CN101603967A - 快速检测人ABO/Rh/MN血型的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人ABO/Rh/MN血型的快速检测方法及所使用的试剂盒。本发明的方法和检测试剂盒是根据免疫层析法的原理，利用血型物质抗原抗体反应后是否有因为红细胞凝集而残留的红色物质来实现对血型的检测。本发明的方法操作简单、可避免现有普通血型检测方法的各种缺陷。本发明的方法中，被检血样的加样量不超过10微升，全部检测过程不超过2分钟。

Description

快速检测人ABO/Rh/MN血型的方法及试剂盒

发明领域

本发明涉及快速检测人类ABO/Rh/MN血型的方法及相应的试剂盒。

发明背景

血液分型方法是将人血液红细胞分成A、B、AB和O四种不同类型以及Rh血型***和MN血型***的常规方法。鉴定血型的一般方法是将受检红细胞与含有血型抗体的试剂混合，两者反应后，通过观察红细胞是否发生细胞凝集来判断被检红细胞的血型。此类方法是首先从病人血清中分离红细胞。将适量的红细胞与引入试管中或玻片上的试验溶液(含有抗A血清、抗B血清或者抗D血清或者抗M血清、抗N血清)混和，可以另外加入利于免疫反应进行的其他试剂并保温、离心和搅拌。然后肉眼观察，确定细胞是否发生了聚集。

如果样品在抗A试剂存在下发生细胞聚集，而在抗B存在下不发生聚集即鉴定为A型血。样品在抗B试剂存在下发生细胞聚集，但在抗A存在下不发生聚集则鉴定为B型血。样品与抗A和抗B试剂均有聚集，样品为AB型血。样品与抗A和抗B试剂均不发生反应则定为O型血。样品与抗D试剂发生聚集的为Rh阳性血型，样品与抗D试剂不发生凝集的血样为Rh阴性血型。MN血型***根据是否发生相应的凝集反应可以分为M、N和MN三种血型。

目前检测人ABO/Rh/MN血型的技术可以分为两类，一类是检测细胞膜上结合的血型抗原，包括红细胞盐水凝集法、中和实验、吸收实验、解离实验和混合凝集反应等。另一类是直接检测游离血型抗原，包括协同凝集反应、放射免疫反应等。

目前常用的红细胞盐水凝集法是通过已知的IgM或IgG型抗体结合新鲜红细胞表面的血型抗原，导致红细胞凝集，进而判断被检血液的血型。此方法被广泛用于临床输血前的血型检验(配型)。然而，这种方法需要相应的配套试剂，而且试剂需要低温保存，结果也难以判断。

其他血型检测方法也都存在各自的缺点，例如中和实验方法费时较长，而且灵敏度比较低。解离实验和混合凝集反应法操作要求高，每次实验需要反复摸索条件，其灵敏度也不高；协同凝结反应方法是用IgG型抗体致敏金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)，通过观察葡萄球菌是否凝集来判断被检样品的血型，但该方法对试剂保存要求较高；放射免疫和酶联免疫方法虽然灵敏度高，但是费时较长、不适合单人份检测，也无法进行现场检测。

总之，目前常用的临床血型鉴定方法存在检定时间长、手工劳动强度大，以及结果受主观偏差影响较大和存在污染的可能等问题。因此，有必要对传统的血型检测方法做出实质性的改进。

发明内容

本方法的一个目的是提供一种检测人ABO/Rh/MN血型的方法，该方法包括将被测血样滴加在预先包被固定了抗A或抗B或抗D或者抗M或者抗N血型抗体的测试条上，在测试条的一端滴加冲洗液后，使未与抗体发生凝集反应的红细胞在冲洗液的泳动下远离加样点处，而与抗体发生免疫凝集的红细胞被残留在加样点处，然后即可根据反应位点是否有凝集的红细胞残留来判定被测样品的血型。

