CN101646775B - 用于产生脱唾液酸化免疫球蛋白的方法和载体 - Google Patents

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Abstract

通过由用编码唾液酸酶的载体序列转染表达含Fc蛋白质的细胞系改变Fc区中寡糖的唾液酸化，来控制含Fc蛋白质例如抗体的性质。修饰的含Fc蛋白质在疾病或状况中具有治疗功用，在所述疾病或状况中希望控制对于FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA受体的一种或多种的亲和力、ADCC活性、巨噬细胞或单核细胞活化、血清半衰期和抗体亲抗原性。

Description

用于产生脱唾液酸化免疫球蛋白的方法和载体
发明背景
发明领域
本发明涉及产生与Fc受体相互作用的治疗蛋白质例如抗体的方法，其中寡糖链的组成就抗体与其靶的抗体亲抗原性以及Fc受体结合亲和力进行最优化，从而与产生糖基化抗体的非最优化方法相比较，最优化所述抗体的效应子功能活性。
相关技术的描述
抗体是在先天免疫中发挥显著作用的可溶性血清糖蛋白。在重链恒定区中的保守位置处所有天然产生的抗体的碳水化合物结构都随同种型而变化。每种同种型都具有N联寡糖结构的不同阵列，这反复不定地地影响蛋白质装配、分泌或功能活性(Wright，A.和Morrison，S.L.，Trends Biotech.15：26-32(1997))。参考图1和2，依赖于加工程度，附着的N联寡糖结构相当不同，并且可以包括高甘露糖，以及含或不含二等分GlcNAc和核心岩藻糖残基的复杂双触角寡糖(Wright，A.和Morrison，S.L.，同上)。一般地，存在在特定糖基化位点处附着的核心寡糖结构的异质加工，从而使得甚至单克隆抗体也作为多重糖形存在。类似地，已显示抗体糖基化中的主要差异在抗体产生细胞系之间发生，并且甚至对于在不同培养条件下生长的给定细胞系可见微小差异。
在聚糖上的唾液酸(静止基团)已知在延长除抗体外的糖蛋白的血清半衰期中是重要的(Stockert，R.J.(1995)Physiol.Rev.75，591-609)。迄今为止，唾液酸对单克隆抗体(Mabs)的作用仍未完全了解。Mabs的血清半衰期特别长寿，并且Fc-融合蛋白的构建已证明是在开发治疗蛋白质例如蛋白质enteracept中有用的策略。
抗体和T细胞受体分子具有负责特异性细胞表面受体结合的区域，所述结合调节细胞应答。在免疫***中，这些功能分类为体液和细胞的。抗体通常称为连接体液和细胞免疫机制的衔接分子：体液应答主要归因于能够与靶抗原高亲和力结合的成熟的、分泌的、循环抗体。细胞应答归因于通过ab-ag复合物的结合和通过下游结局的细胞激活结果，所述下游结局通过由于ab-ag复合物与效应细胞结合释放的细胞介质引起。这些细胞应答包括靶的中和、调理作用和致敏作用(如果抗原展示于细胞表面上)、肥大细胞的致敏作用和补体激活。对于细胞靶，即，细胞表面抗原，这些效应子功能导致通常所谓的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)。
在抗体同种型(例如，IgE、IgD、IgA、IgM和IgG)中，IgGs是最丰富的，其中IgG1亚类显示出最显著程度和大量的效应子功能。IgG1类型的抗体是癌症免疫治疗中最常用的抗体，在所述癌症免疫治疗中ADCC和CDC活性通常视为重要的。在结构上，IgG铰链区和CH2结构域在抗体效应子功能中起重要作用。Fc区(由铰链、CH2和CH3结构域的二聚化形成)中存在的N联寡糖影响效应子功能。共价结合的寡糖是复杂双触角类型结构，并且是高度异质的(参见图1和2)。在Asn297处的保守N联糖基化位点位于每个CH2结构域中。在成熟抗体中，与Asn297附着的2个复杂双触角寡糖包埋在CH2结构域之间，与多肽主链形成广泛接触。已发现它们的存在对于抗体介导效应子功能例如ADCC是必需的(Lifely，M.R.，等人，Glycobiology 5：813-822(1995)；Jefferis，R.，等人，Immunol Rev.163：59-76(1998)；Wright，A.和Morrison，S.L.，同上)。
由各种宿主细胞产生的装饰Fc部分抗体或抗体衍生结构包含的异质寡糖占优势地包含唾液酸、岩藻糖、半乳糖和GlcNAc残基作为末端糖(Raju，T.S.，等人Glycobiology2000.10(5)：477-86)。已显示这些末端糖中的一些，特别是暴露的半乳糖、核心岩藻糖和二等分GlcNAc残基，影响分子的Fc部分的结构且由此改变抗体效应子功能。效应子功能例如ADCC活性和CDC活性可以通过附加聚糖的组成加以改变，所述效应子功能依赖于与称为Fc受体的细胞表面受体的结合，以及与各种配体包括C1q补体蛋白质的结合(PrestaL.2003.Curr Opin StructBiol.13(4)：519-25)。在Fc处附着的大多数N联聚糖未唾液酸化至显著程度(Idusogie EE，等人2000.J Immunol.15：164(8)：4178-84)。
在人IgG和其他重组产生的IgGs中发现的大多数结构是含或不含暴露的Gal残基的复杂双触角结构(图1)。存在许多哺乳动物宿主细胞，其目前用于表达重组抗体用于研究目的以及生物制药生产。宿主细胞起源物种以及培养条件可以引起与重组表达分子附加的聚糖程度和结构改变。用于抗体的重组表达的2种常用宿主细胞系是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0、653、NS0)。尽管CHO细胞表达几乎缺乏唾液酸聚糖的重组抗体，但聚糖是99％岩藻糖基化的。岩藻糖的存在已显示是减少的Fc-γIII受体和因此ADCC的主要贡献者。小鼠骨髓瘤细胞表达具有最高达50％唾液酸但具有一般较少的岩藻糖的重组抗体。如上所述，这些差异可以对体内抗体活性具有显著影响。
因此，希望能够以这样的方式减少与治疗抗体相关的聚糖唾液酸化，所述方式消除关于收获后加工的需要，且同时提供就唾液酸含量而言合理地同质结构。
发明概述
本发明包含用于生产具有减少的唾液酸含量的含Fc分子特别是抗体治疗剂的方法、宿主细胞系、以及表达载体和质粒。更具体而言，本发明包含编码工程改造的唾液酸酶编码序列的表达质粒，所述质粒一旦整合入抗体分泌宿主细胞系内，就使得宿主细胞能够分泌具有唾液酸酶活性的多肽。在一个实施方案中，在质粒内的编码序列编码产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶的催化结构域。在本发明的进一步方面，包含产脲节杆菌唾液酸酶的催化结构域的宿主细胞将翻译的催化结构域分泌到培养基内。
本发明包含用于控制含Fc分子的性质的方法，其包括使与Fc区附着的寡糖的唾液酸化降到最低，由此最优化分子对于多种定位的靶蛋白质的抗体亲抗原性和对于一种或多种Fcγ受体例如FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA受体的亲和力；ADCC活性；巨噬细胞或单核细胞活化；和血清半衰期。
本发明还涉及在Fc结构域中包含最大限度的唾液酸化N联寡糖的含Fc分子例如抗体的高度同质批次的制备。它进一步涉及就在Fc寡糖中包含唾液酸的抗体以及在Fc寡糖中不包含唾液酸的抗体富集的抗体批次的纯化。
附图的几个视图的简述
图1是在人IgG中发现的最大寡糖结构的示意描述。
图2描述了在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的重组IgG中发现的主要寡糖结构。
图3显示Fc寡糖的HPLC分析结果。N联寡糖首先通过用PNGase F酶处理从抗体中释放。所释放的寡糖用邻氨基苯甲酸进行标记，并且标记的寡糖通过凝胶过滤层析进行纯化。纯化的标记寡糖通过HPLC进行分析，导致显示的层析谱。
图4A和4B是显示通过2种不同形式的不同Ab1:TNF免疫复合物与K562细胞上的人FcγRII结合的曲线图。(A)在与Ab6复合的固定量125I标记的人IgG1 Ab5的存在下，通过向细胞中加入各种量Ab1和TNF的未标记复合物测量的竞争结合，所述Ab6是对于Ab5特异的小鼠单克隆Ab。(B)通过向K562细胞中加入与125I标记的TNF复合的各种量Ab1测量的直接结合。
图5A-D是用各种测试Ab制剂的FcγRIIIa结合研究曲线图，所述制剂用于与固定浓度的放射性标记的抗FcγRIIIa mAb 3G8竞争结合NK细胞FcγRIIIa:Ab1天然糖基化变体(A)；Ab5天然糖基化变体(B)；Ab1凝集素柱级分(C)；和Ab2凝集素柱级分(D)。
图6A-D是显示使用在唾液酸含量中不同的Ab1、在其细胞表面上超表达TNF的K2靶细胞、和表达FcγRs的人PBMC效应细胞执行的体外ADCC测定结果的曲线图。(A)Ab1天然糖基化变体，(B)Ab2天然糖基化变体，(C)在基于WGA凝集素亲和力的分级分离后，在唾液酸含量中不同的Ab1的3个小批(sublot)与酶促去糖基化(Gno)Ab1的比较，(D)未处理的Ab1样品与完全唾液酸化的Ab1 G2S2样品、或Ab7同种型匹配的阴性对照Ab的比较。样品一式三份地进行分析(误差条表示标准差)，并且所显示的结果代表关于每个变体对的3次独立实验。如通过额外平方和(extra sum of square)F检验测定的，这些测试样品之间在活性中的差异是显著的(对于图A、C和D P＜0.0001；对于图B P＝0.0016)。
图7A和B是显示各种IgG抗体样品与U-937细胞上的人FcγRI(CD64)受体的竞争性结合的曲线图，(A)Ab1 G2(完全半乳糖基化和未唾液酸化的)和Ab1 G2S2(hi)(完全半乳糖基化和完全唾液酸化的)仅相差唾液酸的不存在和存在，(B)Ab3的2个不同批次在荷电寡糖种类(含唾液酸种类)量方面不同，为总寡糖的2％或42％。
图8是显示施用后时间和融合蛋白(FcP1)的Fc部分的血清浓度之间的关联的曲线图，所述融合蛋白已完全唾液酸化(G2S2)或未修饰。
图9是显示施用后时间和完全唾液酸化Ab2 G2S2、或完全脱唾液酸化的Ab2 G2的Fc部分的血清浓度之间的关联的曲线图，通过如所述的酶促方法。
图10A-D是显示Ab制剂中的唾液酸对细胞表面上的靶配体亲和力的作用的曲线图，通过用放射性标记的Ab的竞争结合：(A)Ab1天然变体，(b)Ab5天然变体，(C)Ab1凝集素柱级分变体，和(D)Ab2凝集素柱级分变体。样品一式两份或一式四份地进行测试，并且所显示的结果代表3或4次独立实验。如通过额外平方和F检验测定的，在这些测试样品之间的结合中的差异是显著的(对于图A、C和DP＜0.0001)。
图11A-B是显示Ab制剂中的唾液酸对EIA板上包被的靶配体亲和力的作用的曲线图：(A)与TNF结合的Ab1天然变体，(B)与抗Id抗体结合的Ab2。
图12A-C是显示Ab制剂中的唾液酸对靶配体亲和力的作用的曲线图，所述靶配体作为对表面结合的Ab的放射性标记的可溶性抗原存在：(A)Ab1天然变体，(B)Ab11凝集素柱级分变体，和(C)Ab2凝集素柱级分变体。进行与放射性标记的Ag和100倍过量的未标记Ag的平行温育，以测定非特异性结合。样品一式三份地进行测试。
图13是构建为表达与hGH(人生长激素)信号序列连接的产脲节杆菌唾液酸酶A的催化结构域的表达质粒p3629的示意图示，其中示出了用于克隆到亲本载体p2815内的限制酶位点。
图14是呈现从表达分泌的唾液酸酶催化结构域的细胞系纯化的抗体的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)活性的曲线；克隆3、5、12、13和17。
发明详述
缩写
α1，3GT，α-1，3-半乳糖基转移酶；α2，3ST，α-2，3-唾液酸转移酶；β1，4GT，β-1，4-半乳糖基转移酶；ADCC，抗体依赖性细胞毒作用；ATCC，美国典型培养物保藏中心；BATDA，二(乙酰氧甲基)2，2’：6’，2”-三联吡啶-y，y”-二羧酸；BSA，牛血清清蛋白；CD培养基，化学成分确知培养基；CDC，补体指导的细胞毒性；CMP-Sia，胞苷一磷酸N-乙酰神经氨酸；DMEM，Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基；E∶T，效应细胞与靶细胞比：FBS，胎牛血清；ESI-MS，电喷射离子化质谱分析法。NK细胞，天然杀伤细胞；IgG，免疫球蛋白G；IMDM，Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基；MALDI-TOF-MS，基质辅助激光/解吸离子化飞行时间质谱分析法；MHX，霉酚酸、次黄嘌呤、黄嘌呤；NANA，唾液酸的N-乙酰神经氨酸同分异构体；NGNA，唾液酸的N-羟乙酰神经氨酸同分异构体；PBMC，外周血单核细胞；PBMC，外周血单核细胞；PBS，磷酸缓冲盐水；PNGase F，肽N糖苷酶F；RP-HPLC，反相高效液相层析；RT，室温；Sia，唾液酸；UDP-Gal，尿苷二磷酸半乳糖；UDP-GlcNAc，尿苷二磷酸N-乙酰葡糖胺。
定义
术语“ADCC活性”表示依赖抗体的细胞毒性，且意指通过非致敏效应细胞的抗体介导的靶细胞破坏现象。靶细胞的特性可变，但它必须有具有能够活化Fc受体的Fc结构域或Fc结构域部分的已结合的表面免疫球蛋白G。效应细胞是具有Fc受体的“杀伤”细胞。它可以是例如缺乏常规B或T细胞标记的淋巴细胞，或单核细胞、巨噬细胞、或多核白细胞，依赖于靶细胞的特性。反应是不依赖补体的。本发明的抗体或其他含Fc蛋白质的ADCC活性得到“增强”，如果它显示ADCC介导的细胞杀伤能力超过由可替代宿主细胞产生的基本上相似序列的抗体或蛋白质和Fc结构域的能力的话。ADCC活性可以在体内或体外细胞杀伤标准测定中进行测定，例如本文讨论的测定。优选地，具有增强的ADCC活性的本发明的抗体在比可替代宿主细胞中产生的参考抗体更低的剂量下和/或更短的时间中达到相同作用(预防或抑制肿瘤细胞生长)。优选地，在本发明范围内的抗体和参考抗体效能之间的差异是至少约1.5倍、更优选至少约2倍、甚至更加优选至少约3倍、最优选至少约5倍，如例如通过在所选择的标准铬释放ADCC测定中并行比较测定的。
如本文所使用的，术语“亲和力”意指单个单价配体对于其关联结合配偶体的结合常数的量度，例如，Fab’对于抗原或表位的结合。亲和力可以以几种方法进行测量，包括通过例如等离振子共振(BiaCore)测量结合和解离速率(分别为kon和koff)，并且表示为总体结合(Kass)或解离常数(KD)，其中Kass是kon/koff，和KD是koff/kon。KD也可以通过例如测量在其下配体与结合配偶体的结合是半饱和的浓度凭经验进行测量。测量KD的另一种方法是通过竞争测定，其中一种粘合剂或配体进行标记或加上标签，并且保持在恒定浓度下，而测试粘合剂或配体以各种浓度加入，以从其关联结合配偶体中竞争走标记的物质，且测定在其下标记减少一半的浓度。
如本文所使用的，术语“抗体亲抗原性”意指在配体和结合配偶体可以是多价的，并且关于多个结合和解离事件的趋势可以对于特定配体同时发生的范围内，配体保持与结合配偶体结合的趋势的量度。因此，抗体亲抗原性可以通过具有已知亲和力的结合配偶体的多价构象的表观亲和力中的增加进行测量。
如本文所使用的，术语“含Fc蛋白质”或“含Fc分子”指具有配体结合结构域以及至少免疫球蛋白CH2和CH3结构域的单体、二聚或异二聚蛋白质。CH2和CH3结构域可以形成蛋白质/分子(例如，抗体)的二聚区域的至少部分。
术语“抗体”意欲包含抗体、其消化片段、特定部分及变体，包括但不限于，抗体模拟物，或包含模拟抗体或其指定片段或部分的结构和/或功能，并且保留Fc介导的功能的抗体部分，包括但不限于：与Fc受体(例如FcγRI(CD64)FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIIA(CD16A)和FcRn)结合、结合补体(例如C1q)、ADCC和CDC。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是特定形式的含Fc融合蛋白，其中配体结合结构域保留与至少一个动物抗体种类的重或轻链抗体可变结构域至少之一的相当大同源性。
