CN101637188A - 一种防治植物真菌病害的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治植物真菌病害的菌剂的制备方法，是将长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)和柠檬绿木霉(Trichoderma citrinoviride)混合，得到防治植物真菌病害的菌剂。利用本发明方法制备的菌剂进行防治效果实验，结果表明，液体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果达54.8％，对青椒疫病的防治效果达67.9％。固体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果达45.12％，并且使黄瓜增产11.06％，其防病与增产效果显著；固体菌剂对青椒疫病的防治效果达61.90％，并且实验组青椒的平均株高比对照组增加8.92％，青椒增产37.19％，说明本发明方法制备的菌剂具有防病、促生和增产的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治植物真菌病害的方法。
背景技术
20世纪80年代以来，我国蔬菜种植业发展迅速，蔬菜已成为仅次于粮食作物的第二大农作物。由于蔬菜栽培的特殊环境，给蔬菜病害的发生、发展提供了适宜的条件，致使蔬菜病害的种类、数量及危害程度都呈现出逐年增加的趋势，严重影响蔬菜的产量和质量，给菜农造成很大的经济损失，已经成为限制我国蔬菜种植业发展和增强国际市场竞争力的“瓶颈”。蔬菜病害的防治，是我国蔬菜种植业发展的必需，也是菜农的迫切要求。
蔬菜多为连年重茬种植，从而导致某些病害的病原菌大量积累，尤其是一些土传病害日趋严重，如黄瓜枯萎病、茄子黄萎病和青椒疫病等的危害逐年加重。长期以来，在蔬菜病害防治方面，农药特别是化学农药的使用发挥了巨大的作用。由于化学农药具有见效快、杀菌谱广和使用简便等特点，在病害防治中发展迅速，成为防病丰产的有效手段之一。但是长期、反复和大量使用化学农药会导致有益微生物被杀死或抑制，破坏生物群落结构，造成环境污染，使蔬菜中有害物质大量残留，导致病原菌产生耐药性或抗药性，从而使化学农药的用量增加，带来了更加严重的问题。当代农业的可持续发展，要求生产者在利用资源、提高产量的同时，注意保护和改善人们赖以生存的环境，这就对蔬菜病害防治中的传统观念和不良做法提出了严峻的挑战。由于长期使用化学药剂防治各种蔬菜病害所造成的生态环境破坏和病原菌抗药性增强等原因，迫切需要寻找一种更安全有效的蔬菜病害防治途径。生物防治的特点正好弥补了化学防治的不足，因而成为倍受关注的研究方向。
利用生物方法防治蔬菜病害不仅避免了化学农药带来了一系列问题，而且安全、有效和持久，且不易产生耐药性、对人畜安全无毒、不污染环境、无残留、能保持生态平衡和生产工艺较简单的特点。由于生物防治兼具保护生态和抗病的双重功效，在蔬菜病害防治中发挥着巨大的作用，因而得到世界各国研究者的关注，己经成为蔬菜病害防治中十分重要且日益得到重视的有效措施。
目前，已发现多种微生物具有生防的作用，木霉菌就是其中一类普遍存在并具有重要经济意义的生防有益菌。木霉菌(Trichoderma spp.)作为一种重要的植病生防因子(Biological control agents，BCAs)一直受到普遍关注。国外已有商品化的木霉制剂问世，如美国的Topshield(哈茨木霉T22)和以色列的Trichodex(哈茨木霉T39)。
黄瓜枯萎病和青椒疫病是蔬菜种植中最为常见且危害严重的两类土传真菌病害，主要症状表现为植株凋萎和萎蔫，根和茎的维管束阻塞、变褐等。近年来，由尖镰孢菌(Fusarium oxysporum Schlecht.)所致的枯萎病已经成为蔬菜的主要病害之一，其中，以黄瓜受害最为严重，发病率一般为20％～30％，受害重的地区发病率高达80％～90％，甚至绝产。青椒疫病是由青椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)引起的一种土传病害，是青椒的毁灭性病害，在青椒的整个生育期内均可发病。大水漫灌和高温高湿的条件容易引起青椒疫病的大面积流行，常造成青椒减产，甚至绝收，青椒疫病已成为世界范围内青椒的毁灭性病害。黄瓜枯萎病和青椒疫病的有效防治成为蔬菜生产中急待解决的难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种防治植物真菌病害的方法。
本发明所提供的防治植物真菌病害的菌剂，它的活性成分包括长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)和柠檬绿木霉(Trichoderma citrinoviride)。
