CN104004727B - 一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质的制备方法及其应用。本发明所提供的蛋白质的制备方法，包括下述步骤1)和2)：1)制备表达所述蛋白质的重组生物细胞；2)表达所述重组生物细胞，得到所述蛋白质；所述蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ？ID？No.2或SEQ？ID？No.4的蛋白质；b)将SEQ？ID？No.2或SEQ？ID？No.4的蛋白质所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质；所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。实验证明，本发明提供的生产唾液酸水解酶的方法具有较强的实用性。

Description

一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质的制备方法。
背景技术
单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)被证明具有显著的神经修护及再生活性，是神经退行性疾病或神经损伤的良好的治疗药物，目前已被应用于阿尔茨海默症、帕金森症等疾病的治疗中。由于生产技术的制约，GM1的价格非常昂贵，而在神经***疾病中，GM1用药周期较长，一个疗程最少也要三个月，如此一来，治疗费用大幅增加，导致GM1普遍应用受到限制。
目前，GM1的生产主要是从动物脑组织，如猪脑、牛脑中进行提取。提取时用到大量的氯仿、甲醇等有机试剂，造成了环境污染。此外，由于猪脑组织的神经节苷脂(gangliosides，GLS)中，GM1的含量较低，仅为10-20％，大部分是多唾液酸神经节苷脂，如GD1a、GD1b、GD3和GT1b等。直接提取时大部分的多唾液酸神经节苷脂被当作废弃物丢弃掉，最后提取得到的GM1还不到神经节苷脂总脂的10％，一方面造成了猪脑原材料的浪费，另一方面也增加了成本。
猪脑中多唾液酸神经节苷脂GD1a、GD1b和GT1b的含量占总神经节苷脂的50-60％。对比各种神经节苷脂的结构可知，GM1可通过水解GD1a，GD1b和GT1b的唾液酸残基得到。以往，有研究者通过部分酸水解猪脑神经节苷脂(gangliosides，GLS)来制备GM1。但酸水解的稳定性差，不同批次之间质量不稳定。此外，酸水解的专一性差，容易产生副产物，造成了GM1产率偏低，且后续的产品分离纯化比较困难。也有研究者利用GLS作为诱导剂，与唾液酸水解酶产生细菌共同培养，通过这些细菌分泌的唾液酸水解酶来生物转化GLS，制备GM1。生物转化与酸水解相比，具有条件温和、专一性好等优越性。但是由于细菌分泌的唾液酸水解酶一般是诱导酶，即使用GLS进行诱导，分泌的唾液酸水解酶的量也非常少，造成了这一生物转化过程的效率很低，这一生产过程不适合放大，不适用于工业规模的应用。此外，细菌菌种容易出现退化、变异等问题，给生产过程增添了不稳定性。现在急需通过基因工程的手段，直接克隆和表达所需要的酶的基因，实现GM1的稳定制备。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质的制备方法，由该方法制备的唾液酸水解酶能将GLS转化为GM1。
本发明所提供的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质的制备方法，包括将Ccesia-1的编码基因在生物细胞中进行表达得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白质的步骤；
所述Ccesia-1，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白质；
b)氨基酸序列是SEQIDNo.4的蛋白质；
c)将SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质；
d)将SEQIDNo.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质；
所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。
其中，SEQIDNo.2由703个氨基酸残基组成，是天然唾液酸水解酶Ccesia-1(名称为NCcesia-1)的氨基酸序列；SEQIDNo.4由724个氨基酸残基组成，是重组唾液酸水解酶Ccesia-1(名称为RCcesia-1)的氨基酸序列；SEQIDNo.4是在SEQIDNo.2的氨基末端添加氨基酸序列：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的氨基酸序列。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQIDNo.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上SEQIDNo.1所示的信号肽的编码序列得到。上述d)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述d)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQIDNo.3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上SEQIDNo.3所示的His-Tag的编码序列得到。
上述方法中，所述将Ccesia-1的编码基因在生物细胞中进行表达包括将所述Ccesia-1的编码基因导入所述生物细胞的步骤。
上述方法中，所述Ccesia-1的编码基因可通过含有所述Ccesia-1的编码基因的重组载体导入所述生物细胞。
上述方法中，所述Ccesia-1的编码基因可为如下1)或2)或3)或4)或5)所示的核酸分子：
1)编码序列是序列表中SEQIDNo.1的第106-2217位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；
2)核酸序列是序列表中SEQIDNo.1的第1-2217位核苷酸的DNA分子；
