CN101573381A

CN101573381A - 激动剂TrkB抗体及其用途

Info

Publication number: CN101573381A
Application number: CNA2007800442715A
Authority: CN
Inventors: Y·王; S·B·科恩; M·纳索弗
Original assignee: IRM LLC
Current assignee: IRM LLC
Priority date: 2006-11-09
Filing date: 2007-11-06
Publication date: 2009-11-04
Also published as: ECSP099392A; SMAP200900040A; DOP2009000102A; CO6180432A2; NI200900081U; EP2087007A2; TN2009000181A1; TW200829270A; BRPI0719000A2; ZA200902943B; PE20081168A1; RU2009121641A; WO2008058127A3; AR063640A1; MX2009004881A; NO20092217L; EA200970469A1; IL198468A0; CL2007003236A1; KR20090088896A

Abstract

提供了TrkB激动剂抗体及其使用方法。

Description

激动剂TrkB抗体及其用途

相关专利申请的交叉参考

本申请要求2006年11月9日提交的美国临时专利申请60/858,169的利益，为此所述申请以其整体引入作为参考。

发明背景

I.TrkB

酪氨酸受体激酶B(TrkB)属于包括TrkA和TrkC的单跨膜受体酪氨酸激酶家族。这些酪氨酸受体激酶(trks)介导神经营养蛋白的活性。神经营养蛋白为神经存活及发育所需，并通过调整神经元结构及突触可塑性来调节突触传递。神经营养蛋白包括，但不局限于神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)。(Lo，KY等，J.Biol.Chem.，280：41744-52(2005))。TrkB是BDNF的高亲和力受体(Minichiello，等，Neuron 21：335-45(1998))。结合trk的神经营养蛋白激活受体，其二聚化并使受体胞内结构域上的特定酪氨酸残基自磷酸化(Jing，等Neuron 9：1067-1079(1992)；Barbacid，J.Neurobiol.25：1386-1403(1994)；Bothwell，Ann.Rev.Neurosci.18：223253(1995)；Segal和Greenberg，Ann.Rev.Neurosci.19：463489(1996)；Kaplan和Miller，Curr.Opinion Neurobiol.10：381391(2000))。这些磷酸酪氨酸残基作为胞内信号级联放大元件的停泊位点起作用，所述胞内信号级联放大导致神经元死亡的抑制和神经营养蛋白的其它效应。例如，Shc、FRS-2、SH2B、rAPS和PLCγ与TrkB通过磷酸化的酪氨酸残基相互作用。这些衔接分子与活化的TrkB的结合导致信号途径的开始，所述信号途径包括促***原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶和PLCγ途径，从而介导神经营养蛋白的作用(Lo，KY等，J.Biol.Chem.，280：41744-52(2005))。

lI.糖尿病

人血流中葡萄糖的浓度必须控制在相对严格的范围(每分升血液60-120毫克)内以维持正常的健康。如果血糖降得太低，导致产生称为低血糖的状况，其症状如昏晕、虚弱、头痛、意识错乱和个性改变。过量血糖，或高血糖，由于过量葡萄糖与细胞、组织和器官中蛋白质之间的化学反应，可引起组织损伤。认为该损伤会引起失明、肾衰竭、阳痿、动脉粥样硬化及对感染的易感性增加的糖尿病并发症。

糖尿病与持续的和病理升高的血糖浓度相关；在美国它是引起死亡的主要原因之一，并占全部死亡率的约5％。糖尿病分为两种主要的亚类：I型，也称为青少年糖尿病，或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，和II型，也称为成年型糖尿病，或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。

II型糖尿病的诊断包括症状的评估和尿及血液中葡萄糖的测定。血糖水平测定对准确的诊断是必须的。更具体而言，空腹血糖水平测定是所用的标准方法。然而，认为口服葡萄糖耐量试验(OGTT)比空腹血糖水平更为灵敏。II型糖尿病与受损的口服葡萄糖耐量(OGT)相关。因此，所述OGTT可帮助诊断II型糖尿病，虽然通常并非诊断糖尿病所必需(Emancipator K，Am J Clin Pathol 1997November；112(5)：66574；Type2Diabetes Mellitus，Decision Resources Inc.，March 2000)。

因此，在个体中诊断葡萄糖耐量受损，所述个体具有低于诊断II型糖尿病所需的那些空腹血糖水平，但在OGTT过程中具有介于正常人和糖尿病患者之间的血浆葡萄糖反应。认为葡萄糖耐量受损是前驱糖尿病状况，并且葡萄糖耐量受损(由OGTT定义)是发生II型糖尿病的强预测因子(Haffner S M，Diabet Med 1997 August；14Suppl 3：S128)。

II型糖尿病是与胰脏功能和/或其它胰岛素相关过程减弱相关的进行性疾病，其被升高的血糖水平加剧。因此，II型糖尿病通常具有延长的前驱糖尿病期，并且多种病理生理学机制可导致病理学上的高血糖和葡萄糖耐量受损，例如，前驱糖尿病状况中葡萄糖利用及有效性、胰岛素作用和/或胰岛素产生中的异常(Goldberg R B，Med Clin North Am 1998July；82(4)：80521)。

与葡萄糖耐受不良相关的前驱糖尿病状况也可与对腹部肥胖症、胰岛素抗药性、高脂血症及高血压的易感性相关(Groop L，Forsblom C，Lehtovirta M，Am J Hypertens 1997September；10(9Pt 2)：172S 180S；Haffner S M，J Diabetes Complications 1997March-April，11(2)：6976；Beck-Nielsen H，Henriksen J E，Alford F，Hother-Nielson O，Diabet Med1996September；13(9附录6)：S7884)。

在具有发生II型糖尿病风险的个体中进行早期干预(其集中在降低病理学上的高血糖或葡萄糖耐量受损)可预防或延迟向II型糖尿病及相关并发症的发展。因而，通过有效治疗受损的口服葡萄糖耐量和/或升高的血糖水平，人们可以预防或抑制该病症向II型糖尿病发展。参阅例如，美国专利号7,109,174。