如本文所使用的，抗体或抗体类似物的“效应子功能”是通过其病原体或异常细胞例如肿瘤细胞被破坏且从体内去除的过程。先天性和适应性免疫应答使用大部分相同的效应机理以消除病原体，包括ADCC、CA(补体激活)、C1q结合和调理作用。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”指任何种类的细胞***，其可以进行工程改造以产生目的蛋白质、蛋白质片段或肽，包括抗体和抗体片段。宿主细胞包括但不限于，培养的细胞，例如哺乳动物培养的细胞，例如CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，和昆虫细胞，但也包含在转基因动物或培养的组织内的细胞。
术语“唾液酸”指9-碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族的最常见成员是N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-双脱氧-D-甘油基-D-半乳糖吡喃型尤罗索-1-尼克I酸(galactononulopyranos-1-onic I acid)(通常缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA)。该家族的第二个成员是N-羟乙酰-神经氨酸(NGNA、Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基是羟基化的。这种形式在来自啮齿类动物和微生物来源的糖蛋白中是普遍的。第三个唾液酸家族成员是2-酮-3-脱氧-尤罗索尼克酸(KDN)(Nadano等人(1986)J.Biol.Chem.261：11550-11557；Kanamori等人，J.Biol.Chem.265：21811-21819(1990))。还包括9-取代的唾液酸，例如9-O-C-C6酰基Neu5Ac，如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。关于唾液酸家族的综述，参见例如，Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；SialicAcids：Chemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，编辑(SpringerVerlag，New York(1992))。
描述
鉴于本发明人已意外地发现Fc寡糖的唾液酸化水平改变重组产生的治疗抗体对于Fcγ受体的亲和力，从而导致所述抗体生物作用的各个方面的调节。更具体而言，发现高度唾液酸化的Abs已显著减少对于低亲和力受体FcγRIIA(CD32A)和FcγRIIIA(CD16A)的亲和力，并且在其中FcγRIIIA被认为是相关受体的体外ADCC测定中具有显著减少的活性。进一步发现与脱唾液酸化或部分唾液酸化的含Fc蛋白质相比较，高度唾液酸化的Abs对于高亲和力Fcγ受体FcγRI(CD64)具有增加的亲和力，并且完全唾液酸化的含Fc蛋白质具有减少的血清半衰期。进一步发现唾液酸从Fc寡糖中的去除(或不存在或减少水平)增强重组产生的治疗抗体对于其靶分子的抗体亲抗原性。这些发现和支持信息已在共同未决的美国临时申请号60/695,769、60/809,106、60/841,153中得到描述。
尽管不希望受任何一种理论束缚，从寡糖中去除荷电静止基团可以解释为允许总体抗体结构中更多的灵活度，所述灵活度对于在彼此关系中的2个结合结构域赋予扩大范围的潜在相互作用。Ab与2个抗原表位二价结合的能力也将依赖于表位可接近性、定向、密度和可动性。应当指出唾液酸化的抗原结合作用也可以与这样的Abs相关，所述Abs识别病毒或细菌表面抗原，并且甚至为同聚物的可溶抗原，因为Ab灵活度可以测定个别Ab分子在可溶性免疫复合物内二价结合到怎样的程度，其中不仅一些Abs可以结合超过一种抗原，并且一些抗原可以由超过一种Ab结合。
本发明包含通过改变Fc寡糖和改变的含Fc分子的唾液酸化，用于控制含Fc分子的性质的方法。唾液酸在生理pH下具有净负电荷，并且因此，Fc结合碳水化合物中唾液酸的存在可以预期改变三维结构，且因此改变CH2结构域的构象，并且从而影响与各种配体或受体的Fc结合。改变的含Fc分子影响对于一种或多种FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA受体的亲和力，ADCC活性，巨噬细胞或单核细胞活化，和血清半衰期。
唾液酸化形式的含Fc蛋白质的富集
制备在唾液酸含量中不同的特定含Fc蛋白质小批的一种方法是采取具有异质Fc寡糖的含Fc蛋白质制剂，包括唾液酸化和脱唾液酸化分子，并且使其经过含固定凝集素的柱，所述凝集素对于唾液酸化和脱唾液酸化的寡糖具有差别亲和力。未结合的流通物(T，通过)或柱未结合的级分可以与结合的级分(B，结合)分开，后者在使洗脱缓冲液经过柱时收集。例如，通过收集在用原始样品缓冲液持续洗涤柱的过程中洗脱的含Fc蛋白质，还可能分开收集弱结合的级分或柱滞留级分(R，滞留)。依赖于所使用的凝集素，未结合的级分可以具有比结合的级分更高或更低的唾液酸含量。
可以就唾液酸化或脱唾液酸化含Fc蛋白质富集的凝集素的例子是特异性结合具有末端唾液酸的寡糖的来自朝鲜槐(Maackia amurensis)的凝集素(MAA)，以及特异性结合具有末端唾液酸或末端N-乙酰半乳糖胺(GlcNAc)的寡糖的凝集素麦胚凝集素(WGA)。另一个例子是结合具有末端半乳糖的寡糖的凝集素蓖麻毒蛋白I(RCA)。在后面一个例子中，未结合的流通物级分可以就唾液酸化含Fc分子进行富集。
含Fc蛋白质的酶促修饰
用于制备在唾液酸含量中不同的含Fc蛋白质小批的可替代方法是用唾液酸酶处理含Fc蛋白质制剂的部分，从而去除唾液酸。所得到的脱唾液酸化材料可以就生物活性中的差异与原始部分唾液酸化的材料进行比较。原始含Fc蛋白质批次中的唾液酸含量越高，那么检测生物活性中的任何差异中的机会就越大。例如，如果原始蛋白质制剂中仅10％的Fc寡糖包含唾液酸，那么在唾液酸酶处理后，当0-1％的寡糖包含唾液酸时，可能难以检测生物活性中的差异。如果唾液酸酶处理导致岩藻糖基化和脱岩藻糖基化(afucosylated)寡糖的不同分布，那么比较唾液酸酶处理前和后含Fc蛋白质的生物活性将是更困难的，因为岩藻糖水平对某些生物活性例如对于人FcγRIIIA的亲和力和ADCC活性具有显著影响。例如，如果唾液酸含量从寡糖的30％减少至0％导致脱岩藻糖基化寡糖比例从5％增至15％，那么将不可能使ADCC活性中的差异单独归于唾液酸含量中的减少。由于在用唾液酸酶处理以去除唾液酸残基前，岩藻糖基化和脱岩藻糖基化寡糖的唾液酸化中的差异，唾液酸酶处理对岩藻糖基化和脱岩藻糖基化寡糖的相对比例的此种作用是可能的(并且已观察到)。
Fc区中存在的寡糖的唾液酸化也可以使用体外糖基化方法来达到。使用此种方法，可能取得最大限度唾液酸化糖形的抗体样品。基于目前的发现，与脱唾液酸化或唾液酸化不足的抗体相比较，最大限度唾液酸化糖形的抗体或其他含Fc构建体将具有减少的血清半衰期。因此，本发明的方法提供了用于控制包含抗体或包含免疫球蛋白Fc区的其他重组蛋白质构建体的糖形的同质性，以及所述抗体或构建体的体内功能方面的任选方法。
糖基转移酶天然地发挥作用以合成寡糖。它们产生具有极佳立体化学和区域化学几何学的特定产物。糖基残基的转移导致寡糖或多糖的延长或合成。许多糖基转移酶类型已得到描述，包括唾液酸转移酶、岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、N-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶等。
在本发明中有用的糖基转移酶包括，例如α-唾液酸转移酶、α-葡糖基转移酶、α-半乳糖基转移酶、α-岩藻糖基转移酶、α-甘露糖基转移酶、α-木糖基转移酶、α-N-乙酰己糖胺转移酶、β-唾液酸转移酶、β-葡糖基转移酶、β-半乳糖基转移酶、β-岩藻糖基转移酶、β-甘露糖基转移酶、β-木糖基转移酶和β-N-乙酰己糖胺转移酶，例如来自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)或其他细菌来源的那些，以及来自大鼠、小鼠、兔、牛、猪、人以及昆虫和病毒来源的那些。优选地，糖基转移酶是其中膜结合结构域已缺失的截短变体糖基转移酶。
示例性半乳糖基转移酶包括α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.151，参见例如，Dabkowski等人，Transplant Proc.25：2921(1993)和Yamamoto等人Nature 345：229-233(1990))和α(1，4)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.38)。可以使用其他半乳糖基转移酶例如唾液酸转移酶。
通常称为唾液酸转移酶的α(2，3)唾液酸转移酶可以在唾液酸乳糖或更高等级结构的产生中使用。这种酶将唾液酸(NeuAc)从CMP-唾液酸转移到Gal残基，在2种糖之间形成α-连接。糖之间的键合(连接)在NeuAc的2-位和Gal的3-位之间。称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC2.4.99.6)的示例性α(2，3)唾液酸转移酶将唾液酸转移给Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非还原末端Gal。参见，Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.，256：3159(1981)，Weinstein等人，J.Biol.Chem.，257：13845(1 982)和Wen等人，J.Biol.Chem.，267：21011(1992)。另一个示例性α-2，3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.4)将唾液酸转移给二糖或糖苷的非还原末端Gal。参见，Rearick等人，J.Biol.Chem.，254：4444(1979)和Gillespie等人，J.Biol.Chem.，267：21004(1992)。进一步的示例性酶包括Gal-β-1，4-GlcNAc α-2，6唾液酸转移酶(参见，Kurosawa等人Eur.J.Biochem.219：375-381(1994))。
在制备本发明的寡糖中特别有用的其他葡糖基转移酶是甘露糖基转移酶包括α(1，2)甘露糖基转移酶、α(1，3)甘露糖基转移酶、β(1，4)甘露糖基转移酶、Dol-P-Man合酶、OCh1和Pmt1。
另外其他的葡糖基转移酶包括N-乙酰半乳糖胺转移酶，包括α(1，3)N-乙酰半乳糖胺转移酶、β(1，4)N-乙酰半乳糖胺转移酶(Nagata等人J.Biol.Chem.267：12082-12089(1992)和Smith等人J.Biol Chem.269：15162(1994))和多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶(Homa等人J.BiolChem.268：12609(1993))。合适的N-乙酰半乳糖胺转移酶包括GnTI(2.4.1.101，Hull等人，BBRC 176：608(1991))、GnTII和GnTIII(Ihara等人J.Biolchem.113：692(1993))、GnTV(Shoreiban等人J.Biol.Chem.268：15381(1993))。
对于其中方法在商业规模上实践的那些实施方案，可以有利地使糖基转移酶固定在支持体上。这种固定促进酶从产物批中去除以及酶的随后再使用。糖基转移酶的固定可以这样完成：例如通过从转移酶中去除其膜结合结构域，并且在其位置上附着纤维素结合结构域。本领域技术人员将理解其他固定方法也可以使用，并且在可用的文献中得到描述。
因为受体底物可以基本上是具有末端糖残基的任何单糖或寡糖，特定糖基转移酶对于所述末端糖残基显示出特异性，所以底物可以在其非还原末端的位置处取代。因此，糖苷受体可以是单糖、寡糖、荧光标记的糖或糖衍生物，例如氨基糖苷抗生素、神经节苷脂、或糖蛋白包括抗体和其他含Fc蛋白质。在一组优选实施方案中，糖苷受体是寡糖，优选地Galβ(1-3)GlcNAc、Galβ(1-4)GlcNAc、Galβ(1-3)GalNAc、Galβ(1-4)GalNAc、Manα(1，3)Man、Manα(1，6)Man或GalNAcβ(1-4)-甘露糖。在特别优选的实施方案中，寡糖受体与含Fc蛋白质的CH2结构域附着。
活化糖底物即糖-核苷磷酸的使用可以通过使用与糖基转移酶反应同时的再生反应(也称为再循环***)来回避。例如，如例如美国专利6,030,815中教导的，CMP-唾液酸再循环***利用CMP-唾液酸合成酶以补充CMP-唾液酸(CMP-NeuAc)，因为它在α(2，3)唾液酸转移酶的存在下与唾液酸转移酶受体反应，以形成唾液酸-糖。在本发明中有用的CMP-唾液酸再生***包含胞苷一磷酸(CMP)、核苷三磷酸(例如腺苷三磷酸(ATP)、磷酸供体(例如，磷酸烯醇丙酮酸或乙酰磷酸)、能够将磷酸从磷酸供体转移到核苷二磷酸的激酶(例如，丙酮酸激酶或乙酸激酶)和能够将末端磷酸从核苷三磷酸转移到CMP的核苷一磷酸激酶(例如，肌激酶)。α(2，3)唾液酸转移酶和CMP-唾液酸合成酶也可以视为CMP-唾液酸再生***的部分，因为活化唾液酸的去除用于维持合成的正向速率。在使用噬菌粒的唾液酸化程序中唾液酸化合物的合成和使用公开于国际申请WO 92/16640中，所述噬菌粒包含关于经修饰的CMP-唾液酸合成酶的基因，所述专利申请于1992年10月1日公开。
制备寡糖的可替代方法是通过使用糖基转移酶和活化的糖基衍生物作为供体糖，避免了糖核苷酸作为供体糖的需要，如美国专利5,952,203中教导的。活化的糖基衍生物充当天然存在的底物的替代物，所述天然存在的底物是昂贵的糖-核苷酸，通常是核苷酸二磷酸糖(diphosphosugars)或核苷酸单磷酸糖(monophosphosugars)，其中核苷酸磷酸与糖的1-位α-连接。
有用的活化的糖苷衍生物包括活化的离去基团，例如氟、氯、溴、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯等。活化的糖苷衍生物的优选实施方案包括糖基氟化物和糖基甲磺酸酯，其中糖基氟化物是特别优选的。在糖基氟化物中，α-半乳糖基氟化物、α-甘露糖基氟化物、α-葡糖基氟化物、α-岩藻糖基氟化物、α-木糖基氟化物、α-唾液酸氟化物、α-N-乙酰葡糖胺氟化物、α-N-乙酰半乳糖胺氟化物、β-半乳糖基氟化物、β-甘露糖基氟化物、β-葡糖基氟化物、β-岩藻糖基氟化物、β-木糖基氟化物、β-唾液酸氟化物、β-N-乙酰葡糖胺氟化物和β-N-乙酰半乳糖胺氟化物是最优选的。
糖基氟化物可以由游离糖进行制备，这通过首先使糖乙酰化，然后用HF/吡啶处理其实现。乙酰化糖基氟化物可以通过与溶于甲醇的弱(催化)碱(例如NaOMe/MeOH)反应而脱保护。此外，许多糖基氟化物是商购可得的。其他活化的糖基衍生物可以使用本领域技术人员已知的常规方法进行制备。例如，糖基甲磺酸酯可以这样进行制备：通过用甲磺酰氯处理完全苄化半缩醛形式的糖，随后为催化氢化以去除苄基。
