CN101608020A - 用水热法制备得到的磁性Fe3O4聚合物亚微米球及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米材料的可控制备和应用技术领域，特别涉及用水热法制备得到的磁性Fe3O4聚合物亚微米球及磁性Fe3O4聚合物亚微米球的用途。本发明以三价铁盐作为铁源，以聚合物葡聚糖、壳聚糖或聚丙烯酸为表面活性剂，利用水热方法一步即可得到在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的磁性Fe3O4聚合物亚微米球、表面包覆壳聚糖的磁性Fe3O4聚合物亚微米球，或表面包覆聚丙烯酸的磁性Fe3O4聚合物亚微米球。根据这些聚合物所带官能团的不同，可以结合不同的功能分子实现在生物学上的不同应用。所述的三种聚合物磁性Fe3O4亚微米球其尺寸、均一性和单分散性可通过反应条件较好控制，球尺寸在200～1000nm之间。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料的可控制备和应用技术领域，特别涉及用水热法制备得到的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球及磁性Fe3O4聚合物亚微米球的用途。
背景技术
磁性纳米材料因具有强磁性和低细胞毒性在生物医学上有巨大的应用潜力，如在抗体和融合蛋白的纯化、药物或基因的投递、免疫检测和磁共振成像等方面都有广泛的应用。但是，单纯的磁性纳米材料在生物医学上的应用存在着严重的缺陷，因此，近年来磁性纳米材料的多功能化因思路新颖和用途广泛成为研究热点，它具有集主动靶向、成像、低细胞毒性和治疗等于一身的优势。无机材料存在分散性好、尺寸和形貌易控以及均一性好等在可控性上的优势，有机材料具有毒性小、体内可降解和易于多功能化等在应用性上的优势，因此结合两者的长处构建新的多功能磁性材料将弥补相互间的不足和拓展在生物医学上的应用。
相对于一般纳米颗粒的制备而言，多功能聚合物磁性纳米球颗粒的制备难度较大，往往需要较为繁琐的制备流程，使得材料表面所带功能团量比较少，影响材料多功能化的目的，进而削弱材料在生物医学上的应用。目前，已报道的制备多功能化聚合物磁性纳米球颗粒的方法主要有：乳液聚合技术，热交联技术等。这些方法中如乳液聚合技术，存在粒径均一性、大小难以控制，分散性差的缺点，且操作复杂，流程繁琐。Zhou等制备出具有荧光、磁性和靶向细胞的多功能纳米材料，将磁性纳米材料、CdSe/ZnS与共聚物制备成复合的纳米球，再在戊二醛的作用下与氨基化的聚乙二醇(PEG)与叶酸偶联物一起合成出多功能荧光磁性纳米材料[Hai-Yan Xie，Dai-Wen PangWuzong Zhou.Small，2005，506～509]。Hyeon等将Fe3O4、阿霉素和聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)通过微乳聚合的方法，根据Fe3O4磁性材料的大小，合成出具有不同大小的多功能纳米颗粒[Jaeyun Kim，Ji Eun Lee，TaeGhwan Park.Advanced Materials，2007，478]。热交联技术也同样存在单分散性差，操作复杂，流程更为繁琐。Jon等利用热交联的方法合成出超顺磁的磁性纳米材料，以热交联合成含Si-OH的共聚物，再在80℃的条件下将共聚物胶连在磁性材料的表面，合成出表面带羧基功能团的的超顺磁材料，材料表面羧基经过修饰成氨基后，与染料Cy5.5偶联后，实现材料的多功能化[Haerim Lee，YongYeon Jeong，Sangyong Jon.J.Am.Chem.Soc.，2007，12739]。
从以上研究进展可以看出，当前多功能化聚合物磁性纳米球存在制备繁琐，用途单一，单分散性和可控性差等方面的缺点，因此探索一种操作简单，具有好的分散性及能可控制备的磁性材料是必要的，也成为当前国内外迫切需要解决的难点和热点问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用水热法制备得到的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球，该多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球的制备只需一步添加反应物后进行反应，即可实现多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球的可控制备，具有操作简单，成本低，生产周期短等特点。
本发明的再一目的在于提供多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球的用途
本发明通过一步水热法制备出了多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球，该多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球的制备仅仅通过添加葡聚糖、壳聚糖或聚丙烯酸，即可得到表面包覆羟基的葡聚糖、氨基的壳聚糖或羧基的聚丙烯酸的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球，所得到的三种多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球颗粒的单分散性好，大小较均匀，粒径可按需求较好控制。所得到的三种多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球可以与功能化物质组装，实现不同的生物应用。
三种多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球分别是在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球、表面包覆壳聚糖的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球，及表面包覆聚丙烯酸的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球。
