CN101538329B - 新的抗β-淀粉样多肽抗体的可变区序列及其编码序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的抗β-淀粉样多肽抗体的可变区序列及其编码序列。本发明利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮筛选富集具有Aβ特异性的噬菌体，通过对其培养制备噬菌体抗体，并且鉴定获得阳性克隆。然后在大肠杆菌中表达获得可溶性的抗Aβ scFv片段，通过测序获得其相应的编码序列。因此，本发明提供了新的抗Aβ scFv片段及其编码序列。

Description

新的抗β-淀粉样多肽抗体的可变区序列及其编码序列

技术领域

本发明涉及抗β-淀粉样多肽的抗体，进一步涉及新的抗β-淀粉样多肽的特异性scFv抗体，及其可变区的氨基酸序列和DNA编码序列。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种以老年人中进行性记忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经***退行性疾病。老年斑、神经元纤维缠结和神经元丢失是AD的三大主要病理特征。其中老年斑的主要成分是β-淀粉样多肽(beta-amyloid peptide，A β)聚集形成的纤维，而Aβ被认为是导致神经元损伤及认知功能衰退的主要致病物质[Frost D.Co-incorporation of A beta 40and A beta42 to formmixed pre-fibrillar aggregates.Eur J Biochem，2003，270(4)：654-663]。Aβ主要包括Aβ40和Aβ42两种分子，由39～43个氨基酸组成。一般认为Aβ是由于编码APP的基因发生突变或其他原因导致β-分泌酶活性异常增高时，与γ-分泌酶共同切割产生。现在也有观点认为AD患者脑内高于正常人浓度的Aβ可能是由于Aβ的转运清除发生障碍所致。研究证实大脑及脑脊液中Aβ含量的增高与认知能力下降密切相关。Aβ结构中的疏水区域对于调节Aβ纤维的形成起着重要的作用，其1～28位氨基酸为亲水的氨基末端，29位之后为疏水的羧基末端。由于疏水氨基酸主要位于羧基端，所以羧基端的长度决定其溶解性的高低，并影响聚集成纤维的速度。Aβ相互聚集形成的纤维具有毒性，能够促发炎症级联反应、轴突损伤、突触丢失和细胞凋亡等病理改变，是导致神经元变性乃至形成痴呆的重要因素[McGeer EG，McGeer PL，Inflammatory processes in Alzheimer’s disease[J]，ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2003，27(5)1741-749]。

随着全世界人口老龄化程度的不断提高，这种疾病的发病率也在逐渐的上升，给社会和家庭在物质和精神上都带来了巨大的影响。如何找到一种可以治疗这种疾病的药物是一个紧迫的需求。但至今尚无特效的治疗措施，临床上主要以对症治疗和康复疗法为主，如应用乙酰胆碱酯酶抑制剂，以弥补因神经细胞退化而带来的乙酰胆碱神经介质下降。但这些疗法不能从根本上治疗AD。而针对Aβ多肽在发病中的关键作用，研究开发抗Aβ多肽抗体就具有治疗AD的实际应用价值。

抗Aβ抗体治疗AD，主要通过两种途径清除体内的Aβ[盛树力，主编.老年性痴呆及相关疾病.北京：科学技术文献出版社，2006：179-200]。一是抗体经过血脑屏障进入脑内与老年斑中的Aβ纤维结合，小胶质细胞通过Fc受体与抗体的Fc片段结合，吞噬、清除其中的Aβ纤维；二是抗体在外周循环中与可溶性的Aβ结合，增大血脑屏障内外Aβ的浓度差，促进脑内的Aβ外流，从而降低脑内的Aβ水平，减少Aβ在脑内的聚集和沉积。目前，已证明抗Aβ抗体(包括多抗、单抗、抗体片段等)在体外试验及动物体内对清除Aβ有肯定的效果，抗Aβ抗体治疗具有潜在的应用价值。