反应的进一步组分是催化量的核苷磷酸或其类似物。适合于在本发明中使用的核苷一磷酸包括例如腺苷一磷酸(AMP)、胞苷一磷酸(CMP)、尿苷一磷酸(UMP)、鸟苷一磷酸(GMP)、肌苷一磷酸(IMP)和胸苷一磷酸(TMP)。适合于依照本发明使用的核苷三磷酸包括腺苷三磷酸(ATP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)、鸟苷三磷酸(GTP)、肌苷三磷酸(ITP)和胸苷三磷酸(TTP)。优选的核苷三磷酸是UTP。优选地，核苷磷酸是核苷二磷酸，例如腺苷二磷酸(ADP)、胞苷二磷酸(CDP)、尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、肌苷二磷酸(IDP)和胸苷二磷酸(TDP)。优选的核苷二磷酸是UDP。如上所述，本发明还可以用核苷磷酸的类似物进行实践。合适的类似物包括例如核苷硫酸和磺酸。另外其他的类似物包括简单的磷酸，例如焦磷酸。
用于在例如鼠类细胞中修饰所产生的重组蛋白质的一种程序是用唾液酸酶处理蛋白质，以去除NGNA类型的唾液酸，随后为使用试剂UDP-Gal和β1，4 Gal转移酶的酶促半乳糖基化，以产生高度同质的G2糖形，在所述鼠类细胞中羟基化形式的唾液酸占优势(NGNA)。制剂随后可以任选用试剂CMP-NANA和α-2，3唾液酸转移酶进行处理，以产生高度同质的G2S2糖形。
当需要从与抗体或含Fc分子的Fc区附着的聚糖中去除或消除唾液酸基团时，可以使用唾液酸酶。具有可变特异性的许多唾液酸酶是文献中已知的。可溶性CHO细胞唾液酸酶已得到鉴定(Ferrari等人，1994，Glycobiology 4：367-373)，并且如果渗漏到培养基内，那么可能负责重组蛋白质的聚糖上的唾液酸的细胞外去除。因此，唾液酸基团的添加和去除可以在重组蛋白质的生产过程中发生，这是可能的，这可能解释了通过CHO细胞系产生的蛋白质上的可变和异质聚糖结构。
唾液酸酶(神经氨酸酶)已由从细菌到人的多种物种中得到分离和克隆，对于底物具有可变特异性，所述底物例如糖蛋白、糖脂和神经节苷脂以及键。对于静止基团类型例如羟基化(NGNA)或非羟基化神经氨酸和键具有广泛特异性的酶，所述键可以是α2，3-、α2，6-或α2，8-和与内部残基连接的分支唾液酸；包括来自产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的那些和来自产脲节杆菌的唾液酸酶(唾液酸酶A、N-乙酰神经氨酸糖原水解酶(glycobyhdroalse)；EC 3.2.1.18)。纯化的酶可从例如Prozyme，Inc，SanLeandro，CA商购获得。产脲节杆菌唾液酸酶基因的核苷酸序列已由Lundbeck等人2005.Biotechnolo.Appl.Bochem 41：225-231进行克隆(NCBI登记号AY934539)。
使用本领域众所周知的方法，对于通过发酵由分泌的内切葡聚糖酶释放的糖能够产生乙醇的培养物，可以如例如US7,026,152中教导的构建分泌能够对细胞外寡糖发挥作用的酶的宿主细胞。Lundbeck等人(同上)表达了截短形式的唾液酸酶A，其能够从重组***突变蛋白质中去除唾液酸残基。能够表达治疗抗体或其他含Fc蛋白质，以及使细胞外介质中表达的蛋白质同时脱唾液酸化的哺乳动物宿主细胞的工程改造仍未得到证实。申请人的本发明证实可溶形式的唾液酸酶A可以由抗体生产细胞共表达，并且从此种细胞培养中回收的所得抗体产物在其分子的Fc部分中具有减少的唾液酸含量。与由常规细胞系产生的抗体相比较，如此产生的唾液酸最优化的抗体具有增强的ADCC活性。
唾液酸变体的结构表征
对于包含唾液酸变体的寡糖的结构表征，糖蛋白制剂包括抗体制剂用肽-N-糖苷酶F进行处理，以释放N联寡糖。酶肽-N-糖苷酶F(PNGaseF)切割天冬酰胺连接的寡糖。释放的寡糖用邻氨基苯甲酸(2-氨基苯甲酸)进行荧光标记，纯化且通过HPLC进行分析，如所述的(参见Anumula，K.R.和Dhume ST Glycobiology.1998 Jul；8(7)：685-94)。如图3中所示，可以检测且定量在层析谱中作为G0、G1、G2、G2S1和G2S2分离的寡糖。天然地缺乏聚糖或已用化学方法或酶促去除聚糖的无糖基化(aglycosylated)种类命名为Gno。
唾液酸变体的生物学表征
含Fc蛋白质可以通过几种众所周知的体外测定就功能性进行比较。特别地，对于Fcγ受体的FcγRI、FcγRII和FcγRIII家族成员的亲和力是感兴趣的。这些测量可以使用重组可溶形式的受体或细胞结合形式的受体来进行。此外，例如通过BIAcore使用重组可溶的FcRn，可以测量对于负责IgGs延长的循环半衰期的受体FcRn的亲和力。基于细胞的功能测定，例如ADCC测定和CDC测定，提供对特定变体结构的可能功能结果的了解。在一个实施方案中，ADCC测定配置为具有NK细胞充当重要效应细胞，从而反映对FcγRIIIA受体的功能作用。吞噬作用测定也可以用于比较不同变体的免疫效应子功能，测量细胞应答的测定也可以，例如超氧化物或炎症介质释放。
亲和力和抗体亲抗原性测定
天然多价的抗体可以进行测试，以测定与靶蛋白质结合的各种参数。用于测定表观Kd的方便形式是ELISA(酶联免疫吸附测定)或RIA(放射免疫测定)。“ELISA”已变得一般用于意指使用间接检测法在固体支持体上执行的结合测定。一般地，在ELISA中，在与固相反应物特异性结合后，从溶液中去除可溶分析物。在该方法中，固相反应物通过使抗原或抗体吸附在塑料微量滴定板上进行制备；在其他方法中，固相反应物是细胞结合的分子。在所有规程中，使固相试剂与和酶共价偶联的次级或三级反应物一起进行温育。通过洗涤去除未结合的缀合物，并且加入显色或荧光底物。随着底物由结合的酶缀合物水解，产生有色或荧光产物。最后，产物目测地或用微量滴定板阅读器进行检测。所产生的信号强度与测试混合物中的起始分析物量成比例。
在固相测定的变化中，抗原可以例如使用固定的捕获抗体或通过使用抗体或其他配体进行间接固定或捕获，所述固定的捕获抗体识别在抗原上的无关结构域，所述抗体或其他配体结合工程改造到靶蛋白质内的“标签”，例如多组氨酸序列。
测量抗体针对表面抗原的结合的可替代方法是通过使用在细胞表面上表达(天然地或通过基因工程)抗原的全细胞。使细胞与包含第一抗体的测试溶液一起温育。洗掉未结合的抗体，并且随后使细胞与酶一起温育，所述酶与对于第一抗体特异的抗体缀合。洗掉未结合的酶缀合物，并且加入底物溶液。结合的第一抗体水平与底物水解量成比例。如果细胞数目/单位体积保持恒定，那么这将是定量的。可替代地，如上所述，检测可以使用放射标记的配体通过直接结合或竞争来进行。关于ELISA测定的规程在例如Ausebel，FM等人CurrentProtocols inMolecular Biology.2003 John Wiley&Sons，Inc中找到。
缔合速率、结合速率和解离速率也可以使用BIAcore技术进行测量，所述BIAcore技术使用通过表面等离振子共振检测的固相粘合剂或配体和溶液流动相粘合剂或配体。
用于评估效应子功能的方法
抗体糖基化在清除和因此含Fc治疗蛋白质的药物代谢动力学中的作用看起来最小；与被认为负责从循环中去除IgG的新生Fc受体(FcRn)的结合，看起来不受抗体Fc部分上的N联寡糖缺乏的干扰。
使IgG抗体介导的免疫应答与细胞效应子功能连接的IgG Fc受体(FcR)包括Fc-γ受体：FcRI(CD64)、FcRII(CD32)(FcRIIA和FCRIIB)和FcRIII(CD16)。发现所有3种都在单核细胞上展示。然而，这些受体在各种靶细胞上的确立看起来差异地且响应其他因素而发生。因此，糖基化修饰的含Fc生物治疗剂对于Fc-γ受体的亲和力的测量是用于预测增强的效应子功能的一种合适量度。
已报告在使用人PBMC效应细胞的ADCC测定中，在其Fc聚糖中具有低水平岩藻糖的人IgG1 Abs对于人CD16 FcR具有更大的亲和力，和显著增强的体外活性(Shinkawa等人JBiol Chem 278(5)：3466-3473，2003；Shields等人J Biol Chem 277(30)：26733-26740，2002；Umana等人，Nat Biotech 17：176-180，1999)
使用体外ADCC测定评估效应子功能的方法可以以定量方式来进行。因此，体外测定可以设计为测量结合的抗体引起展示其关联配体的细胞破坏的能力，这通过正确选择靶和效应细胞系，且通过细胞不能继续***或通过内部内含物的释放例如51Cr释放评估细胞“杀伤”实现。靶细胞可以是通常表达对于本发明的抗体、抗体片段或融合蛋白的靶配体的细胞系，或可以进行工程改造以在其表面上表达且保留靶蛋白质。此种工程改造的细胞系的例子是在其表面上稳定表达重组人TNF的K2细胞，Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系，由于成熟细胞因子的氨基酸1-12缺失的引入，所述重组人TNF保持为跨膜形式(Perez等人，Cell 63：251-258，1990).。这种细胞系用于评估具有Fc结构域或Fc结构域活性的抗TNF抗体、抗体片段或工程改造的抗TNFα靶向融合蛋白的ADCC活性中的改变。
用于体外ADCC活性测定的效应细胞可以是人或其他哺乳动物来源的PBMC(外周血单核细胞)。通过批准方法从供体收集血液后，可以新鲜分离PBMC效应细胞。可以使用的其他单核细胞或巨噬细胞是衍生自渗出液例如腹膜溢泌物的那些。
用于测量细胞免疫功能的体内模型也是可用的。例如，抗CD3抗体可以用于测量小鼠中的T细胞活化，因为T细胞活化依赖于其中抗体Fc结构域衔接特定Fcγ受体的方式。在体外，比较高岩藻糖和低岩藻糖形式的嵌合人IgG1 Ab针对CC趋化因子受体4的抗肿瘤活性，未观察到在其体外ADCC活性中的差异(使用小鼠效应细胞)，然而，低岩藻糖Ab显示在体内更有效的效力。未提供人效应细胞，并且小鼠保留内源NK细胞(Niwa等人Cancer Res 64：2127-2133，2004)。因为人NK细胞上的CD16受体已证实对于IgG1 Abs的岩藻糖水平增强的敏感性，所以这些数据暗示与人效应细胞中研究的那种不同的机制在小鼠中起作用。一种可能性是最近发现的小鼠CD16-2受体(Mechetina等人Immunogen 54：463-468，2002)。与更为人知的小鼠CD16受体相比较，小鼠CD16-2的细胞外结构域与人CD16A(65％)具有显著更高的序列同一性，暗示它可能比小鼠CD16对它结合的IgGs的岩藻糖水平更敏感。它在小鼠巨噬细胞样J774细胞中的报告的表达与下述可能性一致：表达CD16-2的小鼠巨噬细胞可能负责通过低岩藻糖Ab的更大的抗肿瘤活性，由Niwa等人(2004)描述的。因此，由人IgG1类型的含Fc蛋白质与鼠类效应细胞的Fc受体结合研究并非预测性的。
蛋白质生产方法
涉及含Fc蛋白质产生的不同方法可以影响Fc寡糖结构，包括唾液酸。在一个实施方案中，分泌含Fc蛋白质的宿主细胞在血清例如胎牛血清(FBS)的存在下进行培养，所述血清先前未实施升高的热处理(例如，56℃30分钟)。由于血清中活性唾液酸酶的天然存在，这可以导致不包含或包含极低量唾液酸的含Fc蛋白质，所述唾液酸酶可以从由这些细胞分泌的含Fc蛋白质中去除唾液酸。在另一个实施方案中，分泌含Fc蛋白质的细胞在血清的存在下进行培养，所述血清实施升高的热处理，从而灭活唾液酸酶，或在不存在血清或可能包含唾液酸酶的其他培养基组分的情况下进行培养，从而使得含Fc蛋白质具有更高水平的唾液酸，用于可能需要时的应用(例如，治疗适应症)。
在另一个实施方案中，确定将有利于最佳唾液酸含量的用于纯化且进一步加工含Fc蛋白质的条件。例如，因为唾液酸是酸不稳定的，所以例如在从A蛋白层析柱中洗脱后或在病毒灭活方法过程中延长暴露于低pH环境，可以同时导致唾液酸含量中的减少。
宿主细胞工程改造
如本文所述，选择用于表达含Fc重组蛋白质或单克隆抗体的宿主细胞是对于最终组成的重要贡献者，包括但不限于免疫球蛋白CH2结构域中的装饰蛋白质的寡糖部分组成中的变化。因此，本发明的一个方面涉及选择合适的宿主细胞用于表达所需治疗蛋白质的生产细胞的使用和/或开发。
在一个实施方案中，宿主细胞是天然缺损或缺乏唾液酸转移酶的细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞进行基因修饰或处理，以便缺乏唾液酸转移酶。在进一步的实施方案中，宿主细胞是选择为表达减少的或不可检测水平的唾液酸转移酶的衍生宿主细胞系。在另外一个实施方案中，宿主细胞天然地缺乏CMP-唾液酸合成酶，或进行基因修饰或处理以便缺乏CMP-唾液酸合成酶，所述酶催化CMP-唾液酸的形成，这是由唾液酸转移酶使用以将唾液酸转移给抗体的唾液酸来源。在相关实施方案中，宿主细胞可以天然地缺乏丙酮酸合成酶，或进行基因修饰或处理以便缺乏丙酮酸合成酶，所述酶由丙酮酸形成唾液酸。
在另外的实施方案中，宿主细胞可以天然地缺乏半乳糖基转移酶，或进行基因修饰或处理以便缺乏半乳糖基转移酶，从而使得在所述细胞中表达的抗体缺乏半乳糖。无半乳糖，唾液酸将不附着。在分开的实施方案中，宿主细胞将天然地超表达唾液酸酶，或进行基因修饰以超表达唾液酸酶，所述唾液酸酶在生产过程中从抗体中去除唾液酸。此种唾液酸酶可以在抗体分泌或将分泌到培养基内前在细胞内作用于抗体，并且作用于已分泌到培养基内的抗体。选择具有改变的糖基化酶且表达具有改变的碳水化合物组成的糖蛋白的细胞系的方法已得到描述(Ripka和Stanley，1986.Somatic Cell Mol Gen 12：51-62；US2004/0132140)。工程改造宿主细胞以产生具有导致增强的ADCC的改变的糖基化模式的方法已在例如美国专利6,602,864中得到教导，其中宿主细胞具有编码至少一种糖蛋白修饰糖基转移酶的核酸，具体地为β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)。
通过操作宿主细胞糖基转移酶基因工程改造宿主细胞的糖基化性质的其他方法涉及消除或抑制活性，如EP1,176,195中教导的，具体地，α1，6岩藻糖基转移酶(FUT8基因产物)。在除上文引用的具体例子外中实践宿主细胞工程改造的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。此外，工程改造的宿主细胞将具有哺乳动物起源，并且可以选自骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或其任何衍生的、无限增殖化的或转化的细胞。
在另一个实施方案中，抑制或消除唾液酸附着所需酶的活性的方法可以选自基因沉默，例如通过使用siRNA、遗传敲除、或添加酶抑制剂，例如通过共表达结合且阻断其酶促活性的对于酶特异的细胞内Ab或肽，和其他已知的基因工程技术。在另一个实施方案中，增强阻断唾液酸附着的酶或唾液酸酶(其去除已附着的唾液酸)的表达或活性的方法，可以选自用重组酶基因转染、增强酶RNA合成的转录因子的转染、或增强酶RNA稳定性的基因修饰，全部导致增强的酶例如唾液酸酶活性，这导致纯化产物中较低水平的唾液酸。在另一个实施方案中，特定酶抑制剂可以加入细胞培养基中。
抗体
在本申请中描述的抗体可以包括或衍生自任何哺乳动物，例如但不限于，人、小鼠、兔、大鼠、啮齿类动物、灵长类动物或其任何组合，并且包括分离的人、灵长类动物、啮齿类动物、哺乳动物、嵌合、人源化和/或CDR-嫁接的抗整联蛋白抗体、免疫球蛋白、其切割产物以及其他特定部分和变体。本发明还涉及抗体编码或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、制剂、装置、转基因动物、转基因植物以及制备且使用其的方法，如本文所述的连同如与本领域已知的组合。
本发明进一步提供了表达能够在CH2结构域中糖基化的免疫球蛋白或其片段的细胞、细胞系和细胞培养物，所述免疫球蛋白或其片段结合抗原、细胞因子、整联蛋白、抗体、生长因子、其为细胞谱系和分化标记的表面抗原、激素、受体或其融合蛋白、血液蛋白质、涉及凝固的蛋白质、其任何片段、以及任何前述的任何结构或功能类似物。在优选实施方案中，免疫球蛋白、其片段或衍生物结合靶细胞的表面上的抗原。在特别优选的实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞、肿瘤脉管***细胞、或免疫细胞。在具体实施方案中，免疫球蛋白、其片段或衍生物与TNF、整联蛋白、B细胞抗原或组织因子结合。
