CN106222253B - 老年黄斑变性脉络膜息肉状血管病变疾病的检测试剂盒 - Google Patents

老年黄斑变性脉络膜息肉状血管病变疾病的检测试剂盒 Download PDF

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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明公开了用于检测脉络膜息肉状血管病变疾病的试剂盒，它包括任选的用于检测FGD6基因rs77466370位点变异的试剂。本发明检测脉络膜息肉状血管病变疾病的试剂盒，可用于早期监控和检测PCV高危人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。

Description

老年黄斑变性脉络膜息肉状血管病变疾病的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测老年黄斑变性脉络膜息肉状血管病变疾病的试剂盒，具体地说检测与老年黄斑变性脉络膜息肉状血管病变疾病相关FGD6基因rs77466370位点的试剂盒。
背景技术
息肉状脉络膜血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy，PCV)，又称脉络膜息肉状血管疾病，是一种以异常分支的脉络膜血管网和末梢血管息肉状扩张灶为典型特征的眼底病变。PCV的眼底表现与渗出型老年性黄斑变性相似，但是其吲哚青绿血管造影(indocyanine green angiography，ICGA)表现与渗出型年龄相关性黄斑变性(age－related macular degeneration，AMD)有很大区别。
PCV最早由Yannuzzi于1982年在一个黄斑会议上提出，并将其描述为特殊的出血性和/或浆液性视网膜色素上皮及神经上皮脱离病变。1984年在美国眼科学会议上，Kleiner等报道了7例在后葡萄膜上有不同程度出血性、浆液性视网膜色素上皮及神经上皮脱离病变的患者，并用“后葡萄膜出血综合征”来描述该病。1985年Stern在3例黑人妇女身上观察到类似的情况。Yannuzzi在1990年将此病命名为特发性息肉状脉络膜血管病变(idiopathic polypoidal choroidal vasculopathy，IPCV)。随后Yannuzzi将特发性一词从该病的命名中去除，将此病命名为PCV[目前PCV的发病机制并不明确，但其组织病理学研究有助于阐明其发病机制。最初人们将PCV的病变解释为“血管瘤”，但随后一些学者发现其早期病变为大量血管沟改变目前对PCV的基因学研究并不明确，但已有的报道表明某些基因可能与其临床表现、治疗的反应等有一定联系。
目前对于PCV并无十分有效的治疗方法，缓解的方法包括PDT和玻璃体腔内注射抗血管生成药物与联合疗法，但是不能逆转相关病变。
发明内容
本发明的目的在于提供检测老年黄斑变性脉络膜息肉状血管病变疾病的试剂盒，该试剂盒通过检测来源于待测个体的样本中是否存在FGD6基因rs77466370位点变异，从而在早期监测或诊断老年黄斑变性脉络膜息肉状血管病变疾病的发生，进而为临床诊断和治疗提供参考。
本发明用于检测脉络膜息肉状血管病变疾病的试剂盒，它包括任选的用于检测FGD6基因rs77466370位点变异的试剂。
优选地，所述FGD6基因rs77466370位点变异为C→T变异。
优选地，所述试剂盒还包括检测ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点、CFH基因rs800292位点、CFH基因rs1065489位点中的任意一个或者任意多个位点变异的试剂。
优选地，所述ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点的变异为G→T变异，所述CFH基因rs800292位点的变异为G→A变异，所述CFH基因rs1065489位点的变异为G→T变异。
优选地，所述的试剂为测序用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、Snapshot用试剂或者基因芯片用试剂。
优选地所述Snapshot用试剂包括snapshot引物。
优选地还包括任选的用于扩增包含FGD6基因rs77466370位点的基因片段的试剂；和/或任选的用于扩增包含ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点的基因片段、包含CFH基因rs800292位点的基因片段、包含CFH基因rs1065489位点的基因片段中任意一个或者任意多个基因片段的试剂。
优选地所述扩增的试剂包括扩增引物。
本发明还提供了检测FGD6基因rs77466370位点变异的试剂在制备检测脉络膜息肉状血管病变疾病的试剂的用途。
优选地所述FGD6基因rs77466370位点变异为C→T变异。
优选地，所述试剂还包括检测ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点、CFH基因rs800292位点、CFH基因rs1065489位点中的任意一个或者任意多个位点变异的试剂。
优选地，所述ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点的变异为G→T变异，所述CFH基因rs800292位点的变异为G→A变异，所述CFH基因rs1065489位点的变异为G→T变异。
优选地所述的试剂为测序用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、Snapshot用试剂或者基因芯片用试剂。
优选地所述Snapshot用试剂包括Snapshot引物。
