CN101550451B - 检测老年黄斑变性疾病的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，可用于早期监控和检测AMD高危人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。本发明试剂盒以LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***变异(位于HTRA1基因上游4340碱基处，包含LOC387715基因的部分3’UTR区域的443碱基序列缺失、54碱基序列***的变异)，以及HTRA1基因1号外显子G→T突变，及其相关连锁位点/基因为目标，与AMD的关联度高，协同HTRA1基因启动子区域的G→A变异(单核苷酸多态性SNP rs11200638)、HTRA1基因上游序列的G→T变异(单核苷酸多态性SNP rs10490924)的分析，更可提高检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，具体地说是检测与老年黄斑变性疾病相关LOC387715基因与HTRA1基因之间，HTRA1基因上游4340bp处包含LOC387715基因的部分3’UTR区域的443碱基序列缺失/54碱基序列***变异的试剂盒。
背景技术
黄斑变性疾病被认为是一类以进行性中心视力下降及黄斑部视网膜色素上皮变性为特征的异质性疾病，是重要的致盲性眼病。黄斑变性包括老年黄斑变性、黄斑营养不良(stargart病、best病、sorsby眼底营养不良等)。老年黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)现已成为老年人最主要的致盲性眼病之一，全世界患病人数1000万，我国60-69岁人群AMD患病率为7.77％，70岁以上可达15.33％。目前对于AMD还无有效的治疗方法，其主要原因就是发病机制尚不清楚。
近年来研究认为，黄斑变性是一组异质性疾病，遗传因素在其发病机制中起着重要作用。一些与老年黄斑变性(AMD)有相似临床和组织病理表现的其他类型黄斑变性的研究已取得重要进展，比如：近年研究发现隐性Stargardt黄斑变性在ABCR基因上有变异；显性Stargardt黄斑变性(STGD3)在ELOVL4基因上有变异；Best黄斑营养不良(BMD)在VMD2基因上有变异；Sorsby眼底营养不良患者在TIMP3基因存在点变异，还有黄斑蝶样萎缩等与Peripherin/RDS基因变异有关。
老年性黄斑变性是导致发展中国家不可逆性视力丧失的主要原因，很多研究显示其具有显著的遗传倾向。目前针对不同人群和种族的黄斑变性疾病的研究，正成为国际研究热点之一。国内单基因性黄斑变性疾病及疾病人群和种族相匹配对照人群的基因分析(多基因疾病分析)工作尚未真正***性开展，亦没有相关的基因谱分析。
AMD的前期研究证实补体旁路途径成员的编码基因，包括补体因子H(CFH)以及因子B/C2和个体患病风险有关，尤其是位于染色体1q31上的CFH被认为是AMD主要的风险因子。其他一些关联分析还显示染色体10q26上存在另一个AMD的风险位点。然而其确切致病基因尚不清楚。
老年黄斑变性是一种和年龄增长有关的多因素复合作用的眼底病。多发生在45岁以上，年龄越大，患病率越高。是全球成人致盲的首要疾病之一。老年性黄斑变性有时发展很慢，使患者不易察觉，有时却进展很快，迅速剥夺患者视物能力，因而其早期发现和预防显得至关重要。
本病真正病因不明，系多因素疾病，影响因素除年龄外，还有人种、性别、代谢等，遗传因素至关重要。临床上分为萎缩型(干性型)和渗出型(湿性型)。干性者，在眼底可见玻璃膜疣，逐步引起黄斑区变薄，从而影响功能。目前尚无特别有效的方法治疗。湿性者，多引起视力的严重障碍，其视力破坏的原因主要是异常的新生血管在视网膜下生长，引起视网膜出血、水肿及视网膜组织的破坏，最终导致疤痕形成，从而引起视力的丧失。湿性AMD一旦发病，病程迅速，常规治疗的效果不佳，难以大幅度地恢复其已经丧失的视功能。因此，早期诊断发现，及早干预，能更好的延缓病程，减少病人的视力丧失，提高生活质量。
目前的AMD诊断于依赖：1、多于50岁以上老年人发病，年龄越大，发病率越高；2、双眼先后发生视物变形、视力减退或明显视力障碍；3、眼底有较明显的玻璃膜疣及两型各自的表现；4、眼底荧光血管造影。
为了更为准确地将患病风险人群筛选出来，发明人在本发明中，提供一种新的遗传标记物，在早期筛选发现AMD高危人群时准确率更高，可以及时实施早期检测和预防，减少其视力损害。
发明内容
本发明的目的在于提供检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，该试剂盒通过检测来源于待测个体的样本中是否存在LOC387715基因与HTRA1基因之间，HTRA1基因上游4340bp处包含LOC387715基因的部分3’UTR区域的443碱基序列缺失/54碱基序列***变异，更进一步的，是否存在HTRA1基因1号外显子内的G→T变异(单核苷酸多态性SNP rs2293870)，以及该区域内与上述两种连锁的变异，而在早期监测或诊断老年黄斑变性疾病的发生，进而为临床诊断和治疗提供参考。
本发明针对染色体10q26的易感位点进行了AMD和正常对照的基因型分析，发现染色体10q26的LOC387715基因与HTRA1基因之间的缺失/***是导致AMD的主要的致病性变异，该D/I是位于HTRA1基因转录起始点上游4340bp处，包含LOC387715基因的部分3’UTR区域的443bp的碱基缺失和54bp碱基***，本发明全世界首次发现了该变异和AMD的直接关联性。此D/I基因型变异影响了下游HTRA1基因的表达，并继而参与AMD致病过程。该处缺失/***变异与其上游基因ARMS2(LOC387715)的关系尚在研究中，但本研究发现此处变异导致了上游基因ARMS2表达的下调，是否该蛋白表达量及其功能改变参与了AMD发病过程需要进一步研究证实。