在另外一个实施方案中，本发明的细胞、细胞系和细胞培养物可以可检测地表达包含生长因子或激素的融合蛋白。由本发明预期的生长因子的例子包括但不限于人生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、人绒毛膜促性腺素、***(erythropoeitin)、血小板生成素、骨形态发生蛋白、转化生长因子、***或胰高血糖素样肽、及其任何结构或功能类似物。
本发明的分离的抗体包括下述那些，其有具有ADCC活性的抗体同种型，特别是人IgG1(例如，IgG1κ和IgG1λ)，并且较不优选的是IgG2和IgG3，或在Fc结构域中特定残基处包含改变的残基的杂交同种型是其来自其他物种的配对物。抗体可以是全长抗体(例如，IgG1)，或可以仅包括抗原结合部分和能够引起效应子功能的Fc部分或结构域，所述效应子功能包括ADCC、补体激活和C1q结合。
此外，由本发明的细胞、细胞系和细胞培养物产生的免疫球蛋白片段可以包括但不限于，Fc或其他CH2结构域包含结构及其任何结构或功能类似物。在一个实施方案中，免疫球蛋白片段是二聚受体结构域融合多肽。在具体实施方案中，二聚受体结构域融合多肽是etanercept。Etanercept是重组、可溶TNFα受体分子，其皮下施用且与患者的血清中的TNFα结合，使得其无生物学活性。Etanercept是由与人IgG1的Fc部分连接的人75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分组成的二聚融合蛋白。etanercept的Fc组分包含IgG1的CH2结构域、CH3结构域和铰链区，但不包含CH1结构域。
顺应使用本发明的细胞系制备的其他产物包括，目前由其他类型的动物细胞系制备且具有能够糖基化的CH2的治疗或预防蛋白质。特别优选的是那些治疗、糖基化、包含CH2结构域的蛋白质，其与细胞表面上的靶抗原结合，所述细胞类型是希望v使得无能或从体内消除的。许多此种治疗抗体进行工程改造，以包含人IgG1，特别是IgG1，包含人CH1、CH2和CH3结构域的重链。此种治疗蛋白质包括但不限于下文描述的那些。
英夫单抗目前作为销售。英夫单抗是嵌合IgG1κ单克隆抗体，具有149,100道尔顿的近似分子量。它包含人恒定和鼠类可变区。英夫单抗以1010M-1的结合常数与人肿瘤坏死因子α(TNF(α))特异性结合。英夫单抗通过以高亲和力与可溶和跨膜形式的TNF(α)结合而中和TNF(α)的生物活性，并且抑制TNF(α)与其受体的结合。表达由英夫单抗结合的跨膜TNF(α)的细胞可以在体外或体内进行裂解。英夫单抗指示用于治疗类风湿性关节炎、Crohn氏病和强直性脊柱炎(alkylosing spondylitis)。英夫单抗作为3-5mg/kg的剂量给予，作为静脉内输注给予，随后为在其后2、6和/或8周时以及以每8周的时间间隔的另外类似剂量，这依赖于待治疗的疾病。
达利珠单抗(作为销售)是通过重组DNA技术产生的免疫抑制、人源化IgG1单克隆抗体，其与人高亲和力白细胞介素-2(IL-2)受体的α亚单位(p55α、CD25或Tac亚单位)特异性结合，所述受体在活化淋巴细胞的表面上表达。达利珠单抗是互补性决定区(CDR)嫁接的小鼠-人嵌合抗体。人序列衍生自人IgG1的恒定结构域和Eu骨髓瘤抗体的可变构架区。鼠类序列衍生自鼠类抗Tac抗体的CDRs。达利珠单抗指示用于预防接受肾移植的患者中的急性器官排斥，并且一般用作包括环孢菌素和皮质类固醇的免疫抑制方案的部分。
巴利昔单抗(Basiliximab)(作为销售)是通过重组DNA技术产生的嵌合(鼠类/人)单克隆抗体，其充当免疫抑制剂，特异性结合且阻断活化T淋巴细胞表面上的白细胞介素-2受体(α)链(IL-2R(α)，也称为CD25抗原)。基于氨基酸序列，该蛋白质的计算分子量是144千道尔顿。它是得自基因工程改造以表达质粒的确立的小鼠骨髓瘤细胞系发酵的糖蛋白，所述质粒包含人重链和轻链恒定区基因(IgG1)以及小鼠重链和轻链可变区基因，其编码与IL-2R(α)选择性结合的RFT5抗体。当用作包括环孢菌素和皮质类固醇的免疫抑制方案的部分时，巴利昔单抗指示用于预防接受肾移植的患者中的急性器官排斥。
阿达木单抗(Adalimumab)(作为销售)是对于人肿瘤坏死因子(TNF)特异的重组人IgG1单克隆抗体。阿达木单抗使用噬菌体展示技术进行制备，导致具有人衍生的重链和轻链可变区以及人IgG1κ恒定区的抗体。指示在具有中等到重度活跃类风湿性关节炎的成年患者中用于减少病征和症状且抑制结构性损伤的进展，所述患者已对一种或多种DMARDs具有不足的应答。可以单独或者与MTX或其他DMARDs组合施用。
利妥希玛(作为销售)是针对CD20抗原的基因工程改造的嵌合鼠类/人单克隆抗体，所述CD20抗原在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现。抗体是IgG1κ免疫球蛋白，其包含鼠类轻链和重链可变区序列以及人恒定区序列。利妥希玛对于CD20抗原具有约8.0nM的结合亲和力。利妥希玛指示用于治疗具有复发或难治性、低级别或滤泡性、CD20阳性、B细胞非何杰金淋巴瘤的患者。以375mg/m 2 IV输注给予，每周1次，进行4或8剂。
司徒曼布(作为销售)是重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，其在基于细胞的测定(Kd＝5nM)中以高亲和力与人表皮生长因子受体2蛋白质HER2的细胞外结构域选择性结合。抗体是IgG1κ，其包含人构架区和与HER2结合的鼠类抗体(4D5)的互补性决定区。HERCEPTIN指示作为单一试剂治疗用于治疗具有转移性乳腺癌的患者，所述患者的肿瘤超表达HER2蛋白质，且其已接受用于其转移性疾病的一种或多种化学治疗方案。与紫杉醇组合的指示用于治疗具有转移性乳腺癌的患者，所述患者的肿瘤超表达HER2蛋白质，且其尚未接受用于其转移性疾病的化学治疗。推荐剂量是作为90分钟输注施用的4mg/kg司徒曼布的起始负荷剂量，和2mg/kg司徒曼布的每周维持剂量，如果起始负荷剂量充分耐受，那么所述维持剂量可以作为30分钟输注进行施用。
阿来组单抗(Alemtuzumab)(作为销售)是重组DNA衍生的人源化单克隆抗体(Campath-1H)，其针对21-28kD细胞表面糖蛋白CD52。阿来组单抗与CD52结合，所述CD52是非调节抗原，存在于基本上所有B和T淋巴细胞、大多数单核细胞、巨噬细胞和NK细胞、粒细胞亚群、和雄性生殖***组织的表面上。Campath-1H抗体是具有人可变构架区和恒定区、以及来自鼠类(大鼠)单克隆抗体(Campath-1G)的互补性决定区的IgG1κ。Campath指示用于治疗患者中的B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)，所述患者已用烷化剂进行治疗并且具有失败的氟达拉滨治疗。Campath有效性的测定基于总体应答率。Campath最初以每天作为2小时IV输注施用的3mg给予；一旦耐受，日剂量应升高至10mg，并且持续直至耐受。一旦这个剂量水平耐受，那么可以开始Campath 30mg的维持剂量，并且每周施用3次，进行最高达12周。在大多数患者中，升高至30mg可以在3-7天内完成。
奥马珠单抗(Omalizumab)(作为销售)是重组人源化IgG1(κ)单克隆抗体，其与人免疫球蛋白E(IgE)选择性结合。奥马珠单抗抑制IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的高亲和力IgE受体(Fc(ε)RI)的结合。在具有Fc(ε)RI的细胞上的表面结合的IgE中的减少限制了变应性应答的介质释放程度。用奥马珠单抗治疗也减少特应性患者中的嗜碱性粒细胞上的Fc(ε)RI受体数目。奥马珠单抗指示用于具有中等到重度持续性哮喘的成年和青少年(12岁及以上)，所述成年和青少年具有针对常年性气源性致敏原的阳性皮试或体外反应性，并且其症状用吸入皮质类固醇无法足够控制。奥马珠单抗以150-375mg的剂量每2或4周SC施用。
依法珠单抗(Efalizumab)是免疫抑制的重组人源化IgG1κ同种型单克隆抗体，其与人CD11a结合。依法珠单抗与CD11a——白细胞功能抗原-1(LFA-1)的(α)亚单位结合，所述CD11a在所有白细胞上表达，并且减少CD11a的细胞表面表达。依法珠单抗抑制LFA-1与胞间粘附分子-1(ICAM-1)的结合，从而抑制白细胞与其他细胞类型的粘附。LFA-1和ICAM-1之间的相互作用促成多重过程的起始和维持，包括T淋巴细胞活化、T淋巴细胞与内皮细胞粘附、和T淋巴细胞迁移至炎症位点包括银屑病皮肤。淋巴细胞活化和运输至皮肤在慢性斑块状银屑病的病理生理学中起作用。在银屑病皮肤中，ICAM-1细胞表面表达在内皮和角质形成细胞上是上调的。CD11a也在B淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、天然杀伤细胞和其他白细胞的表面上表达。因此，存在依法珠单抗影响除T淋巴细胞外的细胞的活化、粘附、迁移和数目的可能性。的推荐剂量是单次0.7mg/kg SC条件剂量，随后为每周1mg/kg的SC剂量(最大单次剂量不超过总共200mg)。
在另一个实施方案中，本发明的细胞系稳定转染或以其他方式工程改造，以表达非免疫球蛋白衍生多肽，但其包含在含Fc蛋白质的定义内。
编码本发明的抗体和蛋白质的核酸可以以本领域众所周知的几种方法来获得。在一个方面，抗体方便地得自通过用本发明的肽免疫接种小鼠制备的杂交瘤。抗体因此可以使用本领域众所周知的任何杂交瘤技术来获得，参见例如，Ausubel，等人，编辑，CurrentProtocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)；Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor，NY(1989)；Harlow和Lane，antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan，等人，编辑，Current Protocolsin Immunology，John Wiley&Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science，JohnWiley&Sons，NY，NY，(1997-2001)，所述参考文献各自整体引入本文作为参考。
在衍生抗体的靶结合部分、一般地抗体的可变重链和/或轻链结构域的另一种方便方法中，这些部分选自在例如噬菌体文库中制备的此种结合结构域文库。噬菌体文库可以通过***包含目的序列的随机寡核苷酸文库或多核苷酸文库来制备，例如来自免疫接种的动物或人的B细胞(Smith，G.P.1985.Science 228：1315-1317)。抗体噬菌体文库包含在1个噬菌体中的重(H)和轻(L)链可变区对，从而允许表达单链Fv片段或Fab片段(Hoogenboom，等人2000，Immunol.Today 21(8)371-8)。可以操作噬菌粒文库的多样性，以增加和/或改变文库的单克隆抗体的免疫特异性，以产生且随后鉴定另外的所需人单克隆抗体。例如，重(H)链和轻(L)链免疫球蛋白分子编码基因可以随机混合(改组)，以在装配的免疫球蛋白分子中产生新HL对。此外，任一或两种H和L链编码基因可以在免疫球蛋白多肽的可变区的互补性决定区(CDR)中进行诱变处理，并且随后就所需亲和力和中和能力进行筛选。抗体文库也可以这样合成制备：通过选择一种或多种人构架序列，且引入衍生自人抗体谱的CDR盒集合，或通过设计的变化(Kretzschmar和von Ruden 2000，Current Opinionin Biotechnology，13：598-602)。多样性位置不限于CDRs，还可以包括可变区的构架区段，或可以包括除抗体可变区外，例如肽。
可以包括除抗体可变区外的靶结合组分的其他文库是核糖体展示、酵母展示和细菌展示。核糖体展示是将mRNAs翻译成其关联蛋白质，同时使蛋白质保持与RNA附着的方法。核酸编码序列通过RT-PCR进行回收(Mattheakis，L.C.等人1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，9022)。酵母展示基于膜结合α-凝集素酵母粘着受体——aga1和aga2的融合蛋白的构建，所述受体是接合型***的部分(Broder，等人1997.Nature Biotechnology，15：553-7)。细菌展示基于靶与输出的细菌蛋白质的融合，所述细菌蛋白质与细胞膜或细胞壁结合(Chen和Georgiou2002.Biotechnol Bioeng，79：496-503)。
与杂交瘤技术相比较，噬菌体和其他抗体展示法提供在体外操作针对抗原靶选择的机会，且无宿主对抗原的作用或反之亦然的可能性的限制。
宿主细胞
本文描述的宿主细胞包含能够产生特异性抗体的宿主细胞，所述特异性抗体在所述抗体的寡糖含量中具有限定的唾液酸含量。
与由连续基因组DNA序列转录的大多数基因不同，抗体基因由在种系中可能广泛分开的基因区段装配。特别地，重链基因由3个基因组区段重组形成，所述3个基因组区段编码抗体的可变(V)、多变(D)和连接(J)/恒定(C)区。功能轻链基因通过使2个基因区段连接而形成；一个编码V区和另一个编码J/C区。重链和κ轻链基因座包含许多V基因区段(估计在100s和1000s之间)，估计跨越远超过1000kb。相比之下，λ基因座小得多，并且已显示在小鼠中在染色体16上跨越约300kb。它由2个可变基因区段和4个连接/恒定(J/C)区基因区段组成。功能基因的形成需要V和J/C元件之间的重组。
在其中抗体天然产生的B细胞中，重排的重和λ轻链基因的转录控制依赖于V区上游的组织特异性启动子和位于J-C内含子中的组织特异性增强子的活性。这些元件协同发挥作用。此外，在κ轻链基因座中已鉴定了第二个B细胞特异性增强子。这个进一步的增强子位于Cκ的9kb下游。因此，固定抗体表达基因的杂交瘤方法依赖于亲本B细胞谱系的内源启动子和增强子序列。可替代地，本发明的核酸可以通过在宿主细胞中打开(通过操作)而在宿主细胞中表达，所述宿主细胞包含编码本发明的抗体的内源DNA。此种方法是本领域众所周知的，例如，如美国专利号5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中描述的，所述专利整体引入本文作为参考。
抗体基因组DNA克隆到人工载体内是产生能够表达抗体的宿主细胞的另一种方法。然而，单克隆抗体在强启动子后的表达增加鉴定高生产细胞系且获得单克隆抗体的更高得率的机会。本发明的抗体可以在宿主细胞转染瘤中产生，其中使用例如重组DNA技术和基因转染法的组合，如本领域众所周知的(例如，Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的***是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、酵母和杆状病毒***以及转基因植物和动物。本领域可用于表达异源多肽完整糖基化蛋白质的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、NSO小鼠黑素瘤细胞和衍生细胞系，例如SP2/0、YB2/0(ATC CRL-1662)大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾细胞(HEK)、人胚视网膜细胞PerC.6细胞、hep G2细胞、BSC-1(例如，ATCC CRL-26)，以及可从例如美国典型培养物保藏中心，Manassas，Va(www.atcc.org)获得的许多其他细胞。常见的优选细菌宿主是大肠杆菌(E.coli)。
