KR101832610B1 - 돼지 유행성 설사 바이러스 유래 수용성 재조합 항원 단백질 및 이를 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물 - Google Patents

돼지 유행성 설사 바이러스 유래 수용성 재조합 항원 단백질 및 이를 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스 유래 수용성 재조합 항원 단백질 및 이를 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것으로서, 돼지 유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea, PED)를 예방하기 위해 보다 안전하고 경제적이며, 질병 발생시, 보다 신속하게 대응할 수 있는 전략으로 아단위 백신(Subunit vaccine)을 개발하였다. 기존의 약독화 생백신의 경우, 동물세포에서 장기간의 계대배양(100회)을 거쳐야 되는 번거로움이 있어 새로운 변종 바이러스가 창궐할 시 빠른 대응이 어렵지만, 본 발명의 아단위 백신은 클로닝 벡터에 변이된 유전자 서열의 간단한 치환으로 생산이 가능하므로 신속하게 대응할 수 있다. 이에 본 발명은 동물의약품으로 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료 주사백신 또는 백신 전달체와 함께 경구 백신으로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

돼지 유행성 설사 바이러스 유래 수용성 재조합 항원 단백질 및 이를 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물{Soluble recombinant antigen protein of porcine epidemic diarrhea virus and vaccine composition for preventing or treating porcine epidemic diarrhea comprising the same}
본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스 유래 수용성 재조합 항원 단백질 및 이를 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
돼지 유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea, PED)는 국내 양돈장에서 발생빈도가 가장 높은 바이러스성 질병이며, 신생자돈에서 90~100% 치사율을 보임으로 경제적으로도 손실이 매우 큰 돼지 질병이다. 이러한 PED를 예방하기 위해 보다 안전하고 경제적이며, 질병 발생시, 보다 신속하게 대응할 수 있는 전략으로 아단위 백신(Subunit vaccine) 개발의 필요성이 대두되고 있다. 아단위 백신은 병원성 미생물을 구성하고 있는 항원성이 알려진 구조 또는 비구조 단백질을 재조합 미생물에서(대장균 또는 타 발현 시스템) 대량 생산하여 백신의 항원 단백질로 사용하는 것을 말한다.
국내에서는 대부분 약독화 PED 생백신을 사용하고 있지만, 이러한 백신의 가장 큰 문제점은 약독화 되었더라도 바이러스가 살아 있기에 독성이 회복되면서 병원성을 띠게 되므로 안전성에 문제가 발생할 수 있다. 또한 백신을 개발함에 있어서 약독화하는 단계로 동물세포에서 100회 계대배양을 하게 되는데 비교적 긴 시간이 소요됨으로 변이 속도가 빠른 바이러스에 대한 신속한 대응이 어려우며 동물세포배양을 이용하기에 백신개발 비용 또한 비교적 높은 편이다.
한국공개특허 10-2012-0066555(2012.06.22 공개)
본 발명의 목적은 돼지 유행성 설사 바이러스 유래 수용성 재조합 항원 단백질 및 이를 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 돼지 유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea, PED) 바이러스 스파이크 당단백질 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 돼지 유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea, PED) 바이러스 항원 단백질 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 재조합 미생물, 이의 배양물 또는 이로부터 분리 정제된 PED 바이러스 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스 유래 수용성 재조합 항원 단백질 및 이를 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것으로서, 돼지 유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea, PED)를 예방하기 위해 보다 안전하고 경제적이며, 질병 발생시, 보다 신속하게 대응할 수 있는 전략으로 아단위 백신(Subunit vaccine)을 개발하였다. 기존의 약독화 생백신의 경우, 동물세포에서 장기간의 계대배양(100회)을 거쳐야 되는 번거로움이 있어 새로운 변종 바이러스가 창궐할 시 빠른 대응이 어렵지만, 본 발명의 아단위 백신은 클로닝 벡터에 변이된 유전자 서열의 간단한 치환으로 생산이 가능하므로 신속하게 대응할 수 있다. 이에 본 발명은 동물의약품으로 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료 주사백신 또는 백신 전달체와 함께 경구 백신으로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 P1 (499-636aa) 및 P2 (637-789aa) 유전자를 증폭하기 위한 PCR 수행 결과를 나타낸다.
