CN107337718B

CN107337718B - 一种编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用

Info

Publication number: CN107337718B
Application number: CN201710466551.0A
Authority: CN
Inventors: 李俊; 吴晓燕; 时建立; 彭喆; 王金宝; 于江; 郑书轩; 张玲玲; 辛长勋; 王硕
Original assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2017-06-20
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2037-06-20
Also published as: CN107337718A; AU2017101605A4

Abstract

本发明提供了一种易于在大肠杆菌中表达的编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，含有SEQ ID NO.1所示的序列；及一种含有上述基因的重组表达载体及含有上述重组载体的重组菌；本发明还提供了一种诱导重组菌生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法及利用该蛋白生产猪圆环病毒2型疫苗方面的应用。本发明实现了全长Cap蛋白在大肠杆菌中的高效表达，且操作简单，成本低廉，易于规模化生产；本发明的重组菌及疫苗在预防猪圆环病毒2型疾病方面有广泛的应用前景。

Description

一种编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用，属于分子生物学领域。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV-2)是近年来新发现的、危害养猪业较严重的病毒之一，该病毒与猪的多种疾病综合征密切相关，包括猪断奶后多***衰竭综合征(Post-weaning multi-systemic wasting syndrome，PMWS)和母猪的繁殖障碍(Sowabort ion and mortali ty syndrome，SAMS)等。自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地在2010年国际猪兽医大会(IPVS)上，猪圆环病毒感染成为关注度最高的疾病，是全球公认的危害养猪业的重要传染病之一。近年来，国内猪圆环病毒感染呈上升趋势，在我国猪群中流行十分严重，给我国养猪业造成了重大的经济损失。

PCV-2基因组全长1767bp或1768bp，共包含11个开放阅读框(ORF)，其中ORF1、ORF2是两个最大的开放阅读框，分别编码复制相关蛋白(Rep蛋白)和衣壳蛋白(Cap蛋白)。Cap蛋白是主要的结构蛋白，研究表明其N端含有一个由41个氨基酸残基组成的核定位信号(NLS)，且含有大量的大肠埃希菌稀有密码子，这将严重影响外源蛋白的表达。相关研究证实，Cap蛋白免疫动物可以产生病毒的中和抗体。ORF2基因已经作为研制基因工程疫苗的重点对象。但是，现有技术中Cap蛋白采用真核表达***产量低，分离纯化困难；而ORF2编码蛋白的N端存在着大量串联或单联的大肠埃希氏菌稀有密码子，严重影响在大肠杆菌中的表达，所以目前报道进行原核表达的多为截短型Cap蛋白，这样虽然蛋白表达量较高，但不是完整的Cap蛋白，不能形成完整的病毒样颗粒，同时一些功能性信号区域和保守序列没能表达。

发明内容

针对目前完整Cap蛋白难以使用大肠杆菌规模化生产等问题，本发明提供一种易于可溶性表达的编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因。

本发明的另一目的是提供含有上述基因的重组表达载体。

本发明的再一目的是提供一种目的蛋白的表达量高，表达产物易于纯化的含有上述基因的重组菌。

本发明还有一目的是提供一种上述重组菌表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白在制备猪圆环病毒2型疫苗方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，含有SEQ ID NO.1所示的序列。