胰岛素和磺酰脲类(口服低血糖治疗剂)是美国当今建议的两种主要类型的糖尿病药物。建议胰岛素用于I型和II型糖尿病，而通常建议磺酰脲类仅用于II型糖尿病。磺酰脲类刺激天然胰岛素的分泌并降低胰岛素抗药性；这些化合物并不代替胰岛素在代谢中的功能。大概三分之一接受磺酰脲类的患者变得耐受磺酰脲类。一些II型糖尿病患者不响应磺酰脲类治疗。在对磺酰脲类初治不响应的患者中，5-10％在约10年后可能经历磺酰脲类有效性的丧失。参阅例如，美国专利号7,115,284。

通常建议用于治疗II型糖尿病的许多抗糖尿病剂(例如磺酰脲类和噻唑烷二酮类)具有不想要的副作用：增加体重。因代谢失调和内分泌失调的增强，具有前驱糖尿病状况或具有诊断的II型糖尿病的患者中体重增加产生有害作用，而肥胖症本身就是II型糖尿病发生及渐进性恶化的关键性危险因素。因此希望具有维持或减轻体重的抗糖尿病剂。参阅例如，美国专利号7,199,174。

肥胖症是常见的并且非常严重的公共健康问题，因为它增加了个人患许多严重疾病的风险，所述疾病包括糖尿病、心脏病、中风、高血压和一些类型的癌。在过去二十年里，肥胖个体数量上的大量增加已经产生了深远的公共卫生问题。虽然研究已证明通过饮食及锻炼而减少肥胖症显著降低相关危险因素，但鉴于肥胖症与遗传学上的遗传因素紧密相关，这些治疗大半均未成功，所述遗传因素促进食欲增强、对高热量食物的偏爱、体力活动减少及脂肪生成代谢提高。参阅例如，美国专利号7,115,767。因此，本发明目的是解决目前高血糖、肥胖症和糖尿病治疗中的缺点。

发明简述

本发明提供酪氨酸激酶受体B(TrkB)的分离的抗体激动剂。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体不结合酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C。

在一些实施方案中，所述抗体结合TrkB的配体结合域(LBD)。在一些实施方案中，所述抗体与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。在一些实施方案中，所述抗体与竞争性抗体竞争结合TrkB，所述竞争性抗体包含含SEQ ID NO：3的重链可变区和含SEQ ID NO：4的轻链可变区。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区(其包含SEQ IDNO：7)和轻链可变区(其包含SEQ ID NO：8)。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区(其包含SEQ ID NO：11)和轻链可变区(其包含SEQID NO：12)。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区(其包含SEQID NO：15)和轻链可变区(其包含SEQ ID NO：16)。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区(其包含SEQ ID NO：7、11和15)和轻链可变区(其包含SEQ ID NO：8、12和16)。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区(其包含SEQ ID NO：3)和轻链可变区(其包含SEQ IDNO：4)。

在一些实施方案中，所述抗体不结合TrkB的配体结合域。在一些实施方案中，所述抗体不与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。在一些实施方案中，所述抗体与包含重链可变区(其包含SEQ ID NO：1)和轻链可变区(其包含SEQ ID NO：2)的竞争抗体竞争结合TrkB。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区(其包含SEQ ID NO：5)和轻链可变区(其包含SEQ ID NO：6)。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区(其包含SEQ ID NO：9)和轻链可变区(其包含SEQ ID NO：10)。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区(其包含SEQ ID NO：13)和轻链可变区(其包含SEQ ID NO：14)。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区(其包含SEQ ID NO：5、9和13)和轻链可变区(其包含SEQ ID N：6、10和14)。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区(其包含SEQ ID NO：1)和轻链可变区(其包含SEQ ID NO：2)。

本发明还提供包含治疗有效量的权利要求1的抗体和药物载体的生理组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含降低个体中血糖水平的活性剂。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含减少个体体重的活性剂。

本发明还提供在需要降低血糖水平和/或体重的个体中降低血糖水平和/或体重的方法。在一些实施方案中，所述方法包括对个体施用治疗有效量的酪氨酸激酶受体B(TrkB)的抗体激动剂。在一些实施方案中，所述个体是前驱糖尿病患者。在一些实施方案中，所述个体患有I型糖尿病。在一些实施方案中，所述个体患有II型糖尿病。在一些实施方案中，所述个体超重。在一些实施方案中，所述个体肥胖。

在一些实施方案中，治疗有效量的有效降低血糖的第二种活性剂与TrkB的抗体激动剂组合对个体施用。在一些实施方案中，所述第二种活性剂和TrkB的抗体激动剂作为混合物施用。在一些实施方案中，所述第二种活性剂与TrkB的抗体激动剂分别施用。在一些实施方案中，所述第二种活性剂选自胰岛素、磺酰脲类、促胰岛素剂、二甲双胍、PPARγ激动剂、PPARα激动剂、PPARδ激动剂、PPARα/γ二元激动剂、PPARα/γ/δ全激动剂、α-葡糖苷酶抑制剂、DPP-IV抑制剂和GLP-1/GLP-1类似物。

在一些实施方案中，治疗有效量的有效减少体重或肥胖症的第二种活性剂与TrkB的抗体激动剂组合对个体施用。在一些实施方案中，所述第二种活性剂和TrkB的抗体激动剂作为混合物施用。在一些实施方案中，所述第二种活性剂与TrkB的抗体激动剂分别施用。在一些实施方案中，所述第二种活性剂选自脂肪酶抑制剂、***(sibutramine)、CB-1抑制剂、托吡酯(topiramat)、糊精、糊精类似物、瘦蛋白、PYY/PYY类似物和GLP-1/GLP-1类似物。

定义

“抗体”指包含来自免疫球蛋白基因或其片段的构架区的多肽，其特异性结合并识别抗原。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，及无数种免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白种类-IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

天然发生的免疫球蛋白具有共同的核心结构，其中两条相同的轻链(约24kD)和两条相同的重链(约55或70kD)形成四聚体。每条链的氨基末端部分称为可变(V)区，并可与每条链剩余部分更保守的恒定(C)区区分开。在轻链可变区内是称为J区的C末端部分。在重链可变区内，除了J区还有D区。免疫球蛋白中绝大多数的氨基酸序列变异限制在V区中的三个单独的位置上，所述V区称为高变区或互补决定区(CDR)，其直接参与抗原结合。从氨基末端开始，这些区域分别被命名为CDR1、CDR2和CDR3。CDR被更保守的构架区(FR)固定就位。从氨基末端开始，这些区域分别被命名为FR1、FR2、FR3和FR4。例如Kabat等已经定义了CDR和FR区的位置及编号***(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and HumanServices，U.S.Government Printing Office(1991))。