体外试验研究进展主要是观察抗Aβ抗体中和或清除Aβ的作用。Legleiter等分别用m266和3D6单克隆抗体与Aβ1-42以1∶10的摩尔比一起孵育，几天之后用原子力显微镜(AFM)观察Aβ纤维形成情况发现：两种单抗都能有效抑制Aβ纤维的形成，其中m266效果更好一些[Legleiter J，Czilli DL，Gitter B，et al.Effect of different anti-Abeta antibodieson Abeta fibrillogenesis as assessed by atomic force microscopy.J MolBiol，2004，335(4)：997-1006]。抗A β抗体可以提高细胞对A β的耐受性、对培养的PC12细胞及海马神经元具有保护作用[杨志勇，汪华侨，徐杰等.阿尔茨海默病人外周血中抗淀粉样蛋白的特性.解剖学研究，2005，27：83-87.Du Y，Wei X，Dodel R，et al.Human anti-β-amyloidantibodies blockβ-amyloid fibril formation and preventβ-amyloid-induced neurotoxicity.Brain，2003，126(9)：1935-9]。为了检测抗体清除斑块的效应，Bard等用抗Aβ单抗(10D5、3D6)经腹腔注射给PDAPP转基因小鼠，六个月后处死小鼠，其冰冻脑切片与小胶质细胞一起孵育24小时，通过免疫染色发现外源小胶质细胞可以吞噬斑块中的Aβ纤维；而对照组，斑块保持完整且未见小胶质细胞的吞噬现象[BardF，Cannon C，Barbour R，et al.Peripherally administered antibodies againstamyloid beta-peptide enter the central nervous system and reducepathology in a mouse model of Alzheimer disease.NatMed，2000，6(8)：916-9]。有文献报道健康人体内提取的静注免疫球蛋白(IVIG，intravenous immunoglobulin)中含有抗Aβ抗体[Dodel RC，DuY，Depboylu C，et al.Intravenous immunoglobulins containing antibodiesagainstβ-amyloid for the treatment of Alzheimer’s disease.Journal ofNeurology Neurosurgery and Psychiatry，2004，75：1472-1474]，这些抗体不仅能抑制Aβ聚集成纤维，还能使已经形成的Aβ纤维降解，同时还可以提高小胶质细胞向淀粉样斑块迁移的能力，并介导小胶质细胞吞噬、降解Aβ[Solomon B.Intravenous immunoglobulin and Alzheimer′s diseaseimmunotherapy.Curr Opin Mol Ther，2007，9(1)：79-85.Istrin G，BosisE，Solomon B，et al.Intravenous immunoglobulin enhances the clearance offibrillar amyloid-beta peptide.J Neurosci Res，2006，84(2)：434-43]。Fukuchi等提出，抗Aβ抗体的scFv片段也可以抑制Aβ寡聚体(Aβoligomers)对HEK293细胞的毒性作用[Fukuchi K，Accavitti-Loper MA，Kim HD，etal.Amelioration of amyloid load by anti-Abeta single-chain antibody inAlzheimer mouse model.Biochem Biophys Res Commun，2006，344(1)：79-86]。上述体外试验表明，抗Aβ抗体可以通过Fc受体介导小胶质细胞吞噬、降解Aβ纤维，也可以通过其他方式来抑制Aβ聚集成纤维或斑块。

