三、发明内容
技术问题:本发明提供一种戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗及其制备方法,该疫苗以戊型肝炎病毒重组蛋白和戊型肝炎重组质粒DNA为基础,免疫动物后,能够诱导机体产生有效地的免疫应答。与蛋白或核酸单独免疫以及蛋白初免DNA加强免疫方法相比,具有诱导更强的体液免疫应答及有效增强细胞免疫应答的优点。
技术方案:本发明的技术解决方案为:一种戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗,其特征在于包括戊型肝炎病毒重组蛋白以及戊型肝炎病毒重组质粒,其中戊型肝炎病毒重组蛋白的含量为5-50ug/mL,戊型肝炎病毒重组质粒的含量为0.1-3mg/mL。
该疫苗还包括免疫佐剂,该免疫佐剂为氢氧化铝凝胶溶液,氢氧化铝凝胶的浓度范围为0.6-1.5mg/mL。
戊型肝炎病毒重组蛋白与戊型肝炎病毒重组质粒的氨基末端均位于其开放阅读框架2编码蛋白的380位至465位氨基酸之间,其羧基末端均位于590位至650位氨基酸之间,具有SEQ ID NO:1氨基酸序列:RGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLMTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAALEDTVDYPARAHTFDDFCPECRALGLQ。
一种用于制备戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗的方法,制备步骤为:a.将戊型肝炎病毒重组蛋白吸附于氢氧化铝凝胶4℃放置18-20小时;b.将戊型肝炎病毒重组质粒用生理盐水稀释;c.再将a和b所得的溶液混合,调整戊型肝炎病毒重组蛋白质量浓度为5-50ug/mL,戊型肝炎病毒重组质粒的质量浓度为0.1-3mg/mL,氢氧化铝凝胶的质量浓度为0.6-1.5mg/mL;所得的混合溶液即为戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗。
所述戊型肝炎重组蛋白质量浓度优选为10ug/mL;
所述戊型肝炎病毒重组质粒的质量浓度优选为1mg/mL;
所述氢氧化铝凝胶的质量浓度优选为1.0mg/mL。
我们所定义的HE蛋白-核酸复合疫苗,虽然含有HE蛋白疫苗及HE核酸疫苗,且应用于HE的预防,但它不同于联合疫苗或多价疫苗。HE蛋白-核酸复合疫苗在免疫接种时,通过蛋白-核酸的共免疫达到预防戊型肝炎的目的。因此单就复合疫苗而言,则是指选择同一病原微生物的蛋白、核酸或多糖等不同化学成分按比例配制而成,且仅针对一种疾病或同一病原微生物的同一血清型所引发的疾病的预防。而联合疫苗是指含有二种或二种以上不同病原生物的抗原成分,由生产者联合配制而成,用于预防二种或二种以上不同疾病的疫苗制品。如果将载体疫苗和偶联疫苗的载体菌或偶联的载体成分所引起的疾病也作为其适应症时,则载体疫苗和偶联疫苗也属于联合疫苗。多价疫苗指同一种微生物中若干血清型菌(毒)株的增殖培养物制备的疫苗,仅针对同一种疾病的不同血清型。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优点:
本发明的复合疫苗制备简单方便,只需将戊型肝炎病毒重组蛋白、戊型肝炎病毒重组质粒、氢氧化铝凝胶按比例直接混合震荡摇匀即可。
本发明的复合疫苗可以有效地用于预防人及动物的戊型肝炎,动物实验表明,该复合疫苗可有效诱导机体同时产生体液免疫应答和细胞免疫应答,复合疫苗的两种组分间具有相互促进作用,明显优于单独的蛋白疫苗或核酸疫苗。
本发明的复合疫苗所应用的免疫方式为共免疫,即蛋白疫苗与核酸疫苗共同免疫,发挥两者各自的优越性,有效诱导机体同时产生体液免疫应答和细胞免疫应答,进行优势互补。
本发明的复合疫苗所应用的戊型肝炎病毒重组蛋白与戊型肝炎病毒重组质粒的氨基末端位于戊型肝炎病毒开放阅读框架2编码的380位至465位氨基酸之间,其羧基末端位于590位至650位氨基酸之间。
本发明的戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗中,使用的氢氧化铝凝胶可以购买或采用已知方法进行制备。该佐剂为本领域技术人员所熟知的,易于获得和制备,成本低廉。