示例性天然发生的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的N末端定义了主要负责抗原识别的大约100至110或更多氨基酸的可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

抗体例如以完整的免疫球蛋白或经多种肽酶消化产生的大量充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中二硫键处消化抗体，以产生Fab的二聚体F(ab)′₂，所述Fab本身是通过二硫键结合V_H-C_H1的轻链。可在温和条件下还原F(ab)′₂，以断裂铰链区中的二硫键，因而将F(ab)′₂二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体是基本含有部分铰链区的Fab(参阅F_UNDAMENTAL I_MMUNOLOGY(Paul编辑，第三版1993)。多种抗体片段按照完整抗体的消化进行定义的，技术人员将理解可通过化学或使用重组DNA方法从头合成这种片段。因此，如此所用，术语“抗体”也包括通过修饰完整抗体而产生的抗体片段，或使用重组DNA方法学从头合成的那些(例如单链Fv)，或使用噬菌体展示文库鉴定的那些(参阅例如，McCafferty等，Nature 348：552-554(1990))。

对于单克隆或多克隆抗体的制备，可使用本领域已知的任何技术(参阅例如，Kohler&Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，77-96页(1985))。“单克隆”抗体指来自单个克隆的抗体。用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)可适用于产生针对本发明多肽的抗体。同样，转基因小鼠，或其它生物(如其它哺乳动物)可用于表达人源化抗体。或者，噬菌体展示技术可用于鉴定特异性结合所选抗原的抗体和异聚体Fab片段(参阅例如，McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)；Marks等，Biotechnology 10：779-783(1992))。

“嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、代替或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接到不同的或改变的类型、效应子功能和/或种类，或者完全不同的分子(其赋予嵌合抗体新的性质，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)的恒定区上；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、代替或交换。

“人源化”抗体是保留非人类抗体的反应性但在人类中免疫原性较低的抗体。这例如可通过保留非人类CDR区并用它们的人类对应物替代抗体的剩余部分来实现。参阅例如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994)。

当指蛋白质或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“特异性(或选择性)与其免疫反应”指结合反应，其决定在蛋白质和其它生物制剂的异源群体中所述蛋白质的存在。因此，在未指定的免疫测定条件下，特定的抗体至少以两倍背景结合特定蛋白质，并且基本上不大量结合样品中存在的其它蛋白质。在这种条件下的特异性结合抗体可能需要选择对特定蛋白质具有特异性的抗体。可通过扣除与例如TrkA或TrkC交叉反应的抗体来完成这种选择。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定可常规用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(参阅例如，Harlow&Lane，Antibodies，实验室手册(1988)，关于可用于测定特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述)。通常，特异性或选择性反应将具有至少两倍背景信号或噪音，并且更通常地高于10到100倍背景。

术语“抗体激动剂”指能够激活受体以诱导完全或部分受体介导的应答的抗体。例如，TrkB的激动剂结合TrkB，并诱导TrkB介导的信号转导。在一些实施方案中，TrkB抗体激动剂可通过其当接触SH-SY5Y细胞时结合TrkB并诱导神经突增生的能力来鉴定，或如此处描述的鉴定。激动剂抗体是激活的受体反应比在缺少该抗体的情况下的反应高至少10％的那些抗体。在一些情况下，激动剂抗体激活的受体反应比在缺少该抗体的情况下的反应高25％、50％、75％或100％。在一些情况下，激动剂抗体激活的受体反应比在缺少该抗体的情况下的反应高200％、300％、400％、500％或更高。

本发明多肽的“活性”指多肽在其天然细胞或组织中的结构功能、调节功能或生物化学功能。多肽活性的实例包括直接活性和间接活性。示例性直接活性是与多肽直接相互作用的结果，包括配体结合，如BDNF与TrkB的配体结合域(LBD)的结合(参阅例如，Naylor等，Biochem Biophys ResCommun.291(3)：501-7(2002)和SEQ ID NO：18)、第二信使(例如cAMP、cGMP、IP₃、DAG或Ca²⁺)的产生或耗尽、离子流及磷酸化或转录水平的变化。在TrkB的上下文中，示例性间接活性被视为细胞或组织中对多肽直接活性的表型或响应中的变化，例如由于多肽与其它细胞或组织成分的相互作用而降低总的血糖水平。

当用于指成年人时，术语“肥胖的”指具有30或更高的体重指数(BMI)的个体。当用于指成年人时，“超重”指具有25或更高BMI的个体。对于儿童，使用年龄体重指数图，其中认为BM I高于第85百分位数是“超重”，并且认为高于第95百分位数是“肥胖”。参阅例如，Clinical Guidelines onthe Identification，Evaluation，and Treatment of Overweight and Obesity inAdult(National Heart，Lung and Blood Institute，June 17，1998)和世界卫生组织肥胖症协会(WHO，Geneva，June 1997)的报告中的Preventing andManaging the Global Epidemic of Obesity。

“前驱糖尿病个体”指空腹血糖水平高于110mg/dl但低于126mg/dl或2小时PG读数高于140mg/dl但低于200mg/dl的成人。当用于与来自患者的样品比较时，“糖尿病个体”指空腹血糖水平高于126mg/dl或2小时PG读数高于200mg/dl的成人。“空腹”指无热量摄入至少8小时。“2小时PG”指使患者接受葡萄糖负荷后的血糖水平，所述葡萄糖负荷含有溶解在水中的75g无水葡萄糖当量。所有测试通常称作口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。参阅例如，Diabetes Care，2003，26(11)：3160-3167(2003)。