动物试验是抗体进入临床研究的前提，目前大多数实验动物采用APP转基因鼠。抗体经外周(如静脉、腹腔)或经颅腔导入动物体内，然后观察抗体在体内的分布、发挥作用的部位及作用效果。1999年Schenk等发现抗Aβ抗体可以清除小鼠脑内老年斑并可预防老年斑的形成[Schenk D，Barbour R，Dunn W，et al.Immunization with amyloid--betaattenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse.Nature，1999，400(8)：173-7]。DeMattos等将抗Aβ单克隆抗体m266经外周静脉注入仅能在脑组织中表达APP的PDAPP转基因小鼠体内，结果显示血浆中Aβ浓度增高1000倍，脑组织中Aβ蓄积明显减少，说明抗体能中和外周循环中的Aβ，使脑内的Aβ逐步扩散入血液而被清除[DeMattosRB，Bales KR，Cummins DJ，et al.Peripheral anti-A beta antibody alters CNSand plasma A beta clearance and decreases brain A beta burden in a mousemodel of Alzheimer′s disease.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98(15)：8850-5]。Bard等将抗Aβ抗体经腹腔注射到PDAPP转基因小鼠体内，六个月后影像学发现脑内斑块减少80％以上，抗体能通过血脑屏障结合淀粉样斑块，并激活小胶质细胞，促进了先前已存在的淀粉样斑块的清除。Chauhan等直接将抗体注射到第三脑室中，并且在注射后不同时间段检查小鼠的大脑组织，检测结果表明，到第四周时，治疗组淀粉样蛋白的密度比对照组小鼠减少了67％，同时也证明了抗Aβ单抗脑室内注射后第四周效果达到高峰，八周后开始消失[ChauhanNB，Siegel GJ.Intracerebroventricular passive immunization in transgenicmouse models of Alzheimer′s disease.Expert Rev Vaccines，2004，3(6)：717-25.Chauhan NB.Intracerebroventricular passive immunizationwith anti-oligoAbeta antibody in TgCRND8.J Neurosci Res，2007，85(2)：451-63]。近来发现脑内Aβ寡聚体也有较强的毒性，Ma等将抗Aβ抗体注射到Tg2576转基因小鼠脑内，发现其可以清除小鼠脑内Aβ寡聚体，对保护动物脑神经损伤有积极意义[Ma QL，Lim GP，Harris-WhiteME，et al.Antibodies against beta-amyloid reduce Abeta oligomers，glycogensynthase kinase-3beta activation and tau phosphorylation in vivo and invitro，J Neurosci Res，2006，83(3)：374-84]。Levites等发现，抗Aβ1-40及Aβ1-42的单克隆抗体注入APP转基因小鼠体内后，脑内淀粉样斑块总量减少50％左右[Levites Y，Smithson LA，Price RW，et al.Insights into themechanisms of action of anti-Abeta antibodies in Alzheimer′s diseasemouse models.FASEB J，2006，20(14)：2576-8.Levites Y，Das P，PriceRW，et al.Anti-Abeta42-and anti-Abeta40-specific mAbs attenuate amyloiddeposition in an Alzheimer disease mouse model.J Clin Invest，2006，116(1)：193-201]。除了上述全抗体以外，抗体片段也能在动物体内发挥效应。研究人员已经成功应用抗Aβ单克隆抗体片段，如特异F(ab′)2片段、scFv片段等，经腹腔注射、颅内注射或经腺病毒介导等不同给药途径导入APP转基因小鼠体内，都明显减少了脑内的老年斑块[Tamura Y，Hamajima K，Matsui K，et al.The F(ab)′2 fragment of anAbeta-specific monoclonal antibody reduces Abeta deposits in thebrain.Neurobiol Dis，2005，20(2)：541-9.Fukuchi K，Tahara K，KimHD，et al.Anti-Abeta single-chain antibody delivery via adeno-associatedvirus for treatment of Alzheimer′s disease.Neurobiol Dis，2006，23(3)：502-11]。

抗Aβ抗体治疗AD在体外试验和动物试验中是比较成功的。但最终要用于人体治疗的抗体必须是经过人源化的，以克服鼠单克隆抗体在人体引起人抗鼠抗体(HAMA)反应的局限性。获得人源化抗体一般是采用将鼠源抗体进行人源化改造，但这种方法技术复杂难度高，即使改造后也难以得到百分之百的人源化，且有可能在改造过程中使原来抗体的效价亲和力降低[Mike Clark.Antibody humanization：a caseofthe‘Emperor’s new clothes？Immunol Today，2000，21(8)：397-402]。另一方法就是利用噬菌体表面展示技术直接从人源抗体基因库中筛选[Hennie RH.Selecting and screening recombinant antibody bibraries.Nature Biotechnol，2005，23(9)：1105-1116]，天然抗体库中的基因来自于未经免疫的人B细胞(外周血淋巴细胞或脾细胞)全套可变区基因，具有足够的容量和广泛的多样性，通常含有10⁶-10⁹个不同抗原结合特异性的抗体分子克隆，可以对百万乃至亿万个分子进行选择，且每一轮“吸附一洗脱一扩增”可以使目的抗体浓度浓缩50-1000倍，使抗原特异性较强的克隆得到富集，非常容易从抗体库中筛选到特异性抗体。而且从中筛选出来的抗体已经是完全人源的，无需再进行人源化改造。单链抗体(scFv)是利用噬菌体表面展示技术制备的小分子抗体片段，它没有完整抗体的Fc段，只包含VH和VL片段以及中间的连接肤(Linker)，却较好地保持了完整抗体的抗原亲和活性，是具有完整抗原结合位点的最小抗体片段。