도 2는 pGEX 5x-1 발현 벡터 구축 모식도를 나타낸다.
도 3은 P1 및 P2 유전자의 형질전환 여부를 확인하기 위한 콜로니 PCR 결과를 나타낸다.
도 4는 P1 및 P2 유전자의 발현여부를 확인하기 위한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 5는 정제된 P1 및 P2 단백질의 웨스턴 블랏(Western blot) 결과를 나타낸다.
도 6은 마우스에서의 항원 특이 혈청 IgG 분석 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 중화항체 시험 결과를 나타낸다.
도 8은 기니피그에서의 P1 항원 특이 혈청 IgG 분석 측정 결과를 나타낸다.
도 9는 기니피그에서의 P2 항원 특이 혈청 IgG 분석 측정 결과를 나타낸다.
도 10은 자돈에서의 P1 항원 특이 혈청 IgG 분석 측정 결과를 나타낸다.
도 11은 자돈에서의 P2 항원 특이 혈청 IgG 분석 측정 결과를 나타낸다.
이에 본 발명자들은 항원 단백질의 클로닝을 목적으로 국내 양돈 농장에서 분리한 야생 PED 바이러스주 PPIV를 동물세포에서 100회 계대배양을 통하여 약독화한 바이러스를 사용하였다. 항원 단백질은 바이러스의 외각단백질인 스파이크 당단백질(Spike glycoprotein)의 S1 영역에서 중화항체 에피토프 499~636aa와 637~789aa 부위를 선정하여 대장균 발현 시스템에서 발현하였다. 아단위 백신의 경우 발현한 재조합 항원 단백질은 고유의 구조를 가져야 하는데 바이러스 유래의 유전자를 대장균에서 발현 시 비수용성(insoluble) 봉입체(inclusion body)로 발현되는 경우가 많다. 이에 본 발명자들은 수용성 재조합 항원 단백질을 생산하기 위하여 chaperone co-expression 대장균 균주를 도입하여 GST-P1 및 GST-P2를 확보하였다. 발현한 재조합 항원 단백질의 항원성과 중화항체 생성 여부를 조사하고자 모델 동물인 쥐에서 주사로 항원을 투여하여 면역시험을 진행하였다. 결과 GST-P1 및 GST-P2 모두 비교적 높은 항원성을 보였으며, 중화항체 역가 또한 28 ~ 210 수준으로 생성되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 돼지 유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea, PED) 바이러스 스파이크 당단백질 유전자를 제공한다.
본 발명에서 용어, "PED(porcine epidemic diarrhea) 바이러스"는 코로나바이러스과(coronaviridae)에 속하며 단일 가닥 RNA를 게놈(genome)으로 가지며 길이는 약 28Kb이고, 3개의 주요 구성 단백질인 spike 단백질(180-220KDa)과 막단백질 또는 외피 단백질 (27-32KDa) 그리고 뉴클레오캡시드 단백질(55-58KDa)을 암호화 하고 있다).
