CN101621938B - 鱼子的加工方法及该方法制备的加工鱼子 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了加工鱼子的方法，所述方法可以在不使用亚硝酸盐等发色剂，或者减少发色剂使用量的条件下，生产具有良好色泽的鱼子。还公开了通过所述方法生产的加工鱼子。在鱼子中，添加对该鱼子具有色泽改善效果的乳酸菌。上述具有色泽改善效果的乳酸菌，优选的是属于乳杆菌属(Lactobacillus)或肉食杆菌属(Carnobacterium)的乳酸菌，更优选的是棒状乳杆菌K12(Lactobacillus coryniformis K12、保藏编号FERMBP-10945)、或Carnobacterium maltaromaticum B64(保藏编号FERMBP-10449)。
Description
技术领域
本发明涉及具有改善鱼子色泽效果的鱼子加工方法，以及根据该方法制备的加工鱼子。
背景技术
已知的鱼子加工品有，例如：以明太鱼(Theragra chalcogramma)卵作为原料的鳕鱼子、芥末鳕鱼子，以鳟鱼卵为原料的鳟鱼子、以鲑鱼卵为原料的鲑鱼子、筋子，以飞鱼卵为原料的飞鱼子，以鲻鱼、金枪鱼卵为原料的干鱼子，以鲟鱼卵为原料的鱼子酱，以鲱鱼卵为原料的青鱼子，以香鱼卵为原料的Kouruka等。这些鱼子加工品一般是将原料鱼子进行盐腌处理，提高其保存性，再进入流通领域。此外，也有像芥末鳕鱼子一样，经过在盐水中浸泡的盐腌工序后，再经过在调味液中腌制成熟的成熟工序，而加工成的制品。
在鱼子加工品中，其色泽、口感、风味等将影响品质的优劣。因此，在生产例如鳕鱼子、芥末鳕鱼子、鲑鱼子、筋子等时，在原料鱼子中添加亚硝酸盐等发色剂，实施使色泽鲜艳的处理。
但是，发色剂中常用的亚硝酸盐，与鱼子中富含的胺发生反应，生成N-亚硝胺类，(现有技术)已指出所述N-亚硝胺类具有致癌性。
因此，出现了在不使用亚硝酸盐等发色剂的条件下，改善鱼子色泽的各种方案。
例如，下述专利文献1中，公开了防止鱼子褪色的方法，其特征是向鱼子中添加酵母的处理物。
此外，下述专利文献2中，公开了通过使用阿魏酸(ferulic acid)和烟酰胺作为发色助剂，减少亚硝酸盐类的使用量。
此外，下述专利文献3中，公开了芥末鳕鱼子的制造方法，其特征是在将明太鱼卵巢浸泡在盐水中形成鳕鱼子的盐腌工序，和将鳕鱼子浸泡在调味液中成熟的成熟工序构成的芥末鳕鱼子的制造方法中，在上述盐腌工序中使用混合了大叶竹成分的盐制成的盐水。
另一方面，本发明人等，在下述专利文献4中，提出通过在含有红色色素蛋白的食用肉或鱼肉中，添加属于肉食杆菌属(Carnobacterium)或乳杆菌属(Lactobacillus)的微生物，改变所述肉色泽的方法。
专利文献1：特开2000-245400号公报
专利文献2：特开2000-325049号公报
专利文献3：特开2004-283131号公报
专利文献4：特开2006-166815号公报
发明内容
发明解决的技术问题
但是，上述专利文献1-3中记载的方法，虽然可以不使用亚硝酸盐等发色剂，或者减少其使用量，但是无法期待所述方法能够达到代替任何发色剂使用程度的，实用的色泽改善效果。
此外，上述专利文献4中记载的方法，以向含有红色色素蛋白的食用肉或鱼肉中添加为目的，而并没有探讨该方法对于鱼子的色泽改善是否有效。
因此，本发明的目的是提供改善鱼子色泽效果好的，即使在不使用亚硝酸盐等发色剂，或减少使用量的条件下，也可以使鱼子的色泽良好，可以抑制鱼子褪色的鱼子加工方法，以及通过该方法获得的加工鱼子。
解决技术问题的手段
为了实现上述目的，本发明的其中一方面提供了鱼子的加工方法，其特征是在鱼子中，添加对该鱼子具有色泽改善效果的乳酸菌。
根据本发明，通过在鱼子中添加上述乳酸菌，由于所述乳酸菌的作用，出于未知的原因，可以改善鱼子的色泽，特别是可以增强鱼子的红色。因此，即使在不使用亚硝酸盐等发色剂或减少其使用量的条件下，也可以获得色泽良好的鱼子加工品。此外，还可以在抑制乳酸菌以外的普通活菌的增殖、提高保存性的同时，获得使风味良好的效果。进一步地，作为本发明中的“改善色泽”的概念，不仅包括使鱼子的色泽良好，特别是增强鱼子的红色，还包括通过抑制鱼子的褪色，保持色泽良好的含义。
