁散煎剂组对人工发病的仔猪白痢的有效率与阳性对照组比较差异极显著(P<0.01);本发明的中药口服液中剂量组的有效率与白头翁散煎剂组相比较差异不显著(P>0.05);说明本发明的发酵制剂仅需要未发酵制剂50%的剂量就可以达到未发酵制剂的治疗效果。
试验例2
本试验例是用本发明实施例4制备的预混剂预防仔猪黄白痢的试验,取得了良好的试验效果。
选择所产仔猪有黄白痢病史的31头母猪,随机分成3组。1组为本发明的预混剂组,产前5天开始用药,在饲料中按0.5%添加本发明预混剂,连续用药5天;2组为白头翁散组,同样产前5天开始用药,在饲料中按1.0%添加白头翁散,连续用药5天;3组为对照组,饲料中不添加任何药物;3个组的饲养条件相同。记录出生仔猪发病头数及死亡头数,计算各组发病率及死亡率。试验结果见表2。
表2预防仔猪黄白痢的试验结果
组别 | 母猪头数 | 产仔头数 | 仔猪发病头数 | 死亡头数 | 发病率(%) | 死亡率(%) |
1 | 11 | 122 | 6 | 0 | 4.92 | 0 |
2 | 10 | 113 | 13 | 4 | 11.50 | 3.54 |
3 | 10 | 111 | 62 | 27 | 55.86 | 24.32 |
试验结果表明,怀孕母猪产前使用本发明的中药生物制剂后,所产仔猪黄白痢的发病率、死亡率与普通散剂组和对照组相比较明显下降,说明本发明的中药生物制剂可通过母猪来有效预防出生仔猪黄白痢,降低其死亡率。
试验例3
本试验例是按实施例5制备的中药粉剂对肉仔鸡白痢治疗效果的观察试验。
试验方法:某养鸡场提供20日龄肉仔鸡,经临床检查病鸡表现昏睡,怕冷,精神沉郁,食欲减少或不食,翅膀下垂,拉白色浆糊样粪便,***周围粘连石灰样粪便等明显的鸡白痢症状。剖杀10只病鸡,经实验室检测为沙门氏菌感染。将鸡白痢全血平板凝集反应(用标准血清检测未知抗原)阳性的肉仔鸡750只,随机分成5组,每组150只。
其中1组为本发明的粉剂组;2组为庆大霉素组;3组为氟苯尼考组;4组为白头翁散煎剂组(生药含量1g/ml),5组为对照组,不用药物治疗,4个用药治疗组的用药剂量及使用方法见表3。各组鸡的饲养条件相同,饲料中不添加任何药物。连续用药5天,观察治疗效果。试验结果见表4。
表3用药剂量与使用方法
组别 | 使用方法 | 使用剂量 | 使用频次 |
1 | 混饮 | 0.5g/kg.BW | 每天1次,连用5天 |
2 | 混饮 | 30mg/kg.BW | 每天2次,连用5天 |
3 | 混饮 | 20mg/kg.BW | 每天2次,连用5天 |
4 | 混饮 | 1ml/kg.BW | 每天2次,连用5天 |
表4对雏鸡白痢的治疗试验结果
上述试验结果表明,本发明的中药生物制剂对鸡白痢具有良好的治疗效果,能够有效降低死亡率,治疗效果好于西药组和白头翁散煎剂组。
试验例4
本试验例是按实施例2的方法制备的中药颗粒剂对出生羔羊腹泻的防治效果的观察试验。
1、材料与方法
1.1试验动物 选择甘肃某牧场4个月内母羊所产的320只羔羊进行试验。
1.2试验药物 本发明的中药颗粒剂、白头翁散煎剂(生药含量1g/ml)、土霉素。
1.3试验分组 按羔羊的出生时间随机分组,分为3组。试验1组为本发明制剂组;试验2组为白头翁散煎剂组;试验3组为土霉素对照组。
1.4用药方法 出生羔羊吃初乳后马上给药,本发明的中药颗粒剂,按每公斤体重0.5~1.0g给药;白头翁散煎剂组,按每公斤体重0.5~1ml给药;对照组,按每公斤体重0.02~0.05g口服土霉素。各组均日用药2次,连续用药3~5天。
每天观察、记录各组羔羊腹泻和死亡情况等临床症状,进行统计、分析。
2、结果
试验结果见表5。
表5对出生羔羊腹泻的预防效果
组别 | 羔羊数(只) | 腹泻数(只) | 腹泻率(%) | 成活数(只) | 成活率(只) | 死亡数(只) | 死亡率(%) |
1 | 110 | 9 | 8.2 | 107 | 97.3 | 3 | 2.7 |
2 | 110 | 12 | 10.9 | 101 | 91.8 | 9 | 8.2 |