본 발명에서 용어, "스파이크(Spike) 단백질"은 PED 바이러스의 주요 구성 단백질로서, 목표 세포를 인식하고 바이러스와 세포막(cellular membrane)를 융합시키는 생물학적으로 중요한 기능을 가지고 있다. 스파이크(Spike) 단백질의 일부 유전자를 약독화 항원결정기(neutrali zation epitope)로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 발현벡터는 도 2의 개열지도를 갖을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다. 바람직하게는 상기 미생물은 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 상기 대장균은 BL21일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 돼지 유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea, PED) 바이러스 항원 단백질 생산방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 PED 바이러스 항원 단백질은 수용성 단백질이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물, 이의 배양물 또는 이로부터 분리 정제된 PED 바이러스 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, “백신”은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
본 발명의 백신 조성물에는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 항원 물질을 생체 내 부위에 전달하는데 적합한 임의의 성분을 의미하며, 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 혈청 함유 용액, 한스 용액, 기타 수용성의 생리학적 평형 용액, 오일, 에스테르 및 글리콜 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 담체는 화학적 안정성 및 등장성을 증진시키기 위해 적합한 보조 성분과 보존제를 포함할 수 있으며, 트레할로스, 글라이신, 솔비톨, 락토오스 또는 모노소듐 글루타메이트(MSG)와 같은 안정화제를 포함시켜 온도 변화 또는 동결건조에 대해 백신 조성물을 보호할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 멸균수 또는 식염수(바람직하게는 완충된 식염수)와 같은 현탁 액체를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 면역원에 대한 면역반응을 향상시키기에 충분한 양의 임의의 애쥬번트(adjuvant)를 함유할 수 있다. 적합한 애쥬번트는 문헌 Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875에 기술되어 있으며, 예컨대, 알루미늄염(알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 히드록시드), 스쿠알렌 혼합물(SAF-1), 무라밀 펩티드, 사포닌유도체, 마이코 박테리아 세포벽 제조물, 모노포스포릴 지질 A, 미콜산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛, 폴리포스파젠 및 유도체, 및 면역자극 복합체 (ISCOMs)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
다른 모든 백신 조성물과 마찬가지로, 면역원의 면역학적 유효량은 경험적으로 결정되어야 하며, 이 경우 고려될 수 있는 인자는 면역원성, 투여 경로 및 투여되는 면역 투여 회수를 들 수 있다.
본 발명 백신 조성물 중의 항원물질인 돼지 유행성 설사 바이러스 항원단백질은 본 발명의 조성물 내에서 다양한 농도로 존재할 수 있으나, 통상적으로, 상기 항원물질이 생체 내에서 적절한 수준의 항체 형성을 유도하기에 필요한 농도로 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 전신 또는 점막 경로를 통해 투여함으로써, 돼지 유행성 설사 바이러스 감염에 민감한 동물을 보호하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 백신 조성물의 투여는 근내, 복막내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사, 경구/식사, 호흡기, 비뇨생식관으로의 점막 투여를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 >
1. 스파이크 당단백질 발현 영역 유전자 클로닝
1) pMBP-SLONG (499-789) 벡터
P1 (499-636aa; 서열번호 1) 및 P2 (637-789aa; 서열번호 2) 영역을 클로닝하기 위하여 기존에 이미 구축된 pMBP-SLONG (499-789) 벡터에서 PCR을 이용하여 유전자를 증폭하였다.
pMBP-SLONG (499-789) 벡터의 구축 과정은 다음과 같다. 먼저 PPIV 바이러스주의 스파이크 당단백질의 499-789aa 영역에 해당되는 유전자를 클로닝하기 위하여 PPIV 바이러스주를 Vero CCL-81 세포에 감염 후 Trizol을 이용하여 세포 내 total mRNA를 추출하여 RT-PCR을 통하여 cDNA를 합성하였다. RT-PCR을 수행하기 위하여 각각 S_MAL_F 5' TGAAGGATTTCAGTTACTTTGCCATCATTCAATGAC 3'와 S_MAL_R 5' TCCTGCAGGAATACTCATACTAAAGTTGGTGGG 3' primer를 사용하였다. 역전사(Reverse transcription)는 1㎍의 mRNA와 100pmol S_MAL_R를 섞은 용액을 65℃에서 5min 반응 후, 각각의 5x first strand buffer, 0.1M DTT, 10mM dNTP mixture, 100U MMLV reverse transcriptase를 넣어주어 추가로 37℃에서 50분, 70℃에서 15분 반응하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 template로 아래와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 조성은 1㎕ cDNA 용액, 10X PCR buffer, 2.5mM dNTP, Taq polymerase, 1pmol F/R Primer를 DW 섞은 후 50㎕ 맞췄다. PCR 반응은 95℃ 4분, 95℃ 30초, 52℃ 30 초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30cycle로 진행하였다. PCR 반응 후 1% agarose gel에서 800bp 크기의 예상 밴드를 확인하였다. 남은 반응산물은 PCR purification kit을 이용하여 정제 후 pGEM T easy vector (Promega)에 삽입하여 pGEM-SLONG를 구축하였다. pGEM-SLONG 발현벡터를 각각 Xmn I과 Sbf I 제한효소로 4시간 처리 후 1% Agarose gel에서 분리 정제하였고 동일 제한 효소로 자른 pMAL c5x-1 발현벡터와 T4 ligase를 이용하여 연결하여 pMAL-SLONG (499-789) 발현벡터를 구축하였다.
