CN102901815B

CN102901815B - 一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点活性的ELISA试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN102901815B
Application number: CN201210434955.9A
Authority: CN
Inventors: 叶克强
Original assignee: WUHAN YUANZHENG CENTURY PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: WUHAN YUANZHENG CENTURY PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-11-05
Filing date: 2012-11-05
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2032-11-05
Also published as: CN102901815A

Abstract

本发明涉及一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点激活水平的ELISA试剂盒，能在来自E17胚胎的大鼠原代皮层神经元细胞中定量检测内源性TrkB受体受到其同亲配体BDNF刺激后的激活水平。BDNF能诱导TrkB受体胞内段多个酪氨酸残基发生磷酸化，该诱导具有时间依赖性和剂量依赖性。这一过程可在TrkB受体固定在包被后的96孔板后使用第816位氨基酸磷酸化的TrkB（在人源为第817位）抗体以及磷酸化的酪氨酸抗体（抗PY99泛用抗体）检测。因此，本发明为在原代神经元培养物和脑组织中定量检测内源性TrkB受体的激活水平提供了一个强大的工具。

Description

一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点活性的ELISA试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，涉及一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点活性的ELISA试剂盒及其使用方法。

背景技术

脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养因子家族的成员，该家族包括神经生长因子（NGF），NT-3，NT-4/5(Thoenen,1991)。BDNF,如同其他神经营养因子，具有通过TrkB受体酪氨酸激酶通路影响神经元细胞的生物学活性(Huang et al.,2008;Kaplan and Miller,2000)。TrkB是脑中分布最广泛的神经营养因子之一，且在大脑皮层，海马，纹状体，脑干中高度富集(Shelton et al.,1995)。BDNF结合到TrkB能触发后者的二聚化，这一过程是通过顺应性改变和酪氨酸残基的自磷酸化实现的，其结果将导致包括促***素原活化蛋白激酶（MAPK），磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和磷脂酶C-g1（PLC-g1）在内的三条主要信号通路的激活。BDNF/TrkB信号通路在许多细胞过程如突触可塑性和神经保护作用中扮演了关键性角色(Hennigan et al.,2007;Nagappan and Lu,2005)。例如，BDNF能保护海马免受谷氨酸中毒且能拯救小脑神经元细胞的细胞程序性死亡(Leeds et al.,2005)。BDNF对参与多种神经变性性疾病的神经细胞，如参与外周感觉病变的感觉神经元(Lindsay，1996)，在帕金森氏病中缺失的黑质多巴胺能神经元及参与阿尔兹海默症的基底前脑胆碱能神经元(Siegel and Chauhan,2000)，都具有神经营养作用，故而已经成为治疗领域研究热点之一。最近，越来越多的证据表明这些分子也参与到神经发生和抗抑郁药物作用过程。抗抑郁药物能诱导BDNF信使RNA（mRNA）的表达，以及TrkB的自磷酸化激活过程(Nibuya et al.,1995;Saarelainen et al.,2003)，在小鼠强迫游泳实验中，抗抑郁药物对BDNF单等位基因激活小鼠(BDNF^+/-mice)，前脑BDNF特异性完全缺失小鼠，及表达显性失活TrkB（trkB.T1）小鼠的作用药效降低(Monteggia et al.,2004;Saarelainen et al.,2003)。因此，BDNF/TrkB在多种神经学过程都扮演了重要角色。

