CN114231484A - 一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医用材料领域,具体讲,涉及一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法及其产品和应用。ApoB抗原是动脉粥样硬化核心抗原,ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法为:获得脐带华通胶间充质干细胞;将γ‑干扰素和脐带华通胶间充质干细胞共培养,刺激脐带华通胶间充质干细胞诱导表达MHC‑Ⅱ类分子;将步骤S2获得的细胞与ApoB p18多肽共培养,产生ApoB抗原特异性间充质干细胞。本发明创建了抗原特异性WJMSCs,精准靶点抑制动脉粥样硬化(AS)免疫微环境中致病免疫细胞,从病因学上首次达到针对AS特异病理机制靶点干预之目标。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域,具体讲,涉及一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法及其产品和应用。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)导致的缺血性心血管病、脑血管病、周围血管病是世界上致死致残第一位原因。近年一个里程碑式突破是争议100年的AS病因的学说终于揭晓。AS是多种炎症因子、细胞因子、免疫细胞网络交叉作用于血管壁形成的慢性免疫炎症。Canakinumab抗炎性血栓形成结果研究(Canakinumab Anti-inflammatoryThrombosis Outcome Study,CANTOS)首次证实应用白细胞介素-Ⅰβ(IL-1β)受体拮抗剂-卡那单抗治疗的冠状动脉粥样硬化患者(N Engl J Med 2017),结果显示卡那单抗独立于降脂以外,可显著降低心血管事件,第一次以临床结果证实了AS的病因是血管壁免疫介导的慢性炎症。
然而,遗憾的是卡那单抗的副作用全身性非特异性免疫抑制导致了致死性感染,限制了临床应用。其它的免疫抑制剂如秋水仙碱、氯奎、氨甲喋呤等均因副作用无法应用于临床治疗AS。CANTOS研究证明,寄于厚望的他汀类降脂药也不能干预斑块免疫炎症链条。因此,迄今为止,国际上还没有针对AS免疫炎性病因学有效、且副作用小的治疗手段。
近年来,细胞生物学研究表明,来源于中胚层具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)有独特的免疫调节功能。已证明不同来源的MSCs对参与冠状动脉粥样斑块炎症反应的固有免疫与获得性免疫过程中的单核/巨噬细胞、NK、DC、T、B淋巴细胞等均具有调控作用。间充质干细胞(MSCs)通过细胞接触表面分子以通讯联络调控免疫功能,如MSCs的表面分子PD-L1、Gal-9、CD200等与免疫细胞表面受体作用,传导抑制性的信号,抑制CD4+CD8+T细胞的增生,使粥样斑块上ApoB+CD4 T细胞大量凋亡,限制了免疫炎症,恢复了免疫平衡。MSCs通过旁/自分泌,释放有大量胞外囊泡及生物因子、免疫调节因子,如:IDO、PGE2、TGF-β、IL-10、TSG-6、HGF等以发挥抗炎症及免疫调节效应。在Apoe-/-高胆固醇小鼠AS模型中,MSCs可有效限制并逆转AS的粥样斑块。
同时,MSCs分泌大量蛋白分子抑制金属蛋白酶活性(MMP),稳定细胞外基质成分。减少炎症细胞数量,直接补充及极化抗炎症的M2巨噬细胞,使之抗炎症细胞比值增加,逆转易损斑块,抑制组织金属蛋白活性,降低细胞基质降解,稳定纤维帽,防上斑块破裂及血栓形成等生物学效应。
大量临床硏究也证实,MSCs的免疫调节效应已有效的治疗了移植抗宿主病及多种自家免疫性病,如克隆氏病、红斑狼疮、类风湿性关节炎等。
然而MSCs的这种免疫调控作用是非特异性的,在它对AS炎症斑块免疫调控的同时,对全身多***组织均有非特异免疫功能影响,这不仅造成了MSCs非精准靶点免疫干预导致的效果差,而更重要的是全身多***免疫抑制造成不良副作用如各种病毒、细菌感染的机率增加。