葡聚糖材料可以携带荧光物质，在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的磁性Fe3O4聚合物亚微米球与荧光物质组装，用于细胞成像方面的研究，所述的荧光物质可为异硫氰酸荧光素(FITC)或量子点等。
壳聚糖材料可以携带DNA分子或荧光物质，所述的DNA分子为所有能在真核细胞内表达的质粒，所述的荧光物质可为异硫氰酸荧光素(FITC)或量子点等(荧光物质可为一些带羧基的荧光物质如6-羧基荧光素或四氯-6-羧基荧光素等)。在磁性Fe3O4球的表面包覆壳聚糖的磁性Fe3O4聚合物亚微米球与能在真核细胞内表达的DNA分子组装，从而可以进行基因转染、基因投递等方面应用；或在磁性Fe3O4球的表面包覆壳聚糖的磁性Fe3O4聚合物亚微米球与荧光物质组装，用于进行细胞成像方面的应用。
聚丙烯酸可以偶联重组金黄色葡萄球菌蛋白A(protein A)，在磁性Fe3O4球的表面包覆聚丙烯酸的磁性Fe3O4聚合物亚微米球与重组金黄色葡萄球菌蛋白A(protein A)偶联可以用于所有抗体的纯化。
本发明采用水热法，以三价铁盐为铁源，在醇体系中，以葡聚糖、壳聚糖或聚丙烯酸作为表面活性剂分别得到不同的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球。通过改变葡聚糖、壳聚糖或聚丙烯酸聚合物的用量和反应时间，控制所得三种多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球的粒径分布在200～1000nm。由葡聚糖作为表面活性剂可以得到表面带有羟基的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料，由壳聚糖作为表面活性剂可以得到表面带有氨基的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料，由聚丙烯酸作为表面活性剂可以得到表面带有羧基的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料，根据材料基团的性质，再结合不同的功能分子，得到不同功能化的磁性材料，实现不同的生物应用。
本发明用水热法制备得到的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球，是由以下方法制备得到的：
1)配制三价铁盐的乙二醇溶液，浓度为0.01～0.5mol/L，优选浓度为0.05～0.3mol/L；
2)向步骤1)得到溶液中加入无水醋酸钠，使无水醋酸钠的终浓度为0.05～10mol/L，优选浓度为0.5～5mol/L；
3)向步骤2)得到溶液中加入葡聚糖、壳聚糖或聚丙烯酸，使葡聚糖、壳聚糖或聚丙烯酸的终浓度为0.05～100mg/ml；其中葡聚糖的优选浓度为1～50mg/ml，壳聚糖的优选浓度为2～50mg/ml，聚丙烯酸的优选浓度为0.5～30mg/ml；
4)将步骤3)得到的混合物置于密闭的反应釜中，在100～250℃下进行反应，反应时间为5～50小时；得到在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球、表面包覆壳聚糖的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球，或表面包覆聚丙烯酸的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球。
所述的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球是实心的，粒径分布在200～1000nm。
所述的三价铁盐为FeCl3·6H2O、硝酸铁、硫酸铁或醋酸铁。
本发明的三种多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料，根据它们所带基团的性质，通过静电吸引、共价偶联等手段与一些功能化物质进行组装，进而实现在生物医学领域上的一些应用。
本发明得到的三种磁性Fe3O4聚合物亚微米球及在表面包覆的聚合物是通过一步合成策略实现的，在密闭的反应釜中，三价铁离子先结合羟基生成氢氧化铁，之后氢氧化铁发生分解生成单分散的磁性Fe3O4晶体，磁性Fe3O4晶体随着反应时间的延长而生长，即由一小的单晶体球慢慢长大成为亚微米球，聚合物在晶体生长的过程中包覆在晶体球的表面，主要起着分散的作用，能够防止晶体与晶体间在生长过程中相互聚集融合。
本发明得到的三种多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球如图1所示。本发明通过一步水热法得到多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料，由于具有在水中好的分散性的特点，适合在生物上的应用。具有操作简单，成本低，生产周期短，易于推广，具有实质性特点和显著进步。通过选用不同的聚合物，可得到表面带有不同官能团的磁性材料，根据这些官能团的特性，结合一些功能化的分子可得到不同的多功能化磁性材料，从而可以实现不同的生物应用。因此，可以根据应用的需要来选择不同的聚合物，再结合一些功能化分子来实现材料的多功能化。
本发明得到的多功能磁性Fe3O4聚合物亚微米球与过去制备方法显著不同的是，同样的反应体系，同样的反应条件，仅仅通过添加聚合物的不同从而得到带有不同基团的磁性材料，来实现不同的生物应用，更为重要的是这种方法也适合于其它聚合物。
附图说明
图1A.本发明实施例1所得到的在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球的透射电镜。
图1B.本发明实施例1所得到的在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球的扫描电镜照片。
