CN101517070A - 选择干细胞的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

公开了从异质细胞群体中选择干细胞的方法。所述方法包括使所述细胞群体与凋亡诱导剂在对非干细胞而言是凋亡的，而对干细胞而言是非凋亡的条件下接触，从而从所述异质细胞群体中选择干细胞。所选的干细胞然后可用于各种应用，包括移植和分化。

Description

选择干细胞的方法及其用途

发明领域和背景

本发明涉及选择干细胞的方法及其用途。

干细胞具有能够在体内重建细胞群体的独特性质。典型地，干细胞划分为两大类：成体干细胞和胚胎干细胞。与干细胞(成体和/或胚胎两种来源)扩增相关的技术的重要性得到了这些细胞在治疗多种疾病中的许多临床前和临床用途的证明。

与依赖于手术干预或调节生理活性的药物的所有现行治疗不同，干细胞提供功能异常或退化的组织的替换。使用干细胞，替换治疗可显著改变许多目前不治的疾病的预后，恢复受损器官的功能和修正先天的代谢异常和不足。

最近发现骨髓来源的成体干细胞可产生非造血组织，这暗示这些细胞可能具有比先前假定的更大的分化潜能，并为其治疗应用打开了新领域[Petersen，B.E.等.Science 1999；284：1168-1170；Brazelton，T.R.等.Science2000；290：1775-1779；Krause，D.S.等.Cell 2001；105，369-377]。

研究已显示脐带血来源的干细胞能够修复脑损伤和中风引起的神经损伤[Lu D等.Cell Transplant.2002；11：275-81]，并且还能够功能和形态结合入动物心脏组织[Orlic，D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001；98：10344-9]。

干细胞的最早临床用途之一就是用于在具有血液恶性肿瘤的患者中执行骨髓移植，其中供体骨髓来源的造血干细胞在为所述接受者提供足够剂量的辐射和/或化疗后被施用至接受者。此治疗不但融化恶性细胞，而且融化非恶性细胞。内源造血细胞很少幸免于清髓性辐射，并且基质受到严重损伤。消融性损伤的结果是，供体造血干和祖细胞(HSPC)找到其进入宿主骨髓的途径，其接种并移入至宿主骨髓，以重建免疫造血***。造血干细胞和祖细胞的普遍来源包括骨髓、脐带血和动员至外周血的细胞。

除了治疗血液恶性肿瘤外，干、祖和免疫细胞已用于治疗实体瘤的情况。因此，例如，使用自体造血细胞移植物结合高剂量化/放疗进行实体瘤治疗已在乳腺癌[Peppercorn等，2005，Cancer 104：1580-1589]、结肠癌[Leff等，J Clin Oncol 1986；4：1586-1591]、肺癌[Ziske等，Anticancer Res 2002；22：3723-3726]、鼻咽癌[Chen等，Jpn J Clin Oncol 2003；33：331-335]和其他类型的癌症[Gratwohl等，Ann Oncol 2004；15：653-660]中进行了广泛的研究。

1型跨膜蛋白/黏附分子唾液黏蛋白CD34作为造血干细胞标志物的鉴定导致使用CD34⁺细胞选择作为浓缩造血干细胞活性的方法[Civin等，JImmunol 1984；133：157-165]。特定地，已证实虽然骨髓单核细胞含有约1-4％CD34⁺细胞，但是，向接受致死照射的狒狒施用这些细胞而不是消除了CD34⁺细胞的骨髓导致造血重建[Berenson等，J Clin Invest 1988；81：951-955]。相似地，CD133已被认为是造血干和祖细胞的标志物[KobariL等，J Hematother Stem Cell Res.2001；10：273-281]。特别地，干细胞在骨髓中的发生率低得多，为大约0.2-0.5％。

上述分离CD34⁺或CD133⁺细胞的方法得到包括所有谱系和阶段的淋巴造血干和祖细胞和一些晚期前体细胞的干和祖细胞的混合细胞群体。这是不利的，因为已显示仅分离CD34⁺细胞群体中最原始的细胞是有利的[Askenasy N.等，Current Stem Cell Research and Therapy 2006；1：85-94]。此外，所述阳性选择程序还具有一些缺点，包括CD34⁺细胞上存在物质(如抗体和/或磁珠)和除去这些物质对细胞造成的损伤。

此外，最近的证据表明，CD34在细胞膜上的表达不总是与干细胞活性相关。已显示在人中存在缺乏CD34表达，但具有完全的重建能力的高度静止的干细胞群体[Dao等，Leukemia 2000；14：773-776]。已重复显示，与缺乏这些表型标志物的成体骨髓和脐带血来源的干细胞相比，造血祖细胞的多能分化潜能有限[Jang YY等，Nat Cell Biol.2004；6：532-539]。

因此，人们一直关注发现其他方法，以替代或补充现有的分离富集干细胞和原始祖细胞的细胞群体。

干和祖细胞通常需要在受伤和炎症的极端条件下执行分化任务。在此过程中，形成造血细胞的死亡受体的表达和活化被赋予多种功能作用，特别是已分化细胞的负调节，但是死亡受体涉入近HSPC功能阶段尚不清楚。造血重建细胞在所述破坏环境中繁荣的机制特别值得关注，因为其可用于提高移入的效率。

有超过40个不同的配体-受体***目前被认为属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族。大部分TNF配体，最突出的是Fas-配体(FasL)和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)是作为膜结合蛋白合成的，然后通过蛋白水解释放可溶形式。不同细胞类型将FasL存储于在被不同生理刺激活化时分泌的囊泡中。表达数分钟后，FasL即被基质金属蛋白酶从细胞表面切下，并积累为可溶分子。所述可溶和膜形式在凋亡和免疫调节中具有不同的功能。凋亡主要由膜结合FasL介导，而FasL的可溶同种型(sFasL)的生物学是复杂的，并包括凋亡、抗凋亡和趋化活性。抗凋亡(s)FasL与所述膜形式竞争Fas结合，并且是嗜中性粒细胞的趋化因子。

Fas受体在造血干和祖细胞(HSPC)中的表达是可变的，并随谱系分化而变化。已显示胎肝、脐带血(UCB)和成体骨髓(BM)来源的未成熟CD34⁺CD38^-人细胞亚群表达低(但是可检测)水平的此受体和其他介导凋亡的TNF受体[Niho等，Curr Opin Hematol.1998；5：163-165]。

在造血细胞分化过程中，Fas受体表达于增殖和分化祖细胞，充当所有谱系的远端分化负调节剂[Gaur U、Aggarwal BB，Biochem Pharmacol.2003；66：1403-1408；Greil R等，Crit Rev Immunol.2003；23：301-322]。已在培养的造血祖细胞中观察到Fas的所述增强表达，并且所述增强表达与间接体内细胞接触细胞因子、扩增和操作后的活力受损和克隆发生下降有关。