Trk受体的激活导致在该受体胞内段10个进化保守的酪氨酸残基中的若干发生磷酸化。其中3个（在人类是第670、674、675位酪氨酸）位于激酶结构域的激活环。这些残基的磷酸化可以增强酪氨酸激酶的活性，这种增强是通过将这些带负电荷的磷酸化酪氨酸残基与其附近的碱性氨基酸残基配对而实现的。更多的磷酸化酪氨酸可以提供能与含有多聚嘧啶串结合蛋白（PTB）结构域或肉瘤病毒编码蛋白同源结构域2型（SH2）的蛋白结合的停泊位点。细胞内信号转导事件能够被这些受体蛋白激活，包括大鼠肉瘤蛋白（Ras）-快速生长纤维瘤蛋白（Raf）-MAPK，PI3K-Akt，磷脂酶C（PLC）-γ-钙离子（Ca²⁺），核转录因子（NFκB）,以及非典型蛋白激酶C信号通路。当前研究已经关注于一对磷酸化酪氨酸之间的相互作用。第490位和785位的酪氨酸是不在激酶激活结构域内的主要的磷酸化酪氨酸(Stephens et al.,1994)。TrkA和TrkB的磷酸化位点都是各自对应保守的：TrkA第490位酪氨酸对应TrkB第512位酪氨酸，TrkA第674/675位酪氨酸对应TrkB第706/707位酪氨酸，TrkA第785位酪氨酸对应第817位酪氨酸（人源，在小鼠是第816位）(Huang and Reichardt,2003)。目前检测这些信号通路激活的方法中，各种针对TrkB受体特定磷酸化位点的抗体的免疫印迹法已经被广泛应用。尽管定量ELISA检测磷酸化的TrkB的试剂盒已经可以商业化购买，但是目前尚只有针对人源TrkB受体的产品。TrkB受体在许多肿瘤组织中高度表达，如神经母细胞瘤，***癌和胰腺导管腺癌。在神经母细胞瘤中，当促肿瘤生存的自分泌循环信号通路被过度表达的BDNF所增强时，TrkB的高度表达与不利病情转归的出现息息相关。因此，这些方法还可以应用于检测人癌细胞中TrkB的激活。不过，BDNF/TrkB信号通路主要还是在神经***中扮演角色，内源性的TrkB受体也处在一个本底水平。所以研究上还是以大鼠或小鼠作为主要实验对象。然而赛尔新罗公司(Cell Signaling)的ELISA产品并不能满足这种需要。故而，我们建立了一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点激活水平的ELISA试剂盒，可以检测出大鼠内源性TrkB的激活。考虑到不同物种蛋白存在同源性，该试剂盒可应用于人，小鼠和大鼠。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点活性的ELISA试剂盒。

本发明的ELISA试剂盒包括以下组成:

第817位磷酸化的TrkB抗体包被的96孔板；

PY-99抗体，以1:1000稀释于2%BSA/PBST溶液；

辣根过氧化物酶体标记的抗鼠IgG二抗，1:5000稀释于2%BSA/PBST溶液。

还包括：

TMB底物溶液，其为将1mg TMB溶解于1mL二甲基亚砜DMSO中，而后加入新鲜配制的9mL pH5.0的柠檬酸盐缓冲液中，最后加入100μl 3%双氧水H₂O₂；

STOP终止溶液，成分为3N HCL；

洗脱缓冲液，其稀释20倍后的终溶液为PBST溶液；

样品稀释液，为2%BSA/PBST溶液加入2mM钒酸钠；

细胞裂解缓冲液，成分为100mMβ甘油磷酸钠，500mM Tris-盐酸(pH 7.4),1.5M氯化钠，10mM乙二胺四乙酸二钠EDTA(pH 8.0),10%Triton X-100,20mM钒酸钠,500mM氟化钠,100mM焦磷酸钠，1:10加入西格玛公司出品的蛋白酶抑制剂混合物,稀释10倍后使用。