为此,进一步研究又设想,应用AS特异抗原-ApoB肽段免疫诱导对ApoB+CD4T细胞有特异抑制作用的Treg细胞增殖。这一假设在非动脉粥样硬化小鼠,ApoB肽段疫苗接种确实显著提高了ApoB+Treg细胞水平。但AS小鼠模型显示,接种ApoB p18疫苗不但未增加免疫抑制Treg细胞,反而使Treg向表达RORγt or T-bet炎症转录因子的促AS辅助T细胞Th1/Th2表型转化(2020,Circulation)。因此,有人推荐构建类似***的抗原特异靶向斑块CAR生物工程,即CAR-Treg,但该工程需Treg膜外、跨膜、胞内信号、共刺激信号等基因工程,其构建工程较CAR-T或CAR-NK更复杂,造价更高,显然如此高价制备的产品,不能适合AS这样多发病常见病之常规治疗。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法。
本发明的第二发明目的在于提供该制备方法获得的ApoB抗原特异性间充质干细胞。
本发明的第三发明目的在于提供ApoB抗原特异性间充质干细胞的应用。
本发明的第四发明目的在于提供含有ApoB抗原特异性间充质干细胞的制剂。
为了完成本发明的发明目的,采用的技术方案为:
本发明涉及一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法,至少包括以下步骤:
S1、获得脐带华通胶间充质干细胞(WJMSCs);
S2、将γ-干扰素和脐带华通胶间充质干细胞共培养,刺激脐带华通胶间充质干细胞诱导表达MHC-Ⅱ类分子,获得表达MHC-Ⅱ类分子的抗原提呈细胞(WJMSCs-MHC-Ⅱ);
S3、将步骤S2获得的细胞与ApoB p18多肽共培养,产生ApoB抗原特异性间充质干细胞,
所述ApoB p18多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
可选的,在S2中,γ-干扰素的终浓度为50~200ng/mL,优选为200ng/mL;优选的,γ-干扰素共培养的时间为24~48小时,优选为48小时。
可选的,在S2中,将培养得到的细胞重悬,离心,将细胞沉淀用培养基稀释至密度为0.8~1×105个/mL,接种到新的细胞培养瓶中,将γ-干扰素加到细胞培养瓶中进行共培养;优选的,步骤S2中的培养温度为36.5~37.5℃。
可选的,在S3中,ApoB p18多肽的浓度为0.2~40μg/mL,优选为40μg/mL;进一步优选的,所述培养的温度为36.5~37.5℃,培养的时间为24小时,培养的环境中含有体积百分比浓度为4~6%的CO2。
可选的,在S3中,培养结束后用酶消化细胞、清洗、离心获得细胞;
优选的,酶采用质量百分比为0.2%~0.25%胰蛋白酶;更优选的,清洗采用PBS溶液;进一步优选的,离心的条件为800~900g离心力离心4~6min。
可选的,所述制备方法还包括将所述ApoB抗原特异性间充质干细胞进行免疫加强处理的步骤;
优选的,所述免疫加强处理包括低氧及SDF-1培养,使细胞高表达CXCR4。
可选的,所述低氧及SDF-1培养的条件为:将经过步骤S3共培养后生长良好的细胞放置到氧气体积百分比浓度为4~6%的低氧培养箱中培养8~15h;SDF-1的浓度为10~100ng/mL,优选为100ng/mL。
本发明还涉及一种采用上述方法制备得到的ApoB抗原特异性间充质干细胞。
本发明还涉及上述ApoB抗原特异性间充质干细胞在制备用于治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
本发明还涉及一种含有上述ApoB抗原特异性间充质干细胞的制剂,所述制剂为注射液,注射液中还含有人血白蛋白和生理盐水;优选的,所述注射液中人血白蛋白浓度为0.2~0.25%,ApoB抗原特异性间充质干细胞的浓度为0.75~1.25×107个/mL;更优选的,所述注射液的包装单位为1~3mL。
本发明至少具有以下有益的效果:
