CN101633915B

CN101633915B - 布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法

Info

Publication number: CN101633915B
Application number: CN2009100566865A
Authority: CN
Inventors: 姚璎; 杲光伟; 李大伟
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Taizhou Xinshengyuan Biotechnology Pharma Co., Ltd.
Priority date: 2009-08-20
Filing date: 2009-08-20
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2029-08-20
Also published as: CN101633915A

Abstract

一种生物技术领域的酶的布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，具体步骤如下：分别设计引物，扩增布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶的α亚基和β亚基基因；将α亚基和β亚基基因分别克隆到原核表达载体pET21a(+)中，构建pET21a(+)-PheRSα及pET21a(+)-PheRSβ表达载体；将α亚基的操纵子亚克隆到pET21a(+)-PheRSβ中，形成重组共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ；将重组共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ转化大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中，IPTG诱导表达；收集裂解后的菌液上清，纯化蛋白，得布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶。本发明构建布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶(PheRS)的重组质粒，表达纯化出布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶蛋白，为抗寄生虫药物的筛选奠定了基础。

Description

布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的酶的制备方法，具体是一种布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法。

背景技术

布氏锥虫是一种在撒哈拉以南非洲地区所特有的寄生虫，当侵入寄主后会引起非洲锥虫病或昏睡病，每年引起50,000～200,000的死亡。锥虫主要通过采采蝇叮咬来传染给人和牲畜，早期主要表现为不舒服和不规律的发热；如果不及时治疗，寄生虫会侵入中央神经***，最终导致昏迷并引起死亡。目前市场上存在的药物都存在着一些缺陷，比如药物毒性、缺乏胃肠外管理抗药性等都是需要解决的问题。

近年来，随着生物化学的大力发展，以及锥虫基因组序列的陆续破解，为我们寻找新的药物作用靶点提供了很好的基础。氨酰tRNA合成酶(aaRS)为蛋白质生物合成过程中的一类关键酶，一旦aaRS受到抑制，其相应的tRNA就不能够结合，进而影响整个翻译过程。蛋白合成受到抑制，会导致整个细胞处于生长静息。因此，可以抑制氨酰tRNA合成酶的化合物都可以作为潜在的抗感染剂。目前，仅有一种氨酰tRNA合成酶抑制剂莫匹罗星——异亮氨酰tRNA合成酶(IleRS)抑制剂作为已上市的抗菌剂。因此以氨基酰tRNA合成酶进行药物设计和筛选，有非常好的前景。苯丙氨酰tRNA合成酶(PheRS)是最大的氨酰tRNA合成酶之一，由α₂β₂四聚体所构成，其表达和纯化有很大的难度。

经对现有技术的文献检索发现，Nina Moor在《Protein Expression andPurification》(《蛋白表达及纯化》)2002年24期第260～267页发表了题为《Cloning and Expression of Human Phenylalanyl-tRNA Synthetase inEscherichia coli：Comparative Study of Purified Recombinant Enzymes》(《人苯丙氨酰tRNA合成酶在大肠杆菌中的克隆表达：研究比较纯化的重组酶》)，文章中给出了表达纯化人类苯丙氨酰tRNA合成酶的方法，但是该方法的表达纯化步骤繁琐，对布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的表达效率较低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法。本发明构建布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶(PheRS)的重组质粒，表达纯化出布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶蛋白。

本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明涉及一种布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，分别设计引物，扩增布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶的α亚基和β亚基基因；

步骤二，将α亚基和β亚基基因分别克隆到原核表达载体pET21a(+)中，构建pET21a(+)-PheRSα及pET21a(+)-PheRSβ表达载体；

步骤三，扩增α亚基的操纵子，之后将操纵子亚克隆到pET21a(+)-PheRSβ中，形成重组共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ；

步骤四，将重组共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ转化大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中，IPTG诱导表达；