3)编码序列是序列表中SEQIDNo.3的第1-2175位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；
4)与1)或2)或3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码Ccesia-1的cDNA分子或基因组DNA分子；
5)在严格条件下与1)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码Ccesia-1的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，SEQIDNo.1由2217个核苷酸组成，SEQIDNo.1的第1-105位核苷酸编码信号肽，SEQIDNo.1的第106-2217位核苷酸编码SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.)21中的Ccesia-1基因的基因组基因编码SEQIDNo.2的蛋白质。SEQIDNo.3由2175个核苷酸组成，编码SEQIDNo.4所示的氨基酸序列，SEQIDNo.3的第1-63位核苷酸为pET-28a(+)载体上的序列，SEQIDNo.3的第13-30位核苷酸编码His-Tag，SEQIDNo.3的第64-2175位核苷酸编码SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。
上述方法中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
上述方法中，所述细菌为大肠杆菌。
上述方法中，所述大肠杆菌可为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，所述重组载体可为用SEQIDNo.1的第106-2217位所示的DNA分子替换pET-28a(+)的NdeI和BamHI识别位点间的片段得到的重组载体pET-28a/Ccesia-1。
上述方法中，所述将Ccesia-1的编码基因在生物细胞中进行表达包括将所述重组载体pET-28a/Ccesia-1导入所述大肠杆菌E.coliBL21(DE3)得到重组大肠杆菌，使所述Ccesia-1的编码基因在所述重组大肠杆菌中表达得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白质。
上述方法中，使所述Ccesia-1的编码基因在所述重组大肠杆菌中表达得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白质包括以下步骤：将所述重组大肠杆菌接种到发酵培养基中，在条件1下进行培养，得到发酵液，将该发酵液命名为发酵液1，向发酵液1中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，在条件2下培养4-30小时诱导所述Ccesia-1表达，得到发酵液，将该发酵液命名为发酵液2，将所述发酵液2进行离心，得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白质。
上述方法中，所述发酵培养基由水和溶质组成，pH为6-8，所述溶质及其浓度为0.5％-3％(质量百分比浓度)胰蛋白胨、0.1％-1％(质量百分比浓度)酵母提取物、0.5％-3％(质量百分比浓度)NaCl、0.5％-3％(体积百分比浓度)甘油、0.01％-0.5％(质量百分比浓度)磷酸二氢钾、0.1％-0.5％(质量百分比浓度)磷酸氢二钾、0.1％-0.5％(质量百分比浓度)硫酸镁；所述溶质及其浓度具体可为1％(质量百分比浓度)胰蛋白胨、0.5％(质量百分比浓度)酵母提取物、1％(质量百分比浓度)NaCl、1％(体积百分比浓度)甘油、0.14％(质量百分比浓度)磷酸二氢钾、0.24％(质量百分比浓度)磷酸氢二钾、0.25％(质量百分比浓度)硫酸镁。
上述方法中，所述条件1为：培养温度28-42℃，空气流量为1-6L/min，压力为0.01-0.1MPa，pH为6-8；或培养温度30-37℃，空气流量为2-5L/min，压力为0.03-0.08MPa，pH为6.5-7.5；具体可为：培养温度37℃，空气流量为3L/min，压力为0.05MPa，pH为7.2。
上述方法中，所述条件2为：培养温度15-42℃，空气流量为1-6L/min，压力为0.01-0.1MPa，pH为6-8；或培养温度20-37℃，空气流量为2-5L/min，压力为0.03-0.08MPa，pH为6.5-7.5；具体可为：培养温度25℃，空气流量为3L/min，压力为0.05MPa，pH为7.2。
本发明还提供了制备唾液酸水解酶的制备方法。
本发明所提供的唾液酸水解酶的制备方法，包括从上述具有唾液酸水解酶活性的蛋白质的制备方法得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质中纯化得到Ccesia-1的步骤，所述Ccesia-1为唾液酸水解酶。可利用Ni柱亲和层析法从所述具有唾液酸水解酶活性的蛋白质中纯化得到所述Ccesia-1。
实验证明，本发明制备的唾液酸水解酶Ccesia-1具有明显的高比唾液酸水解酶酶活，比野生型菌株提高了10-100倍，其比活力达42IU/mg蛋白。本发明制备的唾液酸水解酶Ccesia-1可以神经节苷脂作为底物进行催化反应得到单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)。利用本发明制备的Ccesia-1生产单唾液酸四己糖神经节苷脂，反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效、专一的选择性，且转化率高，达到95％，生物转化速率快，在2h内即可完成，此法生产GM1无副产物产生，纯化方便。反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保，并实现了GM1的稳定制备，解决了传统的生物转化与酸水解制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的产量低、原料浪费、成本高、质量不稳定等问题。实验证明，本发明提供的生产唾液酸水解酶的方法在制备单唾液酸四己糖神经节苷脂中具有较强的实用性。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.)