研究结果显示，相对于无缺失基因型，缺失基因型个体胎盘组织的HTRA1的转录翻译水平上调，LOC387715的转录翻译水平下调，免疫印迹也显示AMD患者眼睛HTRA1抗体反应强阳性。由此可见该变异引起了HTRA1的表达上调，从而在AMD易感性中占据重要地位。
另外，本发明针对染色体10q26的易感位点进行了AMD和正常对照的基因型分析，还发现位于10q26染色体HTRA1基因1号外显子内的G→T变异(单核苷酸多态性SNP rs2293870)也是导致AMD的病因之一，其关联度达到P＜10-12。SNP rs2293870的G→T变异导致了氨基酸的改变，有可能导致蛋白功能的改变。
前期的研究还发现，HTRA1基因转录起始点上游512bp处的G→A变异与AMD高度相关，此处等位基因G→A的改变属于单核苷酸序列多态性(SNPrs11200638)，于2003年在基因组研究时发现报道。然而该变异的意义尚不清楚。本研究全世界首次发现了rs11200638和AMD的直接关联性。即使相对于包含已知AMD风险基因CHF变异的对照者，分析得到rs11200638变异的人群归因危险度也达到49.3％。将rs11200638和CHF基因变异协同分析，得到人群归因危险度达到71.4％。
研究结果显示存在rs11200638G→A变异的AMD患者淋巴细胞和视网膜色素上皮细胞HTRA1的转录翻译水平上调，免疫印迹也显示AMD患者眼睛HTRA1抗体反应强阳性。由此可见，rs11200638的G→A变异引起了HTRA1的表达上调，从而在AMD易感性中占据重要地位。
此外，染色体10q26上的rs10490924G→T变异也和AMD高度相关，并且rs11200638和rs10490924处于一个LD。
HTRA1基因编码分泌型丝氨酸蛋白酶，其编码产物在小鼠视网膜和视网膜色素上皮细胞均有表达，研究发现HTRA1蛋白参与调控细胞外基质蛋白聚糖降解，促进了基质蛋白降解酶对底物的降解作用，例如胶原酶和基质金属蛋白酶。可以想见，HTRA1的过度表达会破坏Bruch’s膜的完整性，使得脉络膜血管易于穿透侵入细胞外基质，形成湿性AMD。此外，TGF-β在调节细胞外基质降解和血管生成中发挥着重要作用，而HTRA1能够结合并抑制转化生长因子TGF-β。因此，LOC387715基因与HTRA1基因之间的缺失/***变异，以及rs11200638的G→A变异均上调了HTRA1表达(见图7)，继而HTRA1蛋白及其下游信号活性分子的改变影响了眼内细胞外基质代谢降解过程以及血管生成，最终参与了AMD的发病进程。
此外，本研究还发现了位于LOC387715基因与HTRA1基因之间的一组单核苷酸多态性变异(见下表)，它们也和AMD高度相关，并且与上述HTRA1基因上游4340bp的缺失/***变异在一个LD。
| 编号. | 名称 | 基因 | 变异 | 基因组定位 |
| 1 | rs11200630 | Intergenic PLEKHA1-ARMS2 | T＞C | 124199674 |
| 2 | ENSSNP6019764 | Intergenic PLEKHA1-ARMS2 | G＞A | 124200359 |
| 3 | rs36212731 | ARMS2Intron | G＞T | 124204966 |
| 4 | rs36212732 | ARMS2Intron | A＞G | 124205188 |
| 5 | rs36212733 | ARMS2Intron | T＞C | 124205201 |
| 6 | rs3750848 | ARMS2Intron | T＞G | 124205305 |
| 7 | rs3750847 | ARMS2Intron | C＞T | 124205411 |
| 8 | rs3750846 | ARMS2Intron | T＞C | 124205555 |
| 9 | rs2014307 | Intergenic-ARMS2-HTRA1 | G＞T | 124207622 |
| 10 | rs3793917 | HTRA1Promoter | C＞G | 124209265 |
| 11 | rs3763764 | HTRA1Promoter | A＞G | 124210051 |
| 12 | rs58077526orrs61871752 | HTRA1Intron | A＞C | 124220014 |
| 13 | rs2672593orrs58005949 | HTRA1Intron | A＞G | 124220096 |
根据本发明的一个方面，提供用于检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，试剂盒的检测原理为检测与老年黄斑变性疾病密切相关的LOC387715基因与HTRA1基因间HTRA1基因缺失/***变异是否存在，进一步的，还检测HTRA1基因1号外显子内的G→T变异(单核苷酸多态性SNP rs2293870)是否存在，更进一步的，还检测与其连锁的一组SNP变异是否存在。试剂盒中可以包括任选的用于检测所述的LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***变异和HTRA1基因1号外显子内的G→T变异的试剂以及相关变异位点的试剂，例如检测LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***，以及检测HTRA1基因1号外显子内的G→T突变的试剂和任选的用于扩增LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***片段的试剂以及扩增HTRA1基因或包含rs2293870基因片段的试剂。首先对获得的样本提取DNA并针对HTRA1基因或其-4340bp处443bp缺失片段以及1号外显子位点进行扩增，检测方法可以参考本领域技术人员熟知的检测基因点突变位点的方法，例如直接测序法或使用限制性片段长度多态方法或单碱基引物延伸法或Taqman法或芯片杂交等，判断rs2293870位点的等位基因型。
