CN101554192A - 一种茶叶提取物磷脂复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种茶叶提取物(TE)——磷脂(phytosomes，ph)的复合物(TE－ph)及其制备方法。它以茶叶提取物和磷脂为原料，通过茶叶提取物的磷脂包埋，以改变茶叶提取物的理化性质并保持或增强其在不同环境中抗氧化性能。本发明通过茶叶提取物的磷脂包埋，以改变茶叶提取物的理化性质并保持或增强其在不同环境中抗氧化性能，以扩大茶叶提取物的应用途径，增强在某些环境中的作用。

Description

一种茶叶提取物磷脂复合物及其制备方法

技术领域：

本发明涉及一种茶叶提取物(TE)——磷脂(phytosomes，ph)的复合物(TE-ph)及其制备方法。

背景技术：

茶叶提取物主要含有活性成分茶多酚，具有独特的抗氧化和抗脂质过氧化性能，但由于茶多酚具多酚羟基，是极性较大的物质，易溶于水，难溶于油中，而限制了其在油脂类产品中的应用和发挥更好的人体生理活性作用。另外，由于茶多酚有很强的苦涩味，而且在使用过程中稳定性较差，特别是在碱性环境中，极易被氧化，而失去其特有的抗氧化作用，更限制了其在食品中的广泛使用。再者，由于茶多酚类分子因其水溶性较强，在生物体内难以吸收利用，而大大降低了其特有生物活性的生物利用度。

磷脂是一种含磷的类脂物质，主要有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、丝氨酸磷脂(PS)和磷脂酸(PA)等。磷脂是动植物细胞中细胞膜、核膜和类脂膜的基本成份，也是神经细胞的组成成份之一，有保护、营养神经细胞，加快其兴奋传递作用，并可修复受损脑细胞与神经鞘细胞。将天然活性成份与磷脂在一定条件下进行复合，得到天然活性成份磷脂复合物，可有效地提高天然活性成份的体内吸收，显著地改善其生物利用度。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种茶叶提取物磷脂复合物及其制备方法，通过茶叶提取物的磷脂包埋，以改变茶叶提取物的理化性质并保持或增强其在不同环境中抗氧化性能，以扩大茶叶提取物的应用途径，增强在某些环境中的作用。

本发明的技术方案是：

一种茶叶提取物磷脂复合物，其特征在于：它以茶叶提取物和磷脂为原料，通过茶叶提取物的磷脂包埋，以改变茶叶提取物的理化性质并保持或增强其在不同环境中抗氧化性能。

所述的茶叶提取物磷脂复合物，其特征在于：所述茶叶提取物中总儿茶素含量可40％～95％。

所述的茶叶提取物磷脂复合物，其特征在于：所述磷脂是主要成分为磷脂酰胆碱的蛋黄磷脂和大豆磷脂，或是主要成分为磷脂酰乙醇胺的脑磷脂，或是主要成分磷脂酰肌醇的肌醇磷脂，或是主要成分磷脂酰丝胺酸的丝氨酸磷脂，或是主要成分溶血磷脂酰胆碱的溶血磷脂，或是包括上述各种磷脂在内的混合体。

一种如权利要求上所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

步骤A：将原料磷脂按比例加入非质子性反应溶剂中，并室温搅拌、溶解；

步骤B：按茶叶提取物∶磷脂＝1∶0.1～10的mol比例逐渐加茶叶提取物至磷脂溶液中，逐渐升温，并搅拌复合液至复合液完全澄清；

步骤C：停止搅拌，待冷至室温，过滤，滤液浓缩至一定量，回收溶剂，再置真空干燥箱真空干燥，得茶叶提取物磷脂复合物产品；

上述步骤中溶剂与磷脂比例：为5～200∶1(V/W)。

所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于所述的非质子性反应溶剂是石油醚、正己烷、环己烷、氯仿、二氯乙烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、苯中的一种，或两种以上混合溶剂。

所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于所述的非质子性反应溶剂中在步骤A中加入一部分，在步骤B中搅拌期间边搅拌边加入另一部分溶剂。分步加入的好处是：视茶叶提取物原料的脂溶性及其与磷脂的比例而定，另一种溶剂的种类和加入量，如果单一溶剂能制成澄清溶液则无需加另一种溶剂。

