CN112166121B - 神经生长因子的单克隆抗体及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了神经生长因子的单克隆抗体及其编码基因和应用。本发明神经生长因子的单克隆抗体包括重链和轻链，重链包括重链恒定区和重链可变区，轻链包括轻链恒定区和轻链可变区，重链可变区包含三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链可变区包含三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。本发明神经生长因子的单克隆抗体能特异性地与神经生长因子结合，可用于检测神经生长因子的存在和/或水平，以及制备抑制TF‑1细胞的神经生长因子依赖性增殖的药物、制备治疗或预防神经性疼痛、慢性疼痛、炎性疼痛中的至少一种的药物，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

神经生长因子的单克隆抗体及其编码基因和应用
技术领域
本发明属免疫学和分子生物学技术领域，更具体地说，本发明涉及一种神经生长因子的单克隆抗体及其编码基因和在制备检测试剂盒、多种药物中的应用。
背景技术
神经生长因子(nervous growth factor，NGF)是最早确定的神经生长营养因子之一，在生物体神经元的发生、分化及功能维持中承担重要作用。NGF可高亲和性与原肌球蛋白受体激酶(tropomyosin receptor kinase A，TrKA)结合，并且能够与P75NTR受体非特异性结合。随着越来越多的证据表明，除具有促进神经元的生长、发育、存活等生物学作用外，NGF被广泛认为是持续性疼痛和慢性疼痛的介导者。例如，静脉输入NGF可导致全身性疼痛反应，局部注射NGF可在注射部位引起痛觉过敏及异常疼痛。NGF在炎症部位的分泌量增加，并且维持时间较长。此外，在某些性质的癌症中，过量的NGF促进神经纤维的生长和浸润，从而诱发癌痛。有报道称TrKA受体的基因敲除小鼠缺乏痛觉，认为NGF是与疼痛的表现紧密相关的分子。证据表明，在神经性和慢性炎症性疼痛动物模型中，使用NGF抑制剂可以缓解疼痛反应。在鼠类癌痛模型中和型抗NGF抗体可使疼痛显著减轻。
抗体治疗药物，特别是单克隆抗体已在多种疾病的治疗中取得了良好的疗效。制备安全、有效地抗NGF单克隆抗体可为慢性痛、癌痛的治疗提供一类不同于阿片类、非甾体类等具有成瘾性或消化道副作用的新的镇痛药物。目前由辉瑞制药有限公司研发的Tanezumab在临床前及临床研究中展现出了良好的镇痛效果，但是目前尚缺乏其它活性更高的抗NGF抗体。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有技术中存在的神经生长因子抗体活性不高且具有种属差异性的缺陷，提供一种活性高、排除种属差异性的神经生长因子的单克隆抗体及其编码基因和应用，以及其在制备检测试剂盒、多种药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种可与人神经生长因子特异性良好结合的单克隆抗体；包括重链和轻链，重链包括重链恒定区和重链可变区，轻链包括轻链恒定区和轻链可变区。
轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；其由Kabat等人命名，见Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition(1991)，第1-3卷，NIH Publication 91-3242，Bethesda Md)。
本发明中，所述重链可变区包含三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；
其中，所述互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；
所述互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
本发明构建了6个CDR区的氨基酸序列，并做了特定修改以提高抗体可变区对抗原的结合活性。为配合在CDR区的改动，框架区也同时被修改，但是需要确保这些框架区的修改仍与人源的种系序列相兼容。框架的修改也将同时进行分析，以确保这些改变对CDR区与抗原的结合没有影响。
通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过美国国立生物技术信息中心网站(NCBI)，分析该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR)，其亦分别如上面的SEQ ID NO：5～7和SEQ ID NO：8～10所示。在本发明中，将该单克隆抗体命名为H26L17。
作为本发明神经生长因子的单克隆抗体的一种优选技术方案，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
作为本发明神经生长因子的单克隆抗体的一种更进一步的优选技术方案，编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQID NO：3所示。
本发明神经生长因子的单克隆抗体的一种实施方案中，所述神经生长因子的单克隆抗体选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
本发明神经生长因子的单克隆抗体的一种实施方案中，所述神经生长因子的单克隆抗体以小于100nM(例如小于大约10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小)的EC50与NGF蛋白结合。其中，EC50可通过ELISA夹心法测定。