所述长柄木霉和柠檬绿木霉的集落形成单位数目比为1∶(0.8-1.2)，具体为1∶1。
所述长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)具体可为长柄木霉(Trichodermalongibrachiatum)ACCC 30150，所述柠檬绿木霉(Trichoderma citrinoviride)具体可为柠檬绿木霉(Trichoderma citrinoviride)ACCC 30152。
本发明所提供的用于防治植物真菌病害的菌剂的活性成份也可仅有由所述长柄木霉和柠檬绿木霉组成。
上述菌剂中，所述长柄木霉和所述柠檬绿木霉可以分别独立包装，也可以混合在一起。
本发明的防治植物真菌病害的菌剂可以为液体菌剂，也可以为固体菌剂，在液体菌剂中加入吸附基质即可获得固体菌剂；所述固体菌剂中，所述吸附基质为由鸡粪、小麦麸皮、豆饼粉、草炭和蛭石组成的混合物。
所述鸡粪、小麦麸皮、豆饼粉、草炭和蛭石的重量份数比为1∶(0.38-0.42)∶(0.18-0.22)∶(0.18-0.22)∶(0.18-0.22)，具体为1∶0.4∶0.2∶0.2∶0.2。
上述固体菌剂中，所述活性成分和所述吸附基质的配比为4.5×108CFU孢子∶(1.6-1.7)g吸附基质，具体为4.5×108CFU孢子∶1.65g吸附基质。
所述真菌病害为由下述11种真菌中的至少一种所引起的真菌病害：黄瓜立枯病菌(R.solani)、黄瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、黄瓜黑星病菌(C.cucumerinum)、番茄早疫病菌(A.solani)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、茄子黄萎病菌(V.dahliae)、白菜黑斑病菌(A.brassicae)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、小麦根腐病菌(B.sorokinianum)、斑点落叶病菌(A.mali)、青椒疫病病菌(P.capsici)。
本发明利用上述制备的菌剂进行防治效果实验，结果表明，液体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果达54.8％，对青椒疫病的防治效果达67.9％。固体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果达45.12％，并且使黄瓜增产11.06％，其防病与增产效果显著；固体菌剂对青椒疫病的防治效果达61.90％，并且实验组青椒的平均株高比对照组增加8.92％，青椒增产37.19％，说明本发明的菌剂的防病、促生和增产的效果显著。
具体实施方式
以下实施例所用菌种均来自于中国农业科学院农业资源与农业区划研究所中国农业微生物菌种保藏管理中心(简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)。
实施例1、防治植物真菌病害的菌剂的制备及其防治效果实验
1、防治植物真菌病害的液体菌剂的制备
筛选产厚垣孢子培养基：KH2PO42.0g/L、NH4NO3 1.0g/L、FeSO4.7H2O 0.005g/L、MnSO40.0016g/L、CaCl2 0.3g/L、NaCl 1.0g/L、MgSO4.7H2O 0.3g/L、玉米秸秆粉(过40mm筛)10g/L。PH 6.0。115℃条件下灭菌20分钟。
将长柄木霉ACCC 30150和柠檬绿木霉ACCC 30152分别接种到PDA液体培养基中，30℃摇床培养3天(摇床转速265转/分)。然后按照10％(体积百分含量)的接种量接种到上述筛选产厚垣孢子培养基中，30℃摇床培养(摇床转速250转/分)至长柄木霉和柠檬绿木霉的发酵液中厚垣孢子的量达到4.5×108CFU/ml，将上述长柄木霉的发酵液和柠檬绿木霉的发酵液按照1∶1的体积比混合，得到防治植物真菌病害的液体菌剂。
2、防治植物真菌病害的固体菌剂的制备
将鸡粪、小麦麸皮、豆饼粉、草炭和蛭石按照5∶2∶1∶1∶1的质量比混合，得到防治植物真菌病害的固体菌剂的吸附基质。将1.65g吸附基质和含有4.5×108CFU孢子的上述步骤1得到的液体菌剂相混合，得到防治植物真菌病害的固体菌剂。
3、菌剂的防治效果实验
(1)液体菌剂防治黄瓜枯萎病试验
用温度为37℃的无菌水浸泡黄瓜(品种名称：长春密刺，由中国农业科学院蔬菜与花卉研究所提供)的种子12～24h，催芽。将栽培土混匀，装在育苗盘中，当种子发芽后，按行播种，再在上面覆一薄层土，喷水保湿，待黄瓜幼苗长到2～3片真叶时，进行黄瓜枯萎病防治试验。