所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于步骤B中所述的升温温度为10℃～100℃。

所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于步骤B中所述的升温温度为25℃～60℃。反应温度高于60℃原料不稳定，有效成分含量下降，抗氧化能力下降，因此温度越低，原料越稳定，但低于25℃反应溶剂溶解度大大下降，反应时间大大延长。

所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于步骤A中将原料磷脂置带搅拌、温度计、回流冷凝管的三颈烧瓶中，按比例加入非质子性反应溶剂中，并室温搅拌、溶解。

本发明以不同总多酚含量的茶叶提取物(TE)作为活性物质，用天然磷脂制备相应磷脂复合物，在制备活性成分磷脂复合物的现有技术中，其活性成分都为单一化学药物成分，本发明制备的茶叶提取物磷脂复合物(TE-ph)，含有茶叶提取物中多种活性成分，且其主要成分儿茶素，可以是不同含量的混合物。

制备的茶叶提取物磷脂复合物(TE-ph)与其原活性成分儿茶素比较，主要增加或加强了以下三个方面的性能：

1.增加了原活性成分的脂溶性，从而扩增了其使用途径。由于被复合的活性成分是一类含多酚羟基的黄酮类化合物，其水溶性较强而脂溶性较差，在大多数有机溶剂中几乎不溶，制备成磷脂复合物后，由于磷脂是一种两性化合物，分子具有一个亲水性的头部和两条疏水长链，其中亲水部分与活性成分相互作用而结合，而磷脂的两个长脂肪酸链不参与复合反应，可自由移动，包裹了磷脂的极性部分形成一个亲脂性的表面，使复合物表现出较强的脂溶性。

2.增加了原活性成分在使用环境中的稳定性。磷脂复合物比其他两性分子对儿茶素类分子的稳定性保护作用更强。其保护作用可能有两个方面，其一由于磷脂复合物与活性成分有相对稳定的结合且使其脂溶性增加。使活性成分不易直接受环境影响而氧化，其二由于磷脂为含氮化合物，一般含氮化合物能再生为具有清除自由基作用的抗氧化剂。

3.增加活性成分在生物体内的作用。磷脂本身是细胞膜的组分之一，其化学组分和人体的细胞膜接近，对人体皮肤和人体内细胞膜的渗透性较强，因此与细胞膜表面有较强的亲和性，可促使茶叶提取物与细胞结合表现出促进吸收，因此可改善茶叶提取物经肠胃道或透皮吸收，可获得较高的生物利用度，且活性成分在体内消除变慢，故可提高茶叶提取物的生物利用度和增强其生物活性作用。磷脂也是神经组织的主要组成成分，随着生物膜和营养学研究的不断深入，磷脂作为在促进生长发育及免疫，降脂，抗衰老等方面的保健作用约来越受到普遍关注。

附图说明：

图1是T80磷脂复合物(T80-ph)紫外扫描鉴定图谱；

图2是T90磷脂复合物(T90-ph)紫外扫描鉴定图谱；

图3是几种脂溶性抗氧化剂POV随时间变化情况。

具体实施方式：

本发明以茶叶提取物(TE)和磷脂(ph)为原料。所述TE中总儿茶素含量可40％～95％；所述磷脂可以是主要成分为磷脂酰胆碱(Pc)的蛋黄磷脂和大豆磷脂，也可以是主要成分为磷脂酰乙醇胺(PE)的脑磷脂、主要成分磷脂酰肌醇(PI)的肌醇磷脂、主要成分磷脂酰丝胺酸(Ps)的丝氨酸磷脂和主要成分溶血磷脂酰胆碱(LPC)的溶血磷脂等，也可以是包括上述各种磷脂在内的混合体。混合体中的主要成分磷脂酰胆碱和磷脂酰醇胺的含量，视被复合活性成分的不同而定。

磷脂化合物制备必须在非质子传递体系中进行，这是因为磷脂与药物结合的键为分子间作用力，在能电离的溶剂中，这种作用力很容易被打破。天然活性成分一般不会溶于非质子性反应溶剂，但生成的磷脂复合物可溶于该体系中。

磷脂复合物的形成与溶剂极性及其用量、原料配比、温度、时间、加料速度等密切相关。本发明就上述因素进行筛选，并以紫外吸收的差值“ΔA”、表观油水分配系数“K”值以及抗脂质过氧化等指标值作为筛选指标，完成了可工业化实施的茶叶提取物——磷脂复合物(TE-ph)制备工艺。