本发明神经生长因子的单克隆抗体的一种实施方案中，所述神经生长因子的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了编码上述神经生长因子的单克隆抗体的基因。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种载体，其包含所述重链可变区的核苷酸序列和/或所述轻链可变区的核苷酸序列。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种宿主细胞，其包含所述重链可变区的核苷酸序列和/或所述轻链可变区的核苷酸序列；
或
包含所述重链可变区的核苷酸序列和/或所述轻链可变区的核苷酸序列的载体。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了制备所述神经生长因子的单克隆抗体的方法，其包括在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述神经生长因子的单克隆抗体的步骤。
本发明还提供了一种单克隆抗体偶联物，其包括所述神经生长因子的单克隆抗体以及与其偶联的偶联部分，所述偶联部分为可检测的标记。优选地，所述偶联部分为放射性同位素、发光物质、有色物质或酶。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括所述神经生长因子的单克隆抗体和/或所述单克隆抗体偶联物。
作为本发明试剂盒的一种优选技术方案，所述试剂盒还包含第二抗体，所述第二抗体特异性识别所述的神经生长因子的单克隆抗体；另外，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、发光物质、有色物质或酶。
本发明还提供了神经生长因子的单克隆抗体和/或单克隆抗体偶联物在可检测神经生长因子的存在和/或水平的试剂盒中的应用。所述试剂盒用于检测NGF在样品中的存在或其水平。
本发明还提供了一种药物，其包括所述神经生长因子的单克隆抗体和/或所述单克隆抗体偶联物；可选地，其还包括药学上可以接受的载体和/或辅料。
上述药物与神经生长因子特异性结合，可用于抑制神经生长因子介导的生物学效应，如TF-1细胞的增殖；
和/或
用于治疗或预防神经性疼痛、慢性疼痛、炎性疼痛。
本发明通过体内实验发现，本发明神经生长因子的单克隆抗体能够改善Lenti-IL-1β-NIH/3T3小鼠膝关节炎疼痛模型中动物的患肢行走行为的改变以及体重下降。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本发明中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本发明中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987 and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人(1989)Nature 342：878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本发明中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，第2版，RavenPress，N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本发明中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab′)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如，scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如，Bird等人，Science 242：423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))。此类scFv分子具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人，Structure 2：1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本发明中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本发明中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature，256：495，1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。
如本发明中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.，Nature，321：522 525(1986)；Reichmann etal.，Nature，332：323 329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593 596(1992)；和Clark，Immunol.Today 21：397 402(2000)。
如本发明中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本发明中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本发明中所使用的，术语“大肠杆菌表达***”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达***，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