哺乳动物细胞例如CHO细胞、骨髓瘤细胞、HEK293细胞、BHK细胞(BHK21，ATCC CRL-10)、小鼠Ltk-细胞和NIH3T3细胞已频繁地用于异源基因的稳定表达。细胞系例如Cos(COS-1 ATCC CRL 1650；COS-7，ATCC CRL-1651)和HEK293常规地用于重组蛋白质的瞬时表达。
由于其高表达率，用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括骨髓瘤细胞，例如Sp2/0、YB2/0(ATC CRL-1662)、NSO和P3X63.Ag8.653(例如SP2/0-Ag14)。特别地，对于与NSO骨髓瘤细胞的使用，另一种优选表达***是在WO 87/04462、WO 89/01036和EP338,841中公开的GS基因表达***。当编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，抗体通过下述进行生产：使宿主细胞培养足够时间段，以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地，抗体分泌到其中宿主细胞生长的培养基内。抗体可以使用标准蛋白质纯化法从培养基中回收。
因为通过使用例如药物氨甲蝶呤(MTX)(R.J.Kaufman，1990.MethodsEnzymol.185：537-566)掺入可选择、可扩增标记DHFR使得能够扩增目的基因，所以CHO-K1和DHFR-CHO细胞DG44和DUK-B11(G.Urlaub，L.A.Chasin，1980.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77，4216-4220)用于高水平蛋白质生产。DHFR-CHO细胞可以成功地用于以高水平生产重组mAbs。DHFR-CHO可以以80-110mg 106细胞-1天-1或超过200mg 106细胞-1天-1的速率生产抗-MCP-1抗体。多种启动子已用于获得H-和L-链在这些CHO细胞中的表达，例如b-肌动蛋白启动子、人CMV MIE启动子、Ad病毒主要晚期启动子(MLP)、RSV启动子和鼠类白血病病毒LTR。用于mAb表达的许多载体在文献中得到描述，其中2条Ig链由具有独立可选择/可扩增标记的2种不同质粒携带。包含与DHFR标记连接的一条抗体链例如H-链的载体，和具有Neor标记的L-链表达盒或反之亦然，可以用于获得在旋转烧瓶中最高达180mg人源化mAb L-17天-1。用于起始选择和后续扩增的方法可以改变，并且是本领域技术人员众所周知的。一般而言，高水平mAb表达可以使用下述步骤获得：候选克隆的起始选择和后续扩增、共选择(例如，在其中H-链和L-链表达载体都携带DHFR表达单位的情况下)和扩增、使用不同可扩增标记的共扩增、以及在大量培养中的起始选择和扩增、随后为稀释克隆以鉴定个别高表达克隆。因为整合位点可以影响H-链和L-链表达以及总体mAb表达的效率，所以已产生了其中2个Ig-链表达单位串联放置的单个载体。这些载体还携带显性选择标记例如Neor和DHFR表达盒。关于综述，参见Ganguly，S.和A.Shatzman.ExpressionSystems，mammalian cells IN：Encyclopedia of BioprocessTechnology：Fermentation，Biocatalysis，and Bioseparation.1999 by John Wiley &Sons，Inc.。
Cockett等人(1990.Bio/Technology 8，662-667)开发了GS***用于在CHO细胞中高水平表达异源基因。包含cDNA(在hCMV启动子的转录控制下)和GS小基因(在SV40晚期启动子的控制下)的表达载体转染到CHO-K1细胞内(随后为用20mM-500mM MSX选择)可以用于产生表达本发明的抗体的克隆，其得率与DHFR-CHO***的那种可比较。GS***与欧洲专利号0 216 846、0 256 055和0 323 997以及欧洲专利申请号89303964.4结合整体或部分进行讨论。
尽管已以概括地描述了本发明，但本发明的实施方案将在下述实施例中进一步公开。
实施例1：抗体的半乳糖基化和唾液酸化的酶促修饰
为了经由酶促方法使纯化的抗体样品半乳糖基化，将得自SigmaChemical Co.(St.Louis，MO)的牛β-1，4-半乳糖基转移酶(β1，4GT)和UDP-Gal加入抗体样品中。重组大鼠肝α-2，3-唾液酸转移酶(α2，3ST)、重组α-1，3-半乳糖基转移酶(α1，3GT)和CMP-Sia得自Calbiochem(SanDiego，CA)。PNGase F得自New England Biolabs(Beverly，MA)或Prozyme(San Leandro，CA)或Selectin BioSciences(Pleasant Hill，CA)。来自肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)的β-半乳糖苷酶和β-氨基葡糖苷酶(β-glucosaminidase)得自ProZyme或Selectin BioSciences。来自牛肾的β-半乳糖苷酶和所有其他酶来自ProZyme或SelectinBioSciences。NAP-5和HiTrap A蛋白柱来自Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)。所有其他试剂是分析等级的。
制备酶促去糖基化形式(称为Gno)的Ab1，以充当缺乏Fc免疫效应子功能的对照抗体。这种变体这样进行制备：通过在100mM MES缓冲液(pH 7.0)中获取Ab1(溶于1.0mL缓冲液的～10mg)，并且用1000U PNGase F在37℃将其处理24小时。加入酶的另一个等分试样，并且使温育继续另外24小时。去糖基化Ab1使用HiTrap A蛋白柱进行纯化，并且配制到PBS，pH 7.0内。Gno糖形通过MALDI-TOF-MS进行表征，以证实去糖基化。
除了实验室操作的Ab制剂外，也比较了在唾液酸含量中天然不同的Ab小批，在本文中称为‘天然变体’。在来自原始批的材料缓冲液更换到PBS内后，将未修饰的抗体命名为Ab1 PBS。其中对的成员在Fc唾液酸化程度方面不同的人IgG1单克隆Abs——Ab1和Ab3，看起来是由于用于制备其的不同生产过程(但通过相同宿主细胞类型生产)。Ab1变体Ab1-20和Ab1-29分别包含20％和29％唾液酸化的聚糖，并且Ab5变体Ab5-20和Ab5-26分别包含0％和26％唾液酸化的聚糖。在其他方面，每个对的成员都具有相同的氨基酸序列、相同水平的Fc岩藻糖基化和二等分GlcNAc含量(MALDI-TOF质谱分析法分析)、以及相同低水平的Ab聚集(通过SEC-HPLC分析＜1％)。
在各种生物测定中使用的Ab和含Fc蛋白质制剂的概括以及其中它们衍生的方式概括于表1中。
表1.在本文中使用的含Fc测试蛋白质制剂的概括列表
亲本抗体 特异性变体 ％唾液酸化 描述
Ab1 - - 抗-TNF人IgG1抗体
未修饰的Ab1，Ab1-29 29 在最初制剂中，天然唾液酸变体
Ab1Gno N.A. 酶促去糖基化
Ab1PBS 29 未修饰的，缓冲液更换到PBS内
Ab1-20 20 天然唾液酸变体
Ab1MAAB 43 与MAA凝集素柱结合
Ab1WGAB 32 与WGA凝集素柱结合
Ab1WGAR 40 由WGA凝集素柱滞留
Ab1WGAT 29 经过WGA凝集素柱
Ab1-WGAR-41 41 由WGA凝集素柱滞留
Ab1-WGAT-29 29 经过WGA凝集素柱
Ab1G2 0 酶促修饰至完全半乳糖基化
Ab1G2S2(hi) 95 酶促修饰至G2S2
Ab1G2S2(lo) 33 丧失大多数唾液酸的G2S2
Ab 2 - - 抗-TNF 人IgG1抗体
未修饰的Ab2 5％ 未修饰的在FcγRI结合中使用，图6
Ab2G2 0％ 修饰的；在小鼠PK研究中使用，图8
Ab2G2S2 ～90％ 修饰的；在小鼠PK研究中使用，图8
Ab2A1aAla 无关的 缺乏对于FcγR的亲和力的突变抗-TNF
Ab2GT-WGAT 5 经过WGA凝集素柱
Ab2GT-WGAR 67 半乳糖基化且与WGA凝
集素柱结合
Ab3 - - 对于细胞因子亚单位特异
Ab3(lo) 2 天然唾液酸变体
Ab3(hi) 42 天然唾液酸变体
Ab4 Ab4 - 小鼠IgG1(缺乏对于人FcγRI的亲和力)
Ab5 Ab5 结合异二聚细胞表面受体
Ab5-0 0 天然糖基化变体
Ab5-26 26 天然糖基化变体
FcP1 - - 含Fc-，非Ab蛋白质
未修饰的FcP1 5 未修饰的，用于PK，图8
FcP1G2S2 ～98 修饰至G2S2，用于PK，图8
测试样品全都包含人IgG1铰链、CH2和CH3结构域。Ab1、Ab2、Ab3和Ab5是具有人IgG1和κ恒定区的单克隆IgG Abs。Ab1是对于人TNF特异的全人Ab，和Ab2是对于人TNF特异的小鼠/人嵌合Ab。Ab3是对于异二聚促炎细胞因子的亚单位之一特异的全人Ab。所有4种Abs在转染的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞中表达。Ab5是针对异二聚细胞表面受体的亚单位的全人抗体。FcP1是包含人IgG1铰链、CH2和CH3结构域的二聚融合蛋白。
通过在37℃对溶于100mM MES缓冲液(pH 7.0)的IgG样品(溶于1.0mL缓冲液中的～10mg)实施50毫单位β1，4GT、5μmol UDP-Gal和5μmol MnCl2 24小时来制备G2糖形。加入酶和UDP-Gal的另一个等分试样，并且使混合物在37℃下温育另外24小时。再次半乳糖基化的IgG样品使用HiTrap A蛋白柱进行纯化。寡糖通过PNGase F得到释放，并且如下所述通过MALDI-TOF-MS和HPLC进行表征。
根据制造商建议的规程，通过使用NAP-5柱将IgG样品放入100mMMES缓冲液(pH7.0)(溶于1.0mL缓冲液中的～10mg)内来制备G2S2糖形。向这种溶液中加入各50毫单位的β1，4GT和α2，3ST以及各5μmol的UDP-Gal、CMP-Sia(NANA同分异构体)和MnCl2。使混合物在37℃下进行温育。在24小时后，加入酶的另一个等分试样连同核苷酸糖，并且使混合物在37℃下温育另外24小时。IgG样品的G2S2糖形如上所述进行纯化。对于1个特别的Ab1 G2S2批次——Ab1 G2S2(lo)，最初附着的唾液酸随后在贮存过程中丧失，可能是由于污染性唾液酸酶。分析显示在Ab1 G2S2(lo)中仅30％的Fc寡糖包含唾液酸，而在Ab1 G2S2(hi)中～95％的寡糖包含唾液酸。
Ab制剂的聚糖结构通过各种方法进行分析。为了执行完整IgG Abs的MALDI-TOF-MS分析，将IgG样品放入10mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.0内，并且将浓度调整至～1mg/mL缓冲液。使约2μl IgG溶液与2μl基质溶液(通过使10mg芥子酸(sinnapinic acid)溶解于包含0.1％三氟乙酸的水中的1.0ml 50％乙腈中制备基质溶液)混合，并且将2ml这种溶液装载到靶上，且允许风干。使用来自Applied BioSystems(Foster City，CA)的Voyager DE仪器获得MALDI-TOF-MS。
为了执行释放的Fc聚糖的MALDI-TOF-MS分析，在体外糖基化反应前和后的IgG样品(～50μg)在10mM Tris-HCl缓冲液(50μl)pH 7.0中于37℃用PNGaseF消化4小时。消化通过用50％乙酸(～5μl)使反应混合物酸化得到终止，并且随后经过阳离子交换树脂柱，如先前所述(Papac等人，1996；Papac等人，1998；Raju等人，2000)。包含酸性和中性寡糖的混合物的这些样品通过MALDI-TOF-MS以阳离子和阴离子模式进行分析，如其他地方描述的(Papac等人，1996；Papac等人，1998；Raju等人，2000)，其中使用来自Applied BioSystems(FosterCity，CA)的Voyager DE仪器。
通过在10mM Tris-HCl缓冲液(～50μl)pH 7.0中于37℃用PNGase F使IgG样品(～50μg)消化4-8小时来完成Fc聚糖的HPLC分析。释放的寡糖用邻氨基苯甲酸(2-氨基苯甲酸)的衍生化如所述的(参见AnumulaKR，Anal Biochem.2000 Jul 15；283(1)：17-26)进行。简言之，首先制备溶于甲醇的4％乙酸钠3H2O(w/v)和2％硼酸(w/v)溶液。随后通过使～30mg邻氨基苯甲酸(Aldrich)和～20mg氰基硼氢钠(Aldrich)溶解于1.0ml甲醇-乙酸钠-硼酸溶液中新鲜制备衍生化试剂。在1.6ml具有“O”环的聚丙烯螺丝帽冷冻小瓶(Sigma)中，使IgG衍生的寡糖(在20-50μl水中＜3nmol)与0.1ml邻氨基苯甲酸(AA)试剂溶液混合，并且紧紧地盖上盖子。使小瓶在烤箱或加热块(Reacti-Therm，Pierce)中于80℃加热1-2小时。使小瓶冷却至室温后，用水稀释样品以使体积达到～0.5ml。衍生化的寡糖通过使用NAP-5柱进行纯化。
实施例2：与低亲和力细胞Fc受体的结合
在效应细胞上的几种类型的Fc受体中，Fcγ类型II和III视为低或中等亲和力受体。一般地，单体结合可以具有太低以致于无法检测的亲和力或处于极低水平。例如，与Fcγ类型IIA结合的单体IgG更难以测量。这些受体发挥作用以结合免疫复合物，这由于其多价性质更抗体亲抗原性地结合，推测是由于复合物的慢解离速率。
表达FcγRIIA作为唯一Fcγ受体的人K562细胞在2类结合测定中使用，以测试Fc聚糖的唾液酸含量中的变化是否影响与这种低亲和力人Fcγ受体的结合。为了获得与FcγRIIA结合的足够抗体亲抗原性，所述FcγRIIA对于单体IgG具有低亲和力，通过使抗TNF测试Abs与同三聚TNF以2∶1摩尔比混合来制备免疫复合物，所述比显示导致仅痕量的游离Ab或游离TNF。在单独与K562细胞结合的放射性标记的Ab在最高达1ug/ml的浓度下无法检测，而Ab2:TNF复合物在0.02ug/ml下显示出显著结合(数据未显示)时，举例说明了对于免疫复合物的依赖。
竞争结合形式。制备2组IgG免疫复合物，包含与抗V区特异性非人Ab和Ab5复合的、具有无关特异性的人IgG1抗体的标记的复合物。为了产生标记的复合物，如先前所述(Knight等人，1993)，使用IODO-GEN试剂，使具有仓鼠V区与人IgG1和轻链κ恒定区的嵌合单克隆Ab碘化。随后使对于仓鼠-人嵌合体的V区独特型特异的大鼠IgG2a单克隆Ab在PBS中以1∶1摩尔比混合30分钟，以允许形成放射性标记的免疫复合物。大鼠抗Id显示未直接促成FcγRIIA结合，因为当复合物用去糖基化仓鼠-人嵌合体制备时，发生很少的结合；而具有未修饰的嵌合Ab的复合物显示高水平结合(数据未显示)。此外，在用于制备分开的免疫复合物的试剂之间不存在可检测的交叉反应性，这可能指示一种免疫复合物可能与另一种免疫复合物结合(数据未显示)。
对于测试复合物，使Ab1的唾液酸变体与人TNF同三聚体以2∶1摩尔比(通过光散射分析显示导致极少未结合的Ab加上未结合的TNF)在PBS中在室温混合30分钟。在一组实验中，具有20和29％唾液酸的Ab1天然变体的复合物彼此进行比较。在第二组实验中，使Ab1-29:TNF复合物与凝集素柱增强的制剂Ab1-43:TNF复合物进行比较。在2种情况下，对照复合物是Ab1-Gno:TNF，其中抗体已酶促去除聚糖。
人K562细胞以3×105细胞/孔在IMDM，5％FBS中接种到96孔板中。将固定量的放射性标记的抗体复合物加入各种量的测试抗体复合物中，并且将组合的混合物加入K562细胞中，从而使得每个孔包含终浓度0.1μg/ml的碘化抗体复合物。使板在4℃温育16-18小时，这之后通过用IMDM，5％FBS洗涤3次去除未结合的Ab，并且使用γ计数器测定与细胞结合的计数数目。