优选地，可以在试剂盒中进一步包括扩增和检测rs11200638变异的相关试剂，由于rs11200638和rs10490924连锁度高，检测HTRA1基因上游序列的G→T变异(单核苷酸多态性SNP rs10490924)也具有诊断AMD的效力。可以在试剂盒中加入rs10490924位点的扩增和检测试剂，进一步提高准确性。
在所述的试剂盒中还可以进一步包括包括检测LOC387715基因与HTRA1基因之间的一组SNP，rs11200630、ENSSNP6019764、rs36212731、rs36212732、rs36212733rs3750848、rs3750847、rs3750846、rs2014307、rs3793917、rs3763764、rs58077526和/或rs2672593变异的试剂，如在试剂盒中加入所述位点的扩增和检测试剂，进一步提供准确性。
根据本发明的另一方面，由于LOC387715基因与HTRA1基因间的缺失/***突变导致AMD患者的HTRA1转录翻译水平上调和HTRA1蛋白表达水平上调，因此针对HTRA1基因的RNA转录水平和蛋白表达水平设计的试剂盒同样适用本发明。同时，该缺失/***突变还导致了LOC387715转录翻译水平下调和蛋白表达下调，因此针对LOC387715基因的RNA转录水平和蛋白表达水平设计的试剂盒同样适用本发明。对于检测上述基因的RNA转录水平可以采用例如RT-PCR技术，提取mRNA，检测患者细胞或组织内的基因转录水平而获得检测结果。对于蛋白表达水平的检测，可以通过提取来源于视网膜色素上皮细胞的总蛋白，与HTRA1、LOC387715蛋白抗体进行反应，测定蛋白的表达水平而获得检测结果。更进一步，可以通过制备HTRA1、LOC387715蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体，采用免疫组织化学和荧光原位杂交方法在原位进行蛋白表达水平的检测。
本发明提供了检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，可用于早期监控和检测AMD高危人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。本发明试剂盒以LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***变异和HTRA1基因1号外显子G→T突变及其相关位点/基因为目标，与AMD的关联度高，协同HTRA1基因启动子区域的G→A变异(单核苷酸多态性SNP rs11200638)、HTRA1基因上游序列的G→T变异(单核苷酸多态性SNP rs10490924)的分析，更可提高检测的准确性。
附图说明：
图1是LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***变异的PCR扩增产物结果：
A、B：纯合***PCR扩增片段(大小约1000bp)
C：杂合缺失/***变异的PCR片段包括约600bp和1000bp的两个条带
D：纯合缺失变异的PCR扩增片段(大小约600bp)
图2是Snapshot检测SNP rs2293870，rs11200638，rs10490924的基因型图；
图3是Snapshot方法检测rs11200630(T/C)，ENSSNP6019764(G/A)，rs3750847(C/T)，rs36212731(G/T)的基因分型图
图4是Snapshot方法检测rs2014307(G/T)，rs3750846(T/C)，rs36212732(A/G)，rs58077526(A/C)的基因分型图
图5是Snapshot方法检测rs3763764(A/G)，rs36212733(C/T)，rs3793917(C/G)，rs3750848(T/G)，rs2672593(A/G)的基因分型图
图6为RT-PCR检测缺失/***变异对HTRA1mRNA丰度的影响；
图7为RT-PCR检测缺失/***变异对LOC387715mRNA丰度的影响；
图8为Western检测缺失/***变异对LOC387715蛋白表达的影响；
图9为荧光免疫化学检测AMD患者视网膜色素上皮的HTRA1蛋白表达。
发明的具体实施方式
以下实施例中所用试剂，除非特别说明，均为市售购买。
【实施例1】血样收集及标本处理
选取214例中国人老年性黄斑变性(AMD)患者以及214例对照者。患者为临床确诊的AMD，其中115例湿性AMD患者，99例干性AMD患者，对照是符合AMD患者年龄段的大于或等于60岁、非玻璃疣和视网膜色素改变的人群。
对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查和详细的眼科专科检查。在签署知情同意书以后每人采集EDTA抗凝血样5～10ml。酚-氯仿法提取基因组DNA。
【实施例2】包含HTRA1基因上游4340碱基处缺失/***变异基因的PCR扩增和基因型分析
(一)PCR扩增产物电泳分离鉴定
1、抽取受检者血液，提取DNA；
2、以5’-GCCAACTGGAGCTTCTCATC-3’和
5’-GTAGTTTCCAGGGGCTCTCC-3’为上下游引物，PCR扩增基因组DNA；反应条件：
95℃3minutes，(94℃30seconds，57℃30seconds，72℃45seconds)*35cycles
3、1％琼脂糖凝胶电泳分离，根据PCR产物大小判别缺失/***变异。
琼脂糖电泳鉴定：
含HTRA1基因上游4340bp的缺失/***序列的PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，缺失/***使得PCR产物正常片段小约400bp，通过电泳分离即可判读基因型。无缺失/***的PCR产物大小约1000bp，纯合缺失/***的PCR片段大小约600bp，杂合缺失/***的PCR产物包括上述两条条带(见图1)。
(二)核苷酸序列测定
1、抽取受检者血液，提取DNA；