如本发明中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本发明中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本发明中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本发明中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，L1蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本发明中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本发明中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫***的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
相对于现有技术，本发明具有如下优点：
本发明抗神经生长因子单克隆抗体能特异性地与神经生长因子结合，具有活性高等优点，可用于检测神经生长因子的存在和/或水平，以及制备拮抗神经生长因子的药物和制备治疗或预防神经性疼痛、慢性疼痛、炎性疼痛中的药物，具有良好的应用前景和市场价值。
附图说明
图1为本发明神经生长因子的单克隆抗体H26L17的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品及其上样量依次为：非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体，1μg；还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体，1μg；标准分子量蛋白，5μl；牛血清白蛋白，1μg。
图2为H26L17，Tanezumab与抗原人β-NGF的结合活性检测结果。
图3为CCK-8法检测H26L17与Tanezumab抑制TF-1细胞增殖标准曲线结果。
图4为本发明抗神经生长因子的单克隆抗体H26L17抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖的实验中72h后的细胞量。
图5为CCK-8法检测H26L17与Tanezumab抑制TF-1细胞增殖的实验中各组OD值。
图6为H26L17抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖曲线。以抗体浓度(nM)的对数为x轴，OD450nm值为y轴，进行剂量效应曲线拟合，比较不同抗体的EC50。
图7为H26L17对Lenti-IL-1β-NIH/3T3小鼠膝关节炎疼痛模型中疼痛导致的患肢的行走行为的影响结果。
图8为H26L17对Lenti-IL-1β-NIH/3T3小鼠膝关节炎疼痛模型中小鼠体重的影响结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，为可以通过市场购买获得的常规产品。
在本发明的下述实施例中，使用的C57BL/6小鼠小鼠购自广东省医学实验动物中心。
所用的阳性对照抗体Tanezumab是Pfizer抗体Tanezumab(DavidL.Shelton.Methods for treating bone cancer by administering a Nerve GrowthFactor antagonist antibody.USA，20110243961A1.2011-06-06)。
实施例1 H26L17重链和轻链序列的设计，表达和纯化
1.抗体的设计
为制备抗人NGF抗体H26L17，本发明人根据NGF蛋白序列及其蛋白三维晶体结构等，创造性地人工设计了一系列的抗体序列。通过大量的筛选和检测，最终得到了一种与NGF特异性结合的抗体H26L17。该抗体重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列及其编码DNA序列如SEQ ID NO：1～4。
2.抗体的表达和纯化
将H26L17的重链可变区的编码核苷酸序列(如SEQ ID NO：1所示；恒定区是Iggamma-1 chain C region，ACCESSION：P01857)和轻链可变区的编码核苷酸序列(如SEQ IDNO：3所示；恒定区为Ig lambda-2 chain C regions；ACCESSION：P0CG05.1)分别克隆到pUC57simple载体(金斯瑞公司提供)中，分别获得pUC57simple-H26L17H和pUC57simple-H26L17L质粒。
分别将质粒pUC57simple-H26L17H和pUC57simple-H26L17L进行酶切(HindIII&EcoRI)，电泳回收得到的重链轻链核苷酸序列分别亚克隆到pcDNA3.1载体中，提取重组质粒共转染293F细胞。转染后的293F细胞培养7天后，将培养液高速离心，获得的上清浓缩后上样至HiTrap MabSelect SuRe柱，用洗脱液一步洗脱蛋白，回收目标样品。抗体样品保存于PBS溶液中。
将纯化后的样品分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，随后煮沸。处理后的样品进行SDS-PAGE电泳检测。H26L17的电泳图如图1所示，还原型蛋白样品目标蛋白在45kD和30kD处，非还原型蛋白样品(单个抗体)目标蛋白在150kD处。
本实施例制得的H26L17用于下面的实施例2～4。
实施例2 H26L17与抗原人β-NGF的结合活性分析
本实验应用ELISA的方法测定H26L17与人β-NGF的结合EC50(半数效应浓度)，以考察抗体与人β-NGF的结合特异性和亲和力。