结果。渐增量的未标记的竞争免疫复合物渐增地抑制经由放射性标记的免疫复合物的结合。唾液酸变体，未修饰的Ab1(29％唾液酸化的)和Ab1 MAAB(43％唾液酸化的)显示，具有更高唾液酸化的Ab的复合物需要在具有更少唾液酸化的Ab1的复合物的5-10倍的浓度以产生与FcγRII相同程度的结合(图4A)。对于相差9％唾液酸含量(20与29比较)的Ab1的天然变体，差异对于较少唾液酸化的制剂是高约4倍的抗体亲抗原性(未显示)。因此，由于在鼠类骨髓瘤宿主细胞中的重组表达，在这种人IgG1上NGNA同分异构体形式的唾液酸的存在，减少免疫复合物对于人FcγRII的抗体亲抗原性。
免疫复合物与K562细胞的结合。使Ab1测试样品与125I标记的人TNF以固定的2∶1摩尔比混合，然后将各种量的所产生的免疫复合物加入在96孔培养板中的3×105K562细胞中。Ab1 G2:TNF复合物(未唾液酸化的Ab)与Ab1 G2S2(hi):TNF复合物(完全唾液酸化的Ab)的比较显示，完全唾液酸化的Ab以少得多的抗体亲抗原性结合，而更高唾液酸化的变体需要在脱唾液酸化的变体的10倍浓度以达到相同程度的结合(图4B)。这些结果指出通过体外酶促修饰引入的NANA同分异构体的唾液酸的存在，减少抗体对于人FcγRII的抗体亲抗原性，这可能可归因于与靶(TNF)的结合亲和力中的减少，从而使得Ab:TNF复合物更不稳定，通过减少恒定区对于Fc受体的亲和力，或两者。
Ab与细胞FcγRIIIa的结合。为了分析Ab与天然杀伤细胞(NK)上的FcγRIIIa的结合，如上所述分离人PBMCs，并且通过磁法细胞分选使用NK Cell Isolation Kit(MiltenyiBiotec)从PBMCs中分离出NK细胞。NK细胞以1×105细胞/孔在96孔板中在具有10％FBS的DMEM培养基中在37℃与5％CO2下培养过夜。抗-FcγRIIIa mAb 3G822(BDBiosciencesPharmingen)使用Iodogen管(Pierce)用125I标记至11μCi/μg的比活性。使碘化的mAb 3G8与各种量的未标记的竞争Ab在DMEM，10％FBS中预混合，并且将Ab混合物加入NK细胞中，共0.3μg/ml碘化3G8的终浓度。细胞在4℃温育16小时，然后通过用PBS洗涤4次去除未结合的IgG。使用γ计数器测定与细胞结合的CPMs数目。
已在补充有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10％FBS(U-937培养基)的RPMI 1640培养基中培养的U-937细胞(未预处理以增强FcγR表达)接种到96孔板内，以具有在50μlU-937培养基中的3×105细胞/孔。Ab2(人IgG1)用125I标记至17μCi/μg的比活性。使碘化的Ab2 Ab与各种量的未标记的竞争Ab2样品在U-937培养基中预混合。然后将50μl Ab混合物加入50μl U-937细胞中，以在所有孔中具有0.2μg/ml碘化Ab3的终浓度。细胞在4℃温育16小时，并且通过用U-937培养基洗涤3次去除未结合的Ab。使用γ计数器测定与细胞结合的CPMs数目。
为了测试Ab变体是否对于FcγRIIIa显示出差别亲和力，从健康人供体中分离出新鲜分离的NK细胞，并且用于涉及放射性标记的mAb3G8、与Fc竞争结合的抗-FcγRIIIa Ab和未标记的Abs作为竞争者的竞争结合实验。使用游离的未复合的Abs代替免疫复合物(这一般显示与FcγRIIIa大得多的结合)，从而使得结果将不被可溶性免疫复合物自身稳定性中的差异混淆，这可以受Fc唾液酸含量的影响(我们未公开的数据)。结果显示Ab1更高唾液酸化的天然变体Ab1-29对于NK细胞上的FcγRIIIa具有减少的亲和力，需要在Ab1-20的4倍的浓度以达到相同程度的结合(图5A)。存在与Ab5的天然变体的相似差异，而Ab5-26需要在Ab5-0的5倍的浓度以针对mAb 3G8竞争至相同程度(图5B)。当使用来自至少2个其他血液供体的NK细胞时，在每个实验中获得相似结果(数据未显示；未测定FcγRIIIa同种异型)。这些结果显示更高水平的唾液酸化可以减少IgG对于FcγRIIIa的亲和力，并且因此，几乎必然促成所观察到的ADCC活性中的减少。
然而，当用通过凝集素分级分离衍生的变体对来执行相同实验时，更高唾液酸化的变体看起来也同样好地结合FcγRIIIa，并且可能比更少唾液酸化的变体略微更佳(图5C和5D)。关于用2对天然变体和2对凝集素衍生变体的不同结果的原因未知，但良好的可能性是在存在的唾液酸残基位置中存在差异。
实施例3：体外ADCC测定
用于抗-TNF Ab的靶细胞包含Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系，其在其表面上稳定表达重组人TNF，由于成熟TNF的氨基酸1-12缺失的引入，所述重组人TNF保持跨膜形式(Perez等人，1990)。K2细胞在包含热灭活FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸和MHX的Iscove氏培养基中进行培养。培养基和补充剂购自Gibco(Invitrogen)。细胞每2-3天进行1∶5传代。在测定当天，K2细胞进行离心且用PBS洗涤1次。细胞用培养基调整至约1×106细胞/ml，并且将15微升BATDA荧光标记试剂(在Delfia EuTDA CytotoxicityReagentKit中，Perkin-Elmer Life Sciences)加入5ml细胞中(Blomberg等人，1996)。使细胞在37℃温育30分钟，然后用PBS在1000rpm、5分钟下洗涤2次。紧在与PBMC效应细胞混合前，使靶细胞离心，且以2×105细胞/ml重悬浮于包含1％BSA的Iscove氏培养基中。
将血液收集到肝素化vacutainers内后，从健康供体中分离出PBMC效应细胞，并且用PBS稀释2倍。使30ml稀释血液在50ml锥形管中的15ml Ficoll-Paque(Amersham，Uppsala，瑞典)上成层，并且在1500rpm、30分钟下在室温(RT)离心。收集包含PBMCs的界面(暗黄覆盖层)，并且用PBS洗涤2次，且在1200rpm、10分钟、RT下离心。使细胞重悬浮于包含5％热灭活FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和0.1mM非必需氨基酸的Iscove氏培养基中。通过在100mm组织培养皿(Corning)上温育，使PBMCs在37℃、5％CO2活化约4小时，所述组织培养皿已用OKT3(溶于PBS的10ug/ml，Ortho Pharmaceutical)在4℃下包被过夜，并且用PBS冲洗。收集PBMCs，用包含1％BSA的Iscove氏培养基洗涤1次；计数且重悬浮至约1×107细胞/ml。
Ab1的测试样品，包括阴性对照变体Ab1 Gno，在Iscove氏-1％BSA培养基中进行系列稀释。将50微升靶细胞(～10,000)和100微升抗体加入圆底96孔板(Corning)中。将五十(50)微升效应细胞(～500,000细胞)加入混合物中，并且使板在1000rpm下离心5分钟，RT。E∶T比通常是约50∶1，然而，有时使用35∶1。对于背景荧光，使孔与效应细胞、靶细胞和培养基一起温育。对于最大限度荧光，将10微升裂解溶液(来自Delfia EuTDA Cytotoxicity试剂盒)加入背景孔中。对于ADCC测定，使细胞在37℃、5％CO2下温育约2小时。将20微升上清液转移至96孔平底板(Corning)中。加入200微升铕溶液(Delfia EuTDACytotoxcity Kit)，并且将板放置在板振荡器上在RT下10分钟。在时间分辨荧光计，EnVision Instrument(Perkin-Elmer Life Sciences)中测量荧光。在每种样品中的特异性裂解百分比根据下式进行计算：％特异性释放＝([实验释放-自发性释放]÷[最大限度释放-自发性释放])×100。
唾液酸作用的最初评估集中于2对天然变体的体外ADCC活性上。Ab1-29和Ab1-20以各种浓度与铕标记的、Ag1表达靶细胞进行温育。如图6A中所示，存在细胞毒性活性中的明显差异，其中具有更高水平Fc唾液酸化的Ab1-29需要在Ab1-20的7倍的浓度以触发细胞裂解至相同程度。结果显示就唾液酸化糖形富集的Ab1小批——Ab1 MAAB比未修饰的Ab1PBS更不有效。需要约3倍的Ab1 MAAB-43％材料，以达到与Ab1 PBS-29％样品相同的裂解量。用Ag5表达靶细胞的实验显示对于Ab2天然变体对的相同模式。为了达到与无可检测唾液酸的Ab2-0变体相同程度的细胞裂解，需要约6倍浓度的Ab2-26(如图6B中所示)。因此，天然糖基化变化对这种ADCC测量的作用不是Ab或靶特异性的。
在比较Ab1小批的ADCC活性的代表性实验中，在基于凝集素的分级分离后，所述Ab1小批在其唾液酸含量中不同，Ab1 MAAB(43％唾液酸化的)与它由其衍生的未修饰的Ab1批次(Ab1 PBS)进行比较。在比较在唾液酸含量中不同的Ab1小批的第二种实验中，Ab1WGAT(29％唾液酸化的)、Ab1 WGAR(40％唾液酸化的)和Ab1 WGAB(32％唾液酸化的)彼此进行比较。
测定结果也证实在唾液酸含量和ADCC测定中的效力之间的反相关，与其中Ab制备的方式无关(图6C)。即，包含与未修饰Ab1约相同唾液酸量的Ab1 WGAT，显示与未修饰Ab1相同的活性。然而，随着增加的唾液酸含量，WGA制备的级分丧失效力(图6C)。
在实验中，比较在唾液酸含量中具有更显著差异的2种样品——酶促修饰的Ab1G2(0％唾液酸化的)和Ab1 G2S2(hi)(～95％唾液酸化的)。通过在Ficoll-Paque中密度离心分离新鲜的PBMCs。在100ml体积中的5×105PBMCs与各种量的未处理Ab1、Ab1 G2S2(hi)(完全半乳糖基化和唾液酸化的)或Ab7——同种型匹配的阴性对照Ab一起预温育约10分钟。通过用200mCi51Cr标记，表达表面结合的重组人TNF的K2细胞用作靶。将标记的细胞加入PBMC/Ab混合物中，在1000rpm下离心1分钟，并且在37℃温育4小时。这个温育时间(4小时)已知揭示由NK细胞(在PBMC细胞群体内)而不是由巨噬细胞诱导的主要细胞裂解，所述NK细胞表达FcγRIIIA，所述巨噬细胞一般表达FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIIIA(CD16A)。随后使用Topcount测定细胞上清液中的放射性数目。所示结果(图6D)代表使用来自不同供体的PBMCs执行的2次独立实验，且显示在完全唾液酸化的Ab和几乎去唾液酸化的Ab之间在细胞裂解效力中超过10倍的改变。
其他Ab制剂对也在ADCC测定中进行比较。由半乳糖基化的Ab2制备的WGA凝集素级分在ADCC测定中使用Ag2表达靶细胞进行评估。再一次，更高唾液酸化的材料更少活性，虽然在其EC50值中仅存在4倍差异，尽管其在唾液酸含量(5％与67％比较)中存在显著差异。通过比较，由Ab1制备的WGA凝集素级分显示41％唾液酸化的变体需要在29％唾液酸化变体约6倍的浓度以达到相同程度的细胞裂解。
关于测试的所有3种Abs的这些结果一致地显示更高水平的Fc唾液酸与减少的ADCC活性相关。ADCC活性和Ab制剂的唾液酸含量中的量级改变之间的差异尽管不是定量的，但在4种Ab1变体实验对象组内存在一致关系，其中EC50值对于Ab1-20、Ab1-29、Ab1-WGA-29和Ab1-WGA-41一般分别是0.3ng/ml、2ng/ml、2ng/ml和10ng/ml。用凝集素级分的结果也证实唾液酸化的Ab制剂包含具有不同水平的ADCC活性的分子种类。值得注意的是，除Ab3-0和Ab3-26外，本文分析的变体不倾向于显示达到的最大限度裂解水平中的差异。
因为测量ADCC活性的这种方法主要由FcγRIIIA阳性的NK细胞介导，所以数据暗示，虽然Fc寡糖中唾液酸的存在增强与FcγRI的结合，但它的存在显著减少与FcγRIIIA的结合。
实施例4：与高亲和力细胞Fc受体的结合
在唾液酸含量中不同的测试Abs与高亲和力人Fc受体FcγRI(CD64)的结合使用在U-937细胞——人单核细胞系上的竞争结合形式进行测量。U-937细胞在具有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10％FBS的RPMI 1640培养基中在T瓶中进行培养，并且维持在具有5％CO2的在37℃的培养箱中。Ab2，小鼠/人IgG1嵌合Ab使用IODO-Gen预涂覆碘化管碘化至17.2mCi/mg的比活性。U-937细胞以6×106细胞/ml用新鲜培养基进行重悬浮，并且随后以3×105细胞/孔的密度接种到具有滤器的Millipore 96孔组织培养板内。细胞未进行预处理以诱导更高的FcγR表达。使用培养基作为稀释剂，碘化的Ab2与各种量的未标记的Mab竞争者(测试样品)在50μl的体积中预混合。随后将混合物加入50μl U-937细胞培养物中，以给出0.2ng/ml的碘化Ab2终浓度。细胞随后在4℃温育16小时。使用板真空***通过用培养基洗涤且抽吸3次取出未结合的IgG。使用γ计数器测定与细胞结合的计数数目。
图7A显示与Ab1 G2(无唾液酸)相比较，Ab1 G2S2(hi)(～95％唾液酸化的)以高5-10倍亲和力与U-937细胞上的高亲和力FcR(CD64)结合，即，Ab1 G2S2(hi)需要在仅五分之一到十分之一的浓度，以给出碘化的Ab2结合相同程度的抑制。Ab1 G2显示与未处理的Ab1无可检测的差异(数据未显示)，后者是不同糖形的异质混合物，其中大多数包含比Ab1 G2样品更少的半乳糖(即，G0和G1糖形)。
图7B显示在荷电寡糖种类(含唾液酸种类)量中不同的2个不同Ab3批次，2％总寡糖或42％，类似地显示出表征为具有更高唾液酸含量的批次对于FcγRI具有更高的亲和力。
在对于Ab1和Ab5的2对天然糖基化变体观察到通过具有更高唾液酸含量的抗体制剂与NK细胞FcγRIIIa减少的结合后(实施例3，图5A和B)，考虑效应是由于带负电唾液酸和带负电细胞表面之间的简单静电推斥的可能性。然而，唾液酸含量对人U-937细胞上的FcγRI受体的结合亲和力的相反作用不遵循关于Ab5或其他Ab相同的模式(数据未显示)。
应当指出，虽然2种Ab1样品在唾液酸的NANA形式的不存在/存在方面不同，但2种Ab3样品被认为在唾液酸的NGNA形式量方面不同(在小鼠宿主细胞中产生)。
实施例5：血清半衰期的测量
在本实施例中，在小鼠骨髓瘤细胞中表达的包含与抗体可变区序列以及人IgG1铰链、CH2和CH3结构域融合的N末端肽的含Fc融合蛋白，进行处理以形成完全唾液酸化的(G2S2)形式。正常雌性CD1大鼠(4只/处理组)给予未修饰形式的FcP1的静脉内注射，所述未修饰形式的FcP1包含5％唾液酸化的Fc寡糖，或完全唾液酸化的形式(～98％唾液酸化的)单独静脉内注射到雌性CD1大鼠组内。在1小时、5小时、24小时、72小时、7天、14天和21天时，通过眶后放血收集血液，并且随后在第28天时通过从CO2麻醉动物中心脏穿刺获得终末血液收集。由血样制备血清，并且使用比色ELISA测量血清中的人Fc浓度。简言之，96孔EIA板首先用多克隆山羊抗人Fc抗体进行包被。使各种稀度的血清样品在孔中在室温温育1小时。通过洗涤取出未结合的蛋白质，并且使用酶缀合的山羊抗人IgG抗体，随后为合适的颜色底物检测结合的人Fc。
研究结果显示于图8中。计算的曲线下面积(AUC)对于未修饰的抗体是95±1.6天·ng/ml×10-3和48±1.9天·ng/ml×10-3。这显示Fc寡糖中更高程度的唾液酸化与正常大鼠中更快的清除率相关。