2、以5’-GCCAACTGGAGCTTCTCATC-3’和
5’-GTAGTTTCCAGGGGCTCTCC-3’为上下游引物，PCR扩增基因组DNA；
反应条件：
95℃3minutes，(94℃30seconds，57℃30seconds，72℃45seconds)*35
cycles
3、胶回收纯化PCR产物；
4、测序反应；
5、变性为单链；
6、ABI3100上机读取核苷酸序列。
(三)其他方法
1、基于等位基因特异性寡核苷酸杂交反应原理的芯片检测
流程：DNA抽提-----DNA消化----加接头----扩增----产物片段化----生物素标记----芯片杂交---洗涤----染色----扫描----数据分析
2、Tagman方法
流程：序列比对----引物设计----引物合成----DNA抽提和定量---PCR---探针杂交-----扫描----分析
核苷酸测序结果如下：
(1)443bp缺失/54bp***变异序列，阴影部分即443bp缺失后***的54bp
gcaaaatcctttaggaggaagagggagtccctcacaacctagactggtccccttccctccagctgcctcaactgtccacagg
actctcttcccacctgcggccacactgtgcaacctggaatttccccacctgggcggactcatcacgtcatcaccaatt
ggatgcatcttctgctctgtgcagctggtgaaatctttctcaacccttgagatgcagcccaatcttctcctaacatctgg
attcctctctgtcactgcattccctcctgtcatcctgcctttgttttcttgccctcctttctctcccgg
aatgggtgagtagggatggattacaccaccctgga(54bp)
(2)无缺失的正常序列，阴影部分为序列(1)中缺失的443bp，其中下划线部分为功能编码序列
AAAAGCCAACTGGAGCTTCTCATCAGCATCAATGTGAAGCCAAAAATCCTTAGGAGGACAGAGGG
AGTCCCTCACAACCTAGACTGGTCCCCTTCCCTCCAGCTGCCTCAACTGTCCACAGGACTCTCTTCCCAC
CTGCGGCCACACTGTGCAACCTGGAATTTCCCCACCTGGGCGGACTCATCACGTCATCACCAATTGGAT
GCATCTTCTGCTCTGTGCAGCTGGTGAAATCTTTCTCAACCCTTGAGATGCAGCCCAATCTTCTCCTAACA
TCTGGATTCCTCTCTGTCACTGCATTCCCTCCTGTCATCCTGCCTTTGTTTTCTTGCCCTCCTTTCTCTCCC
GG
ATTACACCACCCTGGA
(443bp)
结论：HTRA1基因上游4340碱基处443bp缺失/54bp***变异在AMD病人和对照组之间存在显著差异，缺失基因型的患病风险显著高于***基因型。
【实施例3】包含rs2293870、rs11200638、rs10490924单核苷酸多态性DNA片段的PCR扩增和基因型分析
1、提取AMD患者和对照组的血液基因组DNA。
2、PCR扩增基因组包含目的序列(rs2293870、rs11200638、rs10490924)的基因组DNA片段
引物序列：
rs2293870：正向：5’-GGCCGCTCGGCGCCTTTGGC-3’
反向：5’-CCCCGAAGGGCACCACGCAC-3’
rs11200638：正向：5’-ATGCCACCCACAACAACTTT-3’
反向：5’-CGCGTCCTTCAAACTAATGG-3’
rs10490924：正向：5’-TACCCAGGACCGATGGTAAC-3’；
反向：5’-GAGGAAGGCTGAATTGCCTA-3’
反应条件：
rs2293870：95℃3minutes，(94℃30seconds，57℃30seconds，72℃45seconds)*35cycles
rs11200638：95℃3minutes，(94℃30seconds，52℃30seconds，72℃45seconds)*35cycles
rs10490924：95℃3minutes，(94℃30seconds，55℃30seconds，72℃45seconds)*35cycles
3、样本的基因型分析
(一)单碱基引物延伸法基因分型(SnapShot)
1.纯化PCR反应产物
反应体系：
注：PCR产物总体积9μl视PCR反应数量而定，N对引物的PCR，则每对引物获得的产物加样为9μl/N。
反应条件：37℃1hour；75℃15min
2.单碱基引物延伸
反应体系：
反应条件：
3.纯化反应物
反应体系：0.7μl SAP/well
反应条件：37℃1hour；75℃15min
4.变性
反应体系：
反应条件：95℃5min；迅速冰浴冷却
5.ABI3100上机读取基因型结果
(二)核苷酸序列测定
1、胶回收：
(1)将放有胶回收的管中加入Binding Buffer30ulfangru 55℃孵育7min。(待完全溶化)
(2)胶溶化后，取出柱管，作好标记，把液体转入柱管中，10000rpm/1min离心，完毕后倒掉上清液，再加入700ulSpw，静置2～3min，10000rpm/1min离心，倒掉上清液。
(3)重复上述2操作一次。
(4)倒掉上清液后，把柱管1000rpm/1min空转。
(5)加入15ulElution Buffer到柱中央，静置2～3min，10000rpm/1min离心。
(6)重复上述操作
(7)把洗脱下来的液体轻转至干净管中，作好标记，置于冰箱中。
2、测序前扩增
反应体系：
反应条件：
3、第二步纯化：
4、上机测序
混匀后1ul/well，25ul无水乙醇/wel避光保存15min，4100rpm/30min离心。尽量吸干上清液，70％乙醇40ul/well，4100rpm/10min离心.。吸干上清液，室温避光保存15min。加入9ul/well，避光放置1hour。