以0.5μg/ml的人β-NGF，每孔50μl包被酶标板，4℃孵育过夜。洗板一次拍干后，每孔用300μl 1％BSA溶液(用PBS溶解)封闭，37℃孵育2小时，洗板三次后拍干。将抗体稀释至1μg/ml作为起始浓度，在酶标板上进行1∶3的梯度稀释，共获得7个浓度；另设空白对照孔。以上操作均做2个复孔，每孔终体积100μl，37℃孵育30分钟。洗板三次拍干后，每孔加入50μl辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(H+L)二抗工作液，37℃孵育30分钟。洗板四次拍干后，每孔加入50μl TMB显色液，室温条件下避光显色5分钟后，每孔加入50μl终止液终止显色反应。反应终止后立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
由表2和图2可见，450nm读数结果显示H26L17能有效地结合人β-NGF，结合效率呈现剂量依赖关系。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图，得到的结合EC50为0.071nM，结合活性与Tanezumab相当。H26L17，Tanezumab与人β-NGF的结合活性检测结果见表2。结果表明，H26L17与抗原人β-NGF的结合效率呈现剂量依赖关系，结合EC50为0.071nM，结合活性与Tanezumab相当。
表2 H26L17，Tanezumab与抗原人β-NGF的结合活性检测结果
Figure GPA0000295150590000121
实施例3 H26L17的细胞生物学活性分析
1.检测H26L17抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖的药理学活性
为检测H26L17抑制NGF依赖的TF-1细胞增殖效应，分别用不同浓度的抗体、NGF和TF-1细胞共孵育培养72h后检测细胞增殖，具体的：
离心收集TF-1细胞，计数，96孔板中每孔接种4万个细胞。给药，NGF对照组设置三个浓度：0.2、2、20ng/ml，抗体组中用20ng/ml NGF；抗体分别设置五个浓度：0.016、0.08、0.4、2、10nM。施与细胞NGF/抗体预混液前，抗体与NGF于37℃预孵30min。实验中并设置同型对照组。细胞接受处理后培养72小时(每间隔24小时吹散打匀一次)后，参照CCK-8检测试剂盒说明书检测细胞增殖情况(检测时吸取100μl液体)。细胞增殖标准曲线如图3所示。细胞孵育72h细胞增殖检测结果如图4所示。由图4可见，H26L17呈剂量依赖性抑制NGF对TF-1细胞增殖促进效应。特别地，当抗体浓度低于0.08nM时，H26L17抗体抑制NGF对TF-1细胞增殖效应明显优于阳性对照抗体Tanezumab。
2.H26L17抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖实验中H26L17对NGF的中和活性EC50值
为检测H26L17抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖的药理学活性并计算H26L17对NGF的中和活性的EC50，分别用不同浓度的抗体、NGF和TF-1细胞共孵育培养72小时后检测细胞增殖，具体的操作步骤或方法简述如下：
TF-1细胞离心收集接种于96孔板中，每孔接种4万个细胞。给药，NGF对照组设置三个浓度：0.06、0.3、1.5nM。NGF/抗体预混液组中NGF终浓度为1.5nM，抗体分别为0.0468、0.07、0.105、0.158、0.237、0.356、0.533、0.8nM。施与细胞NGF/抗体预混液前，抗体与NGF于37℃预孵30min。实验中设置同型抗体对照组，浓度为1.5nM，。细胞接受处理后培养72小时(每间隔24小时吹散、打匀一次)后，参照CCK-8检测试剂盒说明书检测细胞增殖情况(检测时吸取100μl液体)。
CCK-8实验中检测的各组OD值如图5所示。以抗体浓度(nM)的对数为x轴，OD450nm值为y轴，进行剂量效应曲线拟合，比较不同抗体的EC50，拟合曲线如图6所示。H26L17可呈剂量依赖性地抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖，表现其对NGF的中和活性，且活性略优于同靶点上市药Tanezumab，二者中和NGF活性EC50分别为0.16nM和0.21nM，H26L17抗体抑制NGF对TF-1细胞增殖效应明显优于阳性对照抗体Tanezumab。
实施例4 H26L17在Lenti-IL-1β-NIH/3T3小鼠膝关节炎疼痛模型中能改善小鼠患肢的行走行为以及减少体重的下降。
在关节炎的患者中，患者会由于疼痛而出现跛行等行为学改变，并由于疼痛诱发的不良情绪导致摄食量减少，体重下降。为检测抗NGF抗体对膝关节炎疼痛反应的缓解，建立Lenti-IL-1β-NIH/3T3诱导的小鼠膝关节炎疼痛模型，并通过小鼠行为学改善进行药效评估。在此模型中，Lenti-IL-1β-NIH/3T3细胞在小鼠关节腔内过量表达IL-1β，进而诱发注射部位关节炎症及疼痛。在本实验中，60只C57BL/6小鼠根据体重分为6组，即正常组(Saline，皮下给药)、模型组(Anti-HEL，20mg/kg，皮下给药)、Tanezumab组(Tanezumab，20mg/kg，皮下给药)及H26L17抗体低剂量组(H26L17，0.2mg/kg，皮下给药)、中剂量组(H26L17，2mg/kg，皮下给药)、高剂量组(H26L17，20mg/kg，皮下给药)，每组10只。分组当天记为第0天(D0)。分组后对小鼠进行称重，并根据小鼠体重按照10ml/kg给药体积皮下注射相对应药物，共给药三次，分别在分组后D0，D3，D6进行皮下给药。分组当天给药后，正常组10只C57BL/6小鼠膝关节腔内接种NIH/3T3细胞悬液(5万个细胞/只)，其余各组50只C57BL/6小鼠膝关节腔内注射接种Lenti-IL-1β-NIH/3T3细胞悬液(5万个细胞/只)。然后在分组给药后D3，D5和D11进行小鼠行为学评分。