截至目前，已认为TNF超家族受体和配体参与在各种实验条件下增加对凋亡信号的HSPC敏感性。假定Fas在接触移植后的受伤信号的HSPC中的过度表达促进了凋亡在供体细胞中的实施，并参与抑制供体细胞活性。人CD34⁺HSPC和鼠c-ki⁺lin^-SCA-1⁺(KLS)HSPC与TNF-α的间接体内温育和增加的Fas受体表达有关，并造成缺陷的归巢(homing)和移入[Bryder D，J Exp Med 2001；194：941-952；Dybedal I，Blood.2003；102：118-126]。所有这些有害效应均通过活化抗Fas抗体进行有效诱导，和通过封闭抗Fas抗体和可溶Fas-配体反转。与Fas受体在HSPC移入中的负作用相佐证，移植物抗宿主病引起的骨髓发育不全通过注射FasL缺陷细胞得到改善[Iwasaki T等，Cell Immtmol.1999；197：30-38]。

Civin等[美国申请第20040131599号]教导了通过在供体造血干细胞中表达重组FasL基因而抑制哺乳动物接受者对供体造血干细胞移植物的免疫应答的方法。FasL在此环境中的积极作用归结于杀伤宿主的反应性T淋巴细胞以改善同种排斥，和杀伤供体的反应性T淋巴细胞以改善移植物抗宿主病。

Shirwan等[美国申请第20040018170号]教导了治疗通过凋亡活化的淋巴细胞得到缓解的疾患的方法。特定地，Shirwan等公开了使用蛋白质例如FasL的稳定四聚体，以增强在活化的淋巴细胞中活化死亡受体的效率。

两种方法均使用死亡受体的配体以通过活化诱导的细胞死亡来消除反应性免疫细胞[Cohen JJ、Duke RC.Ann Rev Immunol.1992；10：267-293]。

但是，无论是Civin等，还是Shirwan等均未提到或间接提到移植前的干细胞选择或干细胞群体的纯化。

Josefsen等，[Exp Hematol.1999；27：1451-1459]教导了通过添加可溶性FasL增加CD34⁺CD38^-细胞活力和增强细胞因子诱导的克隆发生。使用CD34⁺⁺CD38^-胎肝细胞获得了相似的结果[Barcena等，Exp Hematol.1999，27：1428-1439]。在此情形中，可溶性FasL用于抑制由Fas受体的活化(三聚化)介导的凋亡[Askenasy N等，Blood.2005；105：1396-404]，Fas受体在移植入人受治疗者[Saheki K等，Br J Haematol.2000；109：447-452]和异种移植的鼠模型[Dybedal I等，Blood.2003；102：118-126]的显著分数的人细胞中表达。但是，未提出使用Fas-L作为选择干细胞的试剂。

发明概述

根据本发明的一个方面，提供了从异质细胞群体中选择干细胞的方法，所述方法包括使所述细胞群体与凋亡诱导剂在对非干细胞而言是凋亡的，而对干细胞而言是非凋亡的条件下接触，从而从所述异质细胞群体中选择干细胞。

根据本发明的另一个方面，提供了将选择的干细胞移植入宿主的方法，所述方法包括：

(a)使异质细胞群体的干细胞与凋亡诱导剂在对非干细胞而言是凋亡的，而对干细胞而言是非凋亡的条件下接触，从而选择干细胞；和

(b)将所述选择的干细胞移植入宿主，从而移植所述选择的干细胞。

根据描述的优选实施方案中的进一步的特征，所述方法进一步包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前分离所述选择的干细胞。

根据本发明的又一个方面，提供了分化干细胞的方法，所述方法包括：

(a)使异质细胞群体的干细胞与凋亡诱导剂在对非干细胞而言是凋亡的，而对干细胞而言是非凋亡的条件下接触，从而选择干细胞；和

(b)诱导所述选择的干细胞的分化，从而分化干细胞。

根据下文描述的本发明优选实施方案中的进一步的特征，所述干细胞选自由脐带血干细胞、动员后外周血干细胞、骨髓干细胞和神经干细胞组成的组。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述干细胞是骨髓干细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述骨髓干细胞是造血干细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述方法进一步包括在所述接触之前修饰所述干细胞，以生成修饰的干细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述方法进一步包括在所述接触之前纯化所述干细胞，以生成纯化的干细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述方法进一步包括在所述接触之前扩增所述干细胞，以生成扩增的干细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述骨髓干细胞是间充质干细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述干细胞是成体干细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述干细胞是胚胎干细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述凋亡诱导剂选自由TNF-α、FasL、Trail和Tweak组成的组。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述凋亡诱导剂是FasL。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述FasL偶合至表面。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述FasL是不可切割的。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述方法进一步包括在所述接触之前上调所述异质细胞群体上凋亡受体的表达。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述凋亡受体选自由Fas受体、TNF-α受体、Tweak受体和Trail受体组成的受体组。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述凋亡受体的上调表达是通过使所述异质细胞群体与干扰素γ或TNF-α接触实现的。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述异质细胞群体不包含免疫活化的T淋巴细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述异质细胞群体包含谱系阳性细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述谱系阳性细胞选自由粒细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、成红血细胞、抗原呈递细胞、髓样细胞、淋巴样细胞和巨核细胞组成的组。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述异质细胞群体包含凋亡敏感的恶性细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述方法进一步包括在所述接触之后分离干细胞。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述干细胞是宿主自体的。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述干细胞是宿主同基因的。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述干细胞是宿主异基因的。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述干细胞是宿主异种的。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述诱导分化是通过在所述干细胞中表达基因产物实现的。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述基因产物是多肽。

根据描述的优选实施方案中的更进一步的特征，所述基因产物是多核苷酸。

本发明通过提供基于干细胞对凋亡信号的不敏感性的选择干细胞的新方法，成功解决了现有已知配置的缺点。

除非另外指明，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的含义相同。虽然与本文所述方法相似或等效的方法和材料也可用于实施或检验本发明，但是合适的方法和材料如下文所述。如有冲突，则以本专利说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是例证性的，并非意在限制。

附图简述

本文通过举例结合附图描述了本发明。对于本文详细地特别指定图，应强调，所显示的特定内容只是举例和为了对本发明的优选实施方案说明性讨论，其被提出的目的是提供被认为是最有用的和易于理解本发明的原理和概念方面的描述的内容。在这一点上，未试图比基本理解本发明所必须的更详细地显示本发明的结构细节，对附图的此描述使得如何在实践中实施本发明的多种形式对本领域技术人员是明显的。