在本发明中，具有上述色泽改善效果的乳酸菌，优选的是乳杆菌属(Lactobacillus)或肉食杆菌属(Carnobacterium)的乳酸菌。此外，具有上述色泽改善效果的乳酸菌，更优选的是选自棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)、分歧肉食杆菌(Carnobacterium divergens)和Carnobacterium maltaromaticum中的至少一种。进一步地，具有上述色泽改善效果的乳酸菌，更优选的是棒状乳杆菌K12(Lactobacillus coryniformis K12，保藏编号：FERM BP-10945)，或Carnobacterium maltaromaticum B64，(保藏编号：FERM BP-10449)。这些乳酸菌易于操作，可以获得更高的色泽改善效果。
此外，在本发明中，在使用含有食盐的水溶液和/或调味液浸泡处理鱼子时，在浸泡处理前，浸泡处理时或浸泡处理后，都适宜添加上述乳酸菌。在使用含有食盐的水溶液和/或调味液浸泡处理鱼子时，通过在上述时间内添加具有上述色泽改善效果的乳酸菌，在色泽优良的同时，还可以获得保存期长、风味好的鱼子加工品。
进而，在本发明中，上述鱼子最好选自明太鱼、真鳕鱼等鳕鱼类，鳟鱼、鲑鱼等鲑鳟鱼类，飞鱼、鲻鱼、鲷鱼、鲟鱼、鲱鱼、鲔鱼、圆鳍鱼、柳叶鱼、日本叉牙鱼、香鱼的卵。
另一方面，本发明还提供了通过上述方法获得的加工鱼子。如前所述，这些加工鱼子即使在不使用亚硝酸盐等发色剂，或降低其使用量的条件下，也具有良好的色泽，特别是红色增强。
发明效果
根据本发明，即使在不使用亚硝酸盐等发色剂，或减少其使用量的条件下，也可以改善鱼子的色泽。此外，还可以抑制鱼子的褪色。进一步地，在抑制乳酸菌以外的普通活菌的增殖，提高保存性的同时，还具有使风味良好的效果。
附图说明
图1显示出棒状乳杆菌K12(Lactobacillus coryniformis K12，保藏编号FERM BP-10945)及其近缘种的进化树。
图2显示出对于无添加鳕鱼子的颜色改善效果。
具体实施方式
在本发明中，作为鱼子，可以列举例如以明太鱼卵作为原料的鳕鱼子、芥末鳕鱼子，以鳟鱼卵为原料的鳟鱼子、以鲑鱼卵为原料的鲑鱼子、筋子，以飞鱼卵为原料的飞鱼子，以鲻鱼卵、金枪鱼为原料的干鱼子，以鲟鱼卵为原料的鱼子酱，以鲱鱼卵为原料的青鱼子等。这些鱼子都可以将从鱼体采集后冷冻的鱼子解冻后使用。
在本发明中，可以通过传统已知的各种方法加工这些鱼子。例如，将生的鱼子用盐水等洗净后，即使仅添加具有色泽改善效果的乳酸菌，也可以获得本发明的鱼子加工品。理想的是，还可以进行浸泡在食盐水或调味液中的浸泡工序。更理想的是，在进行了生的鱼子在食盐水中浸泡的浸泡工序后，再进行在调味液中浸泡的成熟工序。在此情况下，可以在食盐水或调味液的浸泡处理前，浸泡处理时或浸泡处理后的任一个时期，添加上述乳酸菌。
对于上述调味液没有特殊的限制，例如优选从食盐、糖类、氨基酸、核酸类调味料、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸等有机酸、磷酸盐、乙醇、酒、甜料酒、辣椒等香辛料中进行适当的选择，使其溶解成水溶液使用。此外，还可以添加海带和干鲣鱼等的提取物。此外，食盐水和调味液中所含的食盐含量没有特殊限制。一般来说，理想的是1质量％～饱和食盐水浓度，更理想的是5质量％～饱和食盐水浓度。
在本发明中，使用了对鱼子具有色泽改善效果的乳酸菌。这类乳酸菌可以选取用如下所示的方法筛选的菌。
即，在市售的MRS培养基中添加1质量％的氯化钠，使用该改良MRS白土琼脂培养基，在20℃下进行7天的厌氧培养后，针对溶解碳酸钙而形成清亮区的菌落，考虑菌落的形状、大小等因素，进行菌株的1次筛选。然后，将在上述培养基中进行了1次筛选的菌株培养液，接种到不添加无发色的亚硝酸的火腿切片上，2次筛选出在接种火腿上观察到红色化的菌株。进一步地，将筛选出的菌株接种到不添加亚硝酸盐和着色剂的鳕鱼子上，最终筛选出在该鳕鱼子中呈现红色化的菌株。此外，最终筛选不限于鳕鱼子，也可以利用其它鱼子进行，还可以将抑制鱼子褪色的效果作为指标进行筛选。更理想的是使用作为要改善色泽的目标鱼子进行筛选。此外，为了观察接种菌株后的红色化程度，在接种后数小时～2周左右的保存期间内，进行色泽观察。作为其保存条件，可以在真空包装等厌氧条件下进行，也可以在像不排气包装这样的需氧条件下进行。