(三)限制性内切酶酶切鉴定基因型
(1)含rs11200638的PCR产物采用Eag I酶切鉴定G等位基因，含rs10490924的PCR产物采用PVUII酶切鉴定G等位基因。
采用NEB的限制性内切酶Eag I(5′...C^G G C C G...3′)，反应体系如下：3.9ul H2O+5ul PCR产物+1ul buffer 3+0.1ul Eag I；反应条件如下：37℃12hour。
采用NEB的限制性内切酶PVUII(5′...C A G^C T G...3′)，反应体系如下：3.9ul H2O+5ul PCR产物+1ul buffer 2+0.1ul PVUII；反应条件如下：37℃12hour。
(2)2％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，根据电泳条带判读基因型。
图2为Snapshot检测SNP rs2293870、rs11200638、rs10490924(的基因型图(蓝色峰为G，绿色峰为A，红色峰为T)。rs2293870：TT纯合子为红色单峰；TG杂合子为红色和蓝色双峰(如图示)；GG纯合子为蓝色单峰.。rs11200638：AA纯合子为绿色单峰；AG杂合子为蓝色和绿色双峰(如图示)；GG纯合子为蓝色单峰。rs10490924：TT为红色单峰；TG杂合子为红色和蓝色双峰(如图示)；GG纯合子为蓝色单峰。纯合的风险基因型患病风险显著高于正常基因型，杂合基因型患病风险介于二者之间。
(四)其他方法
1、基于等位基因特异性寡核苷酸杂交反应原理的芯片检测
流程：DNA抽提-----DNA消化----加接头----扩增----产物片段化----生物素标记----芯片杂交---洗涤----染色----扫描----数据分析
2、Tagman方法
流程：序列比对----引物设计----引物合成----DNA抽提和定量---PCR---探针杂交-----扫描----分析
3、变性高效液相色谱(Denture HPLC)
【实施例4】与LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***变异连锁的一组单核甘酸多态性的PCR扩增和基因型分析，包含rs11200630，rs36212731，rs3763764等13个SNP。
1、提取AMD患者和对照组的血液基因组DNA。
2、PCR扩增基因组包含目的序列的基因组DNA片段
引物序列见下表，反应条件：95℃3minutes，(94℃30seconds，52～57℃30seconds，72℃45seconds)*35cycles
3、样本的基因型分析
(一)单碱基引物延伸法基因分型(SnapShot)
1.纯化PCR反应产物
反应体系：
注：PCR产物总体积9μl视PCR反应数量而定，N对引物的PCR，则每对引物获得的产物加样为9μl/N。
反应条件：37℃1hour；75℃15min
2.单碱基引物延伸
反应体系：(SNaPshot引物见下表)
反应条件：
3.纯化反应物
反应体系：0.7μl SAP/well
反应条件：37℃1hour；75℃15min
4.变性
反应体系：
反应条件：95℃5min；迅速冰浴冷却
5.ABI3100上机读取基因型结果(见图2、3、4、5)
(二)核苷酸序列测定
5、胶回收：
(8)将放有胶回收的管中加入Binding Buffer30ulfangru 55℃孵育7min。(待完全溶化)
(9)胶溶化后，取出柱管，作好标记，把液体转入柱管中，10000rpm/1min离心，完毕后倒掉上清液，再加入700ulSpw，静置2～3min，10000rpm/1min离心，倒掉上清液。
(10)重复上述2操作一次。
(11)倒掉上清液后，把柱管1000rpm/1min空转。
(12)加入15ulElution Buffer到柱中央，静置2～3min，10000rpm/1min离心。
(13)重复上述操作
(14)把洗脱下来的液体轻转至干净管中，作好标记，置于冰箱中。
6、测序前扩增
反应体系：
反应条件：
7、第二步纯化：
8、上机测序
混匀后1ul/well，25ul无水乙醇/wel避光保存15min，4100rpm/30min离心。尽量吸干上清液，70％乙醇40ul/well，4100rpm/10min离心.。吸干上清液，室温避光保存15min。加入9ul/well，避光放置1hour。
| No. | 名称 | PCR正向引物 | PCR反向引物 | SnapShot引物 |
| 1 | rs11200630 | tttggtgtgaagcatgtggt | tgattccgaggaaattcagg | tgtccaggcagtagcttgaa |
| 2 | ENSSNP6019764 | taccctgcgatctgatttcc | agatgcttgcagcagaaggt | aaaagtacctcgaccatgattcatcagg |
| 3 | rs36212731 | aaacaagaagacgcagta | cagttccgtaagcattag | agtcatttagaaagctgtaccattctttcaatattctcac |
| 4 | rs36212732 | tattctcacggctttcca | acatgctgccatttaggc | taatgcttacggaactgtggcgctttgtgcttgcc |
| 5 | rs36212733 | taatgcttacggaactgt | tcaaggacattatgagcc | tttgtgcttgccatagtatatataa |
| 6 | rs3750848 | gctgctgctcagtttccttt | ttgaaccccttccctctctt | cagatttaaaattctggctcataatgtccttgattcaatg |
| 7 | rs3750847 | gctgctgctcagtttccttt | ttgaaccccttccctctctt | gacagaaattgacaagctgtcattcaagaccttt |