根据本发明的一个优选实施方案，其中测试条上滴加的待测血样的体积可以小至1-10μl。所说的冲洗液是10mM磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水或者其他溶液。所说的待检血样是滴加在检测试剂条的加样垫上。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的固定血型抗体的方法可以是物理吸附或者化学交联等方法。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的待测血样可以是红细胞或者全血或者是用生理盐水、磷酸盐缓冲液等等张溶液稀释的红细胞或全血悬浮液。并且所说的血样也可以包括部分溶血或者高血脂含量的血样。

根据本发明的一个优选实施方案，其中检测结果的判断可以是肉眼观察或者利用光学信号或者电信号采集仪器进行判断。

简单地说，当血液样品与结合了相应的血型抗体的加样垫接触并反应后，即在加样垫上与相应的抗体发生免疫结合反应。用冲洗液体冲洗之后，发生了免疫结合反应的样品即在加样垫上残留显著的红色物质，而没有发生免疫结合反应的血样则被冲洗液冲洗而离开加样垫，加样点处便没有红色物质残留。从而可根据红细胞与相应抗体发生免疫反应后，加样垫上是否有红色物质的残留来判断红细胞是否和血型抗体发生了免疫反应，进而判定血液样品的ABO/Rh/MN血型。

本发明的另一个目的是提供完成上述检测方法的试剂盒，该试剂盒由检测试剂条、冲洗液和采血工具组成，其中检测试剂条由冲洗垫、加样垫、缓冲垫、吸水垫、防水胶布以及用来做背衬的聚酯板组成。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的待测血样可以是红细胞或者全血或者是用生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)等等张溶液稀释的红细胞悬浮液或者全血稀释液。并且所说的血样也可以包括溶血样品或者高血脂含量的血样。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的滴加的待测血样的体积不大于10μl。所说的冲洗液是10mM磷酸盐缓冲液、生理盐水或者其他溶液。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的固定血型抗体的方法可以是物理吸附或者化学交联等方法。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的冲洗垫、加样垫、缓冲垫、吸水垫是由玻璃纤维等具有一定孔径的多孔高分子材料制成的，并且其孔径大小至少允许单个红细胞通过。根据其材质的选择，其中冲洗垫、加样垫和缓冲垫有时又统称为玻璃纤维垫。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的待测血样是滴加在加样垫上，并且所说的冲洗液体是滴加在冲洗垫上。加样垫是固定有血型抗体的多孔载体。并且固定血型抗体的方法可以是物理吸附或者化学交联等方法。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的血样包括有一定程度溶血或者血脂含量较高的血样。

根据本发明的一个优选实施方案，其中检测结果的判断可以是用肉眼或者利用光学信号或者电信号采集和判读仪器来完成。

具体地说，使用本发明的试剂盒，检测人ABO/Rh/MN血型的操作步骤包括：

1)将人ABO/Rh/MN血型抗体直接或者间接固定在加样垫3(图2)上：通过物理吸附或者化学交联手段将血型抗体固定在具有一定孔径的玻璃纤维垫上。其中所采用的物理或者化学固定方法对抗体的生物活性影响不大，同时固定化抗体内添加有抗体蛋白保存剂，保护剂可选自牛血清白蛋白、小牛血清、蛋白胨、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮及其组合物。

取高效价的人ABO/Rh/MN血型单克隆抗体，以5mM磷酸盐缓冲液稀释到适当的效价，并加入抗体固定保护剂以利于抗体在玻璃纤维垫上的固定和保存，稀释后的抗体溶液中可加入反应增强剂，以促进后续免疫反应的进行。按照每1.5ml稀释后的抗体铺展5cm×5cm的纤维垫的比例，将抗体铺敷在预先活化的玻璃纤维垫上，37℃烘干后密封保存。