将黄瓜枯萎病病菌(ACCC 30442)制成孢子浓度为106个/mL的菌悬液，将上述黄瓜幼苗先断根，再在上述黄瓜枯萎病病菌的菌悬液中浸泡5min，然后移栽入盆，每棵苗再接种上述黄瓜枯萎病病菌的菌悬液5mL，覆一薄层土。然后，将上述接种黄瓜枯萎病病菌的黄瓜幼苗接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂，每棵苗接种2.5mL，覆土培养。同时以不接种黄瓜枯萎病病菌的正常生长的黄瓜作为阴性对照(CKo)，以接种黄瓜枯萎病病菌而不接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂的黄瓜作为阳性对照(CK)。保湿培养，一周后调查试验结果。
实验设三次重复，上述步骤1制备的液体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果如表1所示。
表1 液体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果
结果表明，上述步骤1制备的液体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果可达54.8％。
(2)固体菌剂防治黄瓜枯萎病试验
将黄瓜幼苗于5月4日3叶1心期进行移栽，以栽培地的传统栽培管理为基准，水分及其它管理措施保持一致。所有实验小区均不使用化学药剂防控病害。试验共设三个处理，分别为：正常施肥组(CK1组)，正常施肥+基质组(CK2组)(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g基质，穴施于黄瓜根下，基质为上述步骤2制备固体菌剂的吸附基质)，固体菌剂组(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g上述步骤2的固体菌剂，穴施于黄瓜根下)。每种处理设4个重复，各实验小区随机排列。每小区移栽2行黄瓜，行距为65cm，株距为29cm，共计12个小区。试验期间每隔20天调查一次，记录病株数和死株数，计算出病株率和死株率。实验设三次重复。不同处理组黄瓜枯萎病的田间发病情况结果如表2所示。
表2 不同处理组黄瓜枯萎病的田间发病情况
结果表明，在同样的管理条件下，与CK1组相比，CK2组与固体菌剂组的病株率和死株率都有不同程度的下降。其中定植后15天时，三个实验组均无死株。CK2组与固体菌剂组的病株率较CK1组下降18.25％-22.22％；之后，CK1组与CK2组之间病株率与死株率的差异越来越小，而固体菌剂组与CK1组和CK2组之间的病株率与死株率差异越来越大。表明上述步骤2制备的固体菌剂对黄瓜枯萎病有较好的防治效果。
不同处理组黄瓜枯萎病的发病起始期及防治效果如表3所示。
表3 固体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果
结果表明，固体菌剂组和CK2组比CK1组的发病时间均晚5天，其防病效果较CK1组分别提高45.12％和4.04％，固体菌剂组与CK1组和CK2组的防病效果差异极显著。
上述各处理分次收获黄瓜，分别称重计算产量。结果如表4所示。
表4 固体菌剂对黄瓜的增产效果
结果表明，固体菌剂组比CK1组黄瓜增产11.06％，差异显著。
上述实验结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂防病与增产效果显著，接种上述步骤2的固体菌剂后，可提高黄瓜的抗病能力，减轻黄瓜枯萎病害造成的损失。
(3)液体菌剂防治青椒疫病试验
用温度为37℃的无菌水浸泡青椒(品种名称：茄门青椒，由中国农业科学院蔬菜与花卉研究所提供)的种子24h，催芽。将栽培土混匀，装在栽培盘中，当种子发芽后，直接播种在栽培盆中，再在上面覆一薄层土，喷水保湿，当青椒幼苗长到5～6片真叶时，进行青椒疫病防治试验。
将青椒疫病病菌(ACCC 30093)制成孢子浓度为103个/mL的菌悬液，将上述青椒幼苗不移栽直接灌根接种上述青椒疫病病菌的菌悬液，每棵苗接种5mL上述青椒疫病病菌的菌悬液，覆一薄层土。然后，将上述接种青椒疫病病菌的青椒幼苗再接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂，每棵苗接种3mL，覆土培养。同时以不接种青椒疫病病菌正常生长的青椒作为阴性对照(CKo)，以接种青椒疫病病菌而不接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂的青椒作为阳性对照(CK)。保湿培养，一周后调查试验结果。