在第二种实验中，正常大鼠用单次3mg/kg剂量的Ab2进行注射，所述Ab2酶促修饰至完全脱唾液酸化(G2)或完全唾液酸化(G2S2)。如上所述使用比色ELISA监控且测量血清中的人Fc。这个实验的结果显示于图9中。在约1周时间段后，Ab2 G2S2开始更快速地从小鼠血清中清除，并且到20天时，血清中剩余的Ab2 G2S2为Ab2-G2浓度的约1/1000。
Ab1唾液酸变体从小鼠体循环中的清除。在注射包含与Ab1附着的聚糖种类的异质混合物的样品后，通过定量个别糖基化种类从血清的清除率来进行唾液酸含量作用的另一种直接测量。
将Ab1的相同异质糖基化制剂以20mg/kg的剂量i.p.注射到18只正常、8-10周大Balb/c小鼠内。在第3天时从6只小鼠中收集血液，另外6只在第14天时，和最后6只在第28天时。由每种血样制备血清，并且使用对于Ab1 V区特异的抗-Id亲和柱从血清再次纯化Ab1。然后通过HPLC分析来分析再次纯化的Ab1样品的Fc聚糖结构，并且如本文先前所述测定各种糖形的相对比例。
发现缺乏唾液酸的半乳糖基化糖形(G2S0)在小鼠中在4周时间段内维持其相对丰度，而包含具有1个唾液酸的聚糖的Ab糖形(G2S1)和具有2个唾液酸的糖形(G2S2)以更快速的速率清除。因此，完全唾液酸化的含Fc蛋白质具有比脱唾液酸化或部分唾液酸化的组成更短的血清半衰期。
实施例6：唾液酸含量和抗体的抗体亲抗原性
本文描述的结果支持Fc结构域(二聚的铰链-CH2-CH3)的Fc-聚糖的唾液酸含量中的改变将影响整个蛋白质的理论。就包含糖基化Fc的抗体和融合蛋白的二价而言，作用可以在蛋白质对于特定靶的抗体亲抗原性中证明。执行这个实施例中的实验以测试这个理论，并且进一步证实唾液酸含量对靶结合亲和力的特别作用。
与细胞表面抗原的结合。在上述ADCC测定中使用的相同Ag表达细胞系在结合测定中使用，以测试在其抗原结合抗体亲抗原性中唾液酸变体中的差异。测定以竞争形式进行，其中在各种量的未标记的测试Abs的存在下，保持在固定浓度的放射性标记的Abs(Ab1、Ab2或Ab5)之一与Ag表达细胞一起温育。通过Iodogen法制备的碘化的Abs一般为10uCi/ug的比活性。
表面TNF表达细胞以50,000细胞/孔，并且Ag2细胞以180,000细胞/孔在具有5％FBS的IMDM培养基中接种到96孔组织培养板中。使合适的125I-标记的Ab与滴定量(titrating amount)的测试Abs预混合，并且将混合物加入合适的Ag表达细胞中。板在RT温育2小时以允许Ab与细胞结合。细胞随后用IMDM、5％FBS洗涤3次，以取出未结合的Ab，并且使用γ计数器测定与细胞结合的计数数目。
对于Ab5变体，将Ag5表达细胞以186,000细胞/孔在50μl DMEM、10％FBS中接种到96孔组织培养板中。使125I-标记的Ab2与滴定量的测试Ab预混合，并且将50μl混合物加入Ag表达细胞中。板在4℃温育16小时以允许Ab与细胞上的抗原结合。细胞随后用DMEM、10％FBS洗涤3次，以取出未结合的Ab，并且使用γ计数器测定与细胞结合的计数数目。样品一式两份或一式四份地进行测试，并且所示结果代表3或4次独立实验。如通过额外平方和F检验测定的，在这些测试样品之间的结合中的差异是显著的(对于曲线a、c和d，P＜0.0001)。
结果显示于图10A-D中：在未标记的Ab1天然变体作为竞争者的存在下，通过放射性标记的Ab1与Ag1表达细胞的结合(图10A)；在未标记的Ab5天然变体作为竞争者的存在下，通过放射性标记的Ab5与Ag5表达细胞的结合(图10B)；在未标记的Ab1凝集素衍生变体作为竞争者的存在下，通过放射性标记的Ab1与Ag1表达细胞的结合(图10C)；在未标记的Ab3凝集素衍生变体作为竞争者的存在下，通过放射性标记的Ab3与Ag3表达细胞的结合(图10D)。
Ab与固相配体的结合。通过将溶于PBS的1μg/ml的50μl Ag或抗-Id Ab加入每个孔中，并且使板在4℃过夜温育，使重组可溶TNF或抗-Id2包被在EIA板上。洗涤孔并且随后用溶于PBS的50μl 1％BSA、0.125％明胶在RT预处理1小时，以使非特异性结合降到最低。125I标记的Ab1或125I标记的Ab3与滴定量的分别的测试Ab制剂在IMDM、5％FBS中预混合，并且将50μl混合物加入靶包被孔中。放射性标记的Ab的终浓度在所有孔中是100ng/ml。使板在RT温育2小时，以允许Ab与包被靶结合。洗涤孔以取出未结合的Ab，并且使用γ计数器测定与细胞结合的计数数目。
板包被的Ab与可溶性抗原的结合。96孔板用Ab1或Ab3的唾液酸变体进行包被，并且随后如下与各种量的放射性标记的可溶性抗原进行温育：(a)放射性标记的可溶性Ag1与板包被的Ab1天然变体的结合，(b)放射性标记的可溶性Ag1与板包被的Ab1凝集素分级分离的变体的结合，和(c)放射性标记的可溶性Ag3与板包被的Ab3凝集素分级分离的变体的结合。进行用放射性标记的Ag和100倍过量的未标记Ag的平行温育，以测定非特异性结合。样品一式三份地进行测试。由于可溶性Ag2不能利用，所以未分析Ab2变体。
统计学分析。抗体变体之间的效力中的差异通过比较曲线进行分析，其中使用同时4参数逻辑回归，其具有遵循关于斜率和范围的初步测试的共同最小值、最大值和斜率，所述初步测试关于零浓度给出共同的曲线的平稳段(即，对于递增曲线无测试的情况下总是假定共同“底”，和对于递减曲线无测试的情况下总是假定共同顶)。用在GraphPadPrismv4中的额外平方和F检验进行显著性测试。＜0.05的P值视为显著的。关于CPM的分析由CPM2相反地加权，因为CPM的标准差与其平均值成比例地增加(即，CPM变异系数，CV与平均值无关)。
结果
以竞争形式用在ADCC测定中使用的相同Ag表达靶细胞进行的抗原结合实验意外地显示，Ab1-29以Ab1-20的约1/3的亲和力一致地结合细胞表面抗原(图10A)。相比之下，Ab5-26显示与Ab5-0无法区分的亲和力(图10B)。用2对凝集素衍生变体执行的相同分析显示与Ab1天然抗体相似的结果，即，更高唾液酸化的Ab1-WGA-41需要在更少唾液酸化的Ab1-WGA-29的4-6倍的浓度以达到相同程度的竞争结合(图10C)，并且更高唾液酸化的Ab2-GT-WGA-67需要在更少唾液酸化的Ab2-GT-WGA-5的4-6倍的浓度(图10D)。
有趣的是，在分析与固定在96孔EIA板上的靶(可溶性重组抗原或抗-Id Ab)结合的实验中，也观察到经由具有更高量唾液酸化的Ab1和Ab2变体相同的降低的结合模式(图11A和B)。这些结果显示Fc唾液酸化程度中的差异可以影响与抗原以及与FcγRIIIA的结合，但唾液酸化的程度不影响所有Abs的抗原结合。
根据关于固定的靶结合的数据，认为增加的Fc唾液酸化可以用于减少Ab铰链区灵活度。在Ab1和Ab2与细胞表面抗原结合的情况下，减少的铰链灵活度可以导致与抗原更多的单价结合和更少的二价(高抗体亲抗原性)结合，这依赖于固体支持体或细胞表面上的抗原表位间隔。Ab5的铰链区也可以具有减少的灵活度，但灵活度对于这种Ab达到与Ag5的最大限度结合可能不是需要的。
为了区分Ab灵活度作用还是固有结合亲和力改变受Fc唾液酸化的影响，测试Ab与可溶性配体的结合作为纯粹单价结合亲和力的量度。结果事实上显示对于在与细胞表面抗原的结合中显示出差异的3对唾液酸变体，在其与可溶性靶的结合中在变体对之间未观察到可检测差异(图12A-C)。总之，这些结果证实与固定的靶(细胞表面或板包被的)的结合中的差异不是由于每个Fab臂和靶之间的固有亲和力中的差异。因此，在其与固定的靶结合中在Ab1和Ab2唾液酸变体之间的差异是由于与细胞的二价结合程度中的差异。
实施例7：用于分泌唾液酸酶的载体的制备
唾液酸酶表达质粒装配。编码产脲节杆菌唾液酸酶的催化结构域的核酸序列，GenBank登记号AY934539的残基40-535，基于那种序列合成。编码人生长激素信号序列-产脲节杆菌催化结构域融合物(具有信号序列作为前26个氨基酸和催化结构域作为其余494个氨基酸的SEQID NO：1)的合成基因(SEQ ID NO：2)克隆到质粒p2815中，其中使用独特的BamH I和Not I限制位点。这个质粒具有CMV启动子、关于人生长激素信号序列的编码序列以影响分泌、和用于稳定选择的新霉素抗性基因。关于与hGH信号编码序列连接的酶催化结构域的编码序列(SEQ ID NO：1)通过限制酶消化和测序加以证实。
瞬时和稳定转染。对于瞬时转染，使用Lipofectamine 2000用15ug纯化质粒p3629或对照质粒(空载体)转染HEK293细胞。质粒DNA和90uL Lipofectamine 2000在Optimem中进行稀释，组合，且随后在室温下温育20分钟。随后将转染混合物加入在生长培养基中的70％汇合的HEK293细胞中过夜。第二天，用293SFM培养基替换生长培养基，并且使细胞温育5天用于培养基收获和分析。对于稳定转染，使C168M细胞用10ug p3629电穿孔，所述p3629已通过用Bgl II限制酶切消化而线性化。转染的细胞维持在具有700ug/mL遗传霉素抗生素的生长培养基中，以选择稳定转化株。扩增抗生素抗性克隆，且就唾液酸酶进行测定。
唾液酸酶活性测定。唾液酸酶活性使用2’-(4-甲基伞形酮)-a-D-N-乙酰神经氨酸进行测定。关于来自活细胞培养的细胞上清液的荧光测定这样进行：在100mM柠檬酸-磷酸缓冲液，ph 6.5中，通过使其与200uL150uM 2’-(4-甲基伞形酮)-α-D-N-乙酰神经氨酸在37℃下混合，随后加入2mL 0.5M Na2CO3以终止反应。激发在366nm处进行，并且发射在446nm处进行。荧光测定单位针对活细胞计数进行标准化。可替代地，培养基中的唾液酸酶活性这样进行测定：通过使唾液酸化的Remicade与来自转染细胞的培养基过夜温育，且如下所述就唾液酸进行测定。
唾液酸测定。在与细胞培养上清液温育后，通过测定来自纯化抗体的唾液酸去除来测定唾液酸酶活性。通过在20mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0中在37℃下用PNGase F将IgG样品(1ml中的0.05-05mg)处理4-6小时释放N联寡糖。使这种溶液的等分试样(～0.01ml)经过包含阳离子交换树脂的柱，并且如先前描述的()通过MALDI-TOF-MS进行分析。对样品的其余部分实施用邻氨基苯甲酸的还原氨基化，并且如由Anumula所述通过HPLC后续分析。简言之，首先制备溶于甲醇的4％乙酸钠3H2O(w/v)和2％硼酸(w/v)溶液。随后通过使～30mg邻氨基苯甲酸(Aldrich)和～20mg氰基硼氢钠(Aldrich)溶解于1.0ml甲醇-乙酸钠-硼酸溶液中新鲜制备衍生化试剂。在1.6ml具有“O”环的聚丙烯螺丝帽冷冻小瓶(Sigma)中，使IgG衍生的寡糖(在20-50μl水中＜3nmol)与0.1ml邻氨基苯甲酸(AA)试剂溶液混合，并且紧紧地盖上盖子。使小瓶在加热块(Reacti-Therm，Pierce)中于80℃加热～1小时。使小瓶冷却至室温后，用水稀释样品以使体积达到～0.5ml。衍生化的寡糖如上所述进行纯化。
抗体纯化。由稳定转染的细胞表达的重组抗体通过A蛋白亲和层析进行纯化。细胞上清液用10X A蛋白缓冲液(0.2M Tris、1.4M NaCl、10mM EDTA，pH8.5)稀释至1X，并且在1mL A蛋白柱上进行纯化。在进一步分析前，将洗脱的抗体透析到PBS，pH 7.2内。
抗体依赖性细胞毒作用测定(ADCC)。通过用跨膜形式的Ag1和Ag3分别转染Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，在Centocor制备关于涉及Ab1和Ab3的测定的靶细胞。Ag1表达和Ag3表达细胞在包含热灭活FBS、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和0.1mM非必需氨基酸的IMDM培养基中进行培养。表达Ag2的贴壁细胞得自ATCC，且在包含10％FBS、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和0.1mM非必需氨基酸的DMEM培养基中进行培养。所有细胞每周传代2次，并且维持对数期生长。培养基和补充剂购自Gibco(Invitrogen)。
在测定当天，使Ab表达骨髓瘤靶细胞离心且用PBS洗涤1次。贴壁Ag2表达靶细胞用胰蛋白酶取出且洗涤2次。细胞用培养基调整至1×106细胞/ml，并且将15μl BATDA((二乙酰氧甲基)-2，2’：6’2”-三联吡啶-6，6”-二羧酸)荧光标记试剂(在Delfia EuTDACytotoxicity Kit中，Perkin-Elmer Life Sciences；Blomber，K.等人)加入5ml细胞中。使细胞在37℃下伴随偶尔振荡温育30分钟；随后用培养基洗涤2次。紧在与效应细胞混合前，使靶细胞离心，且以2×105细胞/ml重悬浮于培养基中。
从健康供体的肝素化血液中分离外周血单核细胞(PBMC)效应细胞。用磷酸缓冲盐水(PBS)稀释血样，并且通过在Ficoll-Hypaque(Amersham)上密度梯度离心分离PBMC。在离心后，收集PBMC，洗涤2次，并且在培养基中在37℃与5％CO2下维持过夜。在下一天，收集PBMC，洗涤且以1×107细胞/ml重悬浮于培养基中。
对于细胞毒性测定，将在100μl培养基中的抗体稀释物加入圆底96孔板中。以50∶1的效应∶靶细胞比，将50μl效应细胞和50μl BADTA标记的靶细胞加入Ab稀释物中。使板短暂离心，以使效应物和靶彼此接触，然后在37℃在5％CO2气氛中温育2小时。温育后，将20μl上清液转移至平底96孔板的孔中，并且将铕增强溶液(在DelfiaCytotoxicity试剂盒中)的200μl等分试样加入每个孔中。使板振荡10分钟后，在时间分辨荧光计(EnVisionInstrument，Perkin-Elmer)中测量荧光。特异性细胞毒性百分比计算为(实验释放-自发性释放)/最大限度释放-自发性释放)×100。自发性释放通过使靶与培养基代替效应细胞温育进行测定，并且最大限度释放通过使靶与10ul含毛地黄皂苷的裂解缓冲液(在DelfiaEuTDA Cytotoxicity试剂盒中)温育进行测定。
结果和讨论
构建表达载体p3629(图13)，并且允许在哺乳动物细胞中表达产脲节杆菌唾液酸酶A催化结构域。关于人生长激素前导序列的编码序列与酶的催化结构域可操作地连接，以迫使唾液酸酶A的细胞外分泌。HEK293细胞用表达质粒进行瞬时转染，并且收集上清液用于关于纯化的抗-TNFα抗体的唾液酸酶活性。抗体与来自p3629转染的细胞、或对照质粒转染的细胞的条件培养基温育过夜。在与条件上清液温育后，从抗体中释放的寡糖的HPLC分析在除从对照转染的亲本细胞系中释放的聚糖外的所有中都是无法检测的。因此，唾液酸酶活性仅存在于p3629转染的细胞上清液中，而不是对照转染的上清液中。
实施例8：抗体和唾液酸酶的共表达
这些研究的目的是产生能够将唾液酸酶分泌到培养基内的宿主细胞系，其可以用抗体编码序列进一步转染，从而产生将是去唾液酸化的糖基化抗体。表达抗体的小鼠骨髓瘤细胞系C168M用在实施例7中制备的载体p3629进行转染，并且就上清液中的唾液酸酶活性选择和筛选稳定克隆。如下表2中所示，在这个实验中荧光(MFU)测定的17个克隆中，6个是唾液酸酶活性阳性的，并且唾液酸酶表达在6周内持续，指示稳定克隆。
表2．
克隆编号 唾液酸酶活性-初步克隆 (MFU) 6周唾液酸酶活性 (MFU)
WT 0
1 0
2 0
3 332 7536
4 0
5 924 11544
6 0
7 0
8 0
9 0
10 -0
11 0
12 6307 23140
13 57 519
14 26
15 305 6408
16 0
17 942 1765
来自唾液酸酶A阳性克隆的纯化的抗体经由SDS-PAGE的进一步分析指出它们仍表达完整抗体，并且唾液酸酶的表达不影响表达水平。与具有几乎15％唾液酸的来自非唾液酸酶转染的宿主细胞的抗体相比较，抗体的碳水化合物分析指出所有克隆包含少于2％唾液酸(表3)。
表3.