所述基因含有BamH I和Xho I限制性内切酶酶切位点。

所述编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

一种含有上述基因的重组表达载体，该重组表达载体是将所述基因***原核表达载体pET30a的BamH I和Xho I酶切位点之间所得。

一种含有上述基因的重组菌，所述重组菌是将所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21所得。

所述重组菌表达猪圆环病毒2型Cap蛋白为诱导型表达。

所述重组菌表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的序列如SEQ ID NO.3所示。

一种上述重组菌在制备猪圆环病毒2型疫苗中的应用。

一种所述重组菌在制备猪圆环病毒2型疫苗的方法，采用如下步骤：

(1)将重组菌诱导表达，再将菌体破碎裂解收集的上清液，加入甲醛灭活，制成灭活蛋白液，灭活检测合格的蛋白液即为疫苗抗原；

(2)将上述疫苗抗原与佐剂混合搅拌，即得猪圆环病毒2型疫苗。

所述甲醛的浓度为0.2％w.t；所述灭活时间为24小时。

所述上清液抗原效价不低于1:8；PCV2Cap蛋白含量不低于150μg/mL。

所述蛋白灭活液抗原与佐剂的体积比为85:15。

所述佐剂为ISA系列佐剂，优选ISA 15AVG。

所述疫苗为水包油型。

一种猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备方法，采用如下步骤：诱导培养所述重组菌，收集菌体，破碎后，获得裂解液上清，纯化后获得猪圆环病毒2型Cap蛋白。

所述培养基为含卡纳霉素的液体LB培养基。

所述重组菌的接种量为1-5％，优选为2-3％。

所述诱导培养的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，浓度为0.2-1.2mmol/L，诱导时间为1-8h，诱导起始量为菌液OD₆₀₀值为0.6-1.0。

作为优选，IPTG的浓度为0.4-0.8mmol/L，诱导时间为2-5h。

本发明具有以下优点：

用原核表达***制备重组蛋白抗原使抗原的生产变得容易，成本低廉而且产量高。如能高效表达，则具有很大的优势。但是由于原核生物和真核生物在密码子使用上具有偏嗜性，且ORF2编码蛋白的N端存在着大量串联或单联的大肠埃希氏菌稀有密码子，这些因素都将严重影响在大肠杆菌中的表达。本研究为了提高ORF2基因在大肠杆菌中的可溶性表达量，在不改变基因编码蛋白质氨基酸序列的基础上，对基因进行了优化，优化密码子后的ORF2基因，能更高效的表达目的蛋白，表达率达90％以上。

ORF2编码蛋白翻译后无需糖基化等修饰加工过程，它以肽链的形式存在，原核表达产物与天然的Cap蛋白具有同样的一级结构和同样的抗原决定簇。本发明对ORF2基因进行密码子优化，改变了难以在大肠杆菌中表达的稀有密码子，极大地提高了蛋白的表达量，同时表达的完整Cap蛋白氨基酸序列和亲本序列完全一致，没有改变其免疫原性，为保证制备的基因工程疫苗免疫效果打下良好的基础。本发明实现了全长Cap蛋白在大肠杆菌中的高效表达，将猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因进行了密码子优化，所以重组猪圆环病毒2型Cap蛋白能够高产、高效、可溶表达，解决了Cap蛋白在原核细胞中表达量低的难题。由于大肠杆菌原核表达***比较成熟，所以操作简单，成本低廉，易于规模化生产。

本发明的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白活性良好，含有该重组蛋白的复合物免疫仔猪后可产生高水平的猪圆环病毒2型特异性抗体。因此，在预防猪圆环病毒2型方面有广泛的应用前景。

附图说明

图1为PCV2 ORF2基因PCR检测结果；其中，M为DL2000 DNA Marker，1为阴性对照，2为阳性质粒；

图2为Cap蛋白SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M为蛋白Marker，1为诱导前菌液，2为诱导后裂解上清液；

图3为Cap蛋白Western-blot电泳检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1重组表达载体pET30a-ORF2的构建与鉴定。

1.ORF2基因的获得与密码子优化

以PCV2 SD株(CGMCC NO.5774，保存日期：2012年2月8日)接种无PCV2污染的PK-15细胞，72h后收获病毒作为模板，PCR扩增猪圆环病毒2型全基因组，引物序列如下：

上游引物序列如下：

5’-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3’(SEQ ID NO.4)；

下游引物序列如下：

5’-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’(SEQ ID NO.5)；

PCV2 SD株基因组序列如SEQ ID NO.6所示(GenBank No.DQ 346683)，对该病毒如SEQ ID NO.7所示的ORF2基因进行优化，改造为大肠杆菌嗜好的密码子，序列如SEQ IDNO.1所示。将优化改造后的ORF2基因5’端和3’端分别加入BamH I和Xho I限制性内切酶酶切位点，序列如SEQ ID NO.2所示，进行人工合成。