当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示所述核酸或蛋白质基本上不含在天然状态中与其结合的其它细胞成分。它优选处于均一状态。它可以是干的或水溶液。通常使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来测定纯度和同质性。在制剂中以优势种类存在的蛋白质是基本上纯化的。尤其是，分离的基因从所述基因两侧的可读框分开，并编码不同于目的基因的蛋白质。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。特别地，它指所述核酸或蛋白质为至少85％纯，更优选至少95％纯，并最优选至少99％纯。

术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其多聚体。除非进行特别限制，所述术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合性质并以与天然发生的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另有指出，特定的核酸序列也暗中包括其保守修饰的变体(例如简并密码子替代)和互补序列及明确指出的序列。尤其是，可通过产生其中一个或更多个所选(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代的序列来完成简并密码子替代(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol等(1992)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes8：91-98(1994))。术语“核酸”或“多核苷酸”可互换使用。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”此处互换使用来指氨基酸残基的多聚体。所述术语应用于氨基酸多聚体，其中一个或更多个氨基酸残基是相应的天然发生氨基酸的人工化学模拟物，还应用于天然发生的氨基酸多聚体和非天然发生的氨基酸多聚体。如此处所用，所述术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。

术语“氨基酸”指天然发生的和合成的氨基酸，及以与天然发生氨基酸类似的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然发生氨基酸具有相同的基本化学结构(即结合氢的α碳、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然发生氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构的化合物，但其以与天然发生氨基酸类似的方式发挥功能。

此处氨基酸可参考公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号。核苷酸同样也参考它们通常接受的单字母密码。

“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，“保守修饰的变体”指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或其中所述核酸不编码氨基酸序列，或指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸被密码子指定的每个位置上，可在不改变编码的多肽的情况下将所述密码子改变成所描述的任何对应的密码子。这种核酸变异是“沉默变异”，其为保守修饰变异的一种。此处，编码多肽的每个核酸序列也描述了所述核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到可修饰核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常仅是甲硫氨酸的密码子，和TGG，其通常仅是色氨酸的密码子)以产生功能上相同的分子。因此，在每个所述序列中暗含编码多肽的核酸的每种沉默变异。

对于氨基酸序列，技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别替代、缺失或添加(其改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或少部分氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸用化学上类似的氨基酸替代。提供功能上类似的氨基酸的保守替代表为本领域所熟知。这种保守修饰的变体是除本发明多态性变体、种间同源物和等位基因之外的但不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。

以下8组每组含有彼此间保守替代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)

(参阅例如Creighton，Proteins(1984))。

通过在比较窗内比较两条最佳比对的序列来确定“序列同一性的百分比”，其中为了两条序列的最佳比对，与不包含添加或缺失的参考序列(例如本发明多肽)相比，比较窗中多核苷酸序列部分可包含添加或缺失(即空位)。如下计算百分比：确定相同核酸碱基或氨基酸残基在两条序列中都出现的位置数以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗中位置的总数并将结果乘以100来产生序列同一性的百分比。

在两条或更多核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一的”或百分比“同一性”指为相同序列的两条或更多序列或子序列。当如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目检测定的在比较窗指定区域内，或未指明时在全序列范围内比较并比对用于最大对应时，如果两条序列具有相同的氨基酸残基或核苷酸的特定百分比(即在特定区域内，或者未指定时在全序列内时，具有60％的同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性)，那么所述序列是“基本上同一的”。本发明提供多肽或多核苷酸，其编码与此处示例的多肽(例如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18)基本上同一的多肽或包含与此处示例的多肽基本上同一的序列。该定义也指核苷酸检测序列的互补序列。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸的区域内，或更优选长度为100到500或1000或更多个核苷酸的区域内。

为了进行序列比较，通常一条序列充当参考序列，检测序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将检测序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标并指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或可指定备选的参数。序列比较算法然后基于程序参数来计算检测序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

如此处所用，“比较窗”包括参考任何一个数目相邻位置的区段，所述相邻位置数选自从20到600，通常从约50到约200，更通常从约100到约150，其中在两条序列进行最佳比对后，可将序列与相同数目的相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对的方法为本领域所熟知。例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机实现(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)或通过手动比对及目检(参阅例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995附录))。

适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等(1977)Nuc.AcidsRes.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。可通过National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得用于进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字串来鉴定高得分序列对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字串比对时，其匹配或满足一定的正值阈值得分T。T被称为邻近字串得分阈值(neighborhood wordscore threshold)(Altschul等，上文)。这些初始相邻字串命中充当种子用于启动搜索以发现含有它们的更长HSP。字串命中沿每条序列向两个方向延伸，只要累积比对得分可以提高。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积分。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积分。当累积比对分从其最大获得值下降数量X；累积分因一个或更多负得分残基比对的累积而达到零或以下；或到达任一条序列的末端时，字串得分在每一方向上的延伸就中止。BLAST算法参数W、T和X决定算法的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长3和期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参阅Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。

BLAST算法也进行两条序列间相似性的统计学分析(参阅例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性的测定是最小总数概率(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在检测核酸与参考核酸的比较中，最小总数概率低于大约0.2，更优选低于大约0.01，并最优选低于大约0.001，则认为核酸与参考核酸相似。

附图简述

图1图解BDNF在失巢凋亡测定中的效果。

图2显示失巢凋亡测定中多种鉴定的TrkB抗体的效果。

图3展示分离的TrkB抗体的反应性。

图4显示纯化的TrkB功能抗体激动剂与人TrkA或TrkC不反应。

图5显示SH-SY5Y分化测定中的抗体激动剂。

图6显示TrkB单克隆功能抗体的同种型测定结果。

图7概述了所鉴定的多种激动剂抗体的信息。

图8图解了TrkB激动剂抗体预防性降低血清葡萄糖水平并促进体重减轻。

图9图解了TrkB激动剂抗体预防性并治疗性降低血清葡萄糖水平并促进体重减轻。

图10提供了此处公开的A10和C20抗体的可变区序列。对于每条序列，第一个加下划线的部分是CDR1，第二个加下划线的部分是CDR2，并且第三个加下划线的部分是CDR3。