唾液酸含量(％) 岩藻糖含量(％) ADCCEC40(ng/mL) ADCC最大裂解(％)
转染的对照 14.8 90 39.1 37.3
克隆3 1.6 94 5.7 64.3
克隆5 0.76 85 24.9 47.0
克隆12 1.3 92 45.2 41.9
克隆13 2.77 65 22.3 49.0
克隆15 1.36 80 55.2 41.8
克隆17 1.6 73 8.9 43.9
来自超表达唾液酸酶的克隆的低唾液酸抗体就与WT C168M相比较增强的ADCC活性进行测定(图14)。如表3中可见，一些样品显示比野生型抗-TNFα抗体更低的EC40s和更高的最大值分析，指出较低的唾液酸含量对这种抗体的生物学性质具有作用。
已设计了表达质粒，其将产脲节杆菌唾液酸酶A酶的催化结构域分泌到哺乳动物细胞培养基内。这种分泌的酶在细胞上清液中有活性，并且能够从抗体的Fc区中存在的N联寡糖中去除唾液酸残基。表达抗体的细胞系用这种表达构建体的稳定转染导致这样的克隆，其将唾液酸酶A活性连同抗体分泌到培养上清液内。从这些细胞培养物中回收的抗体包含较少的唾液酸，这转化为ADCC活性中的功能改善。这些结果提示该方法可以用于产生表达重组糖蛋白的宿主细胞，并且用于产生培养物用于最低限度唾液酸化的糖缀合物。
实施例9：唾液酸酶的CHO表达
CHO细胞是用于制备生物药物的重要宿主细胞。p3629(图13)质粒用于稳定转染CHO细胞系，所述CHO细胞系能够用载体进一步转染用于表达治疗蛋白质例如抗体。
使用FuGene 6(Roche，Inc.)，用30ug p3629转染CHO细胞(C1835A)，所述p3629已通过用Bgl II限制酶切消化而线性化。转染的细胞维持在具有700ug/mL遗传霉素抗生素(Invitrogen，Inc.)的生长培养基中，以选择稳定转染子。合并抗生素抗性克隆，扩增且就唾液酸酶活性进行测定。
使用荧光团对于来自活细胞培养的细胞上清液测定唾液酸酶活性。在100mM柠檬酸-磷酸缓冲液，pH 6.5中在37℃下，向200uL细胞上清液中加入150uM 2’-(4-甲基伞形酮)-α-D-N-乙酰神经氨酸，随后加入2mL 0.5M Na2CO3以终止反应。激发在366nm处进行，并且发射在446nm处进行。荧光测定单位(FU)通过使关于每种细胞系的个别荧光测定读数除以活细胞总数目进行标准化。如FU中测量的，培养基中的唾液酸酶活性显示于表4中。
表4.
因为在选择后3周和8周时的唾液酸酶活性保持恒定或随着时间过去增加，所以证实唾液酸酶稳定表达且分泌到培养上清液内。
显而易见的是本发明可以以与前述说明书和实施例中具体描述不同的方式进行实践。根据上文教导，本发明的众多修饰和变化是可能的，且因此在附加权利要求的范围内。
<110>CENTOCOR，INC.
<120>用于产生脱唾液酸化免疫球蛋白的方法和载体
<130>CEN5159PCT
<140>To Be Assigned
<141>2007-12-26
<150>60/882301
<151>2006-12-28
<160>2
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>520
<212>PRT
<213>产脲节杆菌产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)
<400>1
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Pro Thr Pro Pro Asn Ser
20 25 30
Pro Thr Leu Pro Pro Gly Ser Phe Ser Glu Thr Asn Leu Ala Ala Asp
35 40 45
Arg Thr Ala Ala Asn Phe Phe Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Thr Tyr Leu
50 55 60
Gly Asn Asp Val Val Leu Ala Ala Trp Asp Gly Arg Pro Gly Ser Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ala Pro Asn Pro Asn Ser Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp
85 90 95
Gly Gly Lys Thr Trp Gly Pro Val Gln Val Ile Ala Ala Gly His Val
100 105 110
Ala Asp Ala Ser Gly Pro Arg Tyr Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Ile
115 120 125
Tyr Asp Ala Glu Ala Asn Lys Val Phe Ala Phe Phe Val Tyr Ser Lys
130 135 140
Asp Gln Gly Phe Gly Gly Ser Gln Phe Gly Asn Asp Asp Ala Asp Arg
145 150 155 160
Asn Val Ile Ser Ser Ala Val Ile Glu Ser Ser Asp Ala Gly Val Thr
165 170 175
Trp Ser Gln Pro Arg Leu Ile Thr Ser Val Thr Lys Pro Gly Thr Ser
180 185 190
Lys Thr Asn Pro Ala Ala Gly Asp Val Arg Ser Asn Phe Ala Ser Ser
195 200 205
Gly Glu Gly Ile Gln Leu Lys Tyr Gly Pro His Lys Gly Arg Leu Ile
210 215 220
Gln Gln Tyr Ala Gly Asp Val Arg Gln Ala Asp Gly Ser Asn Lys Ile
225 230 235 240
Gln Ala Tyr Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Val Thr Trp His Lys
245 250 255
Gly Ala Asn Val Gly Asp Arg Met Asp Glu Asn Lys Thr Val Glu Leu
260 265 270
Ser Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Ser Arg Asp Asn Ala Asn Arg Gly
275 280 285
Tyr Arg Lys Val Ala Val Ser Thr Asp Gly Gly Ala Thr Tyr Gly Pro
290 295 300
Val Ser Gln Asp Thr Glu Leu Pro Asp Pro Ala Asn Asn Gly Ala Ile
305 310 315 320
Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Ala Gln Gly Ser Ala Asp Ala Lys Lys
325 330 335
Leu Ile Phe Thr Asn Ala Asn Ser Lys Thr Gly Arg Glu Asn Val Ser
340 345 350
Ala Arg Val Ser Cys Asp Asp Gly Glu Thr Trp Pro Gly Val Arg Thr
355 360 365
Ile Arg Ser Gly Phe Ser Ala Tyr Ser Thr Val Thr Arg Leu Ala Asp
370 375 380
Gly Lys Phe Gly Val Leu Tyr Glu Gly Asn Tyr Thr Asp Asn Met Pro
385 390 395 400
Phe Ala Thr Phe Asp Asp Ala Trp Leu Asn Tyr Val Cys Ala Pro Leu
405 410 415
Ala Val Pro Ala Val Asn Ile Ala Pro Ser Ala Thr Gln Glu Val Pro
420 425 430
Val Thr Val Thr Asn Gln Glu Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Thr Ala
435 440 445
Thr Val Tyr Thr Pro Ser Gly Trp Ser Ala Thr Thr Val Pro Val Pro
450 455 460
Asp Val Ala Pro Gly Ala Ser Val Thr Val Thr Val Ala Leu Thr Ala
465 470 475 480
Pro Ala Asp Ala Ser Gly Pro Arg Ser Leu Asn Ala Ala Phe Thr Thr
485 490 495
Ala Asp Gly Arg Val Ser Gln Phe Thr Phe Thr Ala Thr Thr Pro Val
500 505 510
Ala Pro Gln Val Gly Leu Thr Ile
515 520
<210>2
<211>1563
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶的催化结构域的核酸序列
<400>2
atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg 60
cttcaagagg gatccgcccc cactccgccc aattcgccca cgcttccacc gggcagcttc 120
tctgaaacca atctggcggc cgaccgcacg gcggcgaatt tcttctaccg gattcccgcg 180
cttacctacc ttggcaacga cgtggtcctt gcagcgtggg acggtcgccc gggttcggcg 240
gcggacgccc cgaacccgaa ctcgatcgtc cagcgccgaa gcacggacgg tggcaagacc 300
tgggggccgg tccaagtgat cgccgcaggc cacgtcgccg atgccagcgg ccctcgatac 360
ggctacagcg atccctcgta catctacgac gcggaagcca acaaggtctt cgctttcttc 420
gtgtactcga aggaccaagg ctttggcggc agtcagttcg gcaacgacga cgcggaccgg 480
aacgtcattt cctccgccgt catcgagtct tccgacgccg gcgtgacatg gagccagccc 540
cgcctcatca cctccgtcac caagccgggt accagcaaga ccaacccggc agccggcgac 600
gtccgctcca actttgcctc ctccggtgag ggcatccagc tcaaatacgg cccgcacaag 660
ggccgtctca tccagcagta cgccggcgac gtgcggcaag ctgacggaag caacaagatc 720
caggcctaca gcgtctattc agacgatcac ggcgtcacgt ggcacaaggg tgccaacgtg 780
ggcgaccgga tggacgagaa caagactgtg gaactgtccg acggtcgggt cctgctcaac 840
tcccgggaca acgccaaccg gggctaccgc aaggtggccg tctccacgga cggcggagcc 900
acgtacggcc ccgtcagcca ggacacggaa ttgccggacc ctgccaacaa cggtgcaatc 960
gcccgcatgt tccccaacgc ggcgcagggc tccgcagacg cgaagaaact gatcttcacc 1020
aacgcaaact ccaagaccgg ccgcgaaaac gtctcggccc gggtctcctg tgacgacggc 1080
gaaacctggc cgggcgtccg caccatccgt tccggcttct cggcctactc aacagtgacc 1140
cgcctggcgg acggaaagtt cggcgtcctc tacgagggca actacacgga caacatgccc 1200
ttcgccacct tcgacgacgc gtggttgaac tacgtctgcg ctcccttggc agtaccggca 1260
gtcaacatcg ccccgagcgc aacgcaggag gttccggtga ccgtcactaa ccaggaagca 1320
accacgcttt ccggcgcgac cgcaactgtc tatacgccgt cggggtggtc tgccaccacg 1380
gtgcccgtgc ccgacgtcgc ccccggcgcg tccgtcaccg tgaccgttgc actgaccgca 1440
ccggcggacg ccagtggccc gcgcagcctc aacgcggcat tcacgacggc ggatggccgg 1500
gtttcgcagt tcaccttcac cgccaccacg cccgtggctc cgcaagtggg ccttaccatc 1560
tag 1563

Claims (13)

1.一种用于在包含工程改造为表达含Fc分子的哺乳动物细胞的培养物中提供唾液酸酶酶促活性的方法，其包括用编码产脲节杆菌唾液酸酶A的催化结构域的载体转染所述哺乳动物工程改造的细胞，其中所述多肽连同所述含Fc分子一起分泌到所述培养物内，由此所述多肽唾液酸酶酶促活性可以作用于所述含Fc分子聚糖。
2.权利要求1的方法，其中所述含Fc分子是抗体，并且哺乳动物细胞系选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、YB2/0或Y3、骨髓瘤或淋巴瘤细胞、或其任何衍生、无限增殖化或转化细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述抗体是抗-TNFα抗体，并且所述细胞系是C168M。
4.一种包含编码产脲节杆菌唾液酸酶A的核苷酸序列的表达载体，其中所述载体能够在表达含Fc分子的哺乳动物细胞培养物中表达具有唾液酸酶酶促活性的多肽。
5.权利要求4的载体，其中所述哺乳动物细胞系选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、YB2/0或Y3、骨髓瘤或淋巴瘤细胞、或其任何衍生、无限增殖化或转化细胞。
6.权利要求4的载体，其中所述载体包含信号序列、启动子序列和抗生素抗性。
7.权利要求6的载体，其中所述信号序列是人生长激素信号序列，所述启动子序列是CMV启动子序列，和所述抗生素抗性是新霉素。
8.一种用于控制细胞系中表达的含Fc分子性质的方法，其包括通过用编码产脲节杆菌唾液酸酶A的催化结构域的载体转染所述细胞系来减少所述Fc区中寡糖的唾液酸化，其中所表达的所述含Fc分子包含减少量的唾液酸残基。
9.权利要求8的方法，其中控制的所述含Fc分子的性质是所述分子对于多重定位的靶蛋白质的抗体亲抗原性；对于一种或多种Fcγ受体FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA的亲和力；ADCC活性；巨噬细胞或单核细胞活化；和血清半衰期。
10.权利要求8的方法，其中所述含Fc分子是抗体，并且所述哺乳动物细胞系选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、YB2/0或Y3、骨髓瘤或淋巴瘤细胞、或其任何衍生、无限增殖化或转化细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述抗体是抗-TNFα抗体，并且所述细胞系是C168M。
12.权利要求8的方法，其中所述含Fc分子具有对于靶特异的结合结构域，所述靶是固定的靶。
13.权利要求8的方法，其中所述含Fc分子具有对于靶特异的结合结构域，所述靶在细胞表面上表达。
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