在附图中：

图1A-H说明Fas/FasL相互作用功能参与同基因造血细胞移入。A.清髓的(Myelaoblated)(950拉德)GFP小鼠(CD45.2⁺GFP⁺)移植了来自同基因野生型(CD45.1⁺GFP^-)和Fas-缺陷(lpr)供体(CD45.2⁺GFP^-)的5x10⁵个lin^-BMC的1；1混合物。移植后3周在外周血中测量造血嵌合，以比较wt(CD45.1)和lpr(CD45.2)供体细胞(GFP^-)移入(n＝16)。B.将5x10⁵个lin^-BMC同基因移植入亚致死照射的(850拉德)接受者(CD45.1→CD45.2)。当将lpr细胞移植入野生型(wt)接受者(n＝8)和当将wt细胞移植入lpr接受者(n＝10)时，3周时的移入是缺陷的。C.gld细胞在wt接受者(n＝8)中和wt细胞在gld接受者(n＝11)中的缺陷移入被异位FasL蛋白通过生物素化在供体细胞表面的表达有效逆转(n＝9)。D.wt细胞的同基因移植物包被FasL蛋白3周后外周血嵌合的实证性差异。E.FasL在移植入同基因lpr接受者(CD45.1→CD45.2)的5x10⁵个lin^-BMC中的表达在3周时对移入无显著影响(n＝6)。F.将来自GFP供体的10⁷个完整BMC移植入清髓的lpr接受者造成移植6周后供体(GFP⁺)在骨髓中的完全嵌合(n＝8)。G.GFP/lpr嵌合体的基质培养物在排除掉CD45⁺和CD11c⁺细胞后主要是lpr(GFP^-)宿主表型。数据代表5只移植小鼠的培养物。H.完全的GFP/lpr嵌合体(Fas⁺GFP⁺BMC和Fas^-GFP^-基质)充当来自同基因CD45.1小鼠(n＝6)的天然和FasL包被的lin^-BMC的接受者。与lpr小鼠中的移植物相似，嵌合不受FasL表达的影响，表明供体细胞FasL靶向基质。

图2A-G说明FasL蛋白的异位表达改善了异基因细胞移入。A.辐射调理的(Radiation-conditioned)异基因(H2K^d→H2K^b)接受者(850拉德)注射了10⁶个天然lin^-BMC和10⁶个lin^-BMC或FasL蛋白包被的脾细胞，对照组移植2x10⁶个天然lin^-BMC(n＝5)。移植后3周在外周血中确定供体嵌合的水平。B.链霉亲和素-FasL嵌合蛋白通过生物素化有效吸附于BMC表面。使用抗FasL单克隆抗体在流式细胞术中检测所述蛋白。C.异位FasL蛋白的表达改善了移植入亚致死照射的(850拉德)接受者(B6＝H2K^b)的异基因(BALB/c＝H2K^d)细胞的移入。D.移植未操作的和FasL包被的lin^-BMC的小鼠在移植后16周开始形成完全的嵌合(n＝10)。E.首次移植(H2K^d→H2K^b)后14周，所述嵌合小鼠充当至次亚致死照射的(H2K^b)宿主(n＝5)的wBMC的供体。移植后14周在外周血中测量嵌合。F.移植后7天，使用5天MLR测定评估注射了8x10⁶个天然或FasL包被的异基因lin^-BMC(H2K^d)的B6小鼠(H2K^b)的脾细胞(Spelenocytes)(n＝6)。B10.BR小鼠(H2K^k)的脾细胞充当第三方抗原。G.使用MLR评估注射了8x10⁶个天然或FasL包被的异基因脾细胞的小鼠的脾(H2K^d→H2K^b)(n＝5)。

图3A-H说明死亡受体在骨髓归巢的供体细胞中的表达。A.完整的BMC表达低水平的TNF家族死亡受体，而～30％的lin-BMC为TRAIL-R2阳性。B.与细胞移植无关，残留的骨髓细胞在全身照射(850拉德)后表达低水平的死亡受体(n＝5)。C.Fas、TNF-R1和TNF-R2在成功归巢至照射的同基因宿主的骨髓的供体细胞中显著上调。数据代表移植后48小时的表达的平均值±SD(n＝5)。D.在移植后的最初几天中，死亡受体在供体细胞中的表达日益增加(n＝4)。E.将用CFSE预标记的Lin^-BMC(＞90％纯)移植入照射的同基因接受者(850拉德TBI)，48小时后分析骨髓归巢的细胞的CFSE稀释(n＝7)。大约25％的细胞循环快速，如CFSE稀释(CFSE^暗)所确定。F.死亡受体主要在快速循环细胞(CFSE^暗)中上调(n＝5)，而慢速循环的细胞具有较低分数的表达(CFSE^亮)。G.大约五分之一的供体lin^-BMC在移植后48小时内表达谱系标志物，指示早期分化(n＝11)。H.死亡受体主要在早期分化细胞中上调(n＝8)。

图4A-G说明Fas受体和配体的动态表达。A.用850拉德全身照射(TBI)调理的小鼠注射了1-2x10⁷个异基因lin^-BMC(H2K^d→H2K^b)。48小时后，收获接受者小鼠的骨髓，并以供体-宿主来源和谱系标志物表达为参照确定Fas和FasL的表达(n＝8)。B.Fas和FasL由相同的供体细胞连带地共表达。所示读数表征多个实验(n＝29)。C.通过RT-PCR分析天然lin^-和完整的(w)BMC中编码Fas和FasL的mRNA的存在。数据代表显示相似结果的3个独立实验。D-G.通过流式细胞术确定将lin^-BMC同基因移植(CD45.1→CD45.2)入照射小鼠(850拉德TBI)后，Fas和FasL在(D)骨髓、(E)肺、(F)脾和(G)肝中的表达模式，平行于这些分子在相应器官的实质细胞中的表达(n＝5)。

图5A-H说明死亡受体在造血干和祖细胞中的表达。A-B.以HSPC标志物(A)Sca-1和(B)c-kit为参照，在同基因移植CFSE⁺lin^-BMC后2和6天，分析骨髓归巢的细胞的死亡受体的表达(n＝8)。HSPC标志物的表达表示为死亡受体阳性细胞的分数。C.确定为lin^-Sca-1⁺c-kit⁺的归巢至照射的同基因宿主的骨髓的所有候选造血HSPC均表达死亡受体(n＝8)。D.lin^-Sca-1⁺c-kit⁺HSPC中TNF-R1表达的代表性读数。E.虽然发现～30％的c-kit⁺细胞表达Fas，但是此子集的大部分和几乎所有的lin^-Sca-1⁺和lin^-Sca-1⁺c-kit⁺细胞均表达FasL(n＝7)。F.骨髓归巢的CFSE⁺lin^-细胞的Sca-1⁺和c-kit⁺子集中Fas表达的代表性读数。G.通过在25ml/min流速下进行逆流淘洗分离小体积细胞，分析其谱系标志物表达，并消除谱系以产生Fr25lin^-细胞(LTR)的＞90％谱系阴性子集。数据代表7个独立的实验。H.淘洗后在远离转子(rotor off)的位置收集STR细胞。将LTR和STR细胞移植入同基因照射的宿主(CD45.2→CD45.1)，两天后对其进行收获并用于分析Fas和FasL表达。数据代表5个独立实验的平均值。