scFv与完整的抗体相比，具有如下优点：(1)scFv分子小、免疫原性低。其相对分子量只有完整抗体的六分之一，应用于人体不易产生异源反应。(2)scFv穿透力强。进入机体后，能够迅速穿过血管壁和组织屏障到达靶细胞和靶组织，有利于疾病治疗。(3)scFv可在原核***中表达，易于基因操作和基因工程大量生产，成本低廉；也可用基因工程方法构建与其他效应分子如药物、细胞因子等连接的各种融合蛋白。(4)scFv没有Fc段，不需要与非靶细胞的Fc受体结合，有利于作为导向药物的载体。(5)scFv半衰期短，易从血液清除，肾脏蓄积量少，鉴于scFv具备的以上优点，使其已经得到了较为广泛的应用。目前，scFv的研究和利用基因工程生产及应用进展迅猛，在生物制剂药的临床试验中已占据30％以上的份额。但scFv半衰期短也是它的一个缺点，scFv的另一缺点是稳定性较差易于降解。

全抗体是将可变区基因连接上人抗体的恒定区FC段基因重组而成，全抗体因为有恒定区和FC段，分子量更大、稳定性更高和半衰期更长；由于全抗体是双价结合抗原，而scFv是单价结合抗原，所以理论上亲和力会比scFv大；再者，全抗体的恒定区和FC段可以相应激活补体，有利于直接清除抗原，或与具有FC受体的细胞结合而产生免疫清除作用，所以理论上更具有应用价值。但是全抗体会增加穿过血脑屏障的难度，但已有研究显示确有部分抗体可以穿过血脑屏障发挥作用，而即使留在血循环中的抗体也可与血液中的Aβ结合并清除，血液中的Aβ降低后大脑中的Aβ单体会不断渗透到血管中，从而使大脑中的Aβ物质得以减少，同样起到减少大脑中Aβ病变物质的作用[DeMattos RB，Bales KR，Cummins DJ，et al.Peripheral anti-Aβantibody alters CNS and plasma Aβclearance and decreases brain Aβburden in a mouse model of Alzheimer’s disease.Proc Natl Acad Sci USA.2001，98(15)：8850-8855]。

发明内容

鉴于目前治疗AD的状况，发现新的抗Aβ抗体有助于促进和改善对治疗AD的治疗。本发明提供新的人源化抗Aβ抗体可变区片段及其编码序列。

本发明提供了一种包括重链可变区、轻链可变区和连接序列的人源抗Aβ特异性scFv抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种编码所述的人源抗Aβ特异性scFv抗体的DNA，其核苷酸序列由SEQ ID NO：1所示的DNA、SEQ ID NO：3所示的DNA和编码连接序列的DNA组成。

另一方面，本发明还提供了编码抗Aβ特异性scFv抗体的重链可变区序列的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码抗Aβ特异性scFv抗体的轻链可变区序列的DNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

再一方面，本发明提供了包括所述的DNA的重组载体及其相应的重组宿主细胞。重组宿主细胞优选的是大肠杆菌(Escherichia coli)。

进一步，本发明提供了于2008年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2399的重组大肠杆菌。

本申请提供的有益效果在于提供了一种新的抗Aβ抗体，且所获得的抗Aβ抗体是scFv。

附图说明

图1：阳性噬菌体克隆的ELISA检测结果。

图2：阳性噬菌粒PCR结果，其中M为标记物；1-7为ELISA效价较高的7个噬菌体克隆。

图3：阳性克隆可溶性表达全菌蛋白电泳结果，其中M为标记物；2、4、6、8、9、11、13为诱导的A10、D8、F2、B9、E6、F4、G2噬箘体克隆；1、3、5、7、10、12、14为相应的噬箘体克隆但未经IPTG诱导。

图4：A10克隆可溶性表达的scFv抗体在各组分中的分布，其中1为未诱导的培养上清；2为IPTG诱导的培养上清；3为未诱导的胞周质；4为IPTG诱导的胞周质；5为未诱导的全菌蛋白；6为IPTG诱导的全菌蛋白。