色泽的观察可以使用目测，也可以利用分光比色计测定反射率和L*a*b*。对于利用分光比色计评价的方法，其理想的状态如后述实施例所示，可以利用a*值与标准品比较，也可以求取在L*a*b*整个***中的色差(ΔE)。在此情况下，由于存在检测装置的差异等，因此不可以笼统的表示评价标准，一般地，当a*值的差在0.6以上时，评价为具有色泽改善效果是理想的，当a*值的差在1以上时，评价为具有色泽改善效果更为理想。此外，当L*a*b*整个***的色差(ΔE)在0.6以上时，评价为具有色泽改善效果是理想的，更理想的是当L*a*b*整个***的色差(ΔE)在1以上时，评价具有色泽改善效果。
本发明人等，通过上述筛选方法，获得了对于不添加食品添加剂的鳕鱼子，具有良好的色泽改善效果的菌株。关于该菌株，解析了16S rDNA的碱基序列，构建了和近缘种的进化树。
即，提取出上述菌株的DNA，通过PCR法扩增16S rRNA范围的DNA。针对扩增的DNA，利用ABI PRISM 310遗传分析仪(AppliedBlosystems)解析碱基序列，将获得的序列与登录在GenBank中的序列以及MicroSeq分析软件(Applied Biosystems)的数据库进行比较。进一步地，利用MicroSeq分析软件，根据近邻结合法(NJ法)构建了和近缘种的进化树。
所述结果表明，上述菌株与棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.torquens)的亲缘关系最为接近，鉴定为一种棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)。图1显示了通过近邻结合法(NJ法)构建的进化树，表1显示了上述菌株和近缘的2种菌种的碱基序列的不一致率。进一步地，解析了关于上述菌株的1472bp的碱基序列，并将其全部用于***解析。
表1
| 菌名 | 与供测试细菌的不一致率(％) |
| 棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.torquens) | 0.95 |
| 棒状乳杆菌棒状亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis) | 1.05 |
乳杆菌是发酵糖而主要生成乳酸的革兰氏阳性杆菌，是从乳制品和谷物等食品、青贮饲料、动物的肠道等中分离出来的。此外，也是公认的作为与制造酸奶和乳酸菌饮料等多种发酵食品有关的菌群。棒状乳杆菌扭曲亚种生成的乳酸几乎都是D-乳酸，已知是从青贮饲料、牛粪、污水中分离出来的。此外，棒状乳杆菌也是众所周知的制做“鲐鱼饭寿司”的乳酸菌。
上述菌株作为棒状乳杆菌K12(Lactobacillus coryniformis K12、保藏编号FERM BP-10945)保藏在独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心。此外，作为该保藏编号(保藏编号FERMBP-10945)保藏的菌，是根据布达佩斯条约，将独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心中以受理编号FERM P-21211保藏的菌移交给国际微生物受理当局的。
此外，本发明人等，还根据上述筛选方法，调查了关于在上述专利文献4中记载的发明时，从不添加亚硝酸的火腿的盐腌完成液中分离的Carnobacterium maltaromaticum B64(保藏编号FERMBP-10449)、棒状乳杆菌近缘种R11(Lactobacillus coryniformis近缘种R11、保藏编号FERM BP-10450)两种菌株，对于鳕鱼子的色泽改善效果。
结果表明，关于棒状乳杆菌近缘种R11，不能认为其对鳕鱼子具有色泽改善效果；关于Carnobacterium maltaromaticum B64，能够认为其对鳕鱼子具有色泽改善效果。因此可知，记载在专利文献4中的、对肉类具有色泽改善效果的微生物，不一定对鱼子也具有色泽改善效果。
在下表2中，显示了Carnobacterium maltaromaticum B64(保藏编号FERM BP-10449)的各种细菌学性质。
表2
可以使用以下培养基培养上述棒状乳杆菌K12(Lactobacilluscoryniformis K12和Carnobacterium maltaromaticum B64，例如下表3～6所示组成的培养基：APT培养基(商品名：DIFCO 265510)、GYP培养基、MRS培养基(商品名：OXOID CM359)、BHI培养基(商品名：BD BBL 4312424)等。由于上述各种乳酸菌都是专性厌氧菌，培养方法优选的是静置培养或二氧化碳置换培养，培养条件优选的是在25℃，15～24小时。