本发明产品的具体制备工艺介绍如下：

原料比例：TE∶磷脂＝1∶0.1～10(mol)

溶剂体系：所用溶剂体系的介电常数＜25，常用溶剂有石油醚、正己烷、环己烷、氯仿、二氯乙烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、苯等，溶剂体系可是单一溶剂也可是两种以上混合溶剂，混合溶剂之间的比例按被复合物的活性成分的性质而定。

溶剂与磷脂比例：一般视原料在制备溶剂体系中的溶解度、分散度而定，可为5～200∶1(V/W)

温度：视活性成分的热稳定性及复合率综合考虑，可为：10℃～100℃。一般为25℃～60℃。

制备时间：一般由原料在制备溶剂体系中的溶解度、分散度、搅拌速度、活性成分与磷脂的结合速率及磷脂复合物在体系中的溶解度等因素所确定。可为：30分钟～50小时。一般为2小时～12小时。

磷脂复合物制备步骤如下：

1.将原料磷脂置带搅拌、温度计、回流冷凝管的三颈烧瓶中，按比例加入体系溶剂A室温搅拌溶解。

2.按比例(1∶0.1～10)逐渐加TE至磷脂溶液中，可粉体加入，也可用适量溶剂溶解后加入，逐渐升温至要求温度，按要求搅拌复合液至一定时间。

3.搅拌期间边，搅拌边按要求比例逐渐分次加入溶剂B，继续搅拌至复合液完全澄清。

4.停止搅拌，待冷至室温，过滤，滤液浓缩至一定量，回收溶剂，再置真空干燥箱真空干燥，得茶叶提取物磷脂复合物(TE-ph)产品。

注：溶剂体系A和溶剂B，可同时加入，也可如上步骤加入，视复合反应情况而定。

茶叶提取物磷脂复合物的结构、脂溶性能和抗氧化性能

1.茶叶提取物磷脂复合物和茶叶提取物紫外吸收差值比较

磷脂复合物是磷脂的极性基团部分与活性成分发生了较强的相互作用而形成的，因此有紫外吸收的活性成分的光谱特征会有所改变，原成分的吸收值会降低，以原活性成分与活性成分磷脂复合物在紫外吸收峰的吸收值之差来评价磷脂复合活性成分的完整性，也是磷脂复合物的评价标准之一。参见廉洁，王伯初《生物技术通讯》.Vol：17No：830～833

试验样品：

①制备TE-ph的原料：茶叶提取物T90和T80(总儿茶素含量分别为90％和80％)；

②以上述原料制备的TE大豆磷脂复合物T80-ph和T90-ph。所制备的样品其原料T90和T80与磷脂的比例都为：原料TE∶磷脂＝1∶1(mol比)。

将各样品分别溶于乙酸乙酯中，都分别配制成以TE浓度为基准的0.1mgTE/ml乙酸乙酯溶液，即T90和T90-ph中的T90浓度及T80和T80-ph中的T80都为0.1mg/ml，按TE原料和磷脂的比例，则T90-ph和T80-ph在溶液中的浓度都为0.26mg/ml。其中磷脂浓度0.16mg/ml。

图1和图2分别为T90-ph和T80-ph紫外扫描图谱，扫描图表明，两样品在270nm处都有最强吸收峰，而相应浓度的大豆磷脂溶液在270nm无吸收峰(注：测定TE和TE-ph时分别以乙酸乙酯和相应浓度的大豆磷脂乙酸乙酯溶液为空白对照)。由于磷脂的屏蔽作用，TE-ph的儿茶素吸收值降低.

T80和T80-ph在270nm处吸收值差为ΔA＝3.18-2.02＝1.16；

T90和T90-ph在270nm处吸收值差为ΔA＝3.40-2.53＝0.87。

2.脂溶性能---表观油水分配系数K值

活性成分经磷脂复合后，通常脂溶性会增强，表观油水分配系数将这种脂溶性增强性质数据化。

试验样品为T90、T90-ph。分别称取T90和T90-ph 0.01g并分别溶于一定量蒸馏水和脂性有机溶剂中，再分别在T90水溶液和T90-ph脂性有机溶剂溶液中加入等量脂性有机溶剂和蒸馏水，振摇后静置，样品中儿茶素成分在乙酸乙酯和水相中自动分配，分离两相溶液，分别以相应溶剂定容。进行高压液相(HPLC)色谱分析检测其中儿茶素含量，以脂相中儿茶素含量除以水相中儿茶素含量，得到的数值即为K值(K_{脂相/水相})，K值越大表明脂溶性越强(即水溶性越差)。