步骤五，收集裂解后的菌液上清，纯化蛋白，得布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶。

步骤一中，扩增α亚基基因的引物为：

上游引物：5’ATGAGTACCATGGAGAACACCATTCT；

下游引物：5’AAAACGCATTAGCTTTGAGTTCC。

步骤一中，扩增β亚基基因的引物为：

上游引物：5’ATGCCAACCCTCGCTGTTGTGCGTGAT；

下游引物：5’CTGGGCAAACTGAACATTCAGCTC。

步骤三中，扩增α亚基基因操纵子的引物序列为：

上游引物：5’GCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAG；

下游引物：5’AGGCAGATCTAGTTATTGCTCAGCG。

步骤五中，所述纯化采用亲和层析方法。

步骤五中，纯化时，用含1M咪唑的洗脱液洗脱亲和层析柱。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明构建布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶(PheRS)的重组质粒，表达纯化出布氏锥虫苯丙氨酸tRNA合成酶蛋白；本发明的步骤简单，纯化效果好，为抗寄生虫药物的筛选奠定了基础。

本发明中所涉及的菌株大肠杆菌DH5α已在《汪玲玲，杨辑，黄诚之，王海洪；大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学报，2008，48(7)：963～969》文献中公开。本发明涉及的菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址：上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。

本发明涉及的大肠杆菌BL21(DE3)RIPL已在《张美祥，张小梅，范三红，罗龙海，闫晓华，郭蔼光；拟南芥Alpha-dioxygenase 2原核表达、纯化及亚细胞定位预测，农业生物技术学报，2007，15(5)：816～820》可通过公开示售的商业渠道取得，如可以从美国stratagene公司购得，菌株编号为B0003。

附图说明

图1为PCR扩增布氏锥虫PheRS的α亚基β亚基的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为重组共表达质粒pET21a(+)-PheRSαβ的构建图；

图3为共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ的酶切鉴定图谱；

图4为SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达图谱；

图5为SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导纯化图谱；

图6为放射性同位素方法测定PheRS的活性曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York ColdSpring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

步骤一，布氏锥虫PheRS的α亚基、β亚基基因的获得

1、PheRS的α亚基基因的获得

(1)取布氏锥虫的全基因组DNA 20μg作为模板，通过PCR的方法扩增目的基因片段，扩增用的上下游引物均是经PAGE纯化的引物，其中，

上游(Primer F)：5’ATGAGTACCATGGAGAACACCATTCT，

下游(Primer R)：5’AAAACGCATTAGCTTTGAGTTCC；

(上游序列见SEQ ID NO：1，下游序列见SEQ ID NO：2)。

(2)用Pfu聚合酶进行PCR反应，其中模板为基因组DNA，所用引物为Primer F、与Primer R，98℃预变性2min，95℃变性1min，55℃复性1min，68℃延伸3min，共35个循环，最后72℃延伸10min；向PCR扩增后的产物加入5×上样缓冲液，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果发现，在1.5Kb处有一条条带，结果见图1，图1为PCR扩增布氏锥虫PheRS的α亚基β亚基的琼脂糖凝胶电泳图M：5000bp DNA marker；1：PCR扩增的PheRS的α亚基基因。

2、PheRS的β亚基基因的获得

(1)同PheRS的α亚基基因的获得方法，同样通过PCR的方法从布氏锥虫的全基因组DNA中扩增目的基因片段，扩增用的上下游引物序列如下：

上游(Primer F)：5’ATGCCAACCCTCGCTGTTGTGCGTGAT，

下游(Primer R)：5’CTGGGCAAACTGAACATTCAGCTC；

(上游序列见SEQ ID NO：3，下游序列见SEQ ID NO：4)。

(2)PCR反应条件为95℃变性1min，58℃复性1min，68℃延伸3min，共35个循环，最后72℃延伸10min；

(3)PCR扩增后的产物加入5×上样缓冲液后用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定在1.8Kb处有一条条带，结果见图1，泳道2：PCR扩增的PheRS的β亚基基因。

步骤二，表达质粒pET21a(+)-PheRS α及表达质粒pET21a(+)-PheRSβ的构建

分别纯化PCR扩增的α基因和β基因片断后，用PNK酶37℃反应30min磷酸化基因片断，并于70℃处理10min使酶失活。同时用PmeI酶消化表达质粒pET21a(+)-PmeI，用CIAP酶37℃反应30min将消化后的载体去磷酸化，并于85℃反应15min使酶失活。以T4DNA连接酶分别将磷酸化后的目的基因片断α基因、β基因连入经PmeI限制性内切酶处理且去磷酸化后的表达载体pET21a(+)-PmeI中，构建表达质粒pET21a(+)-PheRSα，pET21a(+)-PheRSβ。质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购于天根生化公司)，抽提质粒DNA，经酶切鉴定及测序分析正确后用于共表达载体的构建。