根据本发明复合疫苗的优选实施方案,复合疫苗包括戊型肝炎病毒重组蛋白以及戊型肝炎病毒重组质粒,其中戊型肝炎病毒重组蛋白的含量为5-50ug/mL,戊型肝炎病毒重组质粒的含量为0.1-3mg/mL,氢氧化铝凝胶的浓度范围为0.6-1.5mg/mL,剂量为0.1mL。制备出的复合疫苗可有效诱导机体同时产生体液免疫应答和细胞免疫应答,复合疫苗的两种组分间具有相互促进作用,明显优于单独的蛋白疫苗或核酸疫苗。
五、具体实施方式
实施例中戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗以HE蛋白-核酸复合疫苗表示。
实施例1
一种戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗,包括戊型肝炎病毒重组蛋白以及戊型肝炎病毒重组质粒,其中戊型肝炎病毒重组蛋白的含量为5-50ug/mL,戊型肝炎病毒重组质粒的含量为0.1-3mg/mL。
本实施例还包括免疫佐剂,该免疫佐剂为氢氧化铝凝胶溶液,氢氧化铝凝胶的浓度范围调整为0.6-1.5mg/mL。
戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗所应用的戊型肝炎病毒重组蛋白与戊型肝炎病毒重组质粒的氨基末端位于戊型肝炎病毒开放阅读框架2编码的380位至465位氨基酸之间,其羧基末端位于590位至650位氨基酸之间。其所述的序列为:RGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLMTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAALEDTVDYPARAHTFDDFCPECRALGLQ。
实施例2
一种用于制备上述戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗的方法:
在制备最终的戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗之前,将戊型肝炎病毒重组蛋白吸附于氢氧化铝凝胶,4℃放置18-20小时,再与戊型肝炎病毒重组质粒混合。
下面进一步举例说明。
实施例3:戊型肝炎病毒重组蛋白的表达和纯化
(1)以戊型肝炎病毒IV型中国株基因序列为模板(模板序列为GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCCCTGCTCCTTCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTCTCTCTCACCGCCGCCGAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACCCTATGTATGTTTCTGATACTGTAACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAGGTTACCCTTGATGGGCGTCCACTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTTCTGCCTCTTCGTGGTAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCATACAATTATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATCGGGTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATCTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACACTGTTGATTACCCT),用引物1(5’-CCC CCC ATG GTT ATC CAG GAC TAT GAT AAT C-3’)和引物2(5’-CCC CTC GAG TCAAGG GTAATC AAC AGT GTC CTC CA-3’)扩增ORF2编码多肽453-631(p179)的基因片段。PCR条件为:94℃-45秒,52℃-45秒,72℃-50秒,35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化,克隆入质粒载体pET28(a)+中。