实验设三次重复，上述步骤1制备的液体菌剂对青椒疫病的防治效果如表5所示。
表5 液体菌剂对青椒疫病的防治效果
结果表明，上述步骤1制备的液体菌剂对青椒疫病的防治效果可达67.9％。
(4)固体菌剂防治青椒疫病试验
青椒幼苗于4叶期进行移栽，以栽培地的传统栽培管理为基准，水分及其它管理措施保持一致。所有实验小区均不使用化学药剂防控病害。试验共设五个处理，分别为：正常施肥组(CKo组)，正常施肥+低剂量基质组(CK1组)(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g基质，穴施于青椒根下，基质为上述步骤2制备固体菌剂的吸附基质)，正常施肥+高剂量基质组(CK2组)(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g基质，穴施于青椒根下，基质为上述步骤2制备固体菌剂的吸附基质)，低剂量固体菌剂组(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g上述步骤2的固体菌剂，穴施于青椒根下)，高剂量固体菌剂组(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g上述步骤2的固体菌剂，穴施于青椒根下)。每种处理设3个重复，各实验小区随机排列。每垄栽2行青椒，垄距50cm，每两垄为一个小区(19.2m2)，共15个小区。种植密度3300株/667m2。试验期间每隔20天调查一次，记录病株数和病情级别，计算出病株率和病情指数。实验设三次重复。不同处理组青椒疫病的田间发病情况及防治效果如表6所示。
表6 固体菌剂对青椒疫病的防治效果
结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂中，高剂量固体菌剂组对青椒疫病的防治效果为61.90％，低剂量固体菌剂组对青椒疫病的防治效果为45.95％。
不同处理组对青椒株高的影响结果如表7所示。
表7 固体菌剂对青椒株高的影响
结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂对青椒的生长有一定的促进作用。低剂量菌剂组青椒的平均株高比CKo组增加4.34％，高剂量菌剂组青椒的平均株高比CKo组增加8.92％。
上述各处理分次收获青椒，分别称重计算产量。结果如表8所示。
表8 固体菌剂对青椒的增产效果
结果表明，高剂量菌剂组比CKo组青椒增产37.19％，差异显著。
上述实验结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂，其防病与增产效果显著，接种上述步骤2的固体菌剂后，青椒的株高明显提高，而且还可提高青椒的抗病能力，减轻青椒疫病病害造成的损失。
实施例2、防治植物真菌病害的菌剂的制备及其防治效果实验
1、防治植物真菌病害的液体菌剂的制备
筛选产厚垣孢子培养基：KH2PO42.0g/L、NH4NO3 1.0g/L、FeSO4.7H2O 0.005g/L、MnSO40.0016g/L、CaCl2 0.3g/L、NaCl 1.0g/L、MgSO4.7H2O 0.3g/L、玉米秸秆粉(过40mm筛)10g/L。PH 6.0。115℃条件下灭菌20分钟。
将长柄木霉ACCC 30150和柠檬绿木霉ACCC 30152分别接种到PDA液体培养基中，30℃摇床培养3天(摇床转速265转/分)。然后按照10％(体积百分含量)的接种量接种到上述筛选产厚垣孢子培养基中，30℃摇床培养(摇床转速250转/分)至长柄木霉和柠檬绿木霉的发酵液中厚垣孢子的量均达到4.5×108CFU/ml，将上述长柄木霉的发酵液和柠檬绿木霉的发酵液按照1∶1.2的体积比混合，得到防治植物真菌病害的液体菌剂。
2、防治植物真菌病害的固体菌剂的制备
将鸡粪、小麦麸皮、豆饼粉、草炭和蛭石按照1∶0.42∶0.22∶0.22∶0.22的质量比混合，得到防治植物真菌病害的固体菌剂的吸附基质。将1.7g吸附基质和含有4.5×108CFU孢子的上述步骤1得到的液体菌剂相混合，得到防治植物真菌病害的固体菌剂。
3、菌剂的防治效果实验，具体试验过程同实施例1。
(1)液体菌剂防治黄瓜枯萎病试验
用温度为37℃的无菌水浸泡黄瓜(品种名称：长春密刺，由中国农业科学院蔬菜与花卉研究所提供)的种子12～24h，催芽。将栽培土混匀，装在育苗盘中，当种子发芽后，按行播种，再在上面覆一薄层土，喷水保湿，待黄瓜幼苗长到2～3片真叶时，进行黄瓜枯萎病防治试验。