生物材料的菌株编号：21
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2013年05月14日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.7587
附图说明
图1为Ccesia-1基因的PCR琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为DNAmarker，泳道2为Ccesia-1基因的PCR扩增产物。
图2为重组载体pET-28a/Ccesia-1的NdeI和BamHI双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为pET-28a(+)的NdeI和BamHI双酶切产物，泳道2为DNAmarker，泳道3为pET-28a/Ccesia-1的NdeI和BamHI双酶切产物。
图3为蛋白诱导表达的聚丙酰胺凝胶电泳图。其中，泳道1为蛋白质分子量marker，泳道2为重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)诱导前总蛋白溶液；泳道3为重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)诱导后总蛋白溶液；泳道4为重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)诱导前总蛋白溶液；泳道5为重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后总蛋白溶液；泳道6为Ni柱纯化后的Ccesia-1蛋白。
图4为重组唾液酸水解酶Ccesia-1水解猪脑神经节苷脂GLS的反应产物的HPLC-氨基柱分析图谱。其中，曲线a为神经节苷脂标准品图谱；曲线b为神经节苷脂GLS图谱；曲线c为神经节苷脂GLS转化2h后的图谱。
图5为重组表达载体pET-28a/Ccesia-1的构建示意图。
图6为重组唾液酸水解酶Ccesia-1的生物学特性。其中，a为最适pH曲线；b为pH稳定性曲线；c为最适温度曲线；d为温度稳定性曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.)21由东北师范大学从土壤中筛选得到，于2013年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.7587。
实施例1、唾液酸水解酶重组载体的构建
将来自纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.)21(保藏号为CGMCCNo.7587)的唾液酸水解酶的多核苷酸(SEQIDNo.1)通过PCR的方式获得，克隆到表达载体pET-28a中，得到可以表达唾液酸水解酶的重组质粒。具体步骤包括：
1)纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.)21基因组DNA的提取：将纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.)21在LB琼脂培养基上，37℃活化12h。活化的菌种接一环至LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h。6000rpm、4℃离心10min收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，按照说明书提取纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.)21基因组DNA。
2)Ccesia-1基因的扩增：
以纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.)21的基因组DNA为模板进行PCR，扩增Ccesia-1基因。扩增引物为：Primer-F5′-GGAATTCCATATGCACCACACGACCCTCGCCCCC-3′；Primer-R5′-CGGGATCCTCATCAGGACCAGTCGGTCGCCA-3′。扩增条件为：98℃预变性30s；98℃10s，65℃40s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，如图1所示。对获得的片段进行测序，测序结果表明获得的片段含有SEQIDNo.1所示的DNA分子，SEQIDNo.1所示的DNA分子是天然唾液酸水解酶Ccesia-1的编码序列，编码SEQIDNo.2所示的唾液酸水解酶Ccesia-1，将该天然唾液酸水解酶Ccesia-1命名为NCcesia-1。
3)重组载体pET-28a/Ccesia-1的构建