本发明的ELISA试剂盒使用方法如下：

将第817位磷酸化的TrkB抗体包被到96孔板中4摄氏度过夜，洗涤。包被后的平板使用2%牛血清白蛋白（BSA）封闭，充分洗涤后孵育以40μg溶解于样品稀释液中的细胞蛋白，这些细胞来自于经BDNF(100ng/ml)处理15分钟的细胞培养物。平板在4摄氏度下缓速摇过夜，而后再次充分洗涤。接下来用抗PY99孵育平板，4摄氏度过夜。第2天洗涤平板后，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠二抗。用TMB作为底物检测信号，因为TMB可被氧化为蓝色溶液。颜色强度和显色时间随检测的灵敏度和检测条件不同而改变。当反应到达合适的颜色强度时，加入酸性的STOP终止溶液终止反应，溶液颜色将由蓝色变为黄色。反应终止后一个小时内检测结果可以维持稳定，平板应及时在450nm下用读板器分析结果。此外，我们还检测了在650nm的吸光度，这个数值代表平板和溶液本身的本底干扰，故而要用450nm的吸光度减去650nm的吸光度。

本发明的ELISA试剂盒及ELISA方法，能定量分析TrkB在原代神经培养物中被激活的水平。我们验证了ELISA实验的结果同使用磷酸化TrkB抗体进行免疫印迹实验结果的一致性，我们的ELISA结果在剂量依赖性和时间依赖性上显示同免疫印迹实验的高度一致性，说明该新方法确实能反应出内源性的TrkB激活水平。该发明在基础研究和临床前研究领域满足了定量分析大小鼠TrkB激活水平的要求。因为ELISA提供了一种定量检测TrkB受体激活水平的方法，该方法使得靶向TrkB受体的自动高通量（HTS）药物筛选成为可能。

目前，使用磷酸化TrkB抗体的免疫印迹实验是主流甚至唯一的检测原代神经元细胞或小鼠脑中TrkB受体激活水平的方法，定量检测TrkB受体激活水平方法的缺失限制了研究的深入。例如没有定量比对，就没有办法决定性的比较不同刺激物对TrkB激活的效果以及许多生化反应的差异。为缓解这一限制，人们使用了许多替代的方法。例如为了比较BDNF和NT-4的神经营养效果，视网膜神经节细胞（RGC）在BDNF和NT-4刺激下的存活率，而不是TrkB磷酸化信号通路，在流式细胞仪下进行分析(Kashiwagi et al.,2000)。可以想象，本发明的ELISA试剂盒的商业化生产将提供期待已久的研究工具。

附图说明

图1、第817位磷酸化的TrkB抗体和TrkC14抗体能有效满足用ELISA方法分析大鼠原代神经元中TrkB激活水平。

皮层神经元经BDNF刺激后ELISA分析磷酸化TrkB。来自E17大鼠胚胎的原代皮层培养物用100ng/ml BDNF处理15分钟。细胞裂解物用ELISA进行分析。平板用不同的抗体包被和检测。数据来自两套独立重复试验（平均值±标准差）。左右图为同一实验结果的2种显示方式。

图2、定量分析大鼠原代神经元及稳定转染大鼠TrkB的T48细胞系中的TrkB受BDNF刺激的时间依赖性激活。

使用第817位磷酸化的TrkB抗体和TrkC-14抗体的检测方法的时间曲线。大鼠原代神经元和T48细胞系被100ng/ml BDNF处理不同时间。细胞裂解物由使用第817位磷酸化的TrkB抗体或TrkC-14抗体及PY99抗体检测的磷酸化TrkB ELISA法检测。

图3、定量分析大鼠原代神经元及稳定转染大鼠TrkB的T48细胞系中的TrkB受BDNF刺激的剂量依赖性激活。

使用第817位磷酸化的TrkB抗体和TrkC-14抗体的检测方法的剂量曲线。不同剂量的BDNF孵育原代皮层神经元或T48细胞15分钟。细胞裂解物（40μg）用磷酸化TrkB ELISA法进行检测。

图4、蛋白质免疫印迹实验分析大鼠原代神经元及稳定转染大鼠TrkB的T48细胞系中的TrkB受BDNF刺激的激活。

使用第817位磷酸化的TrkB抗体，TrkB抗体，p-AKT S473抗体，AKT抗体，p-MAPK抗体，MAPK抗体。大鼠原代神经元和T48细胞系被不同浓度的BDNF处理不同时间后，细胞裂解物用蛋白质免疫印迹实验进行检测。