图5：诱导株与未诱导株各组分中可溶性scFv的ELISA结果。

图6：抗Aβ抗体抗体的基因可变区序列及相应的蛋白质序列。

本领域技术人员可以明白，根据本申请公开的内容结合本领域技术常识，本申请公开的DNA序列和氨基酸序列可以按照本领域常用的其他方法合成，例如通过化学合成的方法得到本申请公开的序列。而且，本领域技术人员可以将本申请获得的新的DNA序列构建到任何合适的载体、宿主细胞中。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。

具体实施方式

实施例1：单克隆噬菌体抗体的筛选：

利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮富集筛选，以纯化的阿尔茨海默病Aβ为抗原进行了四轮“吸附一洗脱一扩增”的富集筛选，显示每轮筛选回收率呈递增趋势，说明经过筛选后，具有Aβ特异性的噬菌体得到了高度富集(表1)。方法如下：

(1)噬菌体抗体库的扩增：取100μl原库菌液，接种到100ml 2×YT-AG(含100μg/ml氨苄青霉素，1％葡萄糖的2×YT)培养基中，37℃振荡培养至对数期。加10¹²pfu(噬菌斑形成单位)辅助噬菌体M13KO7于培养液，37℃水浴30min，4℃离心后弃上清。用100ml 2×YT-AK(含100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素的2×YT)重悬沉淀，37℃培养过夜。4℃离心，上清即为扩增后的噬菌体抗体库。加100mlPEG/NaCl于上清中，冰浴1h后离心弃上清，用PBS重悬沉淀，4℃保存。

(2)抗体库的富集筛选：以纯化的Aβ1-42(400ng/孔)包被酶标板8个孔，4℃放置过夜。次日用2％MPBS(含2％脱脂奶粉的PBS)37℃封闭2h，弃上清，洗孔后，每孔加入100μl扩增后的噬菌体抗体上清，37℃孵育2h。弃上清，洗孔(第一轮筛选时洗3次，第二轮洗5次，第三轮以后洗10次以上)，每孔加100μl 100mmol/L甘氨酸-盐酸(μH2.2)洗脱特异性噬菌体抗体，室温孵育10min后，立即加入1mol/LTris(pH7.4)中和特异洗脱下来的噬菌体抗体。将洗脱液加入2ml新鲜制备的对数期TG1菌液中，37℃水浴30min后，取少量菌液测噬菌体抗体滴度，余全部涂TYE-AG平板，37℃培养过夜，次日从TYE板上刮下菌落，所得到的菌落被扩增并用于制备下一轮筛选用噬菌体。共进行四轮筛选。计算每轮投入和产出量。

表1各轮富集筛选中噬菌体抗体的回收率

注：回收率(％)＝产出噬菌体量/投入噬菌体量×100％

实施例2：对单克隆噬菌体抗体进行检测：

从第四轮筛选后过夜培养的TYE-AG平板上随机挑取80个单细菌克隆，培养制备噬菌体抗体。检测用ELISA法：抗原Aβ包被酶标板(0.4μg/孔)，封闭后向每孔加100μl单克隆噬菌体抗体上清液，37℃温育2h。洗涤后加入1∶5000的HRP标记鼠抗M13抗体，37℃温育1h。阳性对照为一抗(鼠抗人Aβ)，二抗(羊抗鼠lgG)；阴性对照仅加入2％MPBS。以OPD为底物，2M硫酸终止反应，经酶标仪OD490nm检测。以OD值大于阴性对照的2倍，判断为阳性。单克隆噬菌体抗体与Aβ抗原结合的检测结果：经ELISA检测，共得到7个阳性克隆(A10、D8、F2、B9、E6、F4、G2)。7个阳性克隆ELISA结果的A值均高于阴性对照2倍以上。取其中ELISA效价较高的2个克隆A10和F2反复鉴定。结果显示，这2个克隆均可特异性识别Aβ纯化抗原，不与阴性对照无关抗原结合，且ELISA检测A值高于阴性对照5倍以上(图1)。

(2)PCR鉴定阳性克隆菌液PCR扩增第四轮筛选后获得的阳性克隆菌，引物为通用引物LMB3和Fdseq。引物扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。结果：7个阳性菌经质粒提取后行PCR扩增，经凝胶电泳，可见7个克隆片段为1050bp左右，符合预期scFv抗体片段PCR产物的理论值(图2)。