如图5所示，用PCR产物纯化试剂盒回收PCR产物。用限制性内切酶NdeI和BamHI(NewEnglandBiolabs)酶切回收的PCR产物与pET-28a(+)载体(Novegan)(图2)，酶切结束后用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司，DP209)回收酶切产物。胶回收试剂盒回收的经过相同酶切处理的pET-28a(+)载体与PCR产物在T4DNA连接酶(TAKARA，2011A)的作用下连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，筛选阳性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，验证序列的正确性。将用SEQIDNo.1的所示Ccesia-1基因替换pET-28a(+)的NdeI和BamHI位点间的片段(保持pET-28a(+)的其它序列不变)得到的重组载体命名为pET-28a/Ccesia-1。将含有pET-28a/Ccesia-1重组表达载体的阳性克隆命名为重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)。重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)表达SEQIDNo.4所示的重组唾液酸水解酶Ccesia-1，将该重组唾液酸水解酶Ccesia-1命名为RCcesia-1。SEQIDNo.4的第22-724位氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。pET-28a/Ccesia-1中含有SEQIDNo.4第1-2175位核苷酸所示的重组唾液酸水解酶Ccesia-1的编码基因。
将空载体—pET-28a(+)载体导入E.coliBL21(DE3)得到含有pET-28a(+)的重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)，作为空载体对照菌。
实施例2、重组唾液酸水解酶Ccesia-1的制备
1、将实施例1的重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)接种于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑一环接种到60ml含有50μg/ml卡那霉素的LB与1％甘油的液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为2.0(以含有50μg/ml卡那霉素的LB与1％甘油的液体培养基为空白对照)，即为种子液。将种子液按照1:50的比例接种到3L发酵培养基中(发酵培养基的溶剂为水，其溶质及浓度为：1％(质量百分比浓度)胰蛋白胨、0.5％(质量百分比浓度)酵母提取物、1％(质量百分比浓度)NaCl、1％(体积百分比浓度)甘油、0.14％(质量百分比浓度)磷酸二氢钾、0.24％(质量百分比浓度)磷酸氢二钾、0.25％(质量百分比浓度)硫酸镁，pH7.0)，在宝兴FUS-5L发酵罐中进行发酵。培养温度37℃，空气流量3L/min，压力0.05MPa，转速160rpm，氨水调pH，使发酵过程中pH保持在7.2。发酵过程中溶氧上升时开始补料，补料培养基的溶剂为水，其溶质及浓度为：35％(体积百分比浓度)甘油、5％(质量百分比浓度)蛋白胨和2％(质量百分比浓度)酵母抽提粉。待OD600到达18-20(以发酵培养基为空白对照)时降温至25℃，并加0.4mMIPTG诱导12h。诱导结束后，5000rpm离心10min收集菌体，用PBS洗菌体1次后重新悬浮在1L的PBS缓冲液中，超声破碎细胞，15000g、4℃离心30min，收集上清液，上清液即为重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液。同时取诱导前的重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21菌体，用PBS洗菌体1次后重新悬浮在1L的PBS缓冲液中，超声破碎细胞，15000g、4℃离心30min，收集上清液，得到重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液。
2、按照本实施例中步骤1的方法，将实施例1的重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)替换为重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)，其它步骤不变，分别得到重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液和重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液。
3、重组唾液酸水解酶Ccesia-1的纯化
在重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液中加入咪唑使其终浓度为10mM，得到总蛋白的咪唑溶液，将总蛋白的咪唑溶液与20ml的NiSepharosefastflow凝胶(GEhealthcare)在4℃条件下缓慢振荡30min，得到蛋白-凝胶混合物，将蛋白-凝胶混合物装入直径为1.6cm、高10cm的玻璃层析柱中。然后用2倍层析柱体积的10mM咪唑/PBS溶液洗脱，再用5倍层析柱体积的250mM的咪唑/PBS溶液洗脱。收集250mM咪唑洗脱的级分，得到含有重组唾液酸水解酶Ccesia-1的酶液，用截留分子量为10kDa的超滤膜(Millipore公司产品)除去酶液中的咪唑，得到纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1。