具体实施方式

细胞，试剂，小鼠和大鼠

BDNF购自派普泰克（Peprotech）公司(货号#450-02)。抗817位磷酸化TrkB抗体购自宜百康（Epitomics）公司(货号#2149-1)。抗TrkB抗体购自赛尔新罗（Cell signaling）公司(货号.#4603S)。抗Trk C14抗体购自圣克鲁斯（Santa Cruz）公司(货号#SC-11)。抗473位磷酸化Akt，抗Akt，及抗磷酸化Erk1/2抗体购自赛尔新罗（Cell Signaling）公司。野生型C57BL/6小鼠按照埃默里医学院要求饲养于无病原体环境。定时怀孕的CD大鼠购自查尔斯河（Charles River）公司。所有上面未提到的试剂购自西格玛（Sigma）公司。7,8-二羟基黄酮购自TCI公司。生物素标记的7,8DHF和生物素标记的NAS由埃默里大学马克古德曼教授实验室合成。大鼠皮层神经元细胞来源于E17或E18大鼠胚胎。

原代大鼠皮层神经元培养

原代大鼠神经元的培养方案基于标准方案基础上稍作修改。简要的说，E18大鼠幼崽断头后，大脑皮层被解剖出来并切成小片而后通过移液操作悬浮于5%体积比小牛血清（FCS）和5%马血清（HS）的DMEM培养基中进行分离。细胞悬浮物经过一个网眼滤器（Fisher公司，货号#87711）进行过滤，而后250g离心5分钟，再用前述培养基洗涤细胞一次。细胞种植于聚乙烯亚胺包被的六孔板中，在37摄氏度，含5%体积比二氧化碳和95%体积比空气的环境中培养。三小时后，培养基换成含有B-27补充物的神经培养基（英骏Invitrogen公司）中培养7天（DIV7）。传代时，每4天将一半培养基更换为新鲜的Neurobasal／B27培养基。培养7天后的神经元细胞（DIV7）用1倍的裂解缓冲液裂解（10mMβ甘油磷酸钠，50mMTris-盐酸(pH 7.4),150mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸二钠EDTA(pH 8.0),1%TritonX-100,2mM钒酸钠,50mM氟化钠,10mM焦磷酸钠，加上西格玛公司出品的蛋白酶抑制剂混合物），而后进行各项试验。

磷酸化TrkB ELISA检测法的建立

该ELISA法使用Nunc-Immuno MaxSorp 96孔板(VWR货号#62409-024)，TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺购自西格玛货号#T5525).这些平板均使用不同的抗体包被，抗体以1:200的稀释比稀释于pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）中（每孔加100μL）。平板在4摄氏度下孵育过夜，然后使用250μL PBS/吐温-20(0.5%,体积比)(PBST)中洗涤一次，时间为1分钟；倒掉PBST后，包被后的平板每孔使用200μL含有2%BSA（牛血清白蛋白）的PBST在室温下封闭2小时。封闭后，每孔加入40μg细胞样品（溶解于100μl的2%BSA／PBST溶液中，+2mM钒酸钠），平板在4摄氏度孵育过夜，第二天用250μl PBST洗涤4次。洗涤后，每孔加入100μl检测抗体（抗酪氨酸PY99鼠源单克隆抗体，购自Santa Cruz，货号#:sc7020），抗体以1:1000的稀释比溶解于2%BSA／PBST溶液，4摄氏度孵育过夜，而后洗涤。在用PBST洗涤3到4次后，每孔加入100μl HRP标记的抗鼠二抗(飞世尔（Fisher）公司，货号#NA931-1ml)，二抗以1:5000的稀释比溶解于2%BSA／PBST溶液中，平板4摄氏度孵育过夜，而后用250μlPBST洗涤3次。洗涤完最后一次后，每空加入100μl底物溶液[TMB溶液：将1mg TMB药片溶解于1mL二甲基亚砜DMSO中，而后加入新鲜配制的9mL pH5.0的柠檬酸盐缓冲液中（50mL去离子水中加入20.5mL 0.1M柠檬酸和29.5mL 0.1M柠檬酸钠，混匀），最后加入100μl3%双氧水H₂O₂]，平板在37摄氏度下孵育10到30分钟。每孔加入50μl的3NHCl终止反应，用微孔板读板机在450nm或者荧光区检测每孔的读数，然后用450nm的读数减去650nm处的读数以修正平板光学缺陷的干扰。

尽管上文描述的过夜孵育过程能产生最理想的结果，但这一耗时的步骤也可以用37摄氏度孵育1小时代替，时间若再缩短则结果会变差

图1A总结了定量的结果。很明显，Trk C-14抗体和第817位磷酸化的TrkB抗体配合PY99抗体使用后具有最强的信号，其次是TrkB抗体和第816位磷酸化的TrkB抗体。PY20和生物素标记的PY20产生的信号较弱。我们在图1B中总结了这些检测抗体的数据。因此TrkC-14抗体和第817位磷酸化的TrkB抗体，配合PY99检测抗体使用的抗体组合最适合用于检测TrkB激活的ELISA方法。

大鼠原代神经元细胞TrkB激活水平定量分析

接下来，我们验证这种ELISA方法是否能用于定量检测原代神经元被BDNF激活的水平。为达到这一点，我们用100ng／ml的BDNF处理原代皮层神经元（DIV7）不同时间。按照前述的方法检测神经元细胞裂解物中TrkB酪氨酸磷酸化水平。我们发现第817位磷酸化的TrkB抗体和TrkB C-14抗体都能产生时间依赖性的磷酸化TrkB信号(图2，上下图)，该结果与免疫印迹法检测磷酸化的TrkB结果高度一致。同时下游磷酸化Akt和磷酸化MAPK信号的水平也随上游TrkB激活水平而发生改变，这与预期的结果是一致的(图4，左小图)。在另一方面，我们也用不同剂量的BDNF进行了滴定实验。2种方法都能检测出TrkB的激活效果是剂量依赖性的，在50ng／mL时达到平台期（图3，上下小图）。在这2种方法中，第817位磷酸化的TrkB抗体比TrkB C-14抗体显著具有2到3倍强度的信号。在免疫印迹法分析中，我们也观察到了类似的结果（图4，右小图）。综上所述，这两种定量ELISA法提供了在具有内源性TrkB受体的原代神经元中定量检测TrkBs受体激活程度的可靠方法。

Claims

1.一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点活性的ELISA试剂盒，其特征在于，包括以下组成：

第817位磷酸化的TrkB抗体包被的96孔板；

PY-99抗体，以1:1000稀释于2％BSA/PBST溶液；

辣根过氧化物酶体标记的抗鼠IgG二抗，1:5000稀释于2％BSA/PBST溶液。

2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，还包括：

TMB底物溶液，其为将1mg TMB溶解于1mL二甲基亚砜DMSO中，而后加入新鲜配制的9mL pH5.0的柠檬酸盐缓冲液中，最后加入100μl3％双氧水；

STOP终止溶液，成分为3N HCL；

洗脱缓冲液，其稀释20倍后的终溶液为PBST溶液；

样品稀释液，为2％BSA/PBST溶液加入2mM钒酸钠；

细胞裂解缓冲液，成分为100mMβ甘油磷酸钠，500mM pH7.4的Tris-盐酸,1.5M氯化钠，10mM pH8.0的乙二胺四乙酸二钠,10％Triton X-100,20mM钒酸钠,500mM氟化钠,100mM焦磷酸钠，1:10加入西格玛公司出品的蛋白酶抑制剂混合物,稀释10倍后使用。