表3
表4
表5
表6
作为本发明使用的乳酸菌，优选的是上述棒状乳杆菌K12和Carnobacterium maltaromaticum B64，但不限于此，可以选取根据上述方法筛选的、对鱼子具有色泽改善效果的乳酸菌。特别地，因为在属于乳杆菌属(Lactobacillus)或肉食杆菌属(Carnobacterium)的乳酸菌中，存在许多对鱼子具有色泽改善效果的种类，因此，用属于乳杆菌属(Lactobacillus)或肉食杆菌属(Carnobacterium)的微生物进行上述筛选，可以比较容易地发现对鱼子具有色泽改善效果的乳酸菌。
具体而言，如后述实施例所示的，例如从棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)、分歧肉食杆菌(Carnobacterium divergens)和Carnobacteriummaltaromaticum等乳酸菌中，可以容易地发现对鱼子具有色泽改善效果的乳酸菌。
上述乳酸菌对鱼子的添加量没有特殊的限定，理想的是对于1g鱼子，可以添加100个～1亿个乳酸菌。
如前所述，可以在鱼子加工工序的任一个时期添加乳酸菌，特别地，优选的是在盐腌时或盐腌结束时添加。
如此加工好的鱼子，可以包装在小包等中，以冷藏或冷冻的状态保管、运输。
此外，在本发明中，可以添加其它的色泽改善剂，与上述乳酸菌组合使用。作为此类其它的色泽改善剂，优选的可以列举出从酵母、果实发酵物或其提取物中选择1种以上。
对于上述酵母，可以从属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的啤酒酵母、面包酵母、清酒酵母、葡萄酒酵母、烧酒酵母中选择一种以上使用。这些酵母可以使用市售的。此外，也可以使用酵母的活菌、死菌、菌体破碎物中的任一种，优选的是使用菌体破碎物。酵母的菌体破碎物，可以通过例如机械破碎菌体细胞壁的方法，和酶处理法等公认的方法制备，优选的是使用菌体破碎物悬浮在水等中的悬浊液，或者该悬浊液的上层清液。通过使用菌体破碎物，使菌体内的成分与红色色素蛋白更容易接触，可以更有效地改善色泽。
此外，作为上述果实发酵物或其提取物，可以列举出葡萄酒(红葡萄酒、白葡萄酒、玫红葡萄酒)、苹果酒、果酒(以桃、猕猴桃、杏、柿子、梨等为原料的酒)、苦艾酒(在葡萄酒中加入药草等的酒)等。在本发明中，优选的是使用不添加食品添加剂的葡萄酒。
实施例
实施例1(对鱼子具有色泽改善效果的乳酸菌的分离)
根据以下方法筛选对鱼子具有色泽改善效果的微生物。
使用改良MRS白土琼脂培养基，即在市售的MRS培养基中添加1质量％的氯化钠，在20℃下进行7天的厌氧培养后，对溶解碳酸钙而形成清亮区的菌落，考虑菌落的形状、大小等因素，进行菌株的1次筛选。
然后，将在上述培养基中进行了1次筛选的菌株培养液，接种到不添加无发色亚硝酸的火腿切片上，2次筛选出在接种火腿中观察到红色化的菌株。进一步地，将2次筛选的菌株接种到不添加亚硝酸盐和着色剂的鳕鱼子上，排气包装并在7℃、厌氧的条件下保存，最终筛选出在该鳕鱼子中观察到红色化的菌株。并且，通过目测观察判断红色化。
如前所述，将这样最终筛选出的K12株，通过16S rDNA基因碱基序列鉴定，其结果与棒状乳杆菌具有99％的同一性值，鉴定为革兰氏阳性的乳酸杆菌的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)，作为棒状乳杆菌K12(Lactobacillus coryniformis K12，保藏编号FERMBP-10945)保藏。
此外，关于已知菌株Carnobacterium maltaromaticum B64(保藏编号FERM BP-10449)、棒状乳杆菌近缘种R11(Lactobacilluscoryniformis近缘种R11，保藏编号FERM BP-10450)这2种菌株，也通过上述筛选方法，调查其对鳕鱼子的色泽改善效果。
其结果是，关于棒状乳杆菌近缘种R11，不能认为其对鳕鱼子具有色泽改善效果；关于Carnobacterium maltaromaticum B64，能够认为其对鳕鱼子具有色泽改善效果。