本发明创建了抗原特异性WJMSCs,精准靶点抑制AS中致病免疫细胞,从病因学上首次达到针对AS特异发病及病理机制靶点干预之目标。经实验证实,ApoB-WJMSCs高表达免疫抑制分子PD-L1、IDO,对AS自身抗原ApoB特异反应性CD4+显著抑制。而共刺激抗原CD80、CD86表达无增加,未诱导自身免疫反应。
在优选的技术方案中,本发明采用低氧与SDF-1联合对ApoB-WJMSCs预处理,这不仅增加其免疫活性、体内微环境耐受力,也增加了CXCR4表达,加强了归巢AS病变处。
附图说明
图1为倒置显微镜下WJMSCs的形态图,分别在培养的第一天、第二天、第三天在显微镜下拍照,图为放大100倍后的细胞形态;
图2为不同IFN-γ浓度及时间刺激下WJMSCs MHCII类分子表达流式图;
图3为不同IFN-γ浓度及时间刺激下WJMSCs MHCII类分子表达柱状图;
图4为不同FITC-ApoB浓度孵育后WJMSCs阳性率流式图;
图5为不同FITC-ApoB浓度孵育后WJMSCs阳性率柱状图;
图6为不同SDF-1浓度刺激后ApoB-WJMSCs CXCR-4表达流式图;
图7为不同SDF-1浓度刺激后WJMSCs CXCR-4表达柱状图;
图8为IFNγ刺激WJMSCs后CD80、CD86、PD-L1、IDO表达图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例涉及一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法,以新生儿遗弃的脐带为材料来源,从华通胶组织中提取华通胶源间充质干细胞(WJMSCs),经IFN-γ诱导WJMSCs MHCII分子表达,而后经ApoB p18肽孵育,创建ApoB特异性WJMSCs。将ApoB特异性WJMSCs制成的注射剂,用于靶点抑制AS中致病免疫细胞,治疗动脉粥样硬化性疾病。
至少包括以下步骤:
S1、获得脐带华通胶间充质干细胞(WJMSCs);
S2、将γ-干扰素和脐带华通胶间充质干细胞共培养,刺激脐带华通胶间充质干细胞诱导表达MHC-Ⅱ类分子,获得表达MHC-Ⅱ类分子的抗原提呈细胞(WJMSCs-MHC-Ⅱ);
S3、将步骤S2获得的细胞与ApoB p18多肽共培养,产生ApoB抗原特异性间充质干细胞,
ApoB p18多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1的氨基酸序列为:SLFFSAQPFEITAST。
具体的:华通胶源间充质干细胞制备方法,其过程为:
S11、人脐带华通胶源间充质干细胞(WJMSCs)提取:
具体方法可选用:取废弃的剖腹产新生儿脐带,使用等渗的平衡盐溶液洗去脐带残留血液,将脐带剪成3-4cm小段,将每一段脐带沿脐静脉腔剪开,再使用等渗的平衡盐溶液洗去静脉腔中残留的血液,将脐带平铺于无菌皿中,剔除脐动脉、脐静脉及脐带外膜,提取脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织,剪切成1立方毫米及以下块状,再以等渗的平衡盐溶液清洗剪成块状的华通胶组织。
S12、华通胶间充质干细胞提取培养:
具体方法可选用:在培养瓶中加入10mL无血清培养基,将剪成块状的华通胶组织均匀放置于培养瓶中,将已放入华通胶组织的培养瓶放置于36~37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行培养,3天半量换液,5~6天可观察到有间充质干细胞贴壁生长,10~12天贴壁生长的华通胶间充质干细胞融合至80%以上,进入下一工序。
S13、制成单细胞悬液:
具体方法可选用:弃细胞培养瓶中的培养基,加入PBS冲洗瓶底,弃冲洗液,加入质量百分比浓度为0.2%~0.25%的胰蛋白酶,并均匀的铺满瓶底进行消化,1~2分钟后显微镜下可见细胞收缩,加入3mL细胞培养基中止消化,用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀,把细胞制成单细胞悬液。