3 | 100 | 15 | 15.0 | 88 | 88.0 | 12 | 12.0 |
注:成活数、死亡数均为45日龄时的统计结果。
从试验结果可以看出,本发明的制剂及白头翁散煎剂可以对出生羔羊的腹泻起到很好的预防作用,与对照组相比腹泻率分别降低了6.8%和4.1%,成活率分别提高9.3%和3.8%。本发明的制剂组与对照组之间差异极显著(P<0.01)。
试验例5
本试验例是按实施例3的方法制备的片剂对犬各种腹泻治疗效果的观察。
1、试验动物 从几个养犬场中选择患有急性肠炎、黏液性肠炎、出血性肠炎的病犬共112条供试验用。
2、动物分组及用药 将选定的112条犬分成2组,1组100条犬,为本发明制剂治疗组,其中患急性肠炎的犬72条,黏液性肠炎犬8条,出血性肠炎犬20条,用药量为每公斤体重1片,每日1次,连用3~5天;2组12条犬作为对照组,不给任何药物。
3、判定标准
无效:用药治疗5天,症状未见改变或病情变严重的视为无效。
有效:用药治疗5天,临床症状减轻或痊愈的均视为有效。
治愈:用药治疗5天,临床症状消失,患急性肠炎的犬精神正常,呕吐完全停止,排便正常;患黏液性肠炎的犬精神、体温、食欲、排便均恢复正常;患出血性肠炎的犬出血停止,排便正常,精神、食欲、体温恢复正常,鼻镜润湿。
4、结果
试验结果见表6。
表6对犬腹泻的治疗效果
从试验结果可知,本发明的药物治疗犬各种腹泻的平均有效率在90%以上,平均治愈率在85%以上,效果较好。
Claims (8)
1、一种防治畜禽腹泻的中药生物制剂,其特征在于是将微生物接种到包含白头翁散的培养基中进行发酵制备而成。
2、根据权利要求1所述的防治畜禽腹泻的中药生物制剂,其特征在于所述的白头翁散包括如下组分和重量份数:
白头翁20~80份、黄柏30~60份、秦皮20~80份、黄连10~50份。
3、根据权利要求1所述的防治畜禽腹泻的中药生物制剂,其特征在于所述微生物为酵母菌。
4、根据权利要求3所述的防治畜禽腹泻的中药生物制剂,其特征在于所述的酵母菌为产朊假丝酵母和/或酿酒酵母。
5、根据权利要求1所述的防治畜禽腹泻的中药生物制剂,其特征在于所述的制剂为口服液、粉剂、片剂、颗粒剂、缓释制剂、丸剂、微囊剂、注射剂或其他药剂学上可接受的剂型。
6、根据权利要求1-5任一项所述的防治畜禽腹泻的中药生物制剂的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)制备菌种培养液
将酵母菌菌种接种到YPD培养基中,28~32℃,150~200rpm摇床培养生产一级种子液,当活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时转接到二级种子液发酵罐扩大培养,接种量为3~8%,培养温度28~32℃,搅拌转速180~220rpm,二级种子液活菌含量在1.0×108~9cfu/ml时,停止培养,备用;
(2)培养基的制备:取配方量的中药材,粉碎成80~120目的药材细粉,装入发酵罐中,加入占中药重量5~10%的麸皮、1~5%葡萄糖,0.1~1.0%尿素,0.5~2.0%K2HPO4,加水至含水量在40~60%,调节pH至4~5,灭菌20~25min;
(3)冷却后,按发酵物总重量的5~10%将(1)中的菌种培养液接入到(2)培养基中,于28~37℃恒温培养24~72h,搅拌转速150~250rpm,当活菌含量达到1.0×108~9cfu/ml时停止发酵;
(4)将成熟的固态发酵物用乙醇进行浸提,分离,过滤,滤液精制,发酵液减压浓缩至相对密度为1.0~1.2,加入药学上常用辅料制成相应剂型。
7、根据权利要求6所述的防治畜禽腹泻的中药生物制剂的制备方法,其特征在于还可进一步包括如下步骤:步骤(4)得到的浓缩发酵液经过喷雾干燥或冷冻干燥后,加入辅料制成预混剂。
8、一种包含权利要求1-4任一项所述的防治畜禽腹泻的中药生物制剂的饲料。
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