试验中所用脂性有机溶剂分别为乙酸乙酯和三氯甲烷

表1 表观油水分配系数

表1数据表明：T90-ph的K_{Ethyl Acetate/water}和K_{Chloroform/water}值远大于T90的K_{Ethyl Acetate/water}和K_{Chloroform/water}值，表明经磷脂复合后的茶叶提取物(TE)其脂溶性大大增加。且脂性溶剂极性越小，T90和T90-ph的K值相差越大。也表明T90-ph在脂性溶剂中有很广的可溶解范围。

3.对二苯代苦味肼自由基(DPPH)的抑制率

自由基是指具有未配对价电子的原子、原子团或分子。大多数自由基化学性质极为活泼，寿命极短。而二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)由于有三个苯环的空间障碍，而使夹在其中间氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用，故能提供一个稳定的自由基。且DPPH·在517nm处有一强吸收，其乙醇溶液呈深紫色。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系。因而可用分光法进行定量分析。

试验样品：T80、T80-ph、迷迭香提取物，样品规格见表2。

测定条件：所有样品等质量溶于乙醇中，浓度：25ppm(0.025mg/ml)；DPPH浓度：300μmol/L；测定波长：517nm。

测定时以未加样品溶液的乙醇作样品空白对照。

测定方法参见下述两篇文献：(1)陈季武，胡斌，赵实等，发光学报，第26卷第5期，2005年10月：664-668；(2)李红，张元湖，应用DPPH·法测定苹果提取物的抗氧化能力，山东农业大学学报(自然科学版)，第36卷第1期：35～38。

表2：试验样品规格及抑制率

样品	样品含量％(EGCG/总多酚)	抑制率％
			T80	61.0/80.0	94.1
T80-ph	23.19/30.23	50.0
			迷迭香提取物	鼠尾草酸含量≥60％	53.0

从表2结果可知，样品对DPPH抑制率基本与总儿茶素含量相关。据此，按T80和T80-ph的总儿茶素含量比例比较，磷脂复合物不但没有掩蔽儿茶素自身的自由基抑制作用，而且加强了该作用。

4.抗油脂脂质过氧化性能(油脂脂质过氧化值POV测定)

油脂氧化过程中生成过氧化物，过氧化物与碘化钾作用，生成游离碘，以硫代硫酸钠溶液滴定，以滴定的体积计算生成过氧化物的含量。当油中含有抗氧化剂时，其生成的过氧化物的量就减少，即POV值就降低，以POV值高低判定抗氧化剂的性能优劣。

测定方法参照GB5009.37-1996进行测定。

测定样品及规格见表3

测定条件：将表3样品分别等质量溶于无TBHQ的大豆油中，置98℃条件下保温加速氧化，在不同时间段(小时)：0、4、8、12、16、22、28、32、52、70、78，测定每个样品的油脂质过氧化值(POV，单位：meq/kg)。

样品浓度：100ppm(0.1mg样品/ml大豆油)。

表3：试验样品规格

样品	含量％
		T80(EGCG/总多酚)	61.0/80.0

T80-ph(EGCG/总多酚)	23.19/30.23
		醚迭香提取物(鼠尾草酸含量)	≥60
Ve(总生育酚含量)	≥90

图3结果表明，等质量样品抗油脂过氧化的稳定性由高至低依次为：T80-ph＞醚迭香提取物＞T80≈Ve。在98℃，78小时末，T80-ph的POV值显著低于其他三种脂溶性抗氧化剂。见附图3。另外，就T80-ph和T80抗脂质过氧化性能来看，在油脂中抗氧化性能不完全与总儿茶素相关，T80-PH显示了磷脂在植物油抗氧化中的的稳定和修复作用。

实施例

实施例一

取大豆磷脂15克置三颈烧瓶中，加氯仿200ml室温搅拌溶解后，边搅拌边逐渐加入TE(总儿茶素含量80％)10克，逐渐升温至40℃，搅拌2小时后，边搅拌边逐渐加入无水乙醇20ml，继续搅拌2小时后溶液澄清。过滤回收溶剂，真空干燥，得茶叶提取物磷脂复合物(TE-ph)产品。