因此，以下实验使用棒状乳杆菌K12和Carnobacteriummaltaromaticum B64这2种菌株进行。
实施例2(无添加的鳕鱼子的颜色改善效果)
(1)为了确定无添加鳕鱼子的颜色改善效果，将实施例1中获得的乳酸菌株(K12株)和(B64株)接种到不添加食品添加剂的鳕鱼子中，进行L*a*b*比色。
上述不添加食品添加剂的鳕鱼子是将10kg的小型鳕鱼的冷冻生鱼子在冰箱中解冻，按每100份重量生鱼子使用6份重量食盐和10份重量的水，进行浸泡。浸泡最开始的6个小时，在20℃的室内条件下，每隔30分钟进行搅拌；6小时以后，在7℃的冰箱中放置24小时。腌好的鳕鱼子在7℃控水24小时完成制作。
上述乳酸菌在MRS培养基中30℃下培养12小时后，用生理盐水洗净菌体，用低温离心机(商品名“Himac72”，日立生产)浓缩，制备菌液。
然后，将制得的不添加食品添加剂的鳕鱼子，分为试验区1(接种K12株)、试验区2(接种B64株)、对照区(不接种菌株)，放入聚酰胺制的袋中，按照107CFU/g在试验区1和2中分别接种上述菌液后，用真空包装机排气包装，在设定为7℃的恒温细菌培养器(商品名“IN800”，大和科学制造)中保存11天。
(2)颜色的改善效果
在保存后的第4天和第11天，利用分光比色计(商品名“508i”，Minolta制造)检测各区的L*a*b*的比色，计算其平均值。其结果如表7和图2所示。
表7 通过接种乳酸菌对a*值的改善
| 对照区 | 试验区1(K12株接种) | 试验区2(B64株接种) | |
| 第0天 | 2.68 | 2.93 | 2.46 |
| 第4天 | 3.09 | 5.23 | 4.37 |
| 第11天 | 2.91 | 6.11 | 5.00 |
从表7中可以看出，在第4天，试验区表示鳕鱼子红色的a*值增加，表明鳕鱼子的色泽得到改善。此外，在第11天，a*值还进一步增加，进一步使鳕鱼子的色泽改善。
实施例3(无添加的芥末鳕鱼子的颜色和风味、保存性的改善效果)
(1)接种实施例1获得的乳酸菌株(K12株)，制备芥末鳕鱼子，通过L*a*b*比色、感官评价法(颜色、味道)、微生物检测方法，确定对该芥末鳕鱼子的颜色、味道、保存性的改善效果。菌液的配制与实施例2相同。
芥末鳕鱼子是使用5kg在实施例2中制备的鳕鱼子，按以下方法制备的。即，按每6份重量的浸泡液，对应10份重量的比例，将浸泡用盐腌鳕鱼子浸泡在调味液中。浸泡液的配方是日本酒35重量％、酱油13重量％、甜料酒7重量％、天然鲣鱼提取物5.0重量％、海带5.0重量％、辣椒2重量％、水33重量％。
然后，在设定为7℃的恒温细菌培养器(商品名“IN800”，大和科学制造)中，分成试验区(接种K12株)和对照区(不接种菌株)，放入聚酰胺制的袋中，按照107CFU/g在芥末鳕鱼子用调味液中接种上述菌液后，通过真空包装机排气包装，将该鳕鱼子浸泡7天，控水1天，制备芥末鳕鱼子。
(2)L*a*b*的比色
利用分光比色计(商品名“508i”，Minolta制造)，检测在芥末调味液浸泡工序前和制造好的芥末鳕鱼子的各区的L*a*b*的比色，求出其平均值。其结果如表8所示。
表8 接种K12株的芥末鳕鱼子：芥末调味液浸泡及控水前后的a*值
※对于不同符号间具有1％显著性水平的显著差异
从表8可见，在所述芥末鳕鱼子中，控水结束时试验区表示红色的a*值在1％显著性水平下显著地增加了。此外，与对照区相比，a*值显著提高，表明通过乳酸菌使红色的色泽得到了改善。
(3)感官评价
通过16名专题小组成员，对颜色、香气、味道3个项目，根据各试验区和对照区的成对检测，评价满意度。评价的方法是，两区无差别的情况作为0点，用从-3点～+3点为止的7个阶段进行相对评价，求出其平均值。其结果如表9所示。
表9感官评价的各项目的主要效果
| 试验区 | 对照区 | |
| 颜色的满意度 | 1.000** | -1.000 |
| 气味的满意度 | 0.063 | -0.063 |
| 味道的满意度 | 0.156 | -0.156 |
**是在1％显著性水平下，试验区和对照区之间具有显著差异
从表9可以看出，关于颜色，试验区与对照区相比具有优势的满意度。还可以看出，关于气味和味道，与对照区相比具有满意的倾向。
(4)保存性的效果
将该芥末鳕鱼子在7℃下保存10天，对试验区和对照区检测第10天的微生物数。