图6A-H说明造血重建细胞对凋亡的抗性。A.同基因移植(CD45.1→CD45.2)2天后收获骨髓归巢的细胞，使其经受FasL蛋白(250ng/ml)凋亡攻击18小时(n＝6)。平行于谱系标志物表达、死亡(7AAD)和凋亡(膜联蛋白-V)，确定所述细胞的供体和宿主来源。在(无FasL)培养基中温育的细胞充当对照。B.以Fas受体表达为参照，通过门控供体细胞，用谱系阴性(lin^-)和谱系阳性(lin⁺)标志物测量凋亡性死亡(膜联蛋白-V)(n＝5)。C.将淘洗的和第2天骨髓归巢的Fr25lin^-(LTR)和STR细胞在支持培养基中温育，并在体外用250ng/ml FasL蛋白攻击18小时(n＝5)。D.以Fas表达为参照，在三个独立实验中用第2天骨髓归巢的LTR和STR细胞测量凋亡性死亡。E.在它们暴露于体外250ng/ml FasL蛋白凋亡攻击后，确定第2天骨髓归巢的Fas、TNF和TRAIL受体阳性细胞的凋亡性死亡。F.向亚致死照射的(850拉德)接受者移植5x10⁵个新鲜的(n＝10)或与FasL蛋白预温育24小时的(n＝12)同基因细胞(CD45.1→CD45.2)。3周后通过流式细胞术确定外周血淋巴细胞的嵌合。G.与FasL蛋白预温育不影响短期和长期移入(n＝8)。H.移植1.5x10⁵个来自同基因(CD45.2→CD45.1)和异基因(H2k^b→H2k^d)供体(n＝20)的天然和FasL预处理的BMC的清髓的小鼠(950拉德)的存活率。

图7A-K说明造血干细胞对Fas介导的凋亡的敏感性。5x10⁶个细胞/ml在补充StemPro营养补充剂、2mM L-谷氨酰胺、50μM 2β-巯基乙醇的α-MEM培养基中温育不同时间段。A.完整的BMC在含和不含250ng/mlFasL蛋白的培养基中温育24小时。分别通过7AAD和膜联蛋白-V掺入确定细胞死亡和凋亡，使用抗体混合物确定谱系标志物。数据概括了5个独立实验。B.对响应与250ng/ml FasL蛋白的温育而经受凋亡的BMC谱系的分析揭示，谱系阳性BMC的所有主要子集均对凋亡易感：粒细胞(GR-1)、巨噬细胞(Mac-1)、类红细胞(Ter)、B淋巴细胞(B220)和T淋巴细胞(CD5)。数据代表6个独立实验中占整个wBMC群体的百分比值。C.凋亡(膜联蛋白⁺)和存活细胞(膜联蛋白^-)确定为Fas受体表达的函数，所述Fas受体表达以温育(含和不含250ng/ml FasL蛋白)24小时(n＝7个独立温育)后天然的完整BMC内的谱系标志物表达(lin^-和lin⁺)为参照。横条代表温育开始时的Fas表达。D.Lin^-BMC在添加和不添加10ng/ml干细胞因子(SCF)、100ng/ml血小板生成素(TPO)和75ng/ml FasL蛋白的条件下温育24小时。以Fas受体表达为参照(n＝3个独立的温育)测量凋亡(膜联蛋白⁺)和活力(膜联蛋白^-)。E-J.10⁷个wBMC在补充50ng/ml TNF-α(TNF)的培养基中温育3天，并且最后一天补充250ng/ml FasL蛋白(FasL)和它们的组合(TNF+FasL)。以Fas和TNF受体的表达为参照通过膜联蛋白掺入确定凋亡(n＝4个独立的温育)。E.在培养基中温育后存活的lin^-和lin⁺细胞的数量。F.培养基中温育的受体阳性细胞的凋亡百分比。G.在补充SCF和TPO的培养基中温育后存活的lin^-和lin⁺细胞的数量。H.与SCF和TPO温育后受体阳性细胞的凋亡百分比。I.在补充SCF、TPO和白细胞介素(IL)-3的培养基中温育后存活的lin^-和lin⁺细胞的数量。J.与SCF、TPO和IL-3温育后受体阳性细胞的凋亡百分比。K.wBMC在培养基中和在补充SCF、TPO和IL-3的培养基中温育5天后lin^-细胞百分比的增加(n＝3个独立的温育)。

图8A-F说明死亡受体的双重营养和凋亡功能。3x10⁴个细胞涂平板于含有20％胎牛血清、1％牛血清白蛋白、0.1mM 2β-巯基乙醇、10u/ml重组人红细胞生成素(EPO)、20ng/ml重组小鼠(rm)干细胞因子(SCF)、10ng/ml rm白细胞介素-3(IL-3)和10ng/ml粒细胞(granulogyte)-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)的1.2％甲基纤维素和Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)。A.完整BMC(wBMC)和lin^-BMC与FasL寡聚体在半固体甲基纤维素培养物中温育，导致lin^-BMC的产克隆活性(clonogenic activity)剂量依赖性增加。在高蛋白浓度下(＞1μg/ml)，产克隆活性的突然衰减类似于完整BMC中观察到的现象。数据概括了8个独立实验。B.在相同的培养条件下，高浓度(＞250ng/ml)TNFα刺激lin^-BMC的活性而不影响wBMC的活性(n＝5)。C.来自Fas-缺陷(lpr)小鼠的wBMC和lin^-BMC的产克隆活性和死亡对FasL蛋白的存在不敏感(n＝5)。D.用Z-DEVD-fmk抑制胱天蛋白酶-3和用Z-IETD-fmk抑制胱天蛋白酶-8恢复了完整BMC的产克隆活性(n＝5)。E.胱天蛋白酶-3抑制(DEVD)不影响500ng/ml FasL蛋白诱导的lin^-BMC中克隆发生的增强，并降低了有毒的蛋白浓度下的凋亡性死亡。F.胱天蛋白酶3(DEVD)的抑制显著增加了通过淘洗分离的短期种群恢复细胞(short-term repopulating cell)(STC)的克隆发生(n＝5)。