S14、洗涤:
具体方法可选用:将细胞悬液经过100μm筛网移到50mL离心管中,加入20mL PBS混匀,(100~200)g离心力离心10min,弃上清液,此为洗涤细胞,可重复前述步骤把细胞洗涤一遍。
S15、传代:
具体方法可选用:加入无血清培养基,调整细胞浓度为(0.8~1)×105/mL,将细胞悬液加入到细胞培养瓶中,使每瓶中细胞数量为(0.8~1)×106细胞,此步骤为传代,将传代细胞放置于36~37℃、体积浓度为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中扩增培养,每三天换液,待细胞融合至80~90%时再传代培养,以便进入下一工序。
S16、WJMSCs的3D培养:
具体方法可选用:将第二代WJMSCs细胞悬液以(100~200)g离心力离心10~20min,弃上清液,加入水凝胶培养基混匀,使细胞浓度为(0.8~1)×105细胞/mL,此为水凝胶细胞悬液,在新的培养瓶中加入10mL水凝胶细胞悬液,每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8~1)×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL完全细胞培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36~37℃、体积浓度为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养,每天观察细胞生长情况。
S17、WJMSCs的3D传代培养:
具体方法可选用:3D培养6~7天后,细胞融合(70~80)%时加入36~37℃PBS10mL并放置于36~37℃水浴中,40~70min后水凝胶分解形成细胞悬液,用移液器抽吸并混匀细胞悬液,将悬液移入50mL离心管中,(100~200)g离心力离心10~20min;弃上清,再加入水凝胶混匀,加入细胞培养瓶中,使每瓶中细胞数量为(0.8~1)×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL无血清培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36~37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6~7天,每天观察细胞生长情况,取第二、三代WJMSCs进入下一工序。
在S2中,γ-干扰素的终浓度为50~200ng/mL,优选为100~200ng/mL,更优选200ng/mL;优选的,γ-干扰素共培养的时间为24~48小时,优选为48小时。
具体的,S2的步骤包括:将培养得到的细胞重悬,离心,将细胞沉淀用培养基稀释至密度为0.8~1×105个/mL,接种到新的细胞培养瓶中,将γ-干扰素加到细胞培养瓶中进行共培养;优选的,步骤S2中的培养温度为36.5~37.5℃。
具体的,IFN-γ刺激WJMSCs MHCII分子表达,其过程为:向盛装有经3D培养的WJMSCs细胞的培养瓶中加入37℃的PBS缓冲液,并将细胞培养瓶放置于37℃水浴中,水凝胶分解形成细胞悬液,混匀该细胞悬液,把细胞悬液移入离心管中,750~850g离心力离心,弃上清留取细胞沉淀,将细胞用培养基稀释至密度1×105/mL,接种到新的细胞培养瓶中;将γ-干扰素(IFN-γ)以终浓度为200ng/mL加到细胞培养瓶中,将γ-干扰素与细胞于37℃CO2培养箱中共培养48h。
在S3中,ApoB p18多肽的浓度为10~40μg/mL,优选为40μg/mL;进一步优选的,所述培养的温度为36.5~37.5℃,培养的时间为24小时,培养的环境中含有体积百分比浓度为4~6%的CO2。
可选的,在S3中,培养结束后用酶消化细胞、清洗、离心获得细胞;优选的,酶采用质量百分比为0.2%~0.25%的胰蛋白酶,优选质量百分比为0.25%的胰蛋白酶;更优选的,清洗采用PBS溶液;进一步优选的,离心的条件为800~900g离心力离心4~6min,优选为900g离心力离心5min。