2) 프라이머 합성
프라이머는 pMBP-SLONG (499-789)에 삽입된 유전자 서열을 토대로 작성하였으며 표 1에서와 같이 5' BamH I, 3' Stop codon & Xho I 서열을 삽입하였다.
Figure 112016055838112-pat00001
3) PCR 클로닝
pMBP-SLONG (499-789) 벡터에서 P1과 P2 유전자를 증폭하기 위하여 아래와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 50ng pMBP-SLONG (499-789), 2X i-MAX II PCR mixture (Intron), 10pmol 각각 프라이머 넣어 total volumn 50㎕로 맞췄다. 95℃ 4분, 95℃ 30초, 57℃ 30 초, 72℃ 1분 및 72℃ 5분, 25 cycle로 진행하였다. PCR 반응 후 1% agarose gel에서 약 500bp 크기의 예상 밴드를 확인하였다(도 1). 남은 반응산물은 PCR purification kit을 이용하여 정제 후 pGEM T easy vector (Promega)에 삽입하여 pGEM-P1와 pGEM-P2를 벡터를 확보하였다.
2. 발현 벡터 및 재조합 대장균 발현 균주 구축
1) pGEX 5x-1 발현 벡터 구축
pGEM-P1, pGEM-P2 발현벡터를 각각 BamH I과 Xho I 제한효소로 4시간 처리 후 1% Agarose gel에서 분리 정제하였고, 동일 제한 효소로 자른 pGEX 5x-1 발현벡터와 T4 ligase를 이용하여 연결하여 발현벡터를 구축하였다(도 2).
2) 콜로니 PCR
구축한 벡터는 E. coli BL21 pTF16 competent cell에 열 충격 형질전환(heat shcok transformation) 한 후, 콜로니 PCR을 통하여 형질전환 여부를 확인하였다(도 3). 콜로니 PCR 조건은 LB plate 상에서 자란 콜로니(colony)를 주형(template)으로 사용한 것을 제외하고는 P1 & P2 증폭할 때의 조건과 동일하다.