发明详述

I.引言

本发明提供新的TrkB激动剂抗体。本发明的TrkB激动剂抗体特异性结合TrkB并激活TrkB。令人惊奇的是，本申请证实了本发明的TrkB激动剂抗体在体内也显著降低糖尿病小鼠的体内血糖水平。另外，用本发明的TrkB激动剂抗体的治疗预防了经常在这些小鼠中观察到的体重增加。这些结果表明本发明抗体对TrkB是特异性的，并有效激活该受体。此外，结果显示TrkB激活可用于预防高血糖及其相关情况、肥胖症、前驱糖尿病和II型糖尿病。

II.结合TrkB的抗体

1.引言

根据本发明的方法可使用任何TrkB激动剂抗体。

在一些实施方案中，本发明的TrkB激动剂抗体结合到TrkB配体结合位点上和/或与BDNF竞争结合TrkB。结合到TrkB的配体结合位点上的示例性抗体是抗体A10F18.2(此处也称作“A10F18”或“A10”)。抗体A10的重链可变区示例于SEQ ID NO：1中，并且抗体A10的轻链可变区示例于SEQ ID NO：2中。因此，本发明提供与包含含有SEQ ID NO：1的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的轻链可变区的抗体竞争结合TrkB的激动剂抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体包含至少SEQ ID NO：1和/或2的互补决定区(CDR)。不旨在限制本发明的范围，相信CDR3在抗体A10的结合中起重要作用。因此，在一些实施方案中，本发明抗体包含SEQ ID NO：5和/或6。然而，CDR1和/或CDR2也在结合中起作用。因此，在一些实施方案中，本发明抗体包含SEQ ID NO：9和/或10，或13和/或14。

在一些实施方案中，本发明的TrkB激动剂抗体不结合TrkB配体结合位点和/或与BDNF竞争结合TrkB。不结合TrkB的配体结合位点的示例性抗体是C20.i1.1(此处也称作“C20.i1”、“C20.I1”和“C20”)。抗体C20的重链可变区示例于SEQ ID NO：3中，并且抗体C20的轻链可变区示例于SEQ ID NO：4中。因此，本发明提供与包含含有SEQ ID NO：3的重链可变区和含有SEQ ID NO：4的轻链可变区的抗体竞争结合TrkB的激动剂抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体包含至少SEQ ID NO：3和/或4的互补决定区(CDR)。不旨在限制本发明的范围，相信CDR3在抗体C20的结合中起重要作用。因此，在一些实施方案中，本发明抗体包含SEQ ID NO：7和/或8。然而，CDR1和/或CDR2也在结合中起作用。因此，在一些实施方案中，本发明抗体包含SEQ ID NO：11和/或12，或15和/或16。

根据本发明的方法可使用任何类型的抗体激动剂。通常，所用的抗体是单克隆抗体。可通过本领域已知的任何方法(例如，使用杂交瘤、重组表达和/或噬菌体展示)产生单克隆抗体。

2.人源化抗体

在一些实施方案中，根据本发明所用的抗体是嵌合(例如小鼠/人)抗体，其由来自非人类抗TrkB抗体激动剂的区域与人抗体的区域组成。例如，嵌合H链可包含连接到至少部分人重链恒定区的非人类抗体的重链可变区(例如SEQ ID NO：1或3，或至少其部分，如CDR)的抗原结合区。该人源化或嵌合重链可与嵌合L链组合，所述嵌合L链包含连接到至少部分人轻链恒定区的非人类抗体的轻链可变区(例如SEQ ID NO：2或4，或至少其部分，如CDR)的抗原结合区。在一些实施方案，重链恒定区可以是IgM或IgA抗体。

本发明的嵌合抗体可以是单价的、二价的或多价的免疫球蛋白。例如，如上指出，单价嵌合抗体是通过嵌合H链经二硫键与嵌合L链结合形成的二聚体(HL)。二价嵌合抗体是通过两个HL二聚体经至少一个二硫键进行结合形成的四聚体(H₂L₂)。多价嵌合抗体基于链的聚集。

本发明抗体的DNA序列可通过本领域熟知的操作来进行鉴定、分离、克隆并转移到用于表达的原核或真核细胞中。此类操作通常描述于Sambrook等，上文，及C_URRENT P_ROTOCOLS IN M_OLECULAR B_IOLOGY(Ausubel等，编辑，1989)中。尤其适合于表达重组抗体和人源化抗体的表达载体和宿主细胞为本领域所熟知。以下参考文献代表了适合于表达重组免疫球蛋白的方法和载体(可用于实施本发明)：Weidle等，Gene，51：21-29(1987)；Dorai等，J.Immunol.，13(12)：4232-4241(1987)；De Waele等，Eur.J.Biochem.，176：287-295(1988)；Colcher等，Cancer Res.，49：1738-1745(1989)；Wood等，J.Immunol.，145(a)：3011-3016(1990)；Bulens等，Eur.J.Biochem.，195：235-242(1991)；Beggington等，Biol.Technology，10：169(1992)；King等，Biochem.J.，281：317-323(1992)；Page等，Biol.Technology，2：64(1991)；King等，Biochem.J.，290：723-729(1993)；Chaudary等，Nature，339：394-397(1989)；Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Benhar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：12051-12055(1994)；Singer等，J.Immunol.，150：2844-2857(1993)；Cooto等，Hybridoma，13(3)：215-219(1994)；Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：10029-10033(1989)；Caron等，CancerRes.，32：6761-6767(1992)；Cotoma等，J.Immunol.Meth.，152：89-109(1992)。此外，可通过商业途径获得适合于表达重组抗体的载体。

能够表达功能免疫球蛋白的宿主细胞包括，例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；COS细胞；骨髓瘤细胞，如NSO和SP2/O细胞；细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)；酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；和其它宿主细胞。

3.单链抗体

在一些实施方案中，本发明抗体是单链Fvs(scFvs)。scFv抗体的V_H和V_L区(例如，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)包含单链，其折叠以形成与在两条链抗体中发现的类似的抗原结合位点。一旦折叠，非共价相互作用使单链抗体稳定。尽管一些抗体实施方案的V_H和V_L区可以直接结合在一起，但是技术人员将理解所述区域可被一个或更多氨基酸组成的肽接头分开。肽接头及它们的用途为本领域所熟知。参阅，例如Huston等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 8：5879(1988)；Bird等，Science 242：4236(1988)；Glockshuber等，Biochemistry29：1362(1990)；美国专利号4,946,778，美国专利号5,132,405和Stemmer等.，Biotechniques 14：256-265(1993)。通常，所述肽接头除了连接所述区域或保持V_H和V_L之间一定的最小距离或其它空间关系外，将不具有特定的生物学活性。然而，可选择所述肽接头的组成氨基酸，以影响分子的一些性质，如折叠、净电荷或疏水性。单链Fv(scFv)抗体任选地包括长度不超过50个氨基酸，通常不超过40个氨基酸，优选不超过30个氨基酸，并更优选不超过20个氨基酸的肽接头。