ApoB p18抗原特异性WJMSCs制备的具体步骤为:将MHC II类分子表达量大于90%的细胞更换为终浓度含40μg/mL FITC-ApoB p18的培养基,37℃CO2培养箱(体积百分比浓度为5%)中继续培养24h。
培养后采用流式细胞仪检测FITC-ApoB p18-WJMSCs。
可选的,制备方法还包括将ApoB抗原特异性间充质干细胞进行免疫加强处理的步骤;
优选的,免疫加强处理包括低氧及SDF-1培养,使细胞高表达CXCR4。
可选的,低氧及SDF-1培养的条件为:将经过步骤S3共培养后生长良好的细胞放置到氧气体积百分比浓度为4~6%的低氧培养箱中培养8~15h;SDF-1的浓度为10~100ng/mL,优选为100ng/mL。
具体的:SDF-1刺激ApoB特异性MSCs CXCR-4表达的具体条件为:将ApoB特异性WJMSCs大于90%的细胞更换为终浓度为SDF-1浓度为100ng/mL的培养基,氧气体积百分比浓度为5%的低氧培养箱中继续培养12h。
本发明实施例还涉及一种采用上述方法制备得到的ApoB抗原特异性间充质干细胞。
本发明实施例还涉及上述ApoB抗原特异性间充质干细胞在制备用于治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
本发明实施例还涉及一种含有上述ApoB抗原特异性间充质干细胞的制剂,制剂为注射液,注射液中还含有人血白蛋白和生理盐水;优选的,注射液中人血白蛋白的质量百分比浓度为0.2~0.25%,ApoB抗原特异性间充质干细胞的浓度为0.75~1.25×107个/mL;更优选的,注射液的包装单位为1~3mL,优选为2mL。
制备ApoB抗原特异性间充质干细胞注射剂的步骤包括:将干细胞经组织贴壁培养、IFN-γ诱导以及ApoB p18肽孵育,将其分散于生理盐水中,配制得到注射液。
具体步骤包括:漂洗、消化、终止消化、洗涤、调整浓度、加入人血白蛋白、密封。
以下为本发明的具体实施例。
实施例1:
获得脐带华通胶间充质干细胞,从新生儿脐带内分离华通胶组织,经组织贴壁培养及3D培养,得到脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs,具体包括:
1、从新生儿脐带内分离华通胶组织包括从新生儿脐带内血管间、血管周、羊膜下三部分分离胶样粘液,
其具体包括如下步骤:
1.1无菌提取废弃的剖腹产新生儿脐带,置于PBS缓冲液中,洗去脐带表面的血迹;
1.2将脐带剪成3~4cm小段,加入生理盐水或PBS缓冲液洗涤血凝块;
1.3剪开羊膜,再沿脐静脉腔剪开脐带,撕除脐静脉内膜和外膜,撕取静脉周围、脐静脉与动脉之间、脐动脉周围的疏松***,将剥离下来的疏松***收集,即得到脐带华通胶组织。
2、将脐带华通胶组织所述组织贴壁培养及3D培养包括组织培养和3D培养,包括如下步骤:
2.1组织贴壁培养:将剥离下来的疏松***,剪成1立方毫米以下的组织块,放入无菌细胞培养瓶中贴壁培养,在细胞培养瓶中加入无血清培养基,把含有疏松***的细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度培养箱中培养,每2~4天半量更换无血清培养基,观察细胞生长情况;
2.2 3D培养:当细胞培养瓶中贴壁培养的细胞铺满瓶底80%后,弃细胞培养瓶中的无血清培养基和剩余的组织块,加入PBS缓冲液清洗细胞培养瓶底,弃清洗液,在细胞培养瓶中加入胰蛋白酶消化30~90秒,待贴壁的细胞收缩后加入无血清培养基终止消化,形成细胞悬液;混匀该细胞悬液,将细胞悬液移入离心管中,(100~150)g离心,弃上清,再加入无血清培养基得到细胞悬液;混匀该细胞悬液,细胞计数,(100~200)g离心,弃上清,再加入水凝胶混匀,得到水凝胶细胞悬液,使细胞浓度为每毫升(0.8~1)×105细胞;