优选地还包括任选的用于扩增包含FGD6基因rs77466370位点的基因片段的试剂；和/或任选的用于扩增包含ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点的基因片段、包含CFH基因rs800292位点的基因片段、包含CFH基因rs1065489位点的基因片段中任意一个或者任意多个基因片段的试剂。
优选地所述扩增的试剂包括扩增引物。
各个变异位点的Snapshot引物和扩增引物如下表所示：
本发明检测脉络膜息肉状血管病变疾病的试剂盒，可用于早期监控和检测PCV高危人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。本发明试剂盒以CFH基因中多个与PCV相关联的SNP突变(ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点、CFH基因rs800292位点、CFH基因rs1065489位点)为目标进行协同检测，更可提高检测的准确性。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1 FGD6基因rs77466370位点、ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点、CFH基因rs800292位点、CFH基因rs1065489位点与老年黄斑变性脉络膜息肉状血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy，PCV)的相关性
一、样本收集和基因组DNA的提取
样本来源于四川省人民医院收集的样本。
根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA。在抗凝剂EDTA存在下，将收集的5ml人外周血在3000rpm离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在3000rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mM Tris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4m1)，以悬浮该沉淀物。将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16μl和20μl，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37℃过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟，除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加l/10，3M NaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA。最后将所得的基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率，DNA工作液浓度校正至50ng/μl，置-20℃冰箱保存。
二、FGD6基因rs77466370位点、ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点、CFH基因rs800292位点、CFH基因rs1065489位点的单核苷酸多态性DNA片段的PCR扩增和基因型分析
本发明采用Snapshot基因分型技术对FGD6基因rs77466370位点、ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点、CFH基因rs800292位点、CFH基因rs1065489位点点进行检测。采用基因扩增试剂及Snapshot引物分别按照下述方法进行分型：
实验步骤如下：
1)通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段
PCR扩增(20μl体系)：
反应条件：
2)Sanpshot分型检测
第一步：PCR产物纯化(12μl体系)：
反应条件：
1、37℃酶切1小时
2、75℃灭活15分钟
3、4℃保存
第二步：单碱基引物延伸反应(5μl)：
反应条件：
第三步：纯化反应物：
反应体系：0.7μl血清碱性磷酸酶/孔
反应条件：37℃1小时，75℃15分钟，4℃保存。
第四步：ABI遗传分析仪读取结果：
反应体系：纯化产物1μl+HD 9μl
反应条件：95℃5分钟，迅速冰浴冷却
ABI PRISM 3130XL DNA Sequencer上机读取基因型结果。
三、相关性分析FGD6基因rs77466370位点与老年黄斑变性脉络膜息肉状血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy，PCV)的相关性
统计方法：利用全外显子组测序Plink软件进行全外显子组测序数据分析，采用taqman、SNapShot、sanger sequencing发现rs77466370位点与脉络膜息肉状血管病变显著相关，并在后续的4个不同人群得到验证，结果见表1。基因互作分析发现，该位点与ARMS2/HTRA1-rs10490924、CFH-rs800292及CFH-rs1065489存在互作，结果见表2。
人群1,发现人群,外显子组测序,中国成都；人群2,验证组，中国广州和香港；人群3,中国汕头；人群4,新加坡人群；人群5,日本人群
a:发现组和验证组联合meta-analysis结果。
可以看出，FGD6基因SNP rs77466370的变异与脉络膜息肉状血管病相关，可以通过检测待见样本是否存在FGD6基因SNP rs77466370的变异来预测其患脉络膜息肉状血管病的风险。
表2 FGD6 rs77466370位点与ARMS2/HTRA1和CFH基因上的3个位点存在互作