已经描述了产生scFv抗体的方法。参阅，例如Huse等，Science246：1275-1281(1989)；Ward等，Nature 341：544-546(1989)；和Vaughan等，Nature Biotech.14：309-314(1996)。简言之，分离来自经免疫动物B细胞的mRNA并制备cDNA。使用对免疫球蛋白的重链和轻链可变区特异的引物扩增cDNA。纯化PCR产物并连接核酸序列。如果需要接头肽，那么就在重链和轻链核酸序列之间***编码所述肽的核酸序列。将编码scFv的核酸***到载体中，并在合适的宿主细胞中表达。通常通过淘选噬菌体展示文库来发现特异性结合想要的抗原的scFv。可通过若干方法中的任何一种进行淘选。可使用在它们的表面表达想要的抗原的细胞或使用被想要的抗原包被的固体表面来方便地进行淘选。方便地，所述表面可以是磁珠。将未结合的噬菌体从固体表面洗掉，并将结合的噬菌体洗脱。

寻找具有最高亲和力的抗体由选择方法的效率所控制，并且依赖于可以筛选的克隆数和进行寻找的严格性。通常，更高的严格性对应于更具选择性的淘选。然而如果条件太严格，噬菌体将不结合。一轮淘选过后，结合到TrkB包被的平板上的噬菌体或结合到在它们的表面表达TrkB的细胞上的噬菌体在大肠杆菌中进行扩增并经历另一轮的淘选。这样，多倍富集在3轮淘选中发生。因此，即使每一轮中的富集很低，多轮淘选将导致稀少噬菌体和包含在内的遗传物质的分离，所述遗传物质编码具有最高亲和力的scFv或者在噬菌体上更好地表达的scFv。

不管所选的淘选方法，噬菌体展示提供的基因型和表现型之间的物理联系使得检测cDNA文库的每个成员对抗原的结合成为可能，即使使用大的克隆文库。

4.人抗体

在一些实施方案中，根据本发明使用人抗体。可通过本领域已知的多种方法产生人抗体，所述方法包括使用来自人免疫球蛋白序列的抗体文库通过噬菌体展示方法。参阅，例如Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)，美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；每个参考文献此处以其整体引入作为参考。

在一些实施方案中，使用噬菌体展示产生本发明的抗体。例如，功能抗体结构域展示于携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上。可利用这种噬菌体来展示从所有组成成分或组合抗体文库(例如，人类或鼠类)表达的抗原结合域。可以用TrkB，例如使用标记的TrkB来选择或鉴定表达结合TrkB的抗原结合域的噬菌体。用于这些方法中的噬菌体通常是包括从噬菌体表达的fd和M13结合域的丝状噬菌体，所述噬菌体具有重组融合到噬菌体基因III或基因VIII蛋白质的Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的实例包括在Brinkman等，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等，Gene 187：9-18(1997)；Burton等，Advances inImmunology 57：191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公开的那些；将它们各自在此处以其整体引入作为参考。

5.产生激动剂抗体

可通过产生抗TrkB抗体，然后检测每个抗体触发TrkB介导事件(例如，启动SH-SY5Y细胞的分化和/或dendrification、测定响应于用潜在TrkB激动剂处理细胞的失巢凋亡(因失去细胞基质相互作用而引起的程序性细胞死亡)或使用BaF3/TrkB细胞增殖测定)来鉴定激动剂抗体。

SH-SY5Y测定包括平板接种SH-SY5Y细胞并在有或没有潜在激动剂抗体和/或BDNF的情况下用视黄酸处理细胞，然后测定神经突增生。通常，视黄酸单独将诱导少量的神经突增生。BDNF单独将不诱导显著的神经突增生，并且抗体单独将不诱导显著的神经突增生。然而，用视黄酸、BDNF和抗体处理的细胞显示广泛的神经突增生。示例性SH-SY5Y测定描述于Kaplan DR，等，Neuron 11：321-331(1993)中。

BaF3/TrkB细胞增殖测定包括测定由TrkB受体的激动作用刺激的细胞增殖。例如，BaF3细胞在具有l IL-3的完全RPMI培养基中生长并感染TrkB逆转录病毒。细胞在缺少IL-3的情况下进行洗涤并平板接种。在适当温育后，(例如使用发光细胞活力检测试剂，如Cell-Titer Glo^TM)测定潜在的激动剂抗体和细胞存活。用rhBDNF温育阳性对照细胞。

失巢凋亡测定包括重悬RIE/TrkB细胞(例如在DMEM培养基中)并任选在多孔容器中使细胞接触潜在的抗体激动剂(例如，2.5x104个细胞，10ul的1-20ug/ml抗体)。在存在或缺少hBDNF对照的情况下温育混合物，然后测定细胞活力(例如使用发光细胞活力检测试剂，如Cell-TiterGlo^TM)。示例性失巢凋亡描述于Douma等，Nature 430：1034-1039(2004)中。

也可以在SH-SY5Y细胞上评估TrkB激动剂的保护细胞免于长春碱和顺铂毒性的能力。该测定已经描述于例如Scala等，Cancer Res.56(16)：3737-42(1996)；和Jaboin等，Cancer Res.62(22)：6756-63(2002)中。

III.抗体用途

本发明的TrkB激动剂抗体可用于治疗或改善受益于提高的TrkB活性的任何疾病或状况。

在一些实施方案中，本发明的TrkB激动剂抗体用于治疗或缓解个体中高血糖和/或糖尿病或其症状。或者，或组合，本发明抗体可用于减轻需要减轻体重的个体体重。在一些实施方案中，所述抗体用于缓解肥胖症。这尤其有用，因为肥胖个体更易于发生胰岛素抗药性和II型糖尿病。