普通活菌数使用标准琼脂培养基(日本水产株式会社)，金黄色葡萄球菌和革兰氏阳性球菌数使用食盐卵黄琼脂培养基(日本水产株式会社)，根据平板表面法，在25℃下培养5天，用常规方法测定。
对于产酸菌数，利用多层CaCO3的MRS多层白土琼脂培养基(Difco公司)，利用平板表面法，在25℃下利用Anaero Pack(商品名，三菱气体化学(株))厌氧培养5天，测定清亮区的菌落作为产酸菌数。
关于大肠杆菌和大肠菌群，利用荧光培养LMX-肉汤(默克公司)液体培养基，在35℃下培养24小时，通过常规方法定性测定。表10中显示了保存第10天的样品中的普通活菌数、产酸菌数、金黄色葡萄球菌数的测定结果，和大肠菌群的定性判断结果。
表10 芥末鳕鱼子保存天数第10天
| 试验区 | 对照区 | |
| 产酸菌数 | 1.28x107 | 3.00x103 |
| 普通活菌数金黄色葡萄球菌数大肠菌群 | 7.70x1033.00x103(-) | 5.40x1053.00x103(-) |
根据表10显示，在试验区中，观察到被看做是接种的乳酸菌的产酸菌数为107CFU/g，在对照区为103CFU/g以下。试验区与对照区相比，普通活菌数也被抑制了。两区的金黄色葡萄球菌都在103CFU/g以下，大肠菌群数都是阴性。
从该结果可以显示出，在芥末鳕鱼子等中，通过接种乳酸菌(K12菌株)，形成对于该芥末鳕鱼子的优势菌群，而具有生物防腐效果。
实施例3(无添加的筋子的颜色改善效果)
为了确定筋子的颜色改善效果，将实施例1获得的乳酸菌株(K12株)接种到不添加食品添加剂的筋子中，进行L*a*b*比色。
上述乳酸菌在MRS培养基中30℃下培养12小时后，用生理盐水洗净菌体，用低温离心机(商品名“Himac72”，日立生产)浓缩，制备菌液。
筋子是以每1份重量的鲑鱼子，加入3份重量的水温10℃、3重量％浓度的食盐水，洗净，然后，每1份重量的生筋子，加入3份重量的饱和食盐水，进行20分钟的搅拌浸泡。对于这样浸泡完成的筋子，分为接种107CFU/g上述K12株菌液的试验区和不接种上述菌液的对照区。然后，将上述试验区和对照区的筋子放入为了控水而铺有吸水纸(商品名“fresh master ultra”，UniCharm生产)的聚酰胺制的袋中，通过真空包装机排气包装，在设定为7℃的恒温细菌培养器(商品名“IN800”，大和科学制造)中保存5天，控水成熟。
在盐腌结束时和控水成熟保存后，利用分光比色计(商品名“508i”，Minolta制造)检测各区的L*a*b*的比色，求出其平均值。结果如表11所示。
表11 接种K12株的盐筋子成熟保存时的a*值的变化
※对于不同符号间具有1％显著性水平的显著差异
从表11可知，在控水成熟后，表示试验区的红色的a*值，a*值的减少明显低于对照区和阳性对照区，表明几乎保持了与生鱼子相同程度的红色度。
试验例1(对分开出售的菌株的筛选)
使用从公共分开出售组织获得的微生物菌株，筛选出对鱼子具有色泽改善效果的微生物。此外，在下述表12、13中，附加JCM编号的菌株，是从独立行政法人理化学研究所生物资源中心获得的分开出售的菌株，附加NBRC编号的菌株，是从独立行政法人制品评价基准机构生物技术总部生物遗传资源部门获得的分开出售的菌株。此外，作为对照，还一起评价了关于本发明人等分离的Carnobacteriummaltaromaticum B64株、棒状乳杆菌近缘种R11株、棒状乳杆菌K11株和棒状乳杆菌K12株。
由于分开出售的菌株的种属名和来源是明确的，因此不在改良的MRS白土琼脂培养基中进行1次筛选，而将各种培养菌液按照每1g火腿涂布107，涂布在切成薄片的、不添加无发色亚硝酸的火腿上，真空包装，在7℃(或菌株的最适繁殖温度)下保存14天。通过目测评价红色化，筛选出使火腿红色化的菌株。
然后，从鳕鱼子或盐腌的真鳕鱼的卵巢(真鳕鱼子)中选出鱼子，充分搅拌，按107CFU/g边搅拌边接种所筛选的菌株，在好氧条件下，7℃下保存14天。在与上述火腿相同的条件下，通过目测评价红色化，最终筛选出在所述鳕鱼子或真鳕鱼子中可以观察到红色化的菌株。
其结果显示在表12中。
表12
*：用+表示通过目测可见红色化的评价，用-表示通过目测不可见红色化的评价
**：B64株在厌氧条件下使鳕鱼子红色化，但是在好氧条件下不能看见鱼子的红色化。
***：NBRC3956株是按每1g火腿接种107的菌液，在7℃下保存14天，不能看见红色化，但在30℃下保存2天能够看见红色化。
在分开出售的菌株中，除了菌株JCM10707、JCM1157、JCM1095、JCM1097、JCM9504、JCM9695、JCM6124、JCM2032、JCM2028、NBRC15893以外，其它的菌株中都观察到了火腿红色化。此外，在火腿中不可见红色化的菌株，在鳕鱼子和真鳕鱼子中也不可见红色化。