3. 단백질 발현 확인
구축한 재조합 발현 균주 1 콜로니(colony)를 5ml LB broth + 앰피실린(ampicillin, 100㎍/ml) + 클로람페니콜(chloramphenicol, 20㎍/ml)에 1/1000 접종하여 37℃ shaking incubator에서 14시간 배양하였다. 다음 배양액을 500ml의 LB broth + 앰피실린(ampicillin, 100㎍/ml) + 클로람페니콜(chloramphenicol, 20㎍/ml) + L-아라비노스(L-arabinose, 0.5mg/ml)에 1/100로 접종하였다. OD=0.5~0.6 까지 균이 자라면 4℃ 냉장고에서 30분 식힌 다음 IPTG 0.1mM을 첨가하여 15℃에서 24시간 진탕 배양하였다. 배양이 끝난 후 균을 회수하여 1X PBS에 2회 씻어낸 후 펠렛(pellet)을 회수하였다. 회수한 펠렛(pellet)은 1XPBS 5ml에 풀어서 Sonication을 통하여 균을 파쇄하였다. 파쇄된 용액은 12,000rpm, 4℃에서 10분 원심분리를 통하여 수용성 단백질 구획과 비수용성 구획을 분리하여 보관하였다. 펠렛(pellet)은 10mM Tris-HCl, pH 12.5에 용해 후 수용성 단백질 구획과 함께 12% SDS-PAGE 상에서 크기별로 분리하여 단백질 발현을 1차적으로 확인 하였다(도 4). 발현된 단백질을 정제하기 위하여 GST bind affinity column purification (Novagen)을 이용하였다. 정제 조건은 Novagen 회사의 매뉴얼에서 제시한 방법과 동일하게 적용하였다. 정제된 단백질이 맞는지 확인하기 위하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 수행하였다. 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellurose membrane)에 15V에서 1시간 동안 옮긴 후, Mouse anti-GST monocolonal antibody (1:2000, abcam)와 anti-mouse IgG-HRP (1:5000, Santacruz)를 이용하여 발현된 단백질을 특이적으로 감지하였다(도 5).
4. 백신 효율 검증을 위한 마우스에서의 면역시험
1) 실험동물 및 항원 처리
정제된 단백질은 엔도톡신 제거 컬럼(Endotoxin removal column, Thermo)에 통과시켜 엔도톡신(Endotoxin)을 제거하였다. 6주령 암컷 Balb/c 마우스를 그룹당 5마리씩 배치하였다. 대조구는 PBS을 투여하였고, 실험구는 GST-P1, GST-P2 항원 단백질을 각각 1회당 10㎍씩 2주 간격으로 총 3회 피하로 투여하였다. 1차 항원 투여시에는 동량의 Complete Freud's adjuvant (CFA)를 사용하였으며, 그 후 Boosting 시에는 Incomplete Freud's adjuvant (IFA)를 동량으로 섞어 주사하였다. 혈액은 0주, 2주, 4주, 6주차에 Retro orbital 혈관에서 채취 후 혈청을 분리하여 -20도에 분석 전까지 냉동 보관하였다.
2) ELISA를 이용한 항원 특이 혈청 IgG 분석
정제한 항원 단백질 또는 GST 단백질을 10㎍/ml가 되도록 50mM sodium bicarbonate buffer (pH 9.6)에 희석한 후 96 well immuno-plate (SPL)에 100㎕씩 분주하여 4℃에서 12시간 동안 밤새 배양하였다. 다음날 coating buffer를 제거 후 1XPBS로 3회 세척 후 0.5% skim milk를 이용하여 1시간 실온에서 차단하였다. 차단이 끝난 후 plate를 1XPBS로 3회 세척하였고, 1XPBS에 800배 희석한 혈청 100㎕를 각각 분주한 다음 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 배양이 끝난 후, 1XPBS로 3회 세척 한 후 Goat anti-mouse IgG HRP(1:5000, Santacruz) 100㎕를 분주하고 1시간 실온에서 배양하였다. 1X PBS로 3회 세척 후 TMB solution(Sigma) 100㎕를 분주하여 15분 실온에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 0.16M H2SO4 용액으로 반응을 정지 후 Microplate reader에서 OD450nm 수치를 측정하였다(도 6).