实施例3：可溶性抗AβscFv片段的表达和鉴定：

(1)阳性噬菌粒在大肠杆菌HB2151中诱导表达，将展示有特异结合Aβ的抗体的噬菌体感染对数期大肠杆菌HB2151，37℃水浴静置30min。接种于SOBAG-N平板上，30℃培养至长出单菌落。从多个不同克隆来源的平板上各挑1个克隆，分别接种于5ml 2×YT-AG培养基中，30℃振摇过夜。将5ml过夜菌加到50ml新鲜2×YT-AG培养基中，于30℃振摇1h。离心，弃上清，沉淀重悬于50ml新鲜2×YT-AI(I：IPTG，1mM)培养基中，30℃诱导表达20h。离心，上清过滤除菌-20℃储存。将一管沉淀用0.5ml冰冷的1×TES重悬，然后加入0.75ml冰冷的1/5×TES进行涡旋，冰浴30min。离心，上清即周质提取物，-20℃储存。将另一管沉淀用0.5ml PBS悬浮，煮沸5min，离心，上清即全菌提取物，-20℃储存。取各克隆的全菌蛋白进行12％SDS-PAGE电泳，可见A10和F2克隆在相对分子质量约33,000Da处呈现目的条带，这一条带与预计的可溶性scFv的分子量相符，其他5个克隆未见相应位置的目的条带(图3)。

(2)Western Blot：将表达产物样品处理后经12％SDS-PAGE电泳分离后，于冰浴、170mA下进行电转，然后将硝酸纤维素膜浸入TBS(含5％脱脂奶粉)中，4℃封闭过夜。再与1∶2000的HRP标记鼠抗c-myc标签抗体37℃温育2h。洗涤后加入1∶5000的HRP标记羊抗鼠IgG抗体37℃温育1h。DAB显色，以未经IPTG诱导的相应产物作对照。检测可溶性抗AβscFv的表达。将A10克隆诱导表达后的菌液上清、胞周质提取物和全菌蛋白进行Western Blot检测，可见在相对分子质量约33,000Da处呈现阳性条带，以全菌蛋白反应更强，这一条带与预计的可溶性scFv的分子量相符，而未诱导的A10克隆未检测到阳性条带(图4)。

(3)ELISA检测表达产物抗体活性：步骤同单克隆噬菌体抗体的ELISA检测。一抗为表达产物可溶性抗体，二抗为1∶2000的HRP标记鼠抗c-myc标签抗体，三抗用1∶5000的HRP标记羊抗鼠IgG抗体，阴性对照仅加入2％MPBS。效价较高的A10和F2克隆的各组分表达抗体ELISA结果显示，抗体可与人Aβ结合，不与阴性对照无关抗原结合，诱导株的A值高于未诱导株的2倍以上，其中在上清中和全菌蛋白中分别高于5倍以上(图5)，表明抗体具有生物学活性。因此，初步认定A10和F2克隆菌分泌的产物即为抗人Aβ特异性scFv抗体。

实施例4：DNA序列测定：

提取阳性克隆的噬菌粒，利用ScFv DNA测序引物，交由上海生工测序部经双脱氧末端终止法对scFv DNA中的VH和VL DNA分别进行序列测定。人源抗Aβ特异性scFv抗体基因的序列分析：获得A10和F2克隆的轻链、重链可变区的核苷酸序列，并运用Blast软件对所获得的序列与GeneBank中的免疫球蛋白可变区基因进行综合比对分析。分析结果表明：所获得的A10和F2克隆的可变区基因符合scFv抗体基因，推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构，蛋白序列根据Ig blast和Kabat编码确定出CDR的起始和终止部位。下划线部分为高变区(HVR)，又叫互补决定区(CDR)，其氨基酸组成和排列顺序高度可变。VH和VL的3个CDR共同组成免疫球蛋白的抗原结合部位，负责识别及结合抗原，从而发挥免疫效应。其余部分为骨架区(FR)，其氨基酸组成和排列顺序相对不易变化。(图6)，2个克隆的基因序列一致，表明2个克隆菌可能来源于同一株原始噬箘粒。