准备若干个新的细胞培养瓶,在新的细胞培养瓶中加入水凝胶细胞悬液以便在每个细胞培养瓶中接种细胞;向细胞培养瓶中加入交联剂,促进水凝胶形成胶胨状,在细胞培养瓶中水凝胶液面上加入无血清培养基,将细胞培养瓶放置于37℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度培养箱扩增培养6~7天,每天观察细胞生长情况。
在倒置显微镜下观察WJMSCs形态,如图1所示。
实施例2:
获得ApoB抗原特异性间充质干细胞
1、将γ-干扰素(IFN-γ)和实施例1获得的WJMSCs共培养,在培养过程中,利用γ-干扰素(IFN-γ)激活WJMSCs,制备成为表达MHC-Ⅱ类分子的抗原提呈细胞(WJMSCs-MHC-Ⅱ);
具体的,向盛装有经3D培养的WJMSCs细胞的培养瓶中加入37℃的PBS缓冲液,并将细胞培养瓶放置于37℃水浴中,水凝胶分解形成细胞悬液,混匀该细胞悬液,把细胞悬液移入离心管中,750~850g离心力离心,弃上清留取细胞沉淀,将细胞用培养基稀释至密度1×105/mL,接种到新的细胞培养瓶中;将一定量的γ-干扰素(IFN-γ)加到细胞培养瓶中,使γ-干扰素终浓度分别为50、100、200ng/mL,γ-干扰素与细胞共培养24-48h,获得表达MHC-Ⅱ类分子的WJMSCs,用HLA-DR-FITC抗体经流式细胞仪检测证实为抗原提呈型γ-WJMSCs-MHC-Ⅱ表型。
流式细胞仪检测MHCII类分子标志物HLA-DR表达情况。
具体方法优选:弃培养瓶中的液体,加入PBS 3mL铺满瓶底清洗,弃清洗液,在培养瓶中加入质量百分比浓度为0.25%的胰蛋白酶3mL,并铺满瓶底以进行细胞消化,消化放置1~2min,观察细胞收缩成圆形时加入无血清培养基中止消化反应,移液管吹打细胞悬液和瓶底混匀细胞,将细胞悬液移入50mL离心管中制成单细胞悬浮液。用150g离心力离心5min,弃上清液,此为洗涤细胞,再加入PBS 20mL,混匀细胞,重复上述洗涤步骤再洗涤一遍。弃上清后加入PBS,调整细胞浓度为1×106/mL,加入5μL FITC-HLA-DR抗体,移液枪吹打混匀细胞,避光孵育30min,PBS漂洗细胞两遍,流式细胞仪检测。
如图2和图3所示,随着IFN-γ的作用浓度和时间增加,MHCII分子表达量也增加,检测发现,IFN-γ最优作用时间为48h,最优作用浓度为200ng/mL。
表1.IFN-γ刺激WJMSCs HLA-DR分子表达
2、ApoB p18与γ-WJMSCs共培养,产生ApoB抗原特异性WJMSCs;
具体的,ApoB p18与γ-WJMSCs-MHC-Ⅱ共培养,产生ApoB抗原特异性WJMSCs;将γ-WJMSCs-MHC-Ⅱ细胞与浓度为0.2~40μg/mL的ApoB p18-FITC(SLFFSAQPFEITAST,15氨基酸肽)共培养,37℃、5%CO2培养4h,质量百分比浓度为0.25%的胰蛋白酶消化细胞并用PBS漂洗两遍,900g离心力离心5min获取细胞,流式细胞仪检测FITC阳性率,阳性细胞为ApoB抗原特异性WJMSCs细胞。
将培养后的细胞弃去培养瓶中的液体,加入PBS 3mL铺满瓶底清洗,弃清洗液,在培养瓶中加入质量百分比浓度为0.25%的胰蛋白酶3mL,并铺满瓶底以进行细胞消化,消化放置1~2分钟,观察细胞收缩成圆形时加入无血清培养基中止消化反应,移液管吹打细胞悬液和瓶底混匀细胞,将细胞悬液移入50mL离心管中制成单细胞悬浮液。用150g离心力离心5min,弃上清液,此为洗涤细胞,再加入PBS 20mL,混匀细胞,重复上述洗涤步骤再洗涤一遍。弃上清后加入PBS,调整细胞浓度为1×106/mL,上机检测。
据检测,如图4和图5所示,随着ApoB p18浓度增加,ApoB p18-FITC的阳性率增加,ApoB p18-FITC最优浓度为40μg/mL。
表2.ApoB p18-FITC孵育WJMSCs阳性率
3、将ApoB抗原特异性WJMSCs低氧培养及SDF-1预处理加强其免疫活性、体内微环境耐受力,及增加CXCR4表达,有利于ApoB-WJMSCs靶向动脉粥样病变归巢;