图1C.本发明实施例3所得到的在磁性Fe3O4球的表面包覆壳聚糖的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球的透射电镜。
图1D.本发明实施例3所得到的在磁性Fe3O4球的表面包覆壳聚糖的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球的扫描电镜照片。
图1E.本发明实施例6所得到的在磁性Fe3O4球的表面包覆聚丙烯酸的聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球的透射电镜。
图1F.本发明实施例6所得到的在磁性Fe3O4球的表面包覆聚丙烯酸的聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球的扫描电镜照片。
图2.本发明实施例1所得的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料在A375肿瘤细胞上的应用；其中，图2A显示为葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球在细胞内发生明显的聚集；图2B显示葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料在细胞内的荧光成像；图2C显示为细胞与荧光共定位成像；图2B，图2C中的白框内细胞为葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料在细胞内成像的放大图。
图3A、3B、3C、3D、3E、3F.本发明实施例3、实施例4及实施例5所得的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料在基因转染上的应用；其中：图3A显示为细胞的溶酶体成像；图3B显示为壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料在细胞内的荧光成像；图3C显示为壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料在细胞内与溶酶体的共定位成像；图3D显示为细胞成像；图3E显示为基因以壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料为载体转染入细胞内可以很好的表达得到黄色荧光蛋白(GFP)；图3F显示为细胞与黄色荧光蛋白(GFP)共定位成像。
图4.本发明实施例6所得的聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料在抗体纯化上的应用；其中：图4A显示为聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料作为分离载体进行抗体纯化后的丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，1显示为纯化后的抗体，2显示为穿过液，3显示为未经纯化的小鼠腹水；图4B显示为聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球磁性材料作为分离载体对抗体的活性的分析，1显示为抗体有结合活性，2显示为对照。
具体实施方式
实施例1.
步骤1)：可控制备在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球。
配制0.1mol/L FeCl3·6H2O的乙二醇溶液，加入无水醋酸钠，使其终浓度为0.05mol/L，再加入分子量为10000的葡聚糖，使其终浓度为0.05mg/ml。将上述混合物置于密闭的反应釜中，100℃下反应25小时，得到实心的在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球。
步骤2)：步骤1)得到的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球携带FITC实现多功能化及在细胞成像上的应用。
将20mg步骤1)得到的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球加入到1mg/ml的绿色荧光染料FITC中，室温搅拌反应12小时，用磁铁收集葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球，并将它们水洗三次，冷冻干燥备用。1mg的携带FITC的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球与A375肿瘤细胞一起在DMEM培养基(北京阳光思特公司)中孵育4小时后，换液除去DMEM培养基中的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球，继续培养8小时，用激光共聚焦显微镜(confocol，德国徕卡公司)观察细胞内荧光成像。
图1A和图1B为所得到的在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球的透射电镜和扫描电镜照片，从图中可见所制备的在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球粒径较均匀，粒径为360nm，具有较好的单分散性。图2为葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球在细胞内的荧光成像情况，从图中可以看出，材料会在细胞内发生明显的聚集(图2A)，整个细胞内有明显的绿色荧光存在(图2B)，表明材料可以进入细胞并可以穿透溶酶体进入胞质内。图2C为细胞与荧光共定位成像，说明葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球能够很好的进入细胞内。
实施例2.