本发明也提供通过向需要其的个体施用本发明的TrkB激动剂抗体来治疗或预防神经变性或中枢神经***(CNS)疾病的方法。示例性CNS疾病包括，例如阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症或ALS病。

提高的TrkB激活也涉及药物滥用的缓解。参阅，例如美国专利公布号2005/0203011。因此，本发明提供通过向需要其的个体施用本发明的TrkB激动剂抗体来缓解药物(例如，酒精、烟碱和/或***)滥用和依赖性的方法。

本发明的抗体和活性剂可直接向需要其的哺乳动物受试者施用。通过常用于引导药物(包括抗体)与待治疗的组织最终接触的任何途径施用本发明的组合物。以任何合适的方式，任选地以药学上可接受的载体施用所述抗体。可获得施用这种抗体和活性剂的合适方法并且所述方法为本领域那些技术人员所熟知，并且虽然一种以上的途径可用于施用特定组合物，但是特定途径比其它途径通常能提供更迅速和更有效的反应。

部分通过施用的特定组合物及通过用于施用所述组合物的特定方法来确定药学上可接受的载体。因此，具有多种合适的本发明药物组合物制剂(参阅，例如Remington′s PharmaceuticalSciences，第17版，1985)。

可将抗体单独或与其它合适的成分组合制备成经过吸入施用的气溶胶制剂(即，它们可以进行“喷雾”)。可将气溶胶制剂置于加压可接受的喷射剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。

适于施用的制剂包括水性溶液和非水性溶液、等渗无菌溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂等渗的溶质，和可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。在本发明的实施中，例如可通过口、局部、静脉内、腹膜内、膀胱内或鞘内施用组合物。任选地，经鼻施用所述组合物。化合物制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)中。可从前述种类的无菌粉剂、粒剂和片剂制备溶液和悬浮液。调节剂也可以制备的食物或药物的部分来施用。根据想要的治疗或效果，本发明的化合物也可与一种或更多额外的活性剂(例如化学治疗剂)有效地组合使用。

在本发明的上下文中，向患者施用的剂量随着时间的推移应该足以实现有益反应。将通过使用的特定抗体和试剂的效果和受试者的情况，及体重或待治疗区域的表面积来确定剂量。也将通过在特定受试者中伴随特定化合物或载体的施用而来的任何不利副作用的存在、性质和程度来确定剂量大小。可通过单剂量或分份剂量来完成施用。

TrkB抗体激动剂可与已知有益于减轻体重、降低血糖水平、治疗糖尿病或缓解糖尿病症状、治疗神经变性疾病或减少药物滥用的活性剂组合使用。用于治疗糖尿病的示例性活性剂包括，例如胰岛素；磺酰脲类(例如格列吡嗪(Glipizide)或格列美脲(Amaryl))和促胰岛素剂(例如那格列奈(nateglinide)和瑞格列奈(repaglinide))；二甲双胍；PPARγ激动剂(例如罗格列酮和吡格列酮(pioglitazone))及PPARα激动剂、PPARδ激动剂、PPARα/γ二元激动剂、PPARα/γ/δ全激动剂；α-葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖(Acarbose))；DPP-IV抑制剂(例如vildagliptin)；和GLP-1/GLP-1类似物(例如依泽那太)。用于治疗肥胖症的示例性活性剂包括，例如脂肪酶抑制剂(例如奥利司他(orlistat))；***(sibutramine)；CB-1抑制剂(例如利莫那班(rimonabant))；托吡酯(topiramate)；糊精/糊精类似物(例如普兰林肽(pramlintide))、瘦蛋白(leptin)、PYY/PYY类似物；和GLP-1/GLP-1类似物(例如依泽那太)。

活性剂可与TrkB激动剂抗体以混合物的形式一起，或者每种可分别施用。抗体活性剂和其它活性剂可以，但不必须同时施用。

实施例

实施例1

该实施例讨论了TrkB的抗体激动剂的鉴定和表征。

用人trkB受体免疫小鼠，并通过ELISA筛选来自血清IgG阳性小鼠的杂交瘤上清液与TrkB的反应性。通过检测抗体从失巢凋亡恢复RIE/TrkB细胞的能力来筛选所得抗体激活TrkB的能力。已知BDNF从失巢凋亡恢复RIE/TrkB细胞，因此这种测定是检测抗体激活TrkB能力的好的措施。参阅图1。鉴定了多种TrkB抗体激动剂，其在失巢凋亡测定中模拟BDNF的活性，如图2所示。从低IgG培养基中纯化阳性抗体激动剂。

筛选抗体激动剂与huTrkB、muTrkB和TrkB结合域(LBD)的反应性，如图3所示。大多数激动剂不结合LBD。特别是，发现C20与小鼠和人trkB反应。A10与小鼠和人trkB反应，并结合配体结合域表位。如图4所示，许多功能抗体显示与小鼠Trk B反应，但不结合Trk A或TrkC。

在神经突增生体外模型中证实了抗体激动剂。结果显示Trk B抗体激动剂与BDNF类似地刺激神经突增生。

如图6所示，功能抗体是同种型的。通过蛋白质印迹进一步显示功能抗体结合在RIE细胞中过表达的人TrkB。图7概述了鉴定的多种激动剂抗体的信息。

实施例2

该实施例显示TrkB激动剂抗体有效降低小鼠中的血糖和体重。

在2型糖尿病的db/db小鼠模型中检测了两种最有效的激动剂：A10和C20(其可变区分别展示于SEQ ID NO：3和4及SEQ ID NO：1和2中)。如图8和9显示，这两种抗体看起来可预防性和治疗性地降低血清葡萄糖水平并促进体重减轻。

如图9的上图所示，当施用抗体A10或C20时，易于高血糖水平的小鼠不具有升高的血糖水平，而对照小鼠具有升高的水平。该结果表明抗体具有预防效果。在研究的第32天时，将高血糖、肥胖对照动物(8)分为2组。一组用抗体A10处理，另一组用PBS处理。治疗在1周内逆转了高血糖症，并减轻了25％的体重。最初处理的动物在额外4周内不予处理。C20处理组具有升高的葡萄糖水平并且体重增加。A10组维持正常的葡萄糖并显示小幅的体重增加。这些结果示于图9的上图和下图中。PK研究揭示A10抗体具有更长的血清半衰期，其对应于体内所见的效果。