将黄瓜枯萎病病菌(ACCC 30442)制成孢子浓度为106个/mL的菌悬液，将上述黄瓜幼苗先断根，再在上述黄瓜枯萎病病菌的菌悬液中浸泡5min，然后移栽入盆，每棵苗再接种上述黄瓜枯萎病病菌的菌悬液5mL，覆一薄层土。然后，将上述接种黄瓜枯萎病病菌的黄瓜幼苗接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂，每棵苗接种2.5mL，覆土培养。同时以不接种黄瓜枯萎病病菌的正常生长的黄瓜作为阴性对照(CKo)，以接种黄瓜枯萎病病菌而不接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂的黄瓜作为阳性对照(CK)。保湿培养，一周后调查试验结果。
实验设三次重复，上述步骤1制备的液体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果如表9所示。
表9 液体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果
结果表明，上述步骤1制备的液体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果可达51.8％。
(2)固体菌剂防治黄瓜枯萎病试验
将黄瓜幼苗于5月4日3叶1心期进行移栽，以栽培地的传统栽培管理为基准，水分及其它管理措施保持一致。所有实验小区均不使用化学药剂防控病害。试验共设三个处理，分别为：正常施肥组(CK1组)，正常施肥+基质组(CK2组)(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g基质，穴施于黄瓜根下，基质为上述步骤2制备固体菌剂的吸附基质)，固体菌剂组(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g上述步骤2的固体菌剂，穴施于黄瓜根下)。每种处理设4个重复，各实验小区随机排列。每小区移栽2行黄瓜，行距为65cm，株距为29cm，共计12个小区。试验期间每隔20天调查一次，记录病株数和死株数，计算出病株率和死株率。实验设三次重复。不同处理组黄瓜枯萎病的发病起始期及防治效果如表10所示。
表10 固体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果
结果表明，固体菌剂组和CK2组比CK1组的发病时间均晚5天，其防病效果较CK1组分别提高45.04％和3.98％，固体菌剂组与CK1组和CK2组的防病效果差异极显著。
上述各处理分次收获黄瓜，分别称重计算产量。结果如表11所示。
表11 固体菌剂对黄瓜的增产效果
结果表明，固体菌剂组比CK1组黄瓜增产10.90％，差异显著。
上述实验结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂防病与增产效果显著，接种上述步骤2的固体菌剂后，可提高黄瓜的抗病能力，减轻黄瓜枯萎病害造成的损失。
(3)液体菌剂防治青椒疫病试验
用温度为37℃的无菌水浸泡青椒(品种名称：茄门青椒，由中国农业科学院蔬菜与花卉研究所提供)的种子24h，催芽。将栽培土混匀，装在栽培盘中，当种子发芽后，直接播种在栽培盆中，再在上面覆一薄层土，喷水保湿，当青椒幼苗长到5～6片真叶时，进行青椒疫病防治试验。
将青椒疫病病菌(ACCC 30093)制成孢子浓度为103个/mL的菌悬液，将上述青椒幼苗不移栽直接灌根接种上述青椒疫病病菌的菌悬液，每棵苗接种5mL上述青椒疫病病菌的菌悬液，覆一薄层土。然后，将上述接种青椒疫病病菌的青椒幼苗再接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂，每棵苗接种3mL，覆土培养。同时以不接种青椒疫病病菌正常生长的青椒作为阴性对照(CKo)，以接种青椒疫病病菌而不接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂的青椒作为阳性对照(CK)。保湿培养，一周后调查试验结果。
实验设三次重复，上述步骤1制备的液体菌剂对青椒疫病的防治效果如表12所示。
表12 液体菌剂对青椒疫病的防治效果
结果表明，上述步骤1制备的液体菌剂对青椒疫病的防治效果可达65.3％。
(4)固体菌剂防治青椒疫病试验