| 8 | rs3750846 | gctgctgctcagtttccttt | ttgaaccccttccctctctt | aacccttcccctaaatcagttgcatgag |
| 9 | rs2014307 | cgctggaagtcagggtaa | tgaagccaaacagacgag | tcctgattaaggctctggca |
| 10 | rs3793917 | ggtggtgaataaattggtg | agggaaagagcctagaaac | ccctgagcagccagactgcagagggaatga |
| 11 | rs3763764 | tttggaaggtgctttgag | gttgggacagatgcgagt | gggttcgggatgagggctgg |
| 12 | rs58077526 | gctgcctaggagacatcagc | gccaactagaggtcctaatctctt | caattcctaatgcttcagtgctaggaatcctaaagcattaa |
| 13 | rs2672593 | gaaagtccagtggcataa | ttcttggtgttggctcta | tcaactcctaaagcttcaatgctaggaatcctaaagcattgaagtcca |
图3、图4、图5分别为Snapshot检测SNPrs11200630(包含T→C变异)、ENSSNP6019764(包含G→A变异)、rs36212731(包含G→T变异)、rs36212732(包含A→G变异)、rs36212733(包含T→C变异)、rs3750848(包含T→G变异)、rs3750847(包含C→T变异)、rs3750846(包含T→C变异)、rs2014307(包含G→T变异)、rs3793917(包含C→G变异)、rs3763764(包含A→G变异)、rs58077526(包含A→C变异)以及rs2672593(包含A→G变异)的基因型图。该检查结果为杂合子基因型的个体，其包含一个风险等位基因，分别是C、A、T、G、C、G、T、C、T、G、G、C、G；纯合的风险基因型患病风险显著高于正常基因型，杂合基因型患病风险介于二者之间。
【实施例5】LOC387715/HTRA1间，HTRA1基因上游4340碱基处缺失/***变异与AMD的关联性分析结果
采用卡方检验分析等位基因相关性，同时计算优势比和95％可信区间，评价纯合子和杂合子的患病风险度。
结果表明，缺失基因型和等位基因型分布在病人和对照组间存在显著差异，缺失型的AMD患病风险显著高于无缺失的正常基因型。
【实施例6】HTRA1基因1号外显子上SNP rs2293870变异AMD的关联性分析结果
采用卡方检验分析等位基因相关性，同时计算优势比和95％可信区间，评价纯合子和杂合子的患病风险度。
结果表明，HTRA1基因1号外显子上SNP rs2293870G→T变异与AMD高度相关，T风险等位基因携带者的AMD患病风险显著高于正常基因型。
【实施例7】定量RT-PCR检测人胎盘组织中HTRA1和LOC387715基因的mRNA丰度：
采用实时定量PCR***(Opticon；MJ Research，Watertown，MA)反映HTRA1在***/缺失不同基因型个体组织内的转录水平。
1、采用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取不同基因型个体胎盘组织的总RNA(D/D，D/I，I/I三种基因型各7例)。
2、使用QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit(Qiagen)RT-PCR一步法扩增HTRA1和LOC387715mRNA，
HTRA 1引物：正向：5’-AGCCAAAATCAAGGATGTGG-3’；
反向：5’-GATGGCGACCACGAACTC-3’。
LOC387715引物：正向：CGGACTCATCACGTCATC
反向：GAGGGAATGCAGTGACAG
RNA用量100ng。采用0-400ng总RNA，平行扩增看家基因GAPDH得到标准曲线。
引物：正向：5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’；
反向：5’-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’。
3、计算缺失/***基因型相对于非缺失/***基因型的HTRA1RNA丰度结果表明，风险等位基因携带者的HTRA1和LOC387715的mRNA丰度存在显著差异，前者在风险等位基因携带者中表达上调，后者则在风险等位基因携带者中表达下调。结果如图6，7。
【实施例8】Western检测LOC387715在胎盘组织的表达：
提取四位缺失变异基因型的湿性AMD患者和六位正常无缺失基因型对照的胎盘组织总蛋白，取25μg进行SDS-PAGE电泳，抗体浓度1.5μg/ml进行Western blotting。HTRA1蛋白表达水平以β-actin为内参。采用SPSS version 13.0进行独立样本t检验分析数据，计算其统计学意义。结果如图8，结果表明，缺失基因型的LOC387715蛋白表达比正常基因型的蛋白显著下调。
【实施例9】免疫组化检测HTRA1在人视网膜色素上皮细胞(RPE)的表达：
AMD患者眼球多聚甲醛固定，含0.3％H2O2的甲醇灭活内源性过氧物酶活性。HTRA1多抗(由中国军事科学院制备提供的羊抗人多克隆抗体)浓度5μg/ml。采用VectorStain Elite ABC kit试剂盒，采用Nikon Eclipse 80i显微镜采集信号。图9为荧光免疫化学结果，***为RPE自发荧光，绿色为HTRA1蛋白表达。分布于RPE和玻璃膜疣中。结果表明携带D/D风险基因型患者的病变部位HTRA1蛋白表达上调。
【实施例10】试剂盒
本试剂盒用于：1、AMD患者的早期诊断和分型参考；2、AMD易感人群的基因检测和风险评估。