4、将重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液、重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液、重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液、重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液和纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图3所示，表明只有重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液和纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1和重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液中有75kDa的蛋白(即Ccesia-1)条带，重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液和重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液均没有该75kDa的蛋白(即Ccesia-1)条带。
用考马斯亮蓝G-250法测定重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)诱导后总蛋白溶液的蛋白含量为39.9mg/ml。
5、重组唾液酸水解酶Ccesia-1活性的测定
1)以荧光底物2′-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminicacidsodiumsalthydrate(4-MU-NeuAc)检测重组唾液酸水解酶Ccesia-1和野生型菌株唾液酸水解酶的酶活力。唾液酸水解酶酶活力测定体系为：100μl反应体系中，依次加入10μl适当稀释的重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液或重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液或野生型菌株纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.)21的总蛋白溶液，10μl4-MU-NeuAc(1mM)和80μlTris-HCl缓冲液(50mM,pH7.5)，37℃反应10min后，加入100μl1MNaOH终止反应。参照4-MU标准曲线计算唾液酸水解酶的酶活。
唾液酸水解酶的酶活单位(IU)定义为每分钟催化底物生成1μmol4-MU所需要的酶量为1IU。
根据检测的结果计算得到的重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白中唾液酸水解酶的酶活为17IU/mg总蛋白，重组菌pET-28a/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白并无唾液酸水解酶酶活。实验结果表明Ccesia-1蛋白具有唾液酸水解酶酶活，证明Ccesia-1蛋白为唾液酸水解酶。
重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白中唾液酸水解酶的酶活为17IU/mg总蛋白，野生型菌株纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.)21总蛋白中唾液酸水解酶酶活为0.25IU/mg总蛋白，表明重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白中唾液酸水解酶的酶活是野生型菌株总蛋白中唾液酸水解酶的酶活的68倍，说明重组菌pET-28a/Ccesia-1/E.coliBL21(DE3)的诱导后的总蛋白具有更高的唾液酸水解酶酶活。其中，总蛋白含量均用用考马斯亮蓝G-250法测定。
2)将纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1按照上本实施例中步骤5中1)的测定酶活的方法测定唾液酸水解酶酶活，结果表明纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1的唾液酸水解酶比活力为42IU/mg蛋白。
实施例3、重组唾液酸水解酶Ccesia-1的生物学特性
1、温度对重组唾液酸水解酶活力的影响
在20-80℃水浴中，以4-MU-NeuAc为底物，按照实施例2中步骤5中的1)的方法测定纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1的酶活力。实验结果表明，重组唾液酸水解酶Ccesia-1的最适反应温度为45℃(图6中b)。
2、pH对重组唾液酸水解酶Ccesia-1活力的影响
将适当稀释的纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1与底物4-MU-NeuAc在不同pH值的缓冲液中，37℃条件下反应10min，测定重组唾液酸水解酶Ccesia-1在不同pH条件下的酶活力。采用的缓冲液分别为：50mMNaAc-HAc缓冲液，pH2.0-6.0；50mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH6.0-7.5；50mMTris-HCl缓冲液，pH7.5-9.0；50mMGly-NaOH缓冲液，pH9.0-11.0。实验结果表明，重组唾液酸水解酶Ccesia-1的最适pH值为5.0(图6中a)。
3、温度对重组唾液酸水解酶Ccesia-1稳定性的影响
将纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1分别在20、30、35、40、45、50、60℃的水浴中保温1h测定酶活力。以未处理的纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1作为对照(酶活为100％)。实验结果发现，纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1分别在20、30、35、40、45、50、60℃保温1h后，其残余酶活力分别为73％、82％、66％、6.2％、3.5％、4.0％、6.4％(图6中d)。
4、pH对重组唾液酸水解酶Ccesia-1稳定性的影响
将10μl适当稀释的纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1酶液与50μl浓度为100mM的各种不同pH值(4.0-11.0)的缓冲液混合(采用的缓冲液分别为：50mMNaAc-HAc缓冲液，pH4.0-6.0；50mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH6.0-7.5；50mMTris-HCl缓冲液，pH7.5-9.0；50mMGly-NaOH缓冲液，pH9.0-11.0)，分别在4℃冰箱中保温1h后，取10μl保温后的酶液测定残余酶活。对照组为10μl适当稀释的酶液与50μl去离子水混合(酶活为100％)，结果表明重组唾液酸水解酶Ccesia-1在pH4.0-11.0范围内保温1h后，仍保留60％以上的酶活力(图6中c)。
5、金属离子或化学试剂对重组唾液酸水解酶Ccesia-1活性的影响
将金属离子K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、Hg2+、Ba2+和Mn2+分别与适当稀释的纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1酶液混合，每种金属离子的终浓度均有两种，分别为5mM和50mM。在4℃保温1h后，以4-MU-NeuAc作为底物，测定重组唾液酸水解酶Ccesia-1的残余的酶活力。将常用化学试剂DTT、EDTA和SDS分别与适当稀释的纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1酶液混合，每种化学试剂的终浓度均有两种，分别为5mM和50mM，在4℃保温1h后，以4-MU-NeuAc作为底物，测定重组唾液酸水解酶Ccesia-1的残余的酶活力。在测定金属离子或化学试剂对重组唾液酸水解酶活性的影响中，均将未处理的纯化的重组唾液酸水解酶Ccesia-1酶液的酶活设定为100％，实验结果见表1。实验结果表明，5mMK+、5mMHg2+、5mMBa2+、5mMMn2+和5mMDTT对重组唾液酸水解酶Ccesia-1有激活作用，50mMK+、50mMCa2+、50mMMg2+、和50mMBa2+部分抑制了重组唾液酸水解酶Ccesia-1的酶活，5mMFe3+、50mMFe3+、50mMCu2+、50mMHg2+、5mMSDS和50mMSDS严重抑制了重组唾液酸水解酶Ccesia-1的酶活，其余金属离子Ca2+、Na+、Mg2+、Cu2+和化学试剂EDTA对重组唾液酸水解酶Ccesia-1的酶活抑制程度较轻或几乎无影响。
表1、不同金属离子和化学试剂对重组唾液酸水解酶Ccesia-1酶活的影响
6、酶动力学研究
以不同浓度的4-MU-NeuAc(0.01mM、0.02mM、0.04mM、0.08mM、0.16mM)作为底物，对重组唾液酸水解酶Ccesia-1进行酶动力学研究，测定不同底物浓度时的酶活。反应体系为100μl，其中包含10μl不同浓度的底物，10μl适当稀释的酶液以及80μl缓冲液，于37℃下准确反应10min，用荧光酶标仪读取10min内的吸光值。根据Lineweaver-Burk理论，计算该重组唾液酸水解酶Ccesia-1的Km值为20μM，Vmax为75.0μmol/min/mg，kcat为93.7s-1。
实施例4、用重组唾液酸水解酶Ccesia-1制备GM1
1、神经节苷脂GLS各组分及其含量的检测
本实施例利用实施例2步骤3纯化得到的重组唾液酸水解酶Ccesia-1以神经节苷脂GLS为底物制备GM1。其中，神经节苷脂GLS按照文献(SvennerholmL,FredmanP.Aprocedureforthequantitativeisolationofbraingangliosides.BiochimicaetBiophysicsActa.1980,617,97-109；刘洋，猪脑中总神经节苷脂的分离及GT1b的纯化，东北师范大学硕士学位论文,2012)的方法，从猪脑冷冻组织中提取得到。该神经节苷脂GLS的各组分及所占百分比分别为：GM1：16.7％；GD1a和GD1b：34.8％；GT1b：10.7％。检测神经节苷脂GLS各组分及其含量的方法为HPLC-氨基柱法，方法如下所述：
色谱柱：IntersilNH2氨基柱(250×4.6mm)
上样量：20μl
流动相：A：乙腈：5mM磷酸盐(pH＝5.60)＝83:17(v:v)
B：乙腈：20mM磷酸盐(pH＝5.60)＝50:50(v:v)
程序：0-15min15％B，85％A；
15-30min(不包括15min)B的体积百分含量由15％匀速增加到20％，A的体积百分含量由85％匀速降低到80％；
30-34min(不包括30min)20％B，80％A；
34-50min(不包括34min)B的体积百分含量由20％匀速增加到30％，A的体积百分含量由80％匀速降低到70％；
50-70min(不包括50min)15％B，85％A；
柱温：25℃
检测器：紫外检测器，215nm