图9A-F说明死亡受体在5FU诱导的应激造血(stress hematopoiesis)下的功能。向小鼠注射10μg/g 5FU，并在1、3和5天后收获它们的骨髓细胞用于分析(n＝6)。A.候选鼠HSPC Sca-1和c-kit的特征性细胞表面标志物的表达。B.Fas和FasL的表达。C.天然BMC和施用5FU 5天后的细胞中以谱系标志物表达为参照的Fas和FasL的表达。D.天然BMC和施用5FU 5天后收获的细胞在补充StemPro营养补充剂、2mM L-谷氨酰胺、50μM 2β-巯基乙醇的α-MEM培养基中温育(5x10⁶个细胞/ml)24小时，然后用250ng/ml FasL蛋白攻击。通过以谱系标志物表达为参照的膜联蛋白-V掺入确定凋亡(n＝5)。E.施用5FU 1、3和5天后收获的BMC在培养基中温育24小时，以确定Fas⁺细胞组分内的活力(膜联蛋白^-)和凋亡(膜联蛋白⁺)。E.在相同条件下温育的细胞用250ng/ml FasL蛋白进行凋亡攻击。F.将凋亡(膜联蛋白⁺)对Fas受体表达绘图，概括了来自5只小鼠的数据。

优选实施方案描述

本发明是选择干细胞和从非干细胞中清除异质细胞群体的方法。

本发明选择方法的原理和操作可参考实施例和所附描述而得到更好的理解。

在详细解释本发明至少一个实施方案之前，应理解本发明的应用不限于下列描述中提出或实施例部分举例的详细内容。本发明能够有其他实施方案或以不同的方式实施或执行。同样，应理解本文采用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应视为限制。

干细胞在治疗众多疾病中的种种用途表明，鉴别并纯化大量所述细胞是非常重要的。

在造血***内，干细胞典型地是根据其细胞表面表型例如CD34⁺鉴别的。然而充足的证据表明，CD34在细胞膜上的表达不总是与干细胞活性相关。已用于检测和纯化造血干细胞(HSC)的其他策略是根据荧光染料的染色模式。用活体荧光染料Hoechst 33342(与DNA小沟的富含腺嘌呤-胸腺嘧啶的区域结合的双苯并咪唑)和罗丹明123(其优先在活性线粒体中积累)的染色降低长期以来一直用于在流式细胞术实验中富集HSC。

使用上述选择程序趋向于选择偏好造血表型的干细胞或早期祖细胞。

在研究造血细胞的移入潜能的同时，本发明人在移植后早期检测到供体细胞中死亡受体表达的上调(图3A-B)，其至少部分地受由于辐射损伤而释放的因子(趋化因子和细胞因子)的诱导。

本发明人认为诱导的死亡受体在造血细胞移入的早期具有积极作用，因为他们注意到在Fas-缺陷(lpr)和FasL-缺陷(gld)小鼠中造血干细胞的移入潜能下降(图1A-B)。此外，本发明人显示异位FasL蛋白的瞬时展示同时改善了造血干细胞的同基因(图1C-D)和异基因(图2A-E)细胞移入。

此外，本发明人显示只有最原始的祖细胞在移植后不久上调死亡受体，并在接下来的数天内维持此表达(图5A-H)。值得注意的是，即使这些细胞显示高水平的死亡受体，它们仍保持对凋亡信号的抗性(图6A-B)。

本发明人从这些结果中得出结论，在具有造血重建潜能的祖细胞中，其上表达的死亡受体并不介导凋亡信号。在分化的远端阶段和在体细胞中介导死亡的相同受体，在大部分原始的造血干和祖细胞中介导营养信号。

在实施本发明时，本发明人显示天然(即非修饰的，例如表达凋亡介体)骨髓细胞与促凋亡配体如FasL预温育刺激Fas的表达(图7C)，并进一步显示这些细胞的很大一部分对凋亡不敏感(图7D)。

本发明旨在将此天然存在的现象用于选择和富集异质细胞群体中的干细胞。由于本发明人已显示只有最原始的祖细胞对促凋亡信号免疫，因此，本发明产生的细胞群体比通过根据细胞标志物如CD34的表达进行分离而产生的细胞群体具有更高的可塑性，并由此与CD34⁺细胞不同，不会偏好造血谱系。因此，本发明人提出了使用功能特性选择干和祖细胞：这些细胞对通过细胞表面死亡受体传递的凋亡信号不敏感。

本发明可用于提供干细胞的间接体内群体，其可用于在造血细胞移植和产生适合遗传操作的可用于细胞基因治疗的干细胞方面的应用。其他应用可包括但不限于过继免疫治疗、多种疾病如例如β-血红蛋白病(hemoglobinopathia)的治疗、体内分化和转分化背景下的干细胞移植和分化和转分化背景下的间接体内组织工程。

因此，根据本发明的一个方面，提供了从异质细胞群体中选择干细胞的间接体内方法。所述方法包括使所述细胞群体与凋亡诱导剂在对非干细胞而言是凋亡的，而对干细胞而言是非凋亡的条件下接触。

如本文所用，术语“选择”指区别如下文所定义的本发明干细胞和非干细胞的方法。由于本发明的方法不可避免地导致非干细胞的死亡(如下文进一步所述)，因此所述选择过程通过清除非干细胞导致本发明干细胞的富集。

如本文所用的习语“干细胞”指表达(或可被诱导表达)凋亡介体但抗凋亡信号的非终末分化的细胞。因此，包括在所述干细胞定义下的是早期祖细胞，其在某种程度上比干细胞更加分化，但是据本发明人显示，虽然其表达凋亡受体，但其对凋亡信号具有抗性。根据本发明方法选择的干细胞可根据功能特性鉴定。因而例如，本发明人已显示根据本发明方法选择的干细胞包含与根据其他先前技术方法选择的干细胞相比增强的移入特性。

本发明干细胞可得自脐带血、外周血、骨髓(例如间充质干细胞、造血干细胞)或任何成体组织(包括但不限于脑、肝和肌肉)。此外所述干细胞还可是胚胎干细胞和其衍生物。

胚胎干细胞和其恢复方法在本领域为公知，参见例如Trounson AO(Reprod Fertil Dev 2001；13：523)、Roach ML(Methods Mol Biol 2002；185：1)和SmithAG(Annu Rev Cell DevBiol 2001；17：435)。成体干细胞是得自成体组织的干细胞，并且在本领域也为公知。分离或富集成体干细胞的方法参见例如，Miraglia，S.等.Blood 1997；90：5013；Uchida，N.等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000；97：14720；Simmons，PJ.等.Blood 1991；78：55；Prockop DJCytotherapy 2001；3：393，Bohmer RM等.Fetal Diagn Ther 2002；17：83)和Rowley SD等.Bone Marrow Transplant 1998；21：1253；Stem Cell Biology(干细胞生物学)Daniel R.Marshak和Richard L.Gardner编，出版商：ColdSpring Harbor Laboratory Press，(2001)和Hematopoietic Stem CellTransplantation(造血干细胞移植)，Anthony D.Ho和Richard Champlin编，出版商：Marcel Dekker(2000)。