2)在加样垫3上滴加待测样品，然后在冲洗垫2(图3)上滴加冲洗液体。加样并滴加冲洗液后，即发生免疫结合反应，同时显现结果。

3)反应完成并冲洗后，可根据加样垫上是否有红色残留物来判定被检血样的血型。

在ABO血型检测试剂条上，当反应物被冲洗后，含有抗A抗体的加样垫上有显著的红色物质残留时，说明待测血样被相应抗A抗体捕获，从而与抗A抗体发生了凝集反应(即阳性反应)；冲洗后，含有抗A抗体的加样垫上没有显著的红色物质残留时，说明待测血样与抗A抗体未发生凝集反应(即阴性反应)；当反应冲洗完毕后含有抗B抗体的加样垫上有显著的红色物质残留时，说明待测血样与抗B抗体发生了凝集反应；冲洗后，含有抗B抗体的加样垫上没有显著的红色物质残留时，说明待测血样与抗B抗体未发生凝集反应。因此，由检测结果可以判定，与抗A抗B抗体均发生凝集反应的血样血型为AB型，仅与抗A抗体发生凝集反应的血样的血型为A型；仅与抗B抗体发生凝集反应的血样的血型为B型。与抗A抗B抗体均未发生凝集反应的血样的血型为O型。

在Rh血型检测试剂条上，当反应冲洗完毕后含有抗D抗体的加样垫上有显著的红色物质残留时，说明待测血样与抗D抗体未发生凝集反应；当反应冲洗完毕后含有抗D抗体的加样垫上没有显著的红色物质残留时，说明待测血样与抗D抗体未发生凝集反应。因此，由检测结果可以判定，与抗D抗体发生凝集反应的血样的血型为Rh阳性血型，与抗D抗体不发生凝集反应的血样的血型为Rh阴性血型。

在MN血型检测试剂条上，当反应物被冲洗后，含有抗M抗体的加样垫上有显著的红色物质残留时，说明待测血样被相应抗M抗体捕获，从而与抗M抗体发生了凝集反应；冲洗后，含有抗M抗体的加样垫上没有显著的红色物质残留时，说明待测血样与抗M抗体未发生凝集反应；当反应冲洗完毕后含有抗N抗体的加样垫上有显著的红色物质残留时，说明待测血样与抗N抗体发生了凝集反应。因此，由检测结果可以判定，与抗M抗N抗体均发生凝集反应的血样血型为MN型，仅与抗M抗体发生凝集反应的血样的血型为M型；仅与抗N抗体发生凝集反应的血样的血型为N型。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的快速检测试剂条由背衬、冲洗垫、加样垫、缓冲垫、吸水垫以及防水胶布组成。在背衬上依次贴上冲洗垫、加样垫、缓冲垫、吸水垫以及防水胶布。加样垫边缘压在冲洗垫边缘上，缓冲垫边缘压在加样垫边缘上，吸水垫边缘压在缓冲垫边缘上，防水胶布粘贴在冲洗垫和加样垫重叠的边缘上，以防止冲洗液体从加样垫表面漫延。背衬可以由但是不限于聚酯材料制成。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的抗体固定是指利用物理或者化学交联等方法将抗A或抗B或抗D或抗M或抗N等抗体固定在具有一定孔径的玻璃纤维垫或者其他相似孔径的载体上。固定前，可根据抗体的效价不同对抗体进行一定比例的稀释，使其达到可以使用的适当浓度。可以采用浸泡或者均匀涂抹或者喷雾的方法将抗体固定在玻璃纤维垫(加样垫)上，然后再行冻干或者烘干处理。其中所说的抗体可以是预先用戊二醛交联剂处理的。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的待测血样可以是红细胞或者全血或者用10mM磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水等等张溶液稀释的红细胞悬浮液(稀释度通常为2-50％)。有一定程度的溶血或者有较高血脂含量的血样也适用于本发明的试剂盒。

可以将经过适当稀释或未稀释的待检全血或者血细胞样品加至固定有血型抗体的加样垫上，待发生免疫结合反应后用冲洗液冲洗加样垫。冲洗液可以是10mM磷酸盐缓冲液(PBS)或者其他溶液。免疫反应后凝集的红细胞的存在可以很容易用肉眼观察到，或者也可利用光信号或者电信号采集和判读仪器读出批量样品的血型检测结果。