说明：本试剂盒的试剂可以由下述第一组至第五组试剂任意一组试剂组成，我们优选的试剂由至少第一组试剂组成，或者由第一组试剂与第二组试剂组成，或者由第一组、第二组和第三组试剂组成，或者由上述试剂与第四组或第五组试剂任意组合而成。试剂盒的特异性随试剂组的增加而提高，但是考虑到灵敏度和使用操作方便，适当选择试剂的多少。
[试剂]
[操作步骤]
●2，3，4，5组的PCR扩增和基因型分析：
1取样：取患者全血(EDTA抗凝)1ml，提取AMD患者的血液基因组DNA。
2.PCR操作：基因组DNA 1ul+9ul PCR混合液
反应条件：
| 1、95℃预变性 5minutes |
| 2、95℃变性 30seconds |
| 3、55℃退火 30seconds |
| 4、72℃延伸 45seconds |
| 5、步骤2～4共35个循环 |
| 6、4℃保存 |
3、PCR产物纯化
反应体系：
| PCR产物总体积 | 1-9μl |
| SNaPshot Purify Kit | 3ul |
| ddH2O补足总体积 | 12μl |
注：PCR产物总体积视PCR产物浓度决定用量。
反应条件：
4、单碱基引物延伸
反应体系：
| 纯化产物 | 1-2μl |
| SNaPshot Multiplex | 2μl |
| DdH2O | 补足5μl |
反应条件：
5、纯化反应物
反应体系：0.7μl SAP/well
反应条件：37℃1hour；75℃15min
6、ABI遗传分析仪读取结果
反应体系：纯化产物1μl+HD 9μl
反应条件：95℃5min；迅速冰浴冷却。
ABI3100上机读取基因型结果
[结果判定]
●LOC387715/HTRA1基因间的缺失/***变异PCR扩增和基因型分析：
[操作步骤]
1、取样：取患者全血(EDTA抗凝)1ml，提取AMD患者的血液基因组DNA。
2、PCR操作：基因组DNA 1ul+9ul PCR混合液
反应条件：
3、1％琼脂糖凝胶电泳分离
实验结果如图1所示，泳道A、B：无缺失PCR扩增片段(大小约1000bp)
泳道C：杂合缺失/***变异的PCR片段包括约600bp和1000bp的两个条带
泳道D：纯合缺失/***变异的PCR扩增片段(大小约600bp)
老年黄斑.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>四川省医学科学院(四川省人民医院)
<120>检测老年黄斑变性疾病的试剂盒
<130>CD537-09P106325
<160>4
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>343
<212>DNA
<213>HTRA1基因上游4340碱基处443bp缺失/54bp***变异序列
<400>1
gagggagtcc ctcacaacct agactggtcc ccttccctcc agctgcctca actgtccaca 60
ggactctctt cccacctgcg gccacactgt gcaacctgga atttccccac ctgggcggac 120
tcatcacgtc atcaccaatt ggatgcatct tctgctctgt gcagctggtg aaatctttct 180
caacccttga gatgcagccc aatcttctcc taacatctgg attcctctct gtcactgcat 240
tccctcctgt catcctgcct ttgttttctt gccctccttt ctctcccggt tattaattaa 300
ttaactaaaa ttaaattatt tagttaattt aattaactaa act 343
<210>2
<211>732
<212>DNA
<213>HTRA1基因上游4340碱基处无缺失的正常序列
<400>2
gagggagtcc ctcacaacct agactggtcc ccttccctcc agctgcctca actgtccaca 60
ggactctctt cccacctgcg gccacactgt gcaacctgga atttccccac ctgggcggac 120
tcatcacgtc atcaccaatt ggatgcatct tctgctctgt gcagctggtg aaatctttct 180
caacccttga gatgcagccc aatcttctcc taacatctgg attcctctct gtcactgcat 240
tccctcctgt catcctgcct ttgttttctt gccctccttt ctctcccggg tgataggcat 300
taactaaaat taaataaaaa ttcagatcat ccttgcactt gctgcatttc aaatgcttgg 360
cagtcacatg tagttagtgg ctaccctctt ggacagcaca gatagagatt atttccatca 420
ctgcagaaaa ttctagactt tgagcttctt gaggacaggg gcttgatcat tcgacactgc 480
tttacagtgt ctagcagtgt ctaccctgtg gcaggggctc aggaaatttt tcctgaaccg 540
aacctaactg aactgatgtg ggtttgtcat cagggtgtac ctgctgttaa aggaggttac 600
gacctctgat gctggggtgg ccagagggga tgggagtggg tctggcactc tgaggaaagg 660
gggtgaaacc agctgagaag tcatctttta cctgctggca tggccccagc cagggttctg 720
ttgctatggg ag 732
<210>3
<211>54
<212>DNA
<213>HTRA1基因上游4340碱基处443bp缺失后***的54bp