实施例二

取卵磷脂16克置三颈烧瓶中，加石油醚350ml室温搅拌溶解。另取TE10克(总儿茶素含量80％)，逐渐加入石油醚磷脂溶液中，逐渐升温至40℃，搅拌2小时后，边搅拌边逐渐加入无水乙醇20ml，继续搅拌1小时后溶液澄清。过滤回收溶剂，真空干燥，得TE-ph产品。

实施例三

取大豆磷脂45克置三颈烧瓶中，加氯仿900ml室温搅拌溶解。另取TE27克(总儿茶素含量50％)，边搅拌边逐渐加入氯仿磷脂溶液中，逐渐升温至60℃，搅拌2小时后，边搅拌边逐渐加入无水乙醇50ml，40℃下继续搅拌2小时后溶液澄清。过滤回收溶剂，真空干燥，得TE-ph产品。

实施例四

取卵磷脂20克置三颈烧瓶中，加石油醚400ml室温搅拌溶解。另取TE10克(总儿茶素含量50％)，逐渐加入石油醚磷脂溶液中，逐渐升温至60℃，搅拌2小时后，边搅拌边逐渐加入无水乙醇25ml，继续搅拌1小时后溶液澄清。过滤回收溶剂，真空干燥，得TE-ph产品。

实施例五

取卵磷脂40克置三颈烧瓶中，加氯仿3800ml室温搅拌溶解。另取TE20克(总儿茶素含量90％)，用600ml乙酸乙酯溶解后，逐渐加入氯仿磷脂溶液中，逐渐升温至35℃，搅拌5小时后，边搅拌边逐渐加入无水乙醇15ml，35℃继续搅拌1小时，溶液澄清。过滤回收溶剂，真空干燥，得TE-ph产品。

实施例六

取卵磷脂32克置三颈烧瓶中，加石油醚3000ml室温搅拌溶解。另取TE23克(总儿茶素含量90％)，用200ml乙酸乙酯+10无水乙醇溶解后，逐渐加入石油醚磷脂溶液中，逐渐升温至35℃，搅拌5小时后溶液澄清。过滤回收溶剂，真空干燥，得TE-ph产品。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (9)

1、一种茶叶提取物磷脂复合物，其特征在于：它以茶叶提取物和磷脂为原料，通过茶叶提取物的磷脂包埋，以改变茶叶提取物的理化性质并保持或增强其在不同环境中抗氧化性能。

2、根据权利要求1所述的茶叶提取物磷脂复合物，其特征在于：所述茶叶提取物中总儿茶素含量可40％～95％。

3、根据权利要求1所述的茶叶提取物磷脂复合物，其特征在于：所述磷脂是主要成分为磷脂酰胆碱的蛋黄磷脂和大豆磷脂，或是主要成分为磷脂酰乙醇胺的脑磷脂，或是主要成分磷脂酰肌醇的肌醇磷脂，或是主要成分磷脂酰丝胺酸的丝氨酸磷脂，或是主要成分溶血磷脂酰胆碱的溶血磷脂，或是包括上述各种磷脂在内的混合体。

4、一种如权利要求1或2或3所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

步骤A：将原料磷脂按比例加入非质子性反应溶剂中，并室温搅拌、溶解；

步骤B：按茶叶提取物∶磷脂＝1∶0.1～10的mol比例逐渐加茶叶提取物至磷脂溶液中，逐渐升温，并搅拌复合液至复合液完全澄清；

步骤C：停止搅拌，待冷至室温，过滤，滤液浓缩至一定量，回收溶剂，再置真空干燥箱真空干燥，得茶叶提取物磷脂复合物产品；

上述步骤中溶剂与磷脂比例：为5～200∶1(V/W)。

5、根据权利要求4所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于所述的非质子性反应溶剂是石油醚、正己烷、环己烷、氯仿、二氯乙烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、苯中的一种，或两种以上混合溶剂。

6、根据权利要求4所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于所述的非质子性反应溶剂中在步骤A中加入一部分，在步骤B中搅拌期间边搅拌边加入另一部分溶剂。

7、根据权利要求4所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于步骤B中所述的升温温度为10℃～100℃。

8、根据权利要求7所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于步骤B中所述的升温温度为25℃～60℃。

9、根据权利要求4所述的茶叶提取物磷脂复合物的制备方法，其特征在于步骤A中将原料磷脂置带搅拌、温度计、回流冷凝管的三颈烧瓶中，按比例加入非质子性反应溶剂中，并室温搅拌、溶解。

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