如进行ABO血型的检测，实际操作可以在分隔并列制作于同一块聚酯板背衬上、分别在加样垫上固定有抗A或抗B血型抗体的两条检测试剂条上完成。

如进行MN血型的检测，实际操作可以在分隔并列制作于同一块聚酯板背衬上、分别在加样垫上固定有抗M或抗N血型抗体的两条检测试剂条上完成。

本发明的人ABO/Rh/MN血型快速检测试剂盒适合血站血型筛查、街头采血以及家庭ABO/Rh/MN血型自检使用。通过快速免疫反应及简单方便的结果判读，达到对血型快速简单准确的鉴定。该方法操作简单易行，不需要额外添加抗人球蛋白等试剂。本发明的方法中，被检血样的加样量可以不超过10微升，全部检测过程不超过2分钟。

本发明快速检测人ABO/Rh/MN血型的方法和检测试剂盒是根据免疫层析法的原理，利用血型物质抗原抗体反应后是否残留有因为红细胞凝集而残留的红色物质来实现对血型的判断。本发明的方法操作简单、可避免现有普通血型检测方法的各种缺陷。本发明方法适合单人份或者多人份快速检测。特别适合采血现场ABO/Rh/MN血型的快速检测以及血型的家庭自检。如结合使用相应的仪器，该方法可用于血站***对批量血液样品ABO/Rh/MN血型的人群快速筛查。

附图说明

图1显示本发明血型检测试剂盒中ABO血型快速检测试剂条的模式图。

图2显示本发明血型检测试剂盒中ABO血型快速检测试剂条的进一步模式图结构分解。其中1为冲洗垫，2为防水胶布，3为含有血型抗体的加样垫，4为缓冲垫，5为吸水垫，6为聚酯板背衬。

图3显示本发明血型检测试剂盒中Rh血型快速检测试剂条的模式图。其中1为冲洗垫，2为防水胶布，3为含有抗D抗体的加样垫，4为缓冲垫，5为吸水垫。

图4显示本发明血型检测试剂盒中MN血型快速检测试剂条的模式图。

图5显示为固定有血型抗体的玻璃纤维垫上滴加阳性血样后的反应示意图。其中1为红细胞，2为血型抗体，3为玻璃纤维加样垫。

具体实施方案

以下实施例旨在进一步举例描述本发明，这些实施例并不以任何方式限制本发明。在不背离本发明技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或者改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：人ABO血型试剂盒中检测试剂条的制备及检测步骤

(1)在加样垫上固定血型抗体(抗A、抗B抗体)：

取高效价的血型单克隆抗A抗B抗体(由长春博德生物技术有限公司生产)，以5mM磷酸盐缓冲溶液稀释到1ml，终效价为64。在稀释后的抗体液中加入抗体固定保护剂(由5％牛血清白蛋白、5％蔗糖、5％PVP、5％小牛血清的磷酸盐缓冲液组成)以便促进抗体在玻璃纤维垫上的固定和保存。按照每1.5ml稀释后的抗体铺展5cm×5cm玻璃纤维垫的比例在预先活化的玻璃纤维垫上铺展抗体，然后37℃烘干处理并密封保存。

(2)快速检测试剂条的组装：

在一宽度约5-10cm的长方形的聚酯板背衬中央贴上20mm宽的冲洗玻璃纤维垫，然后两边依次贴上10mm宽的加样垫、缓冲垫和30mm宽的吸水垫，最后在冲洗垫和加样垫交接处用防水胶布粘贴，防止贴垫翻起以及加样和冲洗液的漫延。然后将各层均粘贴好的聚酯板切成5mm宽的条，即得到长约5-10cm，宽约5mm的检测试剂条(参见图1和图2)。