<400>3
ttattaatta attaactaaa attaaattat ttagttaatt taattaacta aact 54
<210>4
<211>443
老年黄斑.ST25
<212>DNA
<213>HTRA1基因上游4340碱基处缺失的443bp
<400>4
gtgataggca ttaactaaaa ttaaataaaa attcagatca tccttgcact tgctgcattt 60
caaatgcttg gcagtcacat gtagttagtg gctaccctct tggacagcac agatagagat 120
tatttccatc actgcagaaa attctagact ttgagcttct tgaggacagg ggcttgatca 180
ttcgacactg ctttacagtg tctagcagtg tctaccctgt ggcaggggct caggaaattt 240
ttcctgaacc gaacctaact gaactgatgt gggtttgtca tcagggtgta cctgctgtta 300
aaggaggtta cgacctctga tgctggggtg gccagagggg atgggagtgg gtctggcact 360
ctgaggaaag ggggtgaaac cagctgagaa gtcatctttt acctgctggc atggccccag 420
ccagggttct gttgctatgg gag 443
Claims (12)
1.用于检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，包括任选的用于检测LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***(Deletion/Insertion，D/I)变异的用于AMD筛选诊断的相关试剂；
所述的缺失/***(Deletion/Insertion，D/I)变异是：位于HTRA1基因转录起始点上游4340bp处，443bp的碱基缺失和54bp的碱基***；所述443bp的碱基缺失序列如SEQ ID NO：4所示，所述54bp的碱基***序列如SEQ ID NO：3所示；
所述缺失/***后变异的序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括任选的用于检测HTRA1基因1号外显子内rs2293870G→T变异用于AMD筛选诊断的相关试剂。
3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包含任选的用于扩增包含LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***(D/I)变异以及HTRA1基因rs2293870基因片段的试剂。
4.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述检测LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***(D/I)变异以及HTRA1基因1号外显子内rs2293870的G→T变异的试剂为测序用试剂。
5.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述检测LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***(D/I)变异以及HTRA1基因1号外显子内rs2293870的G→T变异的试剂为限制性片段长度多态方法用试剂。
6.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述检测LOC387715基因与HTRA1基因间缺失/***(D/I)变异以及HTRA1基因1号外显子内rs2293870的G→T变异的试剂为Snapshot试剂。
7.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于进一步包括检测HTRA1基因rs11200638G→A变异的试剂，和/或任选的用于检测10q26上rs10490924G→T变异的试剂。
8.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于进一步包括检测LOC387715基因与HTRA1基因之间的一组SNP：rs11200630T→C变异、ENSSNP6019764G→A变异、rs36212731G→T变异、rs36212732A→G变异、rs36212733T→C变异、rs3750848T→G变异、rs3750847C→T变异、rs3750846T→C变异、rs2014307G→T变异、rs3793917C→G变异、rs3763764A→G变异、rs58077526A→C变异和/或rs2672593A→G变异的试剂。
9.用于检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，包括任选的检测HTRA1和LOC387715蛋白表达用于AMD筛选诊断的试剂。
10.权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述的检测HTRA1和LOC387715蛋白表达的试剂包括HTRA1和LOC387715蛋白的抗体；以及任选的检测蛋白表达量的试剂。
11.用于检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，包括任选的检测HTRA1和LOC387715的mRNA用于AMD筛选诊断的试剂。
12.权利要求11所述的试剂盒，其特征在于所述检测HTRA1和LOC387715mRNA的试剂为定量RT-PCR试剂。
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