步骤1)：可控制备在磁性Fe3O4球的包覆葡聚糖的葡聚糖磁性Fe3O4亚微米球。
配制0.25mol/L硝酸铁的乙二醇溶液，加入无水醋酸钠，使其终浓度为1mol/L，再加入分子量为10000的葡聚糖，使其终浓度为100mg/ml。将上述混合物置于密闭的反应釜中，200℃下反应5小时，得到实心的在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球。
步骤2)：步骤1)得到的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球携带FITC实现多功能化及在细胞成像上的应用。
将20mg步骤1)得到的葡聚糖磁性亚微米球加入到1mg/ml的量子点中，室温搅拌反应12小时，用磁铁收集葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球，并将它们水洗三次，冷冻干燥备用。将1mg的携带FITC的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球于A375肿瘤细胞中，一起在DMEM培养基(北京阳光思特公司)中孵育4小时后换液除去DMEM培养基中的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球，继续培养8小时，用激光共聚焦显微镜(confocol，德国徕卡公司)观察细胞内荧光成像。
所得到包覆羟基的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球的表征同实施例1类似，粒径为760nm，具有较好的单分散性。表面包覆羟基的葡聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球携带异硫氰酸荧光素(FITC)能够实现多功能化，在细胞检测上的应用及现象同实施例1类似。
实施例3.
步骤1)：可控制备在磁性Fe3O4球的包覆壳聚糖的壳聚糖磁性Fe3O4亚微米球。
配制0.01mol/L FeCl3·6H2O的乙二醇溶液，加入无水醋酸钠，使其终浓度为10mol/L，再加入分子量为50000～800000的壳聚糖，使其终浓度为20mg/ml。将上述混合物置于密闭的反应釜中，150℃下反应18小时，得到实心的在磁性Fe3O4球的表面包覆壳聚糖的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球。
步骤2)：步骤1)得到的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球与FITC偶联后实现多功能化及与溶酶体共定位的研究。
与溶酶体共定位：壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球共价偶联FITC后，取1mg共价偶联FITC后的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球加入到A375细胞中，一起在DMEM培养基(北京阳光思特公司)中培养6小时后，加入溶酶体染料，培养30分钟，换液除去DMEM培养基中的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球后，用激光共聚焦显微镜(confocol，德国徕卡公司)观察细胞内荧光成像。
图1C和图1D为所得到的表面包覆壳聚糖的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球的透射电镜和扫描电镜照片，从图中可见所制备的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球粒径较均匀，粒径为230nm，具有好的单分散性。图3A、B和C为壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球在细胞内(图3B)与溶酶体(图3A)共定位(图3C)的成像情况，可以看出壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球与溶酶体基本上可以共定位，但是壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球已分布在整个细胞内(箭头所示)，表明壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球可以逃脱溶酶体的束缚进入胞质，为其实现基因转染奠定基础。
实施例4.
步骤1)：可控制备在磁性Fe3O4球的包覆壳聚糖的壳聚糖磁性Fe3O4亚微米球。
配制0.25mol/L硫酸铁的乙二醇溶液，加入无水醋酸钠，使其终浓度为0.05mol/L，再加入分子量为50000～800000的壳聚糖，使其终浓度为0.05mg/ml。将上述混合物置于密闭的反应釜中，200℃下反应30小时，得到实心的在磁性Fe3O4球的表面包覆壳聚糖的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球。
步骤2)：步骤1)得到的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球与FITC偶联后实现多功能化及在细胞转染上的应用。
基因转染：将1mg壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球加入到pH6.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入10μg的质粒pYFP，室温搅拌反应1小时，磁铁收集壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球，并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗三次，置于磷酸盐缓冲液(PBS)中，现配现用。取100μg的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球加入到A375肿瘤细胞中，一起在DMEM培养基(北京阳光思特公司)中培养48小时后，换液除去DMEM培养基中的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球后，用激光共聚焦显微镜(confocol，德国徕卡公司)观察细胞内荧光成像。
所得到的包覆氨基的壳聚糖磁性亚微米球的表征同实施例3类似。图3D、图3E和图3F为壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球所携带基因在A375肿瘤细胞的表达情况，从图中可以看出，壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球能够携带DNA在细胞内很好的表达，转染效率为8.9％。
实施例5.