2.重组表达载体pET30a-ORF2的构建与鉴定

2.1重组表达载体pET30a-ORF2的构建

将合成的重组ORF2基因双酶切后与pET30a原核表达载体的相应酶切位点连接，构建pET30a-ORF2表达载体。用热应激法将连接产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃培养。挑取单菌落，在含有卡那霉素的LB培养基中培养，碱裂解法提取质粒，经PCR扩增和BamH I、XhoI双酶切鉴定，阳性质粒获得目的条带，将阳性质粒进行测序，测序结果证明优化后的ORF2基因已经成功***到pET30a质粒中，没有点突变，原核表达载体构建成功，将测序正确的重组质粒命名为pET30a-ORF2。

2.2重组表达载体pET30a-ORF2的PCR

根据改造后的ORF2基因序列，设计一对检测引物，扩增ORF2基因，引物序列如下所示：上游引物序列如下：

5’-ATGGATCCATGACCTACCCGCGTCGTC-3’(SEQ ID NO.8)；

下游引物序列如下：

5’-GTCTCGAGCTTAGGGTTGAGCGGCGGG-3’(SEQ ID NO.9)。

以连接产物为模板，加入以下试剂，建立50μLPCR体系：

按以下扩增条件：95℃5min；94℃30s，61℃30s，30个循环；72℃延伸10min。

回收PCR产物，-20℃保存备用。以1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，如图1所示，其中M为标准DNA Marker(DL2000)，1为阴性对照，2为阳性质粒扩增结果，含有目的条带，约为700bp。

2.3重组表达载体pET30a-ORF2的双酶切鉴定

用BamH I和Xho I将纯化后的pET30a-ORF2原核表达载体质粒进行双酶切，取酶切产物5μL在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，5V/cm，40min。酶切体系如下：

双酶切鉴定为阳性的重组质粒重新测序，结果表明，ORF2基因中无点突变。

实施例2重组表达菌株BL21/pET30a-ORF2的构建与诱导表达。

1.重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21

实施例1中测序正确的pET30a-ORF2原核表达载体质粒转化大肠杆菌BL21(NEB)，得到重组表达菌株BL21/pET30a-ORF2。

2.重组表达菌株BL21/pET30a-ORF2的诱导表达

挑取重组菌单个菌落，接种至10mL含卡那霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6-1.0，加IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养5小时。离心收集菌体，弃上清，PBS(0.015mol/L,pH7.2)洗涤后，加入3mL裂解液，超声裂解3min，离心后收集上清，取适量加入5×SDS上样缓冲液，用12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE检测，剩余样品-20℃冻存备用，同时设立不加IPTG诱导的培养物作为对照。

3.重组表达菌株BL21/pET30a-ORF2表达产物鉴定

收集BL21/pET30a-ORF2菌体，进行SDS-PAGE电泳，电泳后，经考马斯亮蓝染色显示，结果如图2所示：重组表达质粒分别产生了大约37kDa蛋白条带，大小与预期融合蛋白分子量基本一致，表达率达90％以上，而对照无此条带。应用PCV2单克隆抗体对诱导表达的重组蛋白进行Western-blot检测，结果显示在37KDa处呈现特异性目的条带，如图3所示。

实施例3重组表达菌株BL21/pET30a-ORF2的可溶性表达

将2％菌种分别按照含卡纳霉素的液体LB培养基体积的将的重组菌种接种至含卡纳霉素的液体LB培养基，37℃振荡培养至2小时至OD₆₀₀为0.82时加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG诱导3小时，4℃5000rpm离心10min后以PBS(0.015mol/L,pH7.2)洗涤沉淀，然后加入10mL裂解液，超声裂解20min，4℃10000rpm离心15min后收集上清；纯化浓缩后获得猪圆环病毒2型Cap蛋白。