根据本发明的此方面，所述干细胞选自异质细胞群体。

如本文所用，习语“异质细胞群体”指至少两种类型的细胞(一种类型为如上所定义的干细胞，另一种为凋亡敏感的细胞)的混合物。所述异质细胞群体可得自任何单个或多个生物体，优选地哺乳动物和更优选地人。

根据一个实施方案，所述异质细胞群体包含谱系阳性细胞和干细胞的混合物。在此情况下，本发明方法可用于执行谱系清除。

如本文所用，习语“谱系阳性细胞”指向特定细胞谱系定向的细胞，如定向祖细胞和其他进一步分化的细胞。典型地谱系阳性细胞表达谱系分化的标志物，其实例包括但不限于CD3、CD61、CD19、CD33、CD14、CD15和/或CD4。

可根据本发明选择方法清除的谱系阳性细胞的实例包括但不限于B和T淋巴细胞(成熟的和未成熟的)、粒细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、成红血细胞、抗原呈递细胞、髓样细胞、淋巴样细胞和巨核细胞。优选地，所述T淋巴细胞不是免疫活化的T淋巴细胞即T细胞受体活化的T淋巴细胞。

根据另一个实施方案，所述异质细胞群体包含干细胞和凋亡敏感的恶性细胞的混合物。因此，本发明方法可用于清除所述异质群体的恶性细胞。

在本发明选择方法之前，可使用如下本领域已知的技术富集所述异质细胞群体的干细胞：通过FACS(其中所述干细胞定义为CD34⁺或任何其他标志物)、通过排出罗丹明123和Hoescht、通过逆流离心淘洗和通过谱系清除，以获得小胚细胞的群体。

所述异质细胞群体可包含在组织(例如骨髓)或其部分、团聚体、单细胞悬液中或作为原代培养物或细胞样品的一部分，只要它们是本发明促凋亡剂可及的。

所述异质细胞群体可在本发明选择方法之前进行改良，但优选所述改良过程不影响所述干细胞对凋亡剂的抗性，那样的话它们可能无法再根据本发明方法选择。因此，例如，所述异质细胞群体可进行遗传改良以表达感兴趣的分子。

可选地或另外地，所述异质细胞群体可进行扩增。优选地，用于扩增所述异质细胞群体的培养条件导致本发明干细胞的净增加，且不会导致所述干细胞变得对凋亡敏感。

间接体内培养不同组织来源的干细胞的方法在细胞培养领域为公知。对此，参见例如教科书“Culture of Animal Cells-A Manual of BasicTechnique”(动物细胞培养基本技术手册)，Freshney，Wiley-Liss、N.Y.(1994)，第三版，其教导通过引用结合入本文。在允许细胞扩增而不分化的条件下培养干细胞的特殊方法是本领域已知的，参见例如美国专利申请第20050181504、20050265980、20050276793和20050124003号，其均通过引用结合入本文。应理解，所述干细胞扩增还可在本发明选择程序过程中和/或本发明选择程序之后实现。

如所述，本发明选择方法是基于干细胞显示出比非干细胞更高的对促凋亡剂的抗性的发现。因此，可通过与促凋亡剂在杀伤非干细胞的条件下接触富集细胞群体的干细胞。

如本文所用，习语“促凋亡剂”指能够促进程序性细胞死亡的试剂(例如化学制品或多肽)。

可依照本发明使用的示例性促凋亡剂包括但不限于TNF-α、FasL、Trail(Apo2配体)和Tweak(Apo3配体)。所述促凋亡剂可以是重组多肽、生物化学合成的或从细胞提取物纯化的。重组TNF-α、FasL、Trail和Tweak均可从公司如R&D Systems(Minnneapolis，MN)和Abnova Corporation(台湾)商业获得。本领域技术人员知道，存在许多增强凋亡的药剂。所述剂包括双吲哚马来酰亚胺-8和哇巴因(quabain)。如果需要，这些剂可与本发明促凋亡剂联合使用。

根据本发明此方面的优选实施方案，用于选择干细胞的促凋亡剂是FasL。

如本文所用，术语FasL指能够结合Fas受体并诱导凋亡的FasL多肽的至少一个活性部分。优选地FasL是哺乳动物例如人的。人FasL的示例性多肽序列如GenBank AAC50124所述。因此，根据本发明的此方面，所述FasL可以是Fas配体多肽的生物活性肽衍生物、得自Fas配体多肽的生物活性类肽或Fas配体活性的小有机分子激动剂。所述Fas配体多肽可以是生物活性的Fas配体多肽如Fas配体多肽变体、Fas配体多肽衍生物、改良的Fas配体多肽或截短的Fas配体多肽。

根据本发明此方面的一个实施方案，所述FasL偶合至表面(例如细胞膜)，以便其能够使Fas受体三聚化，从而增强其活化的效率。FasL可位于其他表面如例如脂质体，或可使用链霉亲和素偶合的FasL连接至生物素化珠。

FasL与所述表面可是可切割的或不可切割的，虽然根据本发明的目前优选实施方案，所述FasL是不可切割的，以便保持Fas受体的三聚化。仅以膜结合形式表达的天然存在的非切割的人Fas配体的实例如Gen Bank号AAG60017.1所述。美国专利第6951919号教导由于较不易蛋白水解而具有增强的凋亡活性的Fas配体。

根据本发明此方面的另一个实施方案，所述FasL是游离多肽(即未偶合至表面)，但以四聚化状态(即不溶的)存在，以便其能够诱导Fas受体的三聚化，从而诱导凋亡。所述多肽的实例在本领域为已知，参见例如专利申请第20040018170号(通过引用结合入本文)。此外，已显示连接链霉亲和素的FasL能够产生四聚体，并因此充当促凋亡配体。

应理解，本发明促凋亡剂可与主动从干细胞排出的染料如Hoechst或类似染料偶合。所述染料可广泛地商业获得，例如Invitrogen、MolecularProbes。这样，本发明干细胞可不受所述促凋亡剂的任何负影响。

本发明促凋亡剂可与所述异质细胞群体接触足以诱导非干细胞的凋亡的时间。典型地，启动凋亡所用的时间是约1小时，虽然优选地在凋亡开始后、执行所述选择程序之前等待约12-18小时。诱导非干细胞凋亡的最有效的FasL浓度可使用体外分析确定，并可依赖于FasL的精确配制和所述异质群体中存在的细胞的类型。

可选地，本发明促凋亡多肽可在本发明异质群体中表达。

因此，本发明进一步提供编码促凋亡多肽的表达构建体，其可用于在本发明异质细胞群体中表达所述多肽。例如，得自哺乳动物FasL蛋白克隆、编码全长蛋白的全部或选择的部分的多核苷酸序列可用于产生FasL多肽的重组形式。编码野生型人FasL的核酸序列的实例如GenBank号U1182.1所述。编码仅以膜结合形式表达的、天然存在的非切割的人Fas配体的核酸序列的实例如GenBank号AF288573所述。