步骤1)：可控制备在磁性Fe3O4球的包覆壳聚糖的壳聚糖磁性Fe3O4亚微米球。
配制0.2mol/L FeCl3·6H2O的乙二醇溶液，加入无水醋酸钠，使其终浓度为4mol/L，再加入分子量为50000～800000的壳聚糖，使其终浓度为100mg/ml。将上述混合物置于密闭的反应釜中，180℃下反应50小时，得到实心的在磁性Fe3O4球的表面包覆壳聚糖的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球。
步骤2)：步骤1)得到的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球与FITC偶联后实现多功能化及在细胞转染上的应用。
基因转染：将1mg壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球加入到pH6.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入10μg的质粒pYFP，室温搅拌反应1小时，磁铁收集壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球，并用PBS洗三次，置于PBS中，现配现用。取100μg的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球加入到A375肿瘤细胞中，一起在DMEM培养基(北京阳光思特公司)中培养48小时后，换液除去DMEM培养基中的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球后，用激光共聚焦显微镜(confocol，德国徕卡公司)观察细胞内荧光成像。
所得到的表面包覆壳聚糖的壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球的表征同实施例3类似，粒径为840nm，具有好的单分散性。壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球所携带基因在A375肿瘤细胞的表达情况，壳聚糖磁性Fe3O4聚合物亚微米球能够携带DNA在细胞内很好的表达，表达情况同实施例4中的图3D、图E和图F类似，表达效率为7.6％。
实施例6.
步骤1)：可控制备在磁性Fe3O4球的包覆聚丙烯酸的聚丙烯酸磁性Fe3O4亚微米球。
配制0.1mol/L FeCl3·6H2O的乙二醇溶液，加入无水醋酸钠，使其终浓度为1mol/L，再加入分子量为1800的聚丙烯酸，使其终浓度为100mg/ml。将上述混合物置于密闭的反应釜中，250℃下反应10小时，得到实心的在磁性Fe3O4球的表面包覆聚丙烯酸的聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球。
步骤2)：步骤1)得到的聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球与与protein A偶联后实现多功能化及在抗体纯化上的应用。
将10mg聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球加入到2.5mg/ml的碳二亚胺(EDC)和2.5mg/ml琥珀酰亚胺(NHS)混合液中，室温搅拌反应30分钟，磁铁收集聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球，并用水洗3次，将上功能化的聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球加入到0.1mg/ml的金黄色葡萄球菌蛋白A(protein A)醋酸钠缓冲液中(pH6.0，0.2mol/L)，4℃下反应2小时，磁铁收集聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球，并用pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)洗三次，加入Tris溶液(pH7.5，50m mol/L)中室温孵育30分钟，分散于磷酸盐缓冲液(PBS)中备用。20μl的小鼠腹水加入到分散聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球的1ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，4℃，搅拌反应2小时，磁铁收集聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球，并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，用甘氨酸-盐酸缓冲液(100μl，pH3.0，50m mol/L)洗脱，磷酸盐缓冲液(PBS)透析三次，聚丙烯酸凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹(Western blot)分析。
图1E和图1F为所得到的表面包覆聚丙烯酸的聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球的透射电镜和扫描电镜照片，从图中可见所制备聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球粒径较均匀，粒径为400nm，具有较好的单分散性。图4所示为抗体纯化与纯化后活性分析，从图中可看出，偶联protein A的聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球可以实现抗体的纯化(图4A)，并且对抗体的活性没有多少影响(图4B)，其操作简化了抗体的纯化。
实施例7.