具体的,将ApoB抗原特异性WJMSCs低氧培养及SDF-1预处理加强其免疫活性、体内微环境耐受力,及增加CXCR4表达,使ApoB-WJMSCs靶向动脉粥样病变归巢;将ApoB-WJMSCs低氧培养处理的方法为:将经过步骤S3共培养后生长良好的ApoB-WJMSCs放置到氧气浓度为5%的低氧培养箱中培养8~15h,同时培养液中加SDF-1 10~100μg/L,使之增加CXCR4表达;流式细胞仪分别检测ApoB-WJMSCs膜表面以及胞内CXCR4分子表达情况,具体步骤如下:将贴壁培养ApoB-WJMSCs用PBS漂洗一遍,而后用0.25%胰酶消化2~3min,加入培养基中止消化,800g离心力离心5min获取细胞,PBS漂洗两遍,使用PBS调整细胞浓度为1×107/mL后孵育抗体。
检测分为两组,一组检测细胞膜表面的CXCR4表达、另一组检测细胞内的CXCR4表达。孵育抗体时,分别取细胞悬液于3个离心管中,其中一管加入PE荧光标记的抗体20μL,孵育30min,PBS洗涤2遍,此为检测管,另一管加入20μL Mouse PE-IgG1与检测管一致处理,为同型对照管,另一管加入PBS重悬后不经过抗体孵育的细胞为空白对照管,经流式细胞仪进行流式检测,记录标记阳性细胞百分比。
流式细胞仪检测CXCR-4表达情况的方法为:将获得的细胞弃去培养瓶中的液体,加入PBS 3mL铺满瓶底清洗,弃清洗液,在培养瓶中加入质量百分比浓度为0.125%胰蛋白酶3mL,并铺满瓶底以进行细胞消化,消化放置1~2分钟,观察细胞收缩成圆形时加入无血清培养基中止消化反应,移液管吹打细胞悬液和瓶底混匀细胞,将细胞悬液移入50mL离心管中制成单细胞悬浮液。用150g离心力离心5min,弃上清液,此为洗涤细胞,再加入PBS20mL,混匀细胞,重复上述洗涤步骤再洗涤一遍。加入200μL PBS,同时加入5μL FITC-CXCR4抗体,流式细胞仪上机检测。
为检测细胞内的CXCR4表达,将PBS悬浮调整浓度后的细胞经过破膜/固定剂(BD,美国)40℃处理30min,PBS漂洗一遍,同上述孵育抗体进行流式上机检测。得到实验结果如图6、图7和表3所示。
表3.SDF-1刺激ApoB特异性WJMSCs CXCR-4表达情况
经检测,SDF-1最优浓度为100ng/mL。
实施例3
ApoB-WJMSCs高表达免疫抑制分子PD-L1,IDO,而共刺激抗原CD80、CD86表达无增加,未诱导自身免疫反应。
1.盛装有经3D培养的WJMSCs细胞的培养瓶中加入37℃的PBS缓冲液,并将细胞培养瓶放置于37℃水浴中,水凝胶分解形成细胞悬液,混匀该细胞悬液,把细胞悬液移入离心管中,750~850g离心力离心,弃上清留取细胞沉淀,将细胞用培养基稀释至密度1×105/mL,接种到新的细胞培养瓶中培养过夜,而后将终浓度为200ng/mLγ-干扰素与细胞共培养48h。PBS漂洗细胞2次,胰酶消化细胞,800g离心力离心5min收集细胞,经PBS漂洗后,以未经γ-干扰素刺激的WJMSCs为对照组,分别用PD-L1-FITC、IDO-FITC、CD80-PE、CD86-PE抗体经流式细胞仪检测PD-L1、IOD、CD80以及CD86的表达。
经检测,如图8所示,IFN-γ刺激后CD80、CD86无表达,PD-L1、IDO有阳性表达,阳性率分别为55.18%和46.01%。
实施例4
制备ApoB抗原特异性间充质干细胞注射剂的步骤包括:
将ApoB特异性WJMSCs使用生理盐水漂洗一遍,加入胰酶消化2min,而后加入培养基终止消化,800g离心力离心5min,弃上清,加入生理盐水,在800g离心力离心5~10min洗涤细胞,弃上清,将细胞洗涤2~4遍,注入无菌注射液药管中,每管中的细胞总数量为(1.5~2.5)×107,用生理盐水补充至2mL。
ApoB特异性细胞注射液经过安全性检测后,加入人血白蛋白,人血白蛋白浓度为0.2%~0.25%,制备成每2mL包括人血白蛋白/生理盐水的溶液中含有(1.5~2.5)×107细胞数量为一个包装单位的注射液;密封,即时使用,或4~8℃保存,12小时内使用。