青椒幼苗于4叶期进行移栽，以栽培地的传统栽培管理为基准，水分及其它管理措施保持一致。所有实验小区均不使用化学药剂防控病害。试验共设五个处理，分别为：正常施肥组(CKo组)，正常施肥+低剂量基质组(CK1组)(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g基质，穴施于青椒根下，基质为上述步骤2制备固体菌剂的吸附基质)，正常施肥+高剂量基质组(CK2组)(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g基质，穴施于青椒根下，基质为上述步骤2制备固体菌剂的吸附基质)，低剂量固体菌剂组(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g上述步骤2的固体菌剂，穴施于青椒根下)，高剂量固体菌剂组(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g上述步骤2的固体菌剂，穴施于青椒根下)。每种处理设3个重复，各实验小区随机排列。每垄栽2行青椒，垄距50cm，每两垄为一个小区(19.2m2)，共15个小区。种植密度3300株/667m2。试验期间每隔20天调查一次，记录病株数和病情级别，计算出病株率和病情指数。实验设三次重复。不同处理组青椒疫病的田间发病情况结果如表13所示。
表13 固体菌剂对青椒疫病的防治效果
结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂中，高剂量固体菌剂组对青椒疫病的防治效果为59.48％，低剂量固体菌剂组对青椒疫病的防治效果为45.08％。
不同处理组对青椒株高的影响结果如表14所示。
表14 固体菌剂对青椒株高的影响
结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂对青椒的生长有一定的促进作用。低剂量菌剂组青椒的平均株高比CKo组增加4.04％，高剂量菌剂组青椒的平均株高比CKo组增加8.62％。
上述各处理分次收获青椒，分别称重计算产量。结果如表15所示。
表15 固体菌剂对青椒的增产效果
结果表明，高剂量菌剂组比CKo组青椒增产35.56％，差异显著。
上述实验结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂，其防病与增产效果显著，接种上述步骤2的固体菌剂后，青椒的株高明显提高，而且还可提高青椒的抗病能力，减轻青椒疫病病害造成的损失。
实施例3、防治植物真菌病害的菌剂的制备及其防治效果实验
1、防治植物真菌病害的液体菌剂的制备
筛选产厚垣孢子培养基：KH2PO42.0g/L、NH4NO3 1.0g/L、FeSO4.7H2O 0.005g/L、MnSO4 0.0016g/L、CaCl2 0.3g/L、NaCl 1.0g/L、MgSO4.7H2O 0.3g/L、玉米秸秆粉(过40mm筛)10g/L。PH 6.0。115℃条件下灭菌20分钟。
将长柄木霉ACCC 30150和柠檬绿木霉ACCC 30152分别接种到PDA液体培养基中，30℃摇床培养3天(摇床转速265转/分)。然后按照10％(体积百分含量)的接种量接种到上述筛选产厚垣孢子培养基中，30℃摇床培养(摇床转速250转/分)至长柄木霉和柠檬绿木霉的发酵液中厚垣孢子的量均达到4.5×108CFU/ml，将上述长柄木霉的发酵液和柠檬绿木霉的发酵液按照1∶0.8的体积比混合，得到防治植物真菌病害的液体菌剂。
2、防治植物真菌病害的固体菌剂的制备
将鸡粪、小麦麸皮、豆饼粉、草炭和蛭石按照1∶0.38∶0.18∶0.18∶0.18的质量比混合，得到防治植物真菌病害的固体菌剂的吸附基质。将1.6g吸附基质和含有4.5×108CFU孢子的上述步骤1得到的液体菌剂相混合，得到防治植物真菌病害的固体菌剂。
3、菌剂的防治效果实验，具体试验过程同实施例1。
(1)液体菌剂防治黄瓜枯萎病试验
用温度为37℃的无菌水浸泡黄瓜(品种名称：长春密刺，由中国农业科学院蔬菜与花卉研究所提供)的种子12～24h，催芽。将栽培土混匀，装在育苗盘中，当种子发芽后，按行播种，再在上面覆一薄层土，喷水保湿，待黄瓜幼苗长到2～3片真叶时，进行黄瓜枯萎病防治试验。
将黄瓜枯萎病病菌(ACCC 30442)制成孢子浓度为106个/mL的菌悬液，将上述黄瓜幼苗先断根，再在上述黄瓜枯萎病病菌的菌悬液中浸泡5min，然后移栽入盆，每棵苗再接种上述黄瓜枯萎病病菌的菌悬液5mL，覆一薄层土。然后，将上述接种黄瓜枯萎病病菌的黄瓜幼苗接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂，每棵苗接种2.5mL，覆土培养。同时以不接种黄瓜枯萎病病菌的正常生长的黄瓜作为阴性对照(CKo)，以接种黄瓜枯萎病病菌而不接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂的黄瓜作为阳性对照(CK)。保湿培养，一周后调查试验结果。