实施例4猪圆环病毒2型疫苗的制备。

按照以下方法制备猪圆环病毒2型疫苗：

(1)将诱导表达后的重组菌菌体破碎裂解收集的上清液纯化浓缩后采用琼脂扩散法测定抗原效价为1:16；用BCA方法进行总蛋白含量测定，同时进行SDS-PEGA电泳后经过凝胶成像仪扫描，计算PCV2 Cap蛋白含量为155μg/mL。将上述上清液加入0.2％甲醛37℃震荡，灭活24小时，制成蛋白灭活液，检测合格后即为疫苗抗原；

(2)将抗原与油相佐剂ISA 15AVG按照85:15的比例混合搅拌，乳化制成水包油型(O/W)苗。

实施例5猪圆环病毒2型疫苗的效力与生物学检验。

1.抗体检测

用14-21日龄PCV2抗原阴性健康易感仔猪10头，分成2组，每组5头，第1组分别肌肉注射制备的基因工程疫苗2.0mL，第2组不接种，作为空白对照，隔离饲养观察。免疫后28日采血，采用ELISA方法测定PCV2抗体效价，免疫组应PCV2血清ELISA抗体效价不低于1：1600，对照组猪的PCV2血清ELISA抗体效价不高于1：400。具体结果如下：

从表1可以看出，基因工程疫苗免疫组猪的PCV2血清ELISA抗体效价不低于1：1600，空白对照组猪的PCV2血清ELISA抗体效价不高于1：400。

表1疫苗免疫试验猪的血清抗体效价检测结果。

2.免疫攻毒法

用14-21日龄PCV2抗原抗体阴性健康易感仔猪15头，分成3组，每组5头，第1组为免疫攻毒组，分别肌肉注射疫苗2.0mL，第2组为非免疫攻毒组，第3组为空白对照组(非免疫、非攻毒)，3组分别隔离饲养。免疫后28日进行攻毒，攻毒前3日，第1、2组仔猪各肌肉注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA,0.5mg/mL)5.0mL，腹腔注射巯基乙酸培养基10mL。攻毒时，第1、2组仔猪分别接种SD株病毒培养液(≥10^5.5TCID₅₀/mL)，每头滴鼻2.0mL，肌肉注射3.0mL，攻毒后第3、6日，第1、2组仔猪各肌肉注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA,0.5mg/mL)5.0mL，腹腔注射巯基乙酸培养基10mL。感染当日和攻毒后第28日称量所有仔猪体重，攻毒后前7日每日测量各组仔猪体温，攻毒后28日结束，剖检，取仔猪腹股沟***进行免疫组化检测，根据体温、相对日增重和免疫组化检测进行判定，试验结果详见表2-表5。非免疫攻毒组应至少4头发病，免疫攻毒组至少4头保护。

表2攻毒后试验猪的体温变化表

由表2可以看出，在基因工程疫苗免疫后用猪圆环病毒2型SD株病毒液(10^5.5TCID₅₀/mL)攻毒，试验猪的体温未发生明显的变化；非免疫攻毒组中的5头试验猪体温升高(≥40℃)且持续3日以上。

表3攻毒后体重变化情况

由表3可以看出，免疫攻毒组和非免疫攻毒组试验猪使用猪圆环病毒2型SD株病毒液(10^5.5TCID₅₀/mL)攻毒后，经统计学软件SPSS 20.0进行显著性分析，免疫攻毒组平均相对日增重与空白对照组平均相对日增重相比，P＞0.05，差异不显著，该组所有猪没有猪圆环病毒2型引起的临床症状。非免疫攻毒组平均相对日增重与空白对照组平均相对日增重相比，P＜0.01，差异极显著，该组所有猪有猪圆环病毒2型引起的临床症状。

表4攻毒后试验猪的免疫组化检测结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

由表4可以看出，非免疫攻毒组试验猪攻毒后28天时通过免疫组化能检出抗原，试验猪使用疫苗免疫后使用猪圆环病毒2型SD株病毒液(10^5.5TCID₅₀/mL)攻毒28天时免疫组化不能检出抗原。