本申请虽然以较佳实施例公开如上,但并不是用来限定权利要求,任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下,都可以做出若干可能的变动和修改,因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
序列表
<120> 一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法及其产品和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Leu Phe Phe Ser Ala Gln Pro Phe Glu Ile Thr Ala Ser Thr
1 5 10 15
Claims (10)
1.一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法,其特征在于,至少包括以下步骤:
S1、获得脐带华通胶间充质干细胞;
S2、将γ-干扰素和脐带华通胶间充质干细胞共培养,刺激脐带华通胶间充质干细胞诱导表达MHC-Ⅱ类分子,获得表达MHC-Ⅱ类分子的抗原提呈细胞;
S3、将步骤S2获得的细胞与ApoB p18多肽共培养,产生ApoB抗原特异性间充质干细胞,
所述ApoB p18多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在S2中,γ-干扰素的终浓度为50~200ng/mL,优选为200ng/mL;
优选的,γ-干扰素共培养的时间为24~48小时,优选为48小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
在S2中,将培养得到的细胞重悬,离心,将细胞沉淀用培养基稀释至密度为0.8~1×105个/mL,接种到新的细胞培养瓶中,将γ-干扰素加到细胞培养瓶中进行共培养;
优选的,步骤S2中的培养温度为36.5~37.5℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
在S3中,ApoB p18多肽的浓度为0.2~40μg/mL,优选为40μg/mL;
进一步优选的,所述培养的温度为36.5~37.5℃,培养的时间为24小时,培养的环境中含有体积百分比浓度为4~6%的CO2。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在S3中,培养结束后用酶消化细胞、清洗、离心获得细胞;
优选的,酶采用质量百分比为0.2%~0.25%胰蛋白酶;
更优选的,清洗采用PBS溶液,
进一步优选的,离心的条件为800~900g离心力离心4~6min。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括将所述ApoB抗原特异性间充质干细胞进行免疫加强处理的步骤;
优选的,所述免疫加强处理包括低氧及SDF-1培养,使细胞高表达CXCR4。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,
所述低氧及SDF-1培养的条件为:将经过步骤S3共培养后生长良好的细胞放置到氧气体积百分比浓度为4~6%的低氧培养箱中培养8~15h;SDF-1的浓度为10~100ng/mL,优选为100ng/mL。
8.一种采用如权利要求1~7任一项所述的方法制备得到的ApoB抗原特异性间充质干细胞。
9.如权利要求8所述的ApoB抗原特异性间充质干细胞在制备用于治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
10.一种含有如权利要求8所述的ApoB抗原特异性间充质干细胞的制剂,其特征在于,所述制剂为注射液,注射液中还含有人血白蛋白和生理盐水;
优选的,所述注射液中人血白蛋白浓度为0.2~0.25%,ApoB抗原特异性间充质干细胞的浓度为0.75~1.25×107个/mL;
更优选的,所述注射液的包装单位为1~3mL。
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