步骤1)：可控制备在磁性Fe3O4球的包覆聚丙烯酸的聚丙烯酸磁性Fe3O4亚微米球。
配制0.5mol/L醋酸铁的乙二醇溶液，加入无水醋酸钠，使其终浓度为3mol/L，再加入分子量为1800的聚丙烯酸，使其终浓度为0.05mg/ml。将上述混合物置于密闭的反应釜中，150℃下反应20小时，得到实心的在磁性Fe3O4球的表面包覆聚丙烯酸的聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球。
步骤2)：步骤1)得到的聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球与protein A偶联后实现多功能化及在抗体纯化上的应用。
protein A偶联后实现多功能化及在抗体纯化上的应用试验流程同实施例6相同。
所得到的表面包覆聚丙烯酸的聚丙烯酸磁性Fe3O4聚合物亚微米球的表征同实施例6类似，粒径为960nm，具有较好的单分散性。与protein A偶联后实现多功能化及在抗体纯化上的应用情况同实施例6基本一致。
Claims (10)
1.一种用水热法制备得到的磁性Fe3O4聚合物亚微米球，其特征是，该磁性Fe3O4聚合物亚微米球是由以下方法制备得到的：
1)配制三价铁盐的乙二醇溶液，浓度为0.01～0.5mol/L；
2)向步骤1)得到溶液中加入无水醋酸钠，使无水醋酸钠的终浓度为0.05～10mol/L；
3)向步骤2)得到溶液中加入葡聚糖、壳聚糖或聚丙烯酸，使葡聚糖、壳聚糖或聚丙烯酸的终浓度为0.05～100mg/ml；
4)将步骤3)得到的混合物置于密闭的反应釜中，在100～250℃下进行反应，反应时间为5～50小时；得到在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的磁性Fe3O4聚合物亚微米球、表面包覆壳聚糖的磁性Fe3O4聚合物亚微米球，或表面包覆聚丙烯酸的磁性Fe3O4聚合物亚微米球。
2.根据权利要求1所述的磁性Fe3O4聚合物亚微米球，其特征是：所述的磁性Fe3O4聚合物亚微米球是实心的。
3.根据权利要求1或2所述的磁性Fe3O4聚合物亚微米球，其特征是：所述的磁性Fe3O4聚合物亚微米球的粒径分布在200～1000nm。
4.根据权利要求1所述的磁性Fe3O4聚合物亚微米球，其特征是：所述的三价铁盐的乙二醇溶液的浓度为0.05～0.3mol/L。
5.根据权利要求1或4所述的磁性Fe3O4聚合物亚微米球，其特征是：所述的三价铁盐为FeCl3·6H2O、硝酸铁、硫酸铁或醋酸铁。
6.根据权利要求1所述的磁性Fe3O4聚合物亚微米球，其特征是：所述的无水醋酸钠的终浓度为0.5～5mol/L。
7.根据权利要求1所述的磁性Fe3O4聚合物亚微米球，其特征是：所述的葡聚糖的终浓度为1～50mg/ml；壳聚糖的终浓度为2～50mg/ml，聚丙烯酸的终浓度为0.5～30mg/ml。
8.一种权利要求1～7任一项用水热法制备得到的磁性Fe3O4聚合物亚微米球的用途，其特征是：在磁性Fe3O4球的表面包覆葡聚糖的磁性Fe3O4聚合物亚微米球与荧光物质组装，用于细胞成像方面的研究；所述的荧光物质为异硫氰酸荧光素或量子点。
9.一种权利要求1～7任一项用水热法制备得到的磁性Fe3O4聚合物亚微米球的用途，其特征是：在磁性Fe3O4球的表面包覆壳聚糖的磁性Fe3O4聚合物亚微米球与能在真核细胞内表达的DNA分子组装，用于进行基因转染、基因投递方面的应用；
在磁性Fe3O4球的表面包覆壳聚糖的磁性Fe3O4聚合物亚微米球与荧光物质组装，用于进行细胞成像方面的应用；
所述的荧光物质为异硫氰酸荧光素或量子点。
10.一种权利要求1～7任一项用水热法制备得到的磁性Fe3O4聚合物亚微米球的用途，其特征是：在磁性Fe3O4球的表面包覆聚丙烯酸的磁性Fe3O4聚合物亚微米球与重组金黄色葡萄球菌蛋白A偶联用于抗体的纯化。
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