(2)将表达质粒转化入表达菌株E.coli BL-21(DE3)中,挑取单菌落,用含有50ug卡那霉素的LB培养基培养至OD550=0.6~0.8,用终浓度为0.2~1.0mM IPTG进行诱导,诱导温度为37℃,摇床摇速为200rpm,3-4小时后离心收集菌体,用细胞裂解液(50mM Tris-HCl,pH 7.2,300mM NaCl)悬浮菌体沉淀,冻融6次后超声破碎菌体,离心收集上清液,再用离子交换、葡聚糖层析等方法进行纯化,最后使用UV280、SDS-PAGE等方法进行检测。
实施例4:戊型肝炎病毒重组质粒的构建和检测
以重组质粒pCDNA3.1-179为模板,设计特异性引物1(5′-CTAATGGCTAGCGTTATCCAGGACTATG-3′,28bp)和引物2(5’-GGAGGATCCAGGGTAATCAACAGTGT-3’,26bp)进行PCR扩增获得含NheI和BamHI酶切位点的p179编码基因,PCR反应条件如下:94℃预变性75s、94℃-50s、50℃-45s、72℃-70s、35次循环、72℃延伸8min。1%琼脂糖凝胶电泳观察,酶切产物用3S切胶纯化试剂盒纯化。
以NheI和BamHI分别双酶切质粒pVAX和目的片断p179编码基因,1wt%琼脂糖凝胶电泳后,酶切产物用3S切胶纯化试剂盒纯化后,以T4DNA连接酶进行连接反应,转化E-coil DH5α感受态细胞,首先PCR筛选阳性克隆,再用NheI和BamHI双酶切鉴定,酶切阳性之克隆测序。
将构建好的质粒转化细菌、扩增、抽提然后进行PCR鉴定及间接免疫荧光法检测目的抗原p179在体外的表达。
实施例5:制备戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗氢氧化铝凝胶吸附溶液
为了增加免疫原性,将戊型肝炎病毒重组蛋白及戊型肝炎病毒重组质粒吸附于氢氧化铝凝胶:(1)将戊型肝炎重组蛋白和氢氧化铝凝胶搅拌混合;(2)将戊型肝炎病毒重组质粒用生理盐水稀释。再将(1)和(2)所得的溶液混合,调整戊型肝炎重组蛋白质量浓度为10ug/mL,戊型肝炎病毒重组质粒的质量浓度为1mg/mL,氢氧化铝凝胶的质量浓度为1.0mg/mL;所得的混合溶液即为戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗氢氧化铝凝胶吸附溶液。
实施例6:戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗与单价疫苗免疫原性比较实验
A:实验动物分组和免疫方案
选用6-8周龄的雌性Balb/c纯系小鼠24只,随机分为3组,每组8只。A组:戊肝蛋白疫苗组,注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/mL),0.1mL/只;B组:戊肝核酸疫苗组,注射戊肝病毒重组质粒(1mg/mL),0.1mL/只;C组:戊肝蛋白-核酸复合疫苗共免疫组,注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/mL)+戊肝病毒重组质粒(1mg/mL),0.1mL/只;
B:检测方法:
间接ELISA法检测血清中抗HEV-IgG抗体及抗HEV-IgG1、IgG2a抗体。具体操作步骤如下:A.包被:将HEV重组抗原MIX166用1mol/L尿素PBST稀释后包被酶标板,100μl/孔,放置4℃冰箱过夜;B.加样:已包被的酶标板用PBST液洗涤3次,扣干,加5wt%脱脂奶粉PBST 90ul稀释的10μl小鼠血清,37℃孵育40min;C.加酶标二抗:PBST液洗涤4次,以含30wt%甘油的PBST稀释HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5000体积比稀释)及IgG-1、IgG-2a(1∶2500体积比稀释),每孔加100μl,37℃孵育40min;D.显色:包括空白对照孔,每孔加底物A液、B液各50μl,轻拍混匀,置37℃温育10分钟;E.加入终止液50μl,轻拍混匀;F.测定:酶标仪以空白对照孔调零,在波长450nm处测定各孔OD450值,打印测定结果;G.结果判定标准:采用比率表示法,用测定标本孔的OD450与阴性标本测定孔OD450的比值,即P/N>2.1时判为阳性,否则为阴性,以OD450值显示抗体水平。
C:结果
表一单价对照组与复合疫苗组小鼠血清中抗HEV-IgG抗体的值(对照附图1)
|
2W |
4W |
6W |
8W |
10W |
12W |
14W |
A组 |
0.124 |
0.338 |