实验结果说明，FGD6基因SNP rs77466370的变异与ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点、CFH基因rs800292位点、CFH基因rs1065489位点的变异存在相互作用，检测FGD6基因SNP rs77466370的变异的同时，检测ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点、CFH基因rs800292位点、CFH基因rs1065489位点中的一个或多个，可以可提高检测的准确性。
综上，FGD6基因SNP rs77466370的变异与脉络膜息肉状血管病相关，通过检测待见样本是否存在FGD6基因SNP rs77466370的变异来预测其患脉络膜息肉状血管病的风险，在检测FGD6基因SNP rs77466370的变异的同时检测ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点、CFH基因rs800292位点、CFH基因rs1065489位点中的一个或多个，可以可提高检测的准确性。
实施例2本发明检测试剂盒
本发明试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：
PCR扩增试剂(50人份)：
Sanpshot分型检测试剂(50人份)
标准DNA样品：
使用方法：
1)DNA提取
取患者全血(EDTA抗凝)2ml，提取其基因组DNA。
2)通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段PCR扩增(20μl体系)：
反应条件：
PCR产物检测：
用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在后续反应中加入的量。
3)Sanpshot分型检测
第一步：PCR产物纯化(12μl体系)：
反应条件：
1、37℃酶切1小时
2、75℃灭活15分钟
3、4℃保存
第二步：单碱基引物延伸反应(5μl)：
反应条件：
第三步：纯化反应物：
反应体系：0.7μl血清碱性磷酸酶/孔
反应条件：37℃1小时，75℃15分钟，4℃保存。
第四步：ABI遗传分析仪读取结果：
反应体系：纯化产物1μl+HD 9μl
反应条件：95℃5分钟，迅速冰浴冷却
ABI PRISM 3130XL DNA Sequencer上机读取基因型结果。
本试剂盒用于：1、老年黄斑变性疾病抗性人群脉络膜息肉状血管病变的早期诊断和分型参考；2、老年黄斑变性疾病抗性人群脉络膜息肉状血管病变的基因检测和可能性评估。
1)本发明的检测方法可用于分析FGD6基因SNP rs77466370的变异的同时检测ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点、CFH基因rs800292位点、CFH基因rs1065489位点的多态性，应用在老年黄斑变性疾病抗性人群脉络膜息肉状血管病变的辅助性诊断和个体老年黄斑变性疾病脉络膜息肉状血管病变抗性的评估中。
2)利用本发明阐述的老年黄斑变性疾病抗性人群脉络膜息肉状血管病变抗性基因/位点的多态性，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节这些基因表达的活性分子，促进新药开发。
3)本发明建立的检测SNP位点多态性的核酸序列和老年黄斑变性疾病抗性人群脉络膜息肉状血管病变相关基因/位点，可高灵敏度、特异性地应用于老年黄斑变性基因诊断用的试剂盒。
综上，本发明通过检测FGD6基因rs77466370SNP位点的变异，评估待检样本发生老年黄斑变性疾病抗性人群脉络膜息肉状血管病变的可能性，灵敏度高，只需要少量DNA样品就足以测定所述位点的变异，达到早期筛查的目的，在检测FGD6基因rs77466370的同时检测RMS2/HTRA1基因rs1 0490924位点、CFH基因rs800292位点、CFH基因rs1065489位点，可以进一步提高准确度。

Claims (6)

1.检测FGD6基因rs77466370位点变异的试剂在制备检测脉络膜息肉状血管病变疾病的试剂的用途；所述FGD6基因rs77466370位点变异为C→T变异。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂还包括检测ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点、CFH基因rs800292 位点、CFH基因rs1065489位点中的任意一个或者任意多个位点变异的试剂；所述ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点的变异为G→T变异，所述CFH基因rs800292 位点的变异为G→A变异，所述CFH基因rs1065489位点的变异为G→T变异。
3.根据权利要求1或2任意一项所述的用途，其特征在于：所述的试剂为测序用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、Snapshot用试剂或者基因芯片用试剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述Snapshot用试剂包括Snapshot引物。
5. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：还包括任选的用于扩增包含FGD6基因rs77466370位点的基因片段的试剂；和/或任选的用于扩增包含ARMS2/HTRA1基因rs10490924位点的基因片段、包含CFH基因rs800292 位点的基因片段、包含CFH基因rs1065489位点的基因片段中任意一个或者任意多个基因片段的试剂。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述扩增的试剂包括扩增引物。
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