表5疫苗免疫保护效力试验结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

综合上述，免疫攻毒后，免疫组可以达到5/5保护，非免疫攻毒组5/5发病，表明此疫苗免疫效果好。

<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用

<130> 20170614

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacctacc cgcgtcgtcg ttaccgtcgt cgtcgtcacc gtccgcgttc tcacctgggt 60

caaatcctgc gtcgtcgtcc gtggctggtt cacccgcgtc tgcgttaccg ttggcgtcgt 120

aaaaacggca tcttcaacac ccgtctgtct cgtaccatcg gttacaccgt taaagcgacc 180

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ttccgtgagt tcaacctgaa agacccgccg ctcaacccta agtaa 705

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 234

<212> PRT

<213> Porcine circovirus

<400> 3

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg Leu Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

225 230

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaaccgcggg ctggctgaac ttttgaaagt 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcaccgcgga aatttctgac aaacgttaca 30

<210> 6

<211> 1767

<212> DNA

<213> Porcine circovirus

<400> 6

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aaaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac acaaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120

cttccgagga cgagcgcaag aaaatacggg agcttccaat ctcccttttt gattatttta 180

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<210> 7

<211> 723

<212> DNA

<213> Porcine circovirus

<400> 7

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caacccaata acaaaagaaa tcaactctgg ctgagactac aaactactgg aaatgtagac 600

catgtaggcc tcggcactgc gttcgaaaac agtaaatacg accaggacta caatatccgt 660

ataaccatgt atgtacaatt cagagaattt aatcttaaag accccccact taaccctaag 720

tga 723

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggatccat gacctacccg cgtcgtc 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtctcgagct tagggttgag cggcggg 27

Claims

1.一种编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，还含有BamH I和Xho I限制性内切酶酶切位点。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因序列如SEQ ID NO. 2所示。

4.一种含有如权利要求2或3所述基因的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体是将所述基因***原核表达载体pET30a的BamH I和Xho I酶切位点之间所得。

5.一种含有如权利要求4所述重组表达载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21所得。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，表达猪圆环病毒2型Cap蛋白为诱导型表达；所述猪圆环病毒2型Cap蛋白序列如SEQ ID NO. 3所示。

7.一种如权利要求5所述的重组菌在制备猪圆环病毒2型疫苗中的应用。

8.一种如权利要求5所述的重组菌在制备猪圆环病毒2型疫苗的方法，其特征在于，采用如下步骤：

（1）将重组菌诱导表达，再将菌体破碎裂解收集的上清液，加入甲醛灭活，制成灭活蛋白液，灭活检测合格的蛋白液即为疫苗抗原；

（2）将上述疫苗抗原与佐剂混合搅拌，即得猪圆环病毒2型疫苗。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述上清液抗原效价不低于1:8，PCV2 Cap蛋白含量不低于150μg/mL；所述甲醛的浓度为0.2%w.t；所述灭活时间为24小时；所述疫苗抗原与佐剂的体积比为85:15；所述疫苗为水包油型。

10.根据权利要求8或9任一所述的方法，其特征在于，所述佐剂选自ISA系列佐剂。

11.一种猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备方法，其特征在于，采用如下步骤：诱导培养重组菌，收集菌体，破碎后，获得裂解液上清，纯化后获得猪圆环病毒2型Cap蛋白；

所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码基因，序列如SEQ ID NO. 1所示。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述培养基为含卡纳霉素的液体LB培养基；所述重组菌的接种量为1-5%；所述诱导培养的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，浓度为0.2-1.2 mmol/L，诱导时间为1-8h，诱导起始量为菌液OD₆₀₀值为0.6-1.0。

13.根据权利要求11或12任一所述的制备方法，其特征在于，重组菌的接种量为2-3%，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.4-0.8 mmol/L，诱导时间为2-5h。