在分开出售的菌株中，在鳕鱼子中观察到红色化的是：菌株JCM1099、JCM1166、JCM8341、JCM8343、JCM1098、NBRC3956、K11和K12。此外，在真鳕鱼子中观察到红色化的是：JCM1099、JCM1166、JCM8341、JCM8342、JCM8343、JCM5816、JCM1157、JCM1098、NBRC3956、K11和K12。因此，在鳕鱼子和真鳕鱼子中都能观察到红色化的是：菌株JCM1099、JCM1166、JCM8341、JCM8343、JCM1098、NBRC3956、K11和K12，菌株JCM8342、JCM5816、JCM1157只在真鳕鱼子中观察到红色化。
进一步地，在实验中获得的鱼子样品中，关于K12菌株，分析了所获得的鱼子的亚硝酸浓度，确定了红色化不是由亚硝酸产生的。
根据以上结果显示，除上述实施例1中获得的棒状乳杆菌K12株和记载在专利文献4中的Carnobacterium maltaromaticum B64株以外，可以从各种微生物中，获得对鱼子具有色泽改善效果的乳酸菌，可以在鱼子的加工中使用。
试验例2(通过比色计的评价)
为了根据客观的比色数据，评价色泽变化(红色化)的程度，将上述试验例1中获得的鱼子置于比色计中，实施色泽评价。
因此，利用分光比色计(商品名“508i”，Minolta制造)，测定L*a*b*显色系的明度轴L*、(红～绿)轴a*、(黄～蓝)轴b*上的各比色值。比色数据使用对1个样品测定3次的平均值，用下述公式(1)计算色差，美国标准局规定轻微差别(slight)是在0.5-1.5NBS单位的范围内，本发明以其中的1.0(NBS单位)为基准，在该值以上判断为有色泽变化，不到该值则判断为无色泽变化。通过Dunnett测定进行统计分析的多重比较，比较对照区和各试验区。
【式1】
色差ΔE＝[(ΔL＊)2+(Δa＊)2+(Δb＊)2]1/2 … (1)
结果如表13中所示。
其结果是，除在鳕鱼子中的菌株JCM8341，在真鳕鱼子中的菌株K11、NBRC3956、JCM1098以外，在用其它全部菌株进行的实验中，目测的红色化判断(色泽评价)和比色数据的评价都是一致的。因此，根据用比色计测得的比色数据，可以客观的评价色泽变化(红色化)的程度。
此外，以目测判断有红色化时的感官红色评价得分作为1，以目测判断无红色化时的感官红色评价得分作为0，计算L*、a*、b*的各变量之间的相关性，获得如下述表14中显示的关系。
表14
如表15中明确显示出的，在鳕鱼子中试验的情况下，基于目测的红色评价和L*a*b*显色系(红～绿)轴上的a*值之间具有0.82的正相关，在真鳕鱼子中试验的情况下，可以看出有0.57的弱的正相关。
因此，明确了作为客观评价鱼子红色化程度的方法之一，用比色计测定的a*值来进行评价的方法是有效的。
实施例3(无添加的筋子的褪色抑制效果)
使用从公共分开出售组织获得的微生物菌株，筛选出对无添加的筋子具有抑制色泽褪色效果的微生物。此外，在下述表15、16中，附加JCM编号的菌株，是从独立行政法人理化学研究所生物资源中心获得的分开出售的菌株，附加NBRC编号的菌株，是从独立行政法人制品评价基准机构生物技术总部生物遗传资源部门获得的分开出售的菌株。此外，作为对照，还一起评价了关于本发明人等分离的棒状乳杆菌近缘种R11株、棒状乳杆菌K11株和棒状乳杆菌K12株。
筛选的方法是，在分割搅拌得很细的、均质化的筋子中，按照107CFU/g接种各种菌株，然后设立不添加任何物质的对照区，在好氧条件下7℃下保存15天，通过目测对比筋子的褪色来判断，挑选具有抑制褪色的效果的菌株。
结果显示在表15中。
表15
| 菌株编号 | 感官褪色评价 | ||
| 1 | JCM 8129 | 干酪乳杆菌 | 1 |
| 2 | JCM 1098 | 棒状乳杆菌棒状亚种 | 1 |
| 3 | JCM 1164 | 棒状乳杆菌棒状亚种 | 0 |
| 4 | JCM 1099 | 棒状乳杆菌扭曲亚种 | 1 |
| 5 | JCM 1166 | 棒状乳杆菌扭曲亚种 | 0 |
| 6 | JCM 8341 | 胚芽乳杆菌胚芽亚种 | 0 |