流速：1.0mL/min
其中，标准品分别为神经节苷脂GD1a、GD1b、GT1b和GM1(Sigma，商品目录号分别为G2392、G8146、G3767、G7641)。
2、用重组唾液酸水解酶Ccesia-1制备GM1
用重组唾液酸水解酶Ccesia-1制备GM1的具体反应条件，通过响应面分析法优化得到最优反应条件：使用Design-Expert软件设计三因素三水平Box-Behnken模型，三因素分别为：转化pH(4.0、5.0、6.0)、转化温度(30、35、40℃)、物料比(20：1、35:1、50:1；GLS/Ccesia-1，mg/mg)。各实验组在100rpm搅拌条件下反应2h。反应结束后，80℃加热10min使酶失活，离心，上清液冷冻干燥，按照本实施例步骤1中的HPLC-氨基柱法检测转化产物中的GM1含量。通过Design-Expert软件进行二次响应面回归分析。
用重组唾液酸水解酶Ccesia-1制备GM1实验重复三次，每次实验的具体步骤如下：
将实施例2步骤3纯化得到的重组唾液酸水解酶Ccesia-1用20mMNaAc缓冲液(pH5.0)调整蛋白浓度为1mg/ml(即42IU/ml)的酶液，在500ml上述酶液中加入25g神经节苷脂GLS，使其终浓度为50mg/ml，37℃、100rpm搅拌条件下反应2h。反应结束后，80℃加热10min使酶失活，离心，上清液旋转蒸发至100ml，-70℃预冻后，冷冻干燥得到转化产物干燥粉。按照本实施例上述HPLC-氨基柱法以GM1(Sigma，商品目录号G7641)为标准品检测转化产物，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析GM1(图4)，结果表明转化产物中的GM1含量为58.5％(质量百分含量)。
将转化产物干燥粉溶于少量由体积比为5:4的氯仿和甲醇组成的液体中，上样至1.0L硅胶柱层析。用由体积比为5:4的氯仿和甲醇组成的液体进行洗脱，收集含有神经节苷脂GM1的级分，旋转蒸发至无有机溶剂流出，-70℃预冻后冷冻干燥得到GM1纯品。该GM1纯品经上述HPLC分析结果表明GM1含量为97％。结果表明该25g神经节苷脂GLS共得到11.5±0.3gGM1纯品，GM1的产率为46％(GM1产量/投料GLS量*100％)，GM1的转化率为95％(GM1的转化率＝转化前底物中GD1a、GD1b、GT1b的峰面积之和-转化产物中GD1a、GD1b、GT1b的峰面积之和)/转化前底物中GD1a、GD1b、GT1b的峰面积之和×100％)。

Claims (9)

1.具有唾液酸水解酶活性的蛋白质的制备方法，包括将Ccesia-1的编码基因在生物细胞中进行表达得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白质的步骤；
所述Ccesia-1，是如下a)或b)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白质；
b)氨基酸序列是SEQIDNo.4的蛋白质；
所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将Ccesia-1的编码基因在生物细胞中进行表达包括将所述Ccesia-1的编码基因导入所述生物细胞的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Ccesia-1的编码基因通过含有所述Ccesia-1的编码基因的重组载体导入所述生物细胞。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Ccesia-1的编码基因为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：
1)编码序列是序列表中SEQIDNo.1的第106-2217位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；
2)核酸序列是序列表中SEQIDNo.1的第1-2217位核苷酸的DNA分子；
3)编码序列是序列表中SEQIDNo.3的第1-2175位核苷酸的DNA分子或cDNA分子。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述微生物为酵母、细菌、藻或真菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，所述重组载体为用SEQIDNo.1的第106-2217位所示的DNA分子替换pET-28a(+)的NdeI和BamHI识别位点间的片段得到的重组载体pET-28a/Ccesia-1。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述将Ccesia-1的编码基因在生物细胞中进行表达包括将所述重组载体pET-28a/Ccesia-1导入所述大肠杆菌E.coliBL21(DE3)得到重组大肠杆菌，使所述Ccesia-1的编码基因在所述重组大肠杆菌中表达得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白质。
9.唾液酸水解酶的制备方法，包括从权利要求1-8中任一所述的方法得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质中纯化得到Ccesia-1的步骤，所述Ccesia-1为唾液酸水解酶。
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