0.424 |
0.563 |
0.807 |
0.947 |
1.048 |
B组 |
0.135 |
0.276 |
0.378 |
0.57 |
0.536 |
0.662 |
0.907 |
C组 |
0.174 |
0.456 |
0.599 |
0.776 |
1.109 |
1.038 |
1.165 |
表2单价对照组与复合疫苗组小鼠血清第14周抗体及抗体亚类比较(对照附图2)
|
IgG |
IgG-1 |
IgG-2a |
IgG-1/IgG-2a |
A组 |
1.048 |
0.632 |
0.285 |
2.22 |
B组 |
0.907 |
0.279 |
0.402 |
0.69 |
C组 |
1.165 |
0.756 |
0.568 |
1.33 |
如图1、2所示:蛋白-核酸复合疫苗组血清中抗HEV-IgG抗体高于蛋白对照组,但是差异无统计学意义(P>0.05),而其在第一次免疫之后血清中抗HEV-IgG抗体就一直显著高于核酸对照组(P<0.05);我们又检测了第十四周小鼠血清HEV-IgG抗体亚类IgG1与IgG2a的水平,蛋白-核酸复合疫苗组的IgG1水平与蛋白对照组的差异无统计学意义(P>0.05),而IgG2a的水平显著高于蛋白对照组(P<0.01),其IgG1与IgG2a的水平均显著高于核酸对照组(P<0.01),IgG1与IgG2a的比值介于二者之间。表明蛋白-核酸复合疫苗共免疫小鼠可诱导较强的体液免疫应答,并显著增强细胞免疫应答的水平,有利于机体的抗病毒免疫。
实施例7:戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗共免疫组与戊肝蛋白-核酸单价疫苗共免疫组免疫原性比较实验
A:实验动物分组和免疫方案
选用6-8周龄的雌性Balb/c纯系小鼠16只,随机分为2组,每组8只。A组:戊肝蛋白-核酸复合疫苗共免疫组,注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/mL)+戊肝病毒重组质粒(1mg/mL),0.1mL/只;B组:戊肝蛋白-核酸单价疫苗共免疫组,两腿分别注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/mL),戊肝病毒重组质粒(1mg/mL),各0.1mL/只。各组实验动物分别于0、4、8周肌肉注射相应疫苗三次,每次0.1mL。
B:检测方法:
间接ELISA法检测血清中抗HEV-IgG抗体及抗HEV-IgG1、IgG2a抗体。具体操作步骤如下:A.包被:将HEV重组抗原MIX166用1mol/L尿素PBST稀释后包被酶标板,100μl/孔,放置4℃冰箱过夜;B.加样:已包被的酶标板用PBST液洗涤3次,扣干,加5wt%脱脂奶粉PBST 90ul稀释的10μl小鼠血清,37℃孵育40min;C.加酶标二抗:PBST液洗涤4次,以含30wt%甘油的PBST稀释HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5000体积比稀释)及IgG-1、IgG-2a(1∶2500体积比稀释),每孔加100μl,37℃孵育40min;D.显色:包括空白对照孔,每孔加底物A液、B液各50μl,轻拍混匀,置37℃温育10分钟;E.加入终止液50μl,轻拍混匀;F.测定:酶标仪以空白对照孔调零,在波长450nm处测定各孔OD450值,打印测定结果;G.结果判定标准:采用比率表示法,用测定标本孔的OD450与阴性标本测定孔OD450的比值,即P/N>2.1时判为阳性,否则为阴性,以OD450值显示抗体水平。
C:结果
表1不同共免疫方式小鼠血清抗HEV-IgG抗体比较(对照附图3)
|
2W |
4W |
6W |
8W |
10W |
12W |
14W |
A |
0.174 |
0.456 |
0.599 |
0.776 |
1.109 |
1.038 |
1.165 |
B |
0.174 |
0.668 |
0.774 |
0.853 |
1.119 |
1.059 |
1.23 |
表2不同共免疫方式小鼠血清第14周抗HEV-IgG抗体及抗体亚类比较(对照附图4)
|
IgG |
IgG-1 |
IgG-2a |
IgG-1/IgG-2a |
A组 |
1.165 |
0.756 |
0.568 |
2.28 |
B组 |
1.23 |
1.032 |
0.414 |