本发明核酸构建体(在本文也称作“表达载体”)典型地包括赋予此载体适合在原核细胞、真核细胞或优选地二者(例如，穿梭载体)中复制和整合的其他序列。此外，典型的克隆载体还可含有转录和翻译起始序列、转录和翻译终止子和多腺苷酸化信号。

真核启动子典型地含有两类识别序列，TATA盒和上游启动子元件。TATA盒位于转录起始位点上游25-30碱基对处，其被认为参与指导RNA聚合酶开始RNA合成。其他上游启动子元件确定转录起始的速率。

增强子元件可刺激从所连接的同源或异源启动子的转录高达1,000倍。增强子在被置于转录起始位点下游或上游时均具有活性。许多得自病毒的增强子元件具有广泛的宿主范围，并在多种组织中具有活性。例如，SV40早期基因增强子适合用于许多细胞类型。适合用于本发明的其他增强子/启动子组合包括得自多瘤病毒、人或鼠巨细胞病毒(CMV)、来自各种逆转录病毒如鼠白血病病毒、鼠或劳斯肉瘤病毒和HIV的长时程重复序列(long term repeat)的那些。参见Enhancers and Eukaryotic Expression(增强子和真核表达)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1983，其通过引用结合入本文。

在构建表达载体时，启动子距异源转录起始位点的距离优选地与其距其自然背景下的转录起始位点的距离相同。不过，如本领域已知的，可适应对此距离进行一定改变而不丧失启动子功能。

所述表达载体还可添加多腺苷酸化序列以增加促凋亡多肽mRNA翻译的效率。精确且有效的多腺苷酸化需要两个不同的序列元件：位于所述多腺苷酸化位点下游的富含GU或U的序列和位于上游11-30个核苷酸处的高度保守的六核苷酸序列AAUAAA。适合用于本发明的终止和多腺苷酸化信号包括得自SV40的那些。

除了已描述的元件之外，本发明表达载体可典型地含有意增加克隆的核酸的表达水平或利于鉴别携带重组DNA的细胞的其它专门的元件。例如，许多动物病毒含有促进病毒基因组在许可的细胞类型内的额外染色体复制的DNA序列。只要通过所述质粒上携带的或宿主细胞基因组的基因提供适当的因子，携带这些病毒复制子的质粒即可进行游离复制。

所述载体可包括或不包括真核复制子。如果存在真核复制子，则可使用适当的选择标志物在真核细胞中扩增所述载体。如果所述载体不包含真核复制子，则不能进行游离复制。替代地，所述重组DNA整合至所加工的细胞的基因组，所述启动子在其中指导所需的核酸的表达。

本发明表达载体可进一步包括允许例如从单个mRNA翻译多个蛋白的额外多核苷酸序列，如内部核糖体进入位点(IRES)，和用于所述启动子嵌合多肽的基因组整合的序列。

哺乳动物表达载体的实例包括但不限于可获自Invitrogen的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSeeTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，可获自Promega的pCI，可获自Strategene的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可获自Clontech的pTRES和它们的衍生物。

还可使用含有来自真核病毒如逆转录病毒的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。得自牛***瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，得自EB病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A⁺、pMTO10/A⁺、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和允许蛋白在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或已显示在真核细胞中有效表达的其他启动子的指导下表达的任何其他载体。

病毒是在许多情况下已进化出躲避宿主防御机制的非常特化的感染原。典型地，病毒感染特定的细胞类型并在其中繁殖。病毒载体的靶向特异性利用其特定地靶向预确定的细胞类型的天然特异性，从而向感染的细胞引入重组基因。因此，本发明使用的载体的类型将取决于转化的细胞类型。根据转化的细胞类型选择合适的载体的能力适当地在普通技术人员的能力范围内，因此本文未提供选择注意事项的一般描述。例如，可使用I型人T细胞白血病病毒(HTLV-I)靶向骨髓细胞，可使用Liang CY等，(ArchVirol.2004；149：51-60)描述的杆状病毒苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)中存在的异源启动子靶向肾细胞。

重组病毒载体可用于促凋亡多肽的体内表达，因为它们提供如侧向感染和靶向特异性的优点。侧向感染是例如逆转录病毒的生活周期固有的，其是单个感染的细胞产生许多后代病毒粒子的过程，所述病毒粒子出芽并感染相邻细胞。结果是大面积迅速被感染，其中大部分不是被原始病毒粒子初始感染。这与其中感染原仅通过子代传播的垂直型的感染相反。还可产生不能侧向传播的病毒载体。如果所需目的是将指定的基因导入仅局部数量的靶向细胞，此特性可能有用。

不同的方法可用于将本发明表达载体导入干细胞。所述方法一般参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1989，1992)，Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，John Wiley和Sons，Baltimore，Md.(1989)，Chang等，Somatic Gene Therapy(体细胞基因治疗)，CRC Press，Ann Arbor，Mich.(1995)，Vega等，Gene Targeting(基因靶向)，CRC Press，Ann Arbor Mich.(1995)，Vectors：A Survey ofMolecular Cloning Vectors and Their Uses(载体：分子克隆载体和其用途综述)，Butterworths，Boston Mass.(1988)和Gilboa等[Biotechniques1986；4：504-512]，所述方法包括例如稳定或瞬时转染、脂转染、电穿孔和使用重组病毒载体感染。此外，有关阳性选择方法，参见美国专利第5,464,764和5,487,992号。

通过病毒感染导入核酸相对其他方法如脂转染和电穿孔具有多个优点，原因是由于病毒的感染性本质可获得较高的转染效率。

本发明还预期在本发明选择程序之前上调所述异质细胞群体上的凋亡受体(例如Fas受体、TNF-α受体、Tweak受体和Trail受体)。这样可以放大对凋亡信号的响应，本发明干细胞向阳性方向，而本发明非干细胞向阴性方向。

上调凋亡受体的方法在本领域为已知，如使细胞与干扰素γ或TNF-α接触。所述试剂可从公司如Sigma Aldrich和Promokine商业获得。优选地所述细胞与这些试剂接触3小时至5天的任何时间。因此，干细胞选择的示例性方法可包括使所述异质细胞群体与TNF-α温育2天以上调Fas，随后与Fas-L温育1天以杀伤非干细胞。根据本发明此方面的干细胞选择的进一步的实例可包括使所述异质细胞群体与干扰素γ温育3天以上调TNF-α受体，随后与TNF-α温育1天以杀伤非干细胞。