(3)样品检测：

在试剂条的加样垫上滴加5μl的全血样品。滴加待检测样品后，在冲洗垫2上缓慢匀速滴加反应冲洗液5滴。待冲洗液层析后观察加样垫的颜色。加样垫3上有显著的红色物质残留为阳性反应，加样垫3上没有红色物质残留为阴性反应。结合ABO血型抗体和红细胞反应的关系，可以很容易得知待检测样品的血型。或者，也可以利用光信号或者电信号采集***采集加样垫上残留的红色物质，然后可以对结果自动化判断，从而实现对批量血液样品的ABO血型的快速筛查。

实施例2：人Rh血型检测试剂盒中检测试剂条的制备及检测步骤

(1)在加样垫上固定血型抗体(抗D抗体)：

取高效价的血型单克隆抗D抗体(美国MILLIPORE公司生产)，以5mM磷酸盐缓冲溶液稀释到1ml，终效价为32。在稀释后的抗体液中加入抗体固定保护剂(由5％白蛋白、5％蔗糖、5％PVP、5％小牛血清的PBS溶液组成)以便促进抗体在玻璃纤维垫上的固定和保存，并且加入反应增强剂(含有2％Tween20和2％Triton X-100的磷酸盐缓冲液)，用以促进后续免疫反应的进行。按照每1.5ml稀释后的抗体铺展5cm×5cm的纤维垫的比例在预先活化的玻璃纤维垫上铺展抗体，然后37℃烘干处理，然后密封保存(参见图3)。

其他步骤与ABO血型试剂盒快速检测试剂条的制备及检测步骤类似。

实施例3：人MN血型检测试剂盒中检测试剂条的制备及检测步骤

人MN血型检测试剂盒快速检测试剂条的制备及检测步骤与人Rh血型检测试剂盒快速检测试剂条的制备及检测步骤类似(参见图4)。

实施例4：本发明血型检测方法与现有常规方法的比较

我们使用传统的血型检测方法和本发明的方法与试剂盒，对普通人群1500例个体(献血员)同时进行血型双盲法检测。结果显示，本方法的检测结果和与已知的血球液体凝集方法相比较，符合率达到100％。而且本发明可检测样本范围比较广，对于部分溶血、高血脂等样本也可以检测。同时，本发明的试剂盒检测方法避免了目前常用的临床血型鉴定方法存在检定时间长、手工劳动强度大，以及结果受操作者主观偏差影响较大和存在污染的可能等缺陷。

Claims (8)

1、一种检测人ABO/Rh/MN血型的方法，该方法包括将被测血样滴加在预先包被固定了抗A或抗B或抗D或抗M或抗N血型抗体的测试条上，在测试条的一端滴加冲洗液后，使未与抗体发生凝集反应的红细胞在冲洗液的泳动下远离加样点处，而与抗体发生免疫凝集的红细胞被残留在加样点处，然后即可根据反应位点是否有凝集的红细胞残留来判定被测样品的血型。

2、根据权利要求1的方法，其中所说的待测血样可以是红细胞或者全血或者是用生理盐水或等渗磷酸盐缓冲液稀释的红细胞或全血。

3、根据权利要求1的方法，其中所说的血样可以包括部分溶血或者高血脂含量的血样。

4、根据权利要求1的方法，其中所说的抗体是以物理吸附或者化学交联法固定在测试条上。

5、根据权利要求1的方法，其中反应位点是否有凝集可以是以肉眼观察或者利用光学信号或者电信号采集仪器进行判断。

6、用于完成根据权利要求1的方法的试剂盒，该试剂盒由检测试剂条和冲洗液及采血工具组成，其中检测试剂条由冲洗垫、加样垫、缓冲垫、吸水垫、透明防水胶布以及用来做被衬的聚酯板组成。

7、根据权利要求6的试剂盒，其中构成检测试剂条的所说的冲洗垫、加样垫、缓冲垫、吸水垫是由具有一定孔径的多孔高分子材料制成的，并且其孔径大小至少允许单个红细胞通过。

8、根据权利要求6的试剂盒，其中在固定有血型抗体的加样垫上滴加待测血样，并且在冲洗垫上滴加冲洗液。然后观察加样垫上是否有凝集的红细胞残留来判断被测血样的血型。

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