虽然为了透彻理解的目的，通过阐明和实施例已经详细描述了本发明，本领域技术人员将显而易见的是按照本发明教导，可在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下，对其进行某些改变和修饰。

在本说明书中引用的所有出版物、数据库、Genbank序列、专利和专利申请均在此处引用作为参考，就如同每个被明确和单独说明被引用作为参考一样。

序列表

<110>IRM责任有限公司

<120>激动剂TrkB抗体及其用途

<130>P1275PC10

<140>PCT/US07/083774

<141>2007-11-06

<150>60/858,169

<151>2006-11-09

<160>18

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>120

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Ile Lys Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ala Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Arg Leu Leu Leu Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210>2

<211>114

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>2

Asp Val Val Met Thr Gln Leu Pro Leu Ser Leu Pro Val Ile Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala

<210>3

<211>116

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Ala Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Gly Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Gly Val Thr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210>4

<211>114

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>4

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala

<210>5

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>5

Arg Gly Arg Leu Leu Leu Tyr Gly Phe Ala Tyr

1 5 10

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>6

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr

1 5

<210>7

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>7

Val Thr Thr Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>8

Ser Gln Gly Thr His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210>9

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>9

Ser Tyr Asp Ile Asn

1 5

<210>10

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>10

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210>11

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>11

Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210>12

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>12

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210>13

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>13

Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Ile Lys Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>14

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>14

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210>15

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>15

Thr Ile Asp Pro Glu Thr Ala Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>16

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>16

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210>17

<211>477

<212>PRT

<213>人

<400>17

Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp

1 5 10 15

Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala Cys

20 25 30

Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro

35 40 45

Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp

50 55 60

Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu

65 70 75 80

Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu

85 90 95

Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu

100 105 110

Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr

115 120 125

Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile

130 135 140

Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys

145 150 155 160

Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys

165 170 175

Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro

180 185 190

Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val

195 200 205

Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro

210 215 220

Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met

225 230 235 240

Asn Glu Thr Ser Hi sThr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser

245 250 255

Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val

260 265 270

Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr

275 280 285

Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro

290 295 300

Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn

305 310 315 320

Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val

325 330 335

Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr

340 345 350

His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly

355 360 365

Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile

370 375 380

Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr

385 390 395 400

Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu

405 410 415

Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser

420 425 430

Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu

435 440 445

Val Met Leu Phe Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met

450 455 460

Lys Gly Phe Val Leu Phe His Lys Ile Pro Leu Asp Gly

465 470 475

<210>18

<211>144

<212>PRT

<213>人

<400>18

Pro Thr Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys

1 5 10 15

Ile Pro Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe

20 25 30

Tyr Asn Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile

35 40 45

His Val Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn

50 55 60

Pro Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu

65 70 75 80

Tyr Gly Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro

85 90 95

Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu

100 105 110

Asp Tyr Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser

115 120 125

Asn Glu Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His

130 135 140

Claims

1.酪氨酸激酶受体B(TrkB)的分离的抗体激动剂。

2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。

3.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单链抗体。

4.权利要求1的抗体，其中所述抗体不结合酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C。

5.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合TrkB的配体结合域(LBD)。

6.权利要求1的抗体，其中所述抗体与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。

7.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含

i.包含SEQ ID NO：7的重链可变区；和

ii.包含SEQ ID NO：8的轻链可变区。

8.权利要求7的抗体，其中所述抗体包含

i.包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15的重链可变区；和

ii.包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16的轻链可变区。

9.权利要求8的抗体，其中所述抗体包含

i.包含SEQ ID NO：3的重链可变区；和

ii.包含SEQ ID NO：4的轻链可变区。

10.权利要求1的抗体，其中所述抗体不结合TrkB的LBD。

11.权利要求1的抗体，其中所述抗体不与BDNF竞争结合TrkB。

12.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含

i.包含SEQ ID NO：5的重链可变区；和

ii.包含SEQ ID NO：6的轻链可变区。

13.权利要求12的抗体，其中所述抗体包含

i.包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：13的重链可变区；和

ii.包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14的轻链可变区。

14.权利要求13的抗体，其中所述抗体包含

i.包含SEQ ID NO：1的重链可变区；和

ii.包含SEQ ID NO：2的轻链可变区。

15.药物组合物，其包含

i.治疗有效量的权利要求1的抗体；和

ii.药学载体。

16.权利要求15的药物组合物，其中所述抗体选自：

i.包含含有SEQ ID NO：5的重链可变区和含有SEQ ID NO：6的轻链可变区的抗体；和

ii.包含含有SEQ ID NO：7的重链可变区和含有SEQ ID NO：8的轻链可变区的抗体。

17.权利要求15的药物组合物，其中所述药物组合物还包含降低个体中血糖水平和/或体重的活性剂。

18.在需要其的个体中降低血糖水平和/或体重的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的权利要求1的抗体。

19.权利要求18的方法，其中所述个体患有选自前驱糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、超重和肥胖症的疾病。

20.权利要求18的方法，其中将治疗有效量的有效降低血糖和/或体重的第二种活性剂与权利要求1的抗体组合施用于所述个体。

21.权利要求20的方法，其中所述第二种活性剂和权利要求1的抗体作为混合物施用。

22.权利要求20的方法，其中所述第二种活性剂与权利要求1的抗体分别施用。

23.权利要求20的方法，其中所述第二种活性剂选自：胰岛素、磺酰脲类、促胰岛素剂、二甲双胍、PPARγ激动剂、PPARα激动剂、PPARδ激动剂、PPARα/γ二元激动剂、PPARα/γ/δ全激动剂、α-葡糖苷酶抑制剂、DPP-IV抑制剂、脂肪酶抑制剂、***、CB-1抑制剂、托吡酯、糊精、糊精类似物、瘦蛋白、PYY/PYY类似物和GLP-1/GLP-1类似物。

24.权利要求18的方法，其中所述抗体是人源化抗体。

25.权利要求18的方法，其中所述抗体选自：