实验设三次重复，上述步骤1制备的液体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果如表16所示。
表16 液体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果
结果表明，上述步骤1制备的液体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果可达52.7％。
(2)固体菌剂防治黄瓜枯萎病试验
将黄瓜幼苗于5月4日3叶1心期进行移栽，以栽培地的传统栽培管理为基准，水分及其它管理措施保持一致。所有实验小区均不使用化学药剂防控病害。试验共设三个处理，分别为：正常施肥组(CK1组)，正常施肥+基质组(CK2组)(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g基质，穴施于黄瓜根下，基质为上述步骤2制备固体菌剂的吸附基质)，固体菌剂组(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g上述步骤2的固体菌剂，穴施于黄瓜根下)。每种处理设4个重复，各实验小区随机排列。每小区移栽2行黄瓜，行距为65cm，株距为29cm，共计12个小区。试验期间每隔20天调查一次，记录病株数和死株数，计算出病株率和死株率。实验设三次重复。实验设三次重复。不同处理组黄瓜枯萎病的发病起始期及防治效果如表17所示。
表17 固体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果
结果表明，固体菌剂组和CK2组比CK1组的发病时间均晚5天，其防病效果较CK1组分别提高45.08％和4.01％，固体菌剂组与CK1组和CK2组的防病效果差异极显著。
上述各处理分次收获黄瓜，分别称重计算产量。结果如表18所示。
表18 固体菌剂对黄瓜的增产效果
结果表明，固体菌剂组比CK1组黄瓜增产10.98％，差异显著。
上述实验结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂防病与增产效果显著，接种上述步骤2的固体菌剂后，可提高黄瓜的抗病能力，减轻黄瓜枯萎病害造成的损失。
(3)液体菌剂防治青椒疫病试验
用温度为37℃的无菌水浸泡青椒(品种名称：茄门青椒，由中国农业科学院蔬菜与花卉研究所提供)的种子24h，催芽。将栽培土混匀，装在栽培盘中，当种子发芽后，直接播种在栽培盆中，再在上面覆一薄层土，喷水保湿，当青椒幼苗长到5～6片真叶时，进行青椒疫病防治试验。
将青椒疫病病菌(ACCC 30093)制成孢子浓度为103个/mL的菌悬液，将上述青椒幼苗不移栽直接灌根接种上述青椒疫病病菌的菌悬液，每棵苗接种5mL上述青椒疫病病菌的菌悬液，覆一薄层土。然后，将上述接种青椒疫病病菌的青椒幼苗再接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂，每棵苗接种3mL，覆土培养。同时以不接种青椒疫病病菌正常生长的青椒作为阴性对照(CKo)，以接种青椒疫病病菌而不接种上述步骤1制备的防治植物真菌病害的液体菌剂的青椒作为阳性对照(CK)。保湿培养，一周后调查试验结果。
实验设三次重复，上述步骤1制备的液体菌剂对青椒疫病的防治效果如表19所示。
表19 液体菌剂对青椒疫病的防治效果
结果表明，上述步骤1制备的液体菌剂对青椒疫病的防治效果可达65.7％。
(4)固体菌剂防治青椒疫病试验
青椒幼苗于4叶期进行移栽，以栽培地的传统栽培管理为基准，水分及其它管理措施保持一致。所有实验小区均不使用化学药剂防控病害。试验共设五个处理，分别为：正常施肥组(CKo组)，正常施肥+低剂量基质组(CK1组)(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g基质，穴施于青椒根下，基质为上述步骤2制备固体菌剂的吸附基质)，正常施肥+高剂量基质组(CK2组)(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g基质，穴施于青椒根下，基质为上述步骤2制备固体菌剂的吸附基质)，低剂量固体菌剂组(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g上述步骤2的固体菌剂，穴施于青椒根下)，高剂量固体菌剂组(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g上述步骤2的固体菌剂，穴施于青椒根下)。每种处理设3个重复，各实验小区随机排列。每垄栽2行青椒，垄距50cm，每两垄为一个小区(19.2m2)，共15个小区。种植密度3300株/667m2。试验期间每隔20天调查一次，记录病株数和病情级别，计算出病株率和病情指数。实验设三次重复。不同处理组青椒疫病的田间发病情况结果如表20所示。