其中将抗Aβ抗体基因的重链可变区序列命名为SEQ ID NO.：1，其编码的蛋白质序列命名为SEQ ID NO.：2；将抗Aβ抗体基因的轻链可变区序列命名为SEQ ID NO.：3，其编码的蛋白质序列命名为SEQ IDNO.：4。其中，重链可变区的CDR1的序列为SEQ ID NO.：5，CDR2的序列为SEQ ID NO.：6，CDR3的序列为SEQ ID NO.：7；轻链可变区的CDR1的序列为SEQ ID NO.：8，CDR2的序列为SEQ ID NO.：9，CDR3的序列为SEQ ID NO.：10。

实施例5：工程菌株的长期保存。

1)含阳性噬菌粒的TG1菌株：利用噬菌体展示技术筛选出的阳性噬菌体感染TG1菌得来。复苏后可在2×YT-AG(A：Amp，100μg/ml；G：1％Glu)中与噬菌体融合表达出抗A β的scFv抗体。

2)含阳性噬菌粒的HB2151菌株：利用噬菌体展示技术筛选出的阳性噬菌体感染HB2151菌得来。复苏后可在2×YT-AI(A：Amp，100μg/ml；I：IPTG，1mM)中可溶性表达出抗Aβ的scFv抗体，该菌株于2008年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2399。

序列表

<110>中国医学科学院基础研究所

<120>新的抗β-淀粉样多肽抗体的可变区序列及其编码序列

<160>10

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>369

<212>DNA

<213>人

<400>1

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaggc ctgggtcgtc ggtgaacgtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccctcagc aactatggtc tcagctgggt gcgccaggcc 120

cctggacaag gtcttgagtg gatgggaggc atcatccctt cctttggccc cgcaaactac 180

gcacagatat tccagggcag agtcaccatc accgcggacg aatcgacgaa cacagcctac 240

atggaattga ggagcctgac atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagagggg 300

ggggtaggag tggcaacaac atattggctc gacccctggg gccaggggac cacggtcacc 360

gtctcctcc                                                         369

<210>2

<211>123

<212>PRT

<213>人

<400>2

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Asn Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Pro Ala Asn Tyr Ala Gln Ile Phe

    50                  55                  60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Glu Gly Gly Val Gly Val Ala Thr Thr Tyr Trp Leu Asp Pro

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>3

<211>336

<212>DNA

<213>人

<400>3

cattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60

tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcacctatg tgcactggta ccagcagcgc 120

ccgggcactt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc gaagacactc tagagtccct 180

gatcgcttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240

ctgaagactg aggacgaggg tgactactac tgtcagtctt atgatagcac caatgcgtgg 300

gtgttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggt                           336

<210>4

<211>112

<212>PRT

<213>人

<400>4

His Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1               5                   10                  15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Thr

            20                  25                  30

Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ser Pro Thr Thr Val

        35                  40                  45

Ile Tyr Glu Asp Asn Arg Arg His Ser Arg Val Pro Asp Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65                  70                  75                  80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser

                85                  90                  95

Thr Asn Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

            100                 105                 110

<210>5

<211>5

<212>PRT

<213>人

<400>5

Asn Tyr Gly Leu Ser

1               5

<210>6

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>6

Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Pro Ala Asn Tyr Ala Gln Ile Phe Gln

1               5                   10                  15

Gly

<210>7

<211>18

<212>PRT

<213>人

<400>7

Glu Gly Gly Val Gly Val Ala Thr Thr Tyr Trp Leu Asp Pro Trp Gly

1               5                   10                  15

Gln Gly

<210>8

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>8

Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Thr Tyr Val His

1               5                   10

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>9

Glu Asp Asn Arg Arg His Ser

1               5

<210>10

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>10

Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Asn Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly

1               5                   10

Claims (6)

1.一种包括重链可变区、轻链可变区和连接序列的人源抗Aβ特异性scFv抗体，其特征在于其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.一种编码如权利要求1所述的人源抗Aβ特异性scFv抗体的DNA，其核苷酸序列由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和编码连接序列的DNA组成。

3.一种包括如权利要求2所述的编码如权利要求1所述的人源抗Aβ特异性scFv抗体的DNA的重组载体。

4.一种包括如权利要求3所述的重组载体的重组宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的重组宿主细胞，其是大肠杆菌(Escherichiacoli)。

6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，所述的大肠杆菌于2008年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2399。

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