步骤三，共表达质粒pET21a(+)-PheRSαβ的构建

以pET21a(+)-PheRSβ为母体，在此基础上构建双启动子的双目的基因表达的操纵子***。构建的方法，见图2所示，用PCR的方法从pET21a(+)-PheRSα上扩增出T7promoter，目的基因α在内的操纵子；然后将其亚克隆入pET21a(+)-PheRSβ的启动子前面，从而形成共表达的质粒。图2为重组共表达质粒pET21a(+)-PheRSαβ的构建图，由重组表达载体pET21a(+)-PheRSα及组表达载体pET21a(+)-PheRSβ出发，构建重组共表达质粒pET21a(+)-PheRSαβ；

首先从pET21a(+)-PheRSα扩增基因α操纵子，以pET21a(+)-PheRSα为模板，PCR的方法扩增出包括T7promoter，目的基因α在内的操纵子，其中所涉及的引物如下：

上游引物F：5’GCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAG，

下游引物R：5’AGGCAGATCTAGTTATTGCTCAGCG；

BglII

(上游序列见SEQ ID NO：5，下游序列见SEQ ID NO：6)。

扩增出的目的基因经回收纯化后，用BglII限制性内切酶消化，以T4DNA连接酶连接入用同样的内切酶消化的pET21a(+)-PheRSβ中，构建共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ。然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，抽提质粒DNA，经BglII限制性内切酶鉴定正确的重组克隆，并用Sanger双脱氧末端终止法测定DNA序列。酶切鉴定图见图3所示，重组的共表达质粒用BamHI酶消化后，出现约为9kb的片段，经BglII酶切消化后，出现1.7kb和7.2kb大小的片断。图3共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ的酶切鉴定图谱，图中：M：1kb DNAmarker；1：BamHI限制性内切酶消化后的片断；2：BglII限制性内切酶消化后的片断。

步骤四，布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶基因的表达

将经酶切及测序鉴定后正确的共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)RIPL中。将上述经鉴定含有共表达载体的表达菌的单菌落接种到含有2ml含氨卞青霉素100mg/L的LB培养基中，37℃过夜活化培养，按体积比为1∶1000接种到500ml的LB培养基，37℃150rpm摇菌，约4h，待A₅₅₀OD为0.3～0.8时，取出培养瓶，冰上冷却后，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，20℃～25℃过夜培养。分别收集未诱导与诱导后的菌液进行8％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，诱导表达结果见图4，图4中：由泳道1、2，可以看到诱导后α亚基(55KD)和β亚基(72KD)处均有诱导表达；图4为SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达图谱M：标准蛋白Marker；1：未经诱导的菌液；2：IPTG诱导以后的菌液；3：诱导后裂解获得的上清；4：诱导后裂解获得的沉淀；

步骤五，布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶蛋白的纯化

1、蛋白纯化前处理：取IPTG诱导表达后菌液4800rpm，20min，弃上清，收集菌体。加入10ml pH值为7.8的预冷的1×PBS重悬沉淀，加溶菌酶至终浓度1mg/mL，蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mmol/L；超声破碎细胞，功率200W～400W，超声3s，停6s，共超声30min，当溶液不粘稠后，加入Triton-100至终浓度1％(W/V)；4℃，13000rpm，离心20min，分别收集上清与沉淀进行8％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图4中泳道3、4，表达后的蛋白多数以难溶的包涵体形式存在；