表20 固体菌剂对青椒疫病的防治效果
结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂中，高剂量固体菌剂组对青椒疫病的防治效果为59.87％，低剂量固体菌剂组对青椒疫病的防治效果为45.63％。
不同处理组对青椒株高的影响结果如表21所示。
表21 固体菌剂对青椒株高的影响
结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂对青椒的生长有一定的促进作用。低剂量菌剂组青椒的平均株高比CKo组增加4.18％，高剂量菌剂组青椒的平均株高比CKo组增加8.75％。
上述各处理分次收获青椒，分别称重计算产量。结果如表22所示。
表22 固体菌剂对青椒的增产效果
结果表明，高剂量菌剂组比CK1组青椒增产36.21％，差异显著。
上述实验结果表明，上述步骤2制备的固体菌剂，其防病与增产效果显著，接种上述步骤2的固体菌剂后，青椒的株高明显提高，而且还可提高青椒的抗病能力，减轻青椒疫病病害造成的损失。
Claims (10)
1、一种防治植物真菌病害的方法，是用防治植物真菌病害的菌剂对植物真菌病害进行防治；
所述防治植物真菌病害的菌剂的活性成分包括长柄木霉(Trichodermalongibrachiatum)和柠檬绿木霉(Trichoderma citrinoviride)。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述长柄木霉和柠檬绿木霉的集落形成单位数目比为1∶(0.8-1.2)。
3、根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述长柄木霉和柠檬绿木霉的集落形成单位数目比为1∶1。
4、根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)为长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)ACCC30150，所述柠檬绿木霉(Trichoderma citrinoviride)为柠檬绿木霉(Trichodermacitrinoviride)ACCC 30152。
5、根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述菌剂中包括吸附基质，所述吸附基质为由鸡粪、小麦麸皮、豆饼粉、草炭和蛭石组成的混合物。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述吸附基质中，所述鸡粪、小麦麸皮、豆饼粉、草炭和蛭石的重量份数比为1∶(0.38-0.42)∶(0.18-0.22)∶(0.18-0.22)∶(0.18-0.22)。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述鸡粪、小麦麸皮、豆饼粉、草炭和蛭石的重量份数比为为1∶0.4∶0.2∶0.2∶0.2。
8、根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述活性成分和所述吸附基质的配比为4.5×108CFU孢子：(1.6-1.7)g吸附基质。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述活性成分和所述吸附基质的配比为4.5×108CFU孢子：1.65g吸附基质。
10、根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述真菌病害为由下述11种真菌中的至少一种所引起的真菌病害：黄瓜立枯病菌(R.solani)、黄瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、黄瓜黑星病菌(C.cucumerinum)、番茄早疫病菌(A.solani)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、茄子黄萎病菌(V.dahliae)、白菜黑斑病菌(A.brassicae)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、小麦根腐病菌(B.sorokinianum)、斑点落叶病菌(A.mali)和青椒疫病病菌(P.capsici)。
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