抗NGF抗体对小鼠膝关节疼痛反应的结果如图7所示，H26L17高剂量组(20mg/kg，皮下给药)与阳性对照抗体Tanezumab(20mg/kg，皮下给药)相比，降低疼痛反应明显；H26L17抗体低剂量组(0.2mg/kg，皮下给药)和H26L17中剂量组(2mg/kg，皮下给药)与阳性对照抗体Tanezumab(20mg/kg，皮下给药)相比，降低小鼠疼痛效果相当。抗NGF抗体对减轻小鼠膝关节炎疼痛模型中小鼠体重下降结果如图8所示，H26L17抗体中、高剂量组与阳性对照抗体Tanezumab减轻膝关节炎疼痛模型中的小鼠体重下降效果相当，较同型对照anti-HEL明显。
以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Figure GPA0000295150590000151
Figure GPA0000295150590000161
Figure GPA0000295150590000171
Figure GPA0000295150590000181
Figure GPA0000295150590000191

Claims (21)

1.针对神经生长因子的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括：
a)重链可变区(VH)，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3的互补决定区(CDR)，其中CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，以及CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和
b)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3的CDR，其中CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，以及CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述VH包含如SEQID NO:2所示的氨基酸序列，和所述VL包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体和双抗体。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段以小于100nM的EC50与神经生长因子(NGF)蛋白结合。
5.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含衍生自不同于小鼠的物种的非CDR区。
6.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的VH的核酸序列和编码权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的VL的核酸序列。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，编码所述VH的核酸序列包含如SEQ IDNO:1所示的核酸序列，和编码所述VL的核酸序列包含如SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
8.一种载体，其包含权利要求6或权利要求7所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞，其包含权利要求8所述的载体。
10.一种偶联物，其包括权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段以及包含可检测的标记的偶联部分。
11.根据权利要求10所述的偶联物，其特征在于，所述可检测的标记包括放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或它们的任何组合。
12.根据权利要求10或11所述的偶联物在制备用于检测生物样品中NGF蛋白的存在或量的制品中的应用。
13.一种试剂盒，其包括权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求10或11所述的偶联物。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段和至少一种药学上可以接受的载体或辅料。
15.权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗有需要的受试者的疼痛的药物中的应用，其特征在于所述单克隆抗体或其抗原结合片段用于以至少一种有效量施用于所述受试者。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于所述疼痛为神经性疼痛。
17.根据权利要求15所述的应用，其特征在于所述疼痛为慢性疼痛。
18.根据权利要求15所述的应用，其特征在于所述疼痛为炎性疼痛。
19.根据权利要求15所述的应用，其特征在于所述疼痛为癌症疼痛。
20.权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测生物样品中NGF蛋白的存在或量的制品中的应用。
21.权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制NGF依赖性TF-1细胞的增殖的制品中的应用。
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