2、布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶蛋白的纯化

表达的重组蛋白用His-Bind亲和层析纯化，依次在添加柱材料的交换柱中加入3倍柱床体积的去离子水，5倍柱床体积的交换缓冲液(50mM硫酸镍)进行镍离子的交换，6倍柱床体积的结合缓冲液(0.5M NaCl，5mM咪唑，20mMTris-HCl，PH7.9)，上清液过柱，10倍柱床体积的结合缓冲液，6倍柱床体积的洗涤缓冲液(0.5M NaCl，60mM咪唑，20mM Tris-HCl，PH7.9)，6倍柱床体积洗脱缓冲液(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，PH7.9)，分管洗脱目的蛋白，收集目的蛋白，以上流速控制在1柱床体积/6min。将收集的目的蛋白置于透析袋中，用50％(V/V)甘油，0.1mg/ml BSA，5mmol/L β-巯基乙醇，1×PBS，pH 6.8的透析液过夜透析后。将透析后的蛋白取少量进行SDS-PAGE电泳，电泳图如图5所示，其余于-20℃保存。结果表明，通过本发明所提供的方法纯化得到的蛋白的纯度可达95％。图5为SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导纯化图谱，M：标准蛋白Marker；1：未经诱导的菌液；2：IPTG诱导以后的菌液；3：亲和层析纯化后的目的蛋白。

步骤六，布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的活性测定

采用放射性同位素法，以酶催化生成[14C]-Phe-tRNA复合物的量来测定酶活力。反应液包括(均指终浓度)：50mmol/L(pH 7.8)HEPES-KOH，5mmol/LMgCl₂，45mmol/L KCl，10μmol/L[14C]-Phe(0.1μCi/μL)，0.4mg/mL啤酒酵母tRNA，0.02％(W/V)BSA，1mmol/L DTT，10％(V/V)DMSO，苯丙氨酰tRNA合成酶20μL(纯化后酶稀释1000倍)。上述物质混匀后，加入终浓度为2mmol/L ATP时反应起始，混合物终体积为70μL。从加入ATP开始计时，37℃恒温下反应。在40min内每间隔10min各取3等份20μL反应液分别滴加到定性滤纸上，并立即投入到5％TCA溶液100mL中浸泡洗涤，重复3次；将取出的滤纸再投入到95％酒精中浸泡洗涤，重复3次。滤纸置于红外灯下烘干，闪烁计数仪测定，得到如图6所示的酶活性曲线。从图中可以看出在40min内产物生成量随着时间呈线性增加。

因为反应初速率与酶量呈线性关系时，初速率可以反映酶的含量，因此，为了保证所获得的为反应初速率，最终测定酶活力时我们选择以下条件：同上述的酶反应体系，但选择在20min内每间隔5min来测定产物的生成量随时间的变化。酶的活力单位1U定义为在上述最适反应条件下每分钟生成1nmol产物[14C]-Phe-tRNA时的酶量。根据上述方法测得的纯化出来的酶制剂中每毫升酶单位(U/mL)为70。

序列表

<110>上海交通大学

<120>布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>1

atgagtacca tggagaacac cattct 26

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>2

aaaacgcatt agctttgagt tcc 23

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>3

atgccaaccc tcgctgttgt gcgtgat 27

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>4

ctgggcaaac tgaacattca gctc 24

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>5

gcattaggaa gcagcccagt agtag 25

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>6

aggcagatct agttattgct cagcg 25

Claims

1.一种布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述的扩增α亚基基因的引物为：

上游引物：5’ATGAGTACCATGGAGAACACCATTCT；

下游引物：5’AAAACGCATTAGCTTTGAGTTCC ；

所述的扩增β亚基基因的引物为：

上游引物：5’ATGCCAACCCTCGCTGTTGTGCGTGAT；

下游引物：5’CTGGGCAAACTGAACATTCAGCTC；

步骤三，扩增α亚基的操纵子，之后将操纵子亚克隆到pET21a(+)-PheRSβ中，形成重组共表达载体pET21a(+)-PheRSαβ，具体步骤为：以pET21a(+)-PheRSβ为母体，在此基础上构建双启动子的双目的基因表达的操纵子***，用PCR的方法从pET21a(+)-PheRSα上扩增出T7promoter，目的基因α在内的操纵子；然后将其亚克隆入pET21a(+)-PheRSβ的启动子前面，从而形成共表达的质粒，扩增α亚基基因操纵子的引物序列为：

上游引物：5’GCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAG，

下游引物：5’AGGCAGATCTAGTTATTGCTCAGCG；

2.根据权利要求1所述的布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，其特征是，步骤五中，所述纯化采用亲和层析方法。

3.根据权利要求2所述的布氏锥虫苯丙氨酰tRNA合成酶的制备方法，其特征是，步骤五中，纯化时用含1M咪唑的洗脱液洗脱亲和层析柱。