应理解，可在与所述促凋亡剂接触之前增强本发明干细胞对凋亡信号的抗性。例如，可向本发明FasL装甲细胞导入Fas途径的显性负性组成组分如Fas相关的死亡结构域(FADD)的显性负性突变体形式(例如截短的FADD，参见例如Wu等.Cell Immunol 2001；208：137-47)或能够阻断Fa途径的另一个分子如Fas相关的死亡结构域样白细胞介素-1β转化酶抑制蛋白(FLIP)，以保护所述装甲细胞免受FasL诱导的死亡。有关如何增加干细胞对促凋亡剂的抗性的进一步的实例，参见Civin等[美国申请第20040131599号]。

根据本发明方法选择的间接体内干细胞可应用于多种临床情况。下面列出了一些。

细胞移植：造血细胞移植已成为许多遗传或恶性疾病的治疗选择。虽然早期移植程序使用完整的骨髓(BM)群体，但是最近使用更加确定的干细胞(CD34⁺细胞)富集群体。除了骨髓外，所述细胞可得自其它来源如动员至外周血(PB)和新生儿脐带血(CB)的骨髓干细胞。与BM相比，用PB细胞进行移植缩短了各类血细胞减少症的时间，并且降低了感染和出血的风险。

所述供体和接受者可以是一个个体或不同的个体，分别例如自体或异基因移植。当实施异基因移植时，如本领域所公知的，应采取降低移植排斥和/或移植物抗宿主病的制度。所述制度目前已在人治疗中实施。根据本发明方法选择的细胞群体提供显著清除T淋巴细胞，其可用于异基因和单倍体相合移植背景，以降低移植物抗宿主病。

最先进的制度参见出版物Slavin S.等，例如，J Clin Immunol 2002；22：64和J Hematother Stem Cell Res 2002；11：265，Gur H.等.Blood 2002；99：4174和Martelli MF等，Semin Hematol 2002；39：48，其通过引用结合入本文。

对于患有恶性疾病的接受者的自体移植，自体输注中的污染性肿瘤细胞经常导致所述疾病的复发。选择并扩增非恶性干细胞将降低最终的移植物中肿瘤细胞的装载量。

稀有细胞遗传缺陷的出生前诊断：出生前诊断包括在子宫内收集孕妇的胚胎细胞并分析其遗传缺陷。收集胚胎细胞的优选的、非侵入性方法包括分离渗入外周母体循环的胚胎具核红细胞前体。然而由于这些细胞的数量非常稀少，因此本发明的进一步应用是在分析之前根据本文所述方法选择所述细胞。因此，本发明提供选择应用于出生前诊断的胚胎干细胞的方法。

基因治疗：对于成功的长期基因治疗，高频率的遗传改良的具有稳定整合至其基因组内的转基因的干细胞是必须的要求。在BM组织中，虽然大部分细胞是循环祖细胞和前体细胞，但是干细胞仅构成细胞群体的小部分，并且它们中的大多数处于静止的非循环状态。基于病毒(例如，逆转录病毒)的载体需要活跃的细胞***以将转基因整合至宿主基因组。因此，向新鲜BM干细胞的基因转移效率是非常低下的。扩增并纯化干细胞群体和调节其在间接体内的细胞***的能力将提供增加的其遗传改良的可能性。

因此，可改良本发明选择的细胞以表达上文所述基因产物。

如本文所用，习语“基因产物”指蛋白、肽和功能RNA分子(即多核苷酸)。一般地，核酸分子编码的基因产物是供给受治疗者的需要的基因产物。所述基因产物的实例包括由接受的受治疗者的器官正常产生的蛋白、肽、糖蛋白和脂蛋白。例如，可通过基因替换供给胰腺缺陷器官的基因产物包括胰岛素、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、羧肽酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、三酰甘油(triaclyglycerol)脂肪酶、磷脂酶A₂、弹性蛋白酶和淀粉酶；肝正常产生的基因产物包括凝血因子如凝血因子VIII和因子IX、UDP葡糖苷酸基转移酶(transferae)、鸟氨酸转氨基甲酰基酶(transcarbanoylase)和细胞色素p450酶和用于加工血清腺苷或内吞低密度脂蛋白的腺苷脱氨酶；胸腺产生的基因产物包括血清胸腺因子、胸腺体液因子、促胸腺生成素和胸腺素α1；消化道细胞产生的基因产物包括促胃液素、促胰液素、缩胆囊素、促生长素抑制素、5-羟色胺(serotinin)和P物质。

可选地，所述编码的基因产物诱导细胞表达所需的基因产物(例如，所导入的遗传物质编码转录因子，其诱导供给受治疗者的基因产物的转录)。

在另一个实施方案中，重组基因可提供异源蛋白，例如，对表达该异源蛋白的细胞是非天然的。例如，可向非人细胞提供各种人MHC组分以支持在人接受者中的移入。可选地，所述转基因抑制微生物(microorgan)外植体正常表达的供体MHC基因产物的表达或作用。

非造血干和祖细胞的间接体内选择：

本文提出的技术的其他用途包括可用于非造血干和祖细胞的间接体内选择，所述细胞包括例如神经干细胞、少突胶质细胞祖细胞和类似细胞。可通过转染所述干细胞使其表达基因产物(多肽或多核苷酸产物)，强制所述细胞在间接体内沿特定路径分化。可选地或另外地，可通过在适当的培养基中培养而诱导所选择的细胞分化。

髓鞘疾病形成一类重要的至今不治的人神经疾病。动物模型，特别是少突胶质细胞谱系的移植细胞中的进展造成显著病灶性的再髓鞘化(remyelination)，并得到了功能恢复的生理学证据。将来的治疗可同时包括移植和促进内源修复，且这两种方法可与供体组织的间接体内操作结合。

美国专利第5,486,359号说明分离的人间充质干细胞可分化成超过一种的组织类型(例如骨、软骨、肌肉或骨髓基质)，并提供了分离、纯化和扩增培养物中人间充质干细胞的方法。

美国专利第5,736,396号提供在体外或间接体内谱系定向诱导分离的、扩增培养的人间充质干细胞的方法，所述方法包括使间充质干细胞与有效诱导干细胞分化为所选谱系的生物活性因子接触。进一步公开了包括将扩增培养的谱系诱导的间充质干细胞导入原始的自体宿主，以再生或修复间充质组织的方法。

美国专利第4,642,120号提供了修复软骨和骨缺陷的组合物。这些组合物以原样或嵌入天然或人工骨的凝胶形式提供。所述凝胶包含某些类型的细胞。细胞可定向为胚胎软骨细胞或任何间充质来源的细胞，其潜在地可被转化成为功能性软骨细胞，典型地通过包含与纤维蛋白原、抗蛋白酶和凝血酶结合的软骨形成诱导因子。

美国专利第5,654,186号说明血源性间充质细胞在培养和体内条件下繁殖(如动物模型中所证实)，并且能够从血液中移入受伤位点以形成皮肤。

美国专利第5,716,411号揭示了在动物或人中再生受伤或烧伤的皮肤的方法。此方法包括开始用胶原