5. 중화항체가 시험
중화항체 시험에는 PEDV SM98 strain 바이러스와 Vero cell을 감염숙주로 사용하였다. Vero cell 성장배지는 a-MEM에 열처리된(Heat-inactivated) FBS 5%와 페니실린(Penicillin, 100㎍/ml), 스트렙토마이신(Streptomycin, 100U/ml), 암포테리신 B(Amphotericin B, 25㎍/ml) 등 항생제를 첨가하여 사용하였으며, 바이러스 배양시에는 FBS를 제외한 배지 또는 트립신(Trypsin, 2㎍/ml)을 첨가한 배지를 사용하였다. 먼저 혈청 100㎕를 동량의 a-MEM 배지에 섞어 2배씩 점진희석을 한 후, 200TCID/100㎕ 바이러스 용액 100㎕와 1:1로 섞어서 37℃에서 1시간 배양하였다. 배양이 끝나기 직전 96 well plate에 monolayer 상태로 준비한 Vero cell을 1XPBS로 3회 세척 후, 혈청-바이러스 혼합액 100㎕ 첨가 후 37℃에서 2시간 배양하였다. 배양이 끝난 다음 트립신(Trypsin, 2㎍/ml) 첨가된 배지를 100㎕ 첨가 후, 37℃에서 세포변성효과(Cytopathic effect; CPE)가 나타날 때까지 3일~5일간 배양하였다. 중화항체 역가는 CPE 나타나기 직전 well의 혈청 희석배수를 현미경 하에서 관찰하여 측정하였다(도 7).
6. 백신 효율 검증을 위한 기니피그에서의 면역시험
1) 실험동물 및 항원 처리
6주령 암컷 기니피그를 그룹당 5마리씩 배치하였다. 대조구는 아무것도 처리하지 않았고 실험구는 GST-P1, GST-P2 항원 단백질을 각각 1회당 100 ㎍씩 2주 간격으로 총 3회 피하로 투여하였다. 항원 투여시에는 동량의 IMS1313 adjuvant를 동량으로 섞어 주사하였다. 혈액은 0주, 4주, 6주차에 경정맥 또는 심장에서 채취 후 혈청을 분리하여 -20도에 냉동 보관하였다.
2) ELISA를 이용한 항원 특이 혈청 IgG 분석
정제한 항원 단백질은 100 ㎍/ml 되게 50mM sodium bicarbonate buffer (pH9.6)에 희석한 후 96 well immuno-plate (SPL)에 100 ㎕ 분주하여 4 ℃에서 12시간 밤새 배양하였다. 다음날 coating buffer를 제거하고 1XPBS로 3회 세척 후 0.5 % skim milk를 이용하여 1시간 실온에서 blocking 하였다. Blocking이 끝난 후 plate를 1XPBS로 3회 세척하였고 1XPBS에 1000배 희석한 혈청 100㎕를 각각 분주한 다음 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 1XPBS로 3회 세척한 후 Goat anti-guinea pig IgG HRP (1:5000) 100 ㎕를 분주하고 1시간 실온에서 배양하였다. 1X PBS로 3회 세척 후 TMB solution (Sigma) 100 ㎕를 분주하여 15분 실온에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 0.16M H2SO4 용액으로 반응을 정지 후 Microplate reader에서 OD450 nm 수치를 측정하였다(도8 및 도 9).
7. 백신 효율 검증을 위한 자돈에서의 면역시험
1) 실험동물 및 항원 처리
체중이 25-35 kg 되는 자돈을 그룹당 3마리씩 배치하였다. 대조구는 아무것도 처리하지 않았고 실험구는 GST-P1, GST-P2 항원 단백질을 각각 1회당 500 ㎍씩 2주 간격으로 총 3회 이근부에 투여하였다. 항원 투여시에는 동량의 IMS1313 adjuvant를 동량으로 섞어 주사하였다. 혈액은 0주, 2주, 4주, 6주차에 경정맥 또는 심장에서 채취 후 혈청을 분리하여 -20도에 냉동 보관하였다.