| 7 | JCM 8342 | 胚芽乳杆菌胚芽亚种 | 0 |
| 8 | JCM 8343 | 胚芽乳杆菌胚芽亚种 | 1 |
| 9 | JCM 1097 | 香肠乳杆菌 | 1 |
| 10 | JCM 2032 | 乳酸片球菌 | -1 |
| 11 | JCM 3956 | 发酵乳杆菌 | 0 |
| 12 | JCM 12007 | 乳酸乳杆菌乳酸亚种 | 0 |
| 13 | JCM 5818 | 高加索酸奶乳杆菌 | 1 |
| 14 | JCM 9136 | Carnobacterium maltaromaticum | 0 |
| 15 | K11 | 棒状乳杆菌 | 1 |
| 16 | K12 | 棒状乳杆菌 | 1 |
为了在下述试验例4中进行数值评价，把与对照相比目测判断为不可见褪色时的感官褪色评价得分作为1，目测判断为与对照几乎相同时的感官褪色评价得分作为0，与对照品相比目测判断为可见褪色时的感官褪色评价得分作为-1。与对照相比，被判断为不可见褪色的菌株是JCM8129、JCM1098、JCM1099、JCM8343、JCM1097、JCM5818、K11和K12这8株菌株。
试验例4(通过比色计的褪色评价)
为了根据客观的比色数据判断色泽的褪色程度，将上述试验例3中获得的鱼子置于比色计中，实施色泽评价。因此，在每种菌株中设定进行接种的试验区，和不接种的对照区，通过分光光度计进行与试验例2相同的测定。通过检验与每种菌株对应的t值，进行统计解析。
结果显示于表16中。
L*a*b*显色系(红～绿)轴上的a*值显示为1.5(换算为NBS单位的1.5)以上的菌株是：JCM8129、JCM8343、K11和K12这4种菌株，其在褪色比较中也是+1的评价。
此外，计算基于目测的褪色评价，与色相L*、a*、b*的各变量的相关性，获得了下表17中显示的关系。
表17
| 感官褪色评价 | ΔL* | Δa* | Δb* | |
| 感官褪色评价 | 1 | -0.259 | 0.8377 | 0.5875 |
| ΔL* | -0.259 | 1 | -0.34 | -0.3441 |
| Δa* | 0.8377 | -0.34 | 1 | 0.7934 |
| Δb* | 0.5975 | -0.3441 | 0.7934 | 1 |
如表17中明确显示出的，可以看出基于目测的褪色评价值和L*a*b*表色系的(红～绿)轴上的a*值之间有0.83的正相关。因此，明确了作为客观评价鱼子色泽褪色程度的方法之一，使用比色计测定的a*值来进行评价的方法是有效的。
受理机关填写栏
| 0-4 | 该表是与国际申请同时受理的(是/否) | |
| 0-4-1 | 有权限的职员 |
国际事务局填写栏
| 0-5 | 该表被国际事务局受理的日期 | |
| 0-5-1 | 有权限的职员 |
Claims (7)
1.鱼子的加工方法，其特征是在鱼子中，添加对该鱼子具有色泽改善效果的乳酸菌。
2.如权利要求1所述的鱼子加工方法，所述具有色泽改善效果的乳酸菌，是属于乳杆菌属(Lactobacillus)或肉食杆菌属(Carnobacterium)的乳酸菌。
3.如权利要求1所述的鱼子加工方法，所述具有色泽改善效果的乳酸菌，是选自棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)、分歧肉食杆菌(Carnobacterium divergens)和Carnobacterium maltaromaticum中的至少一种。
4.如权利要求1所述的鱼子加工方法，所述具有色泽改善效果的乳酸菌，是棒状乳杆菌K12(Lactobacillus coryniformis K12)，保藏编号：FERM BP-10945，或Carnobacterium maltaromaticum B64，保藏编号：FERM BP-10449。
5.如权利要求1所述的鱼子加工方法，在用含有食盐的水溶液和/或调味液浸泡处理鱼子时，在浸泡处理前，浸泡处理时或浸泡处理后，添加所述乳酸菌。
6.如权利要求1所述的鱼子加工方法，所述鱼子是选自鳕鱼、鳟鱼、鲑鱼、飞鱼、鲻鱼、鲷鱼、鲟鱼、鲱鱼、真鳕鱼、圆鳍鱼、柳叶鱼、日本叉牙鱼、香鱼的卵。
7.权利要求1记载的方法获得的加工鱼子。
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