4.322 |
如图3、4所示:蛋白-核酸复合疫苗共免疫组所诱导的体液免疫应答水平与蛋白、核酸单价疫苗共免疫组相近,两组的IgG抗体无显著性差异(P>0.05),蛋白-核酸复合疫苗共免疫组的IgG1水平低于蛋白、核酸单价疫苗共免疫组,但其差异无统计学意义(P>0.05),而反应细胞免疫应答水平的IgG2a的值则高于蛋白、核酸单价疫苗共免疫组(P<0.01),导致复合疫苗共免疫组的IgG-1/IgG-2a明显低于单价疫苗共免疫组,说明蛋白-核酸复合疫苗共免疫组可诱导更强的细胞免疫应答。
实施例8:戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗组与戊肝蛋白-核酸疫苗交替免疫组免疫原性比较实验
A:实验动物分组和免疫方案
选用6-8周龄的雌性Balb/c纯系小鼠40只,随机分为5组,每组8只。A组:戊肝蛋白-核酸复合疫苗共免疫组,注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/mL)+戊肝病毒重组质粒(1mg/mL),0.1mL/只;B组:戊肝蛋白-核酸疫苗交替免疫组-1(DDP组),第0周和4周注射戊肝病毒重组质粒(1mg/mL),8周注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/mL),各0.1mL/只;C组:戊肝蛋白-核酸疫苗交替免疫组-2(PPD组),第0周和4周注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/mL),8周注射戊肝病毒重组质粒(1mg/mL),各0.1mL/只;D组:戊肝蛋白-核酸疫苗交替免疫组-3(DPP组),第0周注射戊肝病毒重组质粒(1mg/mL),第4周和8周注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/mL),各0.1mL/只;E组:戊肝蛋白-核酸疫苗交替免疫组-4(PDD组),第0周注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/mL),第4周和8周注射戊肝病毒重组质粒(1mg/mL),各0.1mL/只。各组实验动物分别于0、4、8周肌肉注射相应疫苗三次,每次0.1mL。
B:检测方法:
间接ELISA法检测血清中抗HEV-IgG抗体及抗HEV-IgG1、IgG2a抗体。具体操作步骤如下:A.包被:将HEV重组抗原MIX166用1mol/L尿素PBST稀释后包被酶标板,100μl/孔,放置4℃冰箱过夜;B.加样:已包被的酶标板用PBST液洗涤3次,扣干,加5wt%脱脂奶粉PBST 90ul稀释的10μl小鼠血清,37℃孵育40min;C.加酶标二抗:PBST液洗涤4次,以含30wt%甘油的PBST稀释HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5000体积比稀释)及IgG-1、IgG-2a(1∶2500体积比稀释),每孔加100μl,37℃孵育40min;D.显色:包括空白对照孔,每孔加底物A液、B液各50μl,轻拍混匀,置37℃温育10分钟;E.加入终止液50μl,轻拍混匀;F.测定:酶标仪以空白对照孔调零,在波长450nm处测定各孔OD450值,打印测定结果;G.结果判定标准:采用比率表示法,用测定标本孔的OD450与阴性标本测定孔OD450的比值,即P/N>2.1时判为阳性,否则为阴性,以OD450值显示抗体水平。
C:结果
表1戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗组与戊肝蛋白-核酸疫苗交替免疫组小鼠血清抗HEV-IgG抗体比较(对照附图5)
|
6W |
8W |
10W |
12W |
14W |
16W |
18W |
A |
0.119 |
0.245 |
0.751 |
1.17 |
1.337 |
1.466 |
1.345 |
B |
0.02 |
0.04 |
0.032 |
0.037 |
0.174 |
0.359 |
0.275 |
C |
0.05 |
0.138 |
0.244 |
0.308 |
0.699 |
0.756 |
0.675 |
D |
0.013 |
0.046 |
0.097 |
0.298 |
0.911 |
1.034 |
0.958 |
E |
0.024 |
0.042 |
0.04 |
0.052 |
0.196 |
0.239 |
0.281 |
表2复合疫苗组与交替免疫组小鼠血清第16周抗HEV-IgG抗体及抗体亚类比较(对照附图6)
|
IgG |
IgG-1 |
IgG-2a |
IgG-1/IgG-2a |
A组 |
1.466 |
1.195 |
0.608 |
1.965 |
B组 |
0.359 |
0.144 |
0.233 |
0.618 |
C组 |
0.756 |
0.507 |
0.203 |
2.496 |
D组 |
1.034 |
0.651 |
0.444 |
1.466 |
E组 |
0.239 |
0.084 |
0.102 |
0.824 |
如图5、6所示:蛋白-核酸复合疫苗组血清中抗HEV-IgG抗体显著高于所有的交替免疫组(P<0.01);我们又检测了第十六周小鼠血清HEV-IgG抗体亚类IgG1与IgG2a的水平,蛋白-核酸复合疫苗组的IgG1与IgG2a的水平同样显著高于所有的交替免疫组(P<0.01),IgG1与IgG2a的比值介于几者之间。表明蛋白-核酸复合疫苗共免疫小鼠可同时诱导较强的体液免疫应答及细胞免疫应答的水平,但体液免疫应答占主要地位,而显著增强的细胞免疫应答有利于机体的抗病毒免疫。
实施例9:戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗不同剂量组免疫原性比较实验
A:实验动物分组和免疫方案
选用6-8周龄的雌性Balb/c纯系小鼠24只,随机分为3组,每组8只。A组:戊肝蛋白-核酸复合疫苗低剂量组,注射戊肝病毒重组蛋白(5ug/mL)+戊肝病毒重组质粒(0.5mg/mL),0.1mL/只;B组:戊肝蛋白-核酸复合疫苗中剂量组,注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/mL)+戊肝病毒重组质粒(1mg/mL),0.1mL/只;C组:戊肝蛋白-核酸复合疫苗高剂量组,注射戊肝病毒重组蛋白(20ug/mL)+戊肝病毒重组质粒(2mg/mL),0.1mL/只。各组实验动物分别于0、4、8周肌肉注射相应疫苗三次,每次0.1mL。
B:检测方法:
间接ELISA法检测血清中抗HEV-IgG抗体及抗HEV-IgG1、IgG2a抗体。具体操作步骤如下:A.包被:将HEV重组抗原MIX166用1mol/L尿素PBST稀释后包被酶标板,100μl/孔,放置4℃冰箱过夜;B.加样:已包被的酶标板用PBST液洗涤3次,扣干,加5wt%脱脂奶粉PBST 90ul稀释的10μl小鼠血清,37℃孵育40min;C.加酶标二抗:PBST液洗涤4次,以含30wt%甘油的PBST稀释HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5000体积比稀释)及IgG-1、IgG-2a(1∶2500体积比稀释),每孔加100μ1,37℃孵育40min;D.显色:包括空白对照孔,每孔加底物A液、B液各50μl,轻拍混匀,置37℃温育10分钟;E.加入终止液50μl,轻拍混匀;F.测定:酶标仪以空白对照孔调零,在波长450nm处测定各孔OD450值,打印测定结果;G.结果判定标准:采用比率表示法,用测定标本孔的OD450与阴性标本测定孔OD450的比值,即P/N>2.1时判为阳性,否则为阴性,以OD450值显示抗体水平。
C:结果
表1不同剂量组小鼠血清抗HEV-IgG抗体比较(对照附图7)
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2W |
4W |
6W |
8W |
10W |
12W |
14W |
A组 |
0.171 |
0.394 |
0.623 |
0.739 |
0.885 |
0.929 |
1.061 |
B组 |
0.174 |
0.456 |
0.599 |
0.776 |
1.109 |
1.038 |
1.165 |
C组 |
0.109 |
0.378 |
0.641 |
0.843 |
1.224 |
1.274 |
1.473 |
表2不同剂量组小鼠血清第14周抗HEV-IgG抗体及抗体亚类比较(对照附图8)
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IgG |
IgG-1 |
IgG-2a |
IgG-1/IgG-2a |
A组 |
1.061 |
0.569 |
0.328 |
1.74 |
B组 |
1.165 |
0.756 |
0.568 |
1.33 |
C组 |
1.473 |
1.395 |
1.381 |
1.01 |
如图7、8所示:复合疫苗三个不同剂量组相比,随着免疫剂量的增加,体液免疫应答和细胞免疫应答的水平均有不同程度的升高,三个不同剂量组呈现一定的量效关系。低剂量组、中剂量组、高剂量组3组的IgG抗体依次升高,IgG1/IgG2a则依次降低,高剂量组的IgG、IgG2a均高于中剂量组(P<0.05),高剂量组的IgG、IgG1、IgG2a均显著高于低剂量组(P<0.01),中剂量组的IgG、IgG1、IgG2a高于低剂量组但差异无统计学意义(P>0.05)。
序列表
<110>东南大学
<120>戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗及其制备方法
<160>6
<210>1
<211>271
<212>PRT
<213>Hepatitis E virus
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(271)
<400>1
1 RGIALTLFNL ADTLLGGLPT ELISSAGGQL FYSRPVVSAN GEPTVKLYTS VENAQQDKGI
61 AIPHDIDLGE SRVVIQDYDN QHEQDRPTPS PAPSRPFSVL RANDVLWLSL TAAEYDQTTY
121 GSSTNPMYVS DTVTFVNVAT GAQGVSRSLD WSKVTLDGRP LMTIQQYSKT FFVLPLRGKL
181 SFWEAGTTKA GYPYNYNTTA SDQILIENAA GHRVCISTYT TNLGSGPVSI SAVGVLAPHS
241 ALAALEDTVD YPARAHTFDD FCPECRALGL Q
<210>2
<211>537
<212>DNA
<213>Hepatitis E virus
<400>2
1 GTTATCCAGG ACTATGATAA TCAACATGAG CAAGACCGCC CTACCCCCTC CCCTGCTCCT
61 TCTCGCCCTT TTTCTGTGCT TCGTGCTAAT GATGTGCTTT GGCTCTCTCT CACCGCCGCC
121 GAGTATGATC AGACTACCTA CGGCTCTTCT ACTAACCCTA TGTATGTTTC TGATACTGTA
181 ACGTTTGTCA ATGTGGCCAC TGGCGCCCAG GGGGTTTCGC GCTCTCTGGA CTGGTCTAAG
241 GTTACCCTTG ATGGGCGTCC ACTAACTACT ATCCAGCAGT ATTCCAAGAC TTTCTATGTT
301 CTGCCTCTTC GTGGTAAGCT TTCTTTTTGG GAGGCTGGTA CTACTAAAGC CGGCTACCCA
361 TACAATTATA ATACTACTGC TAGTGATCAG ATCCTGATTG AGAATGCAGC TGGCCATCGG
421 GTTTGTATTT CTACTTATAC TACTAATTTG GGCTCCGGGC CTGTTTCTAT CTCTGCTGTC
481 GGTGTCCTCG CACCCCATTC TGCATTGGCC GTTTTGGAGG ACACTGTTGA TTACCCT
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>合成引物
<400>3
1 CCCCCCATGG TTATCCAGGA CTATGATAAT C
<210>4
<211>35
<212>DNA
<213>合成引物
<400>4
1 CCCCTCGAGT CAAGGGTAAT CAACAGTGTC CTCCA
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>合成引物
<400>5
1 CTAATGGCTA GCGTTATCCA GGACTATG
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>合成引物
<400>6
1 GGAGGATCCA GGGTAATCAA CAGTGT