2) ELISA를 이용한 항원 특이 혈청 IgG 분석
정제한 항원 단백질은 100 ㎍/ml 되게 50mM sodium bicarbonate buffer (pH9.6)에 희석한 후 96 well immuno-plate (SPL)에 100 ㎕ 분주하여 4 ℃에서 12시간 밤새 배양하였다. 다음날 coating buffer를 제거하고 1XPBS로 3회 세척 후 0.5 % skim milk를 이용하여 1시간 실온에서 blocking 하였다. Blocking이 끝난 후 plate를 1XPBS로 3회 세척하였고 1XPBS에 1000배 희석한 혈청 100㎕를 각각 분주한 다음 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 1XPBS로 3회 세척한 후 Goat anti-pig IgG HRP (1:5000) 100 ㎕를 분주하고 1시간 실온에서 배양하였다. 1X PBS로 3회 세척 후 TMB solution (Sigma) 100 ㎕를 분주하여 15분 실온에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 0.16M H2SO4 용액으로 반응을 정지 후 Microplate reader에서 OD450 nm 수치를 측정하였다(도 10 및 도 11).
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Soluble recombinant antigen protein of porcine epidemic diarrhea virus and vaccine composition for preventing or treating porcine epidemic diarrhea comprising the same <130> ADP-2016-0227 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 416 <212> DNA <213> porcine epidemic diarrhea virus <400> 1 ccgttacttt gccatcattc aatgaccatt cttttgttaa tattactgtc tctgcggctt 60 ttggtggtca tagtggtgcc aacctcattg catctgacac tactatcaat gggtttagtt 120 ctttctgtgt tgacactaga caatttacca ttacactgtt ttataacgtt acaaacagtt 180 atggttatgt gtctaagtca caggatagta attgcccttt caccttgcaa tctgttaatg 240 attacctgtc ttttagcaaa ttttgtgttt caaccagcct tttggctggt gcttgtacca 300 tagatctttt tggttaccct gagttcggta gtggtgttaa gtttacgtcc ctttattttc 360 aattcacaaa gggtgagttg attactggca cgcctaaacc acttcaaggt gtcacg 416 <210> 2 <211> 461 <212> DNA <213> porcine epidemic diarrhea virus <400> 2 ccgacgtttc ttttatgact ctggatgtgt gtaccaagta tactatctat ggctttaaag 60 gtgagggtat tattaccctt acaaattcta gctttttggc aggtgtttat tatacatctg 120 attctggaca gttgttagcc tttaagaatg tcactagtgg tgctgtttat tctgttacgc 180 catgttcttt ttcagagcag gctgcatatg ttgatgatga tatagtgggt gttatttcta 240 gtttgtctaa ctccactttt aacaatacca gggagttgcc tggtttcttc taccattcta 300 atgatggctc caattgtaca gagcctgtgt tggtgtatag taacataggt gtctgtaaat 360 ctggcagtat tggctatgtc ccacttcagg atggccaagt caagattgca cccatggtta 420 ctgggaatat tagtattccc accaacttta gtatgagtat t 461

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. (1) 서열번호 1로 표시되는 돼지 유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea, PED) 바이러스 스파이크 당단백질 유전자를 포함하는 제 1 재조합 발현벡터로 형질전환된 제 1 재조합 미생물을 제작하는 단계;
    (2) 서열번호 2로 표시되는 돼지 유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea, PED) 바이러스 스파이크 당단백질 유전자를 포함하는 제 2 재조합 발현벡터로 형질전환된 제 2 재조합 미생물을 제작하는 단계; 및
    (3) 상기 형질전환된 제 1 재조합 미생물 및 제 2 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 돼지 유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea, PED) 바이러스의 수용성 재조합 항원 단백질 생산방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 PED 바이러스의 수용성 재조합 항원 단백질 생산방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 대장균은 BL21인 것을 특징으로 하는 PED 바이러스의 수용성 재조합 항원 단백질 생산방법.
  8. 삭제
  9. 서열번호 1로 표시되는 PED 바이러스 스파이크 당단백질 유전자를 포함하는 제 1 재조합 발현벡터로 형질전환된 제 1 재조합 미생물 및 서열번호 2로 표시되는 PED 바이러스 스파이크 당단백질 유전자를 포함하는 제 2 재조합 발현벡터로 형질전환된 제 2 재조합 미생물의 혼합 배양물 또는 이들로부터 분리 정제된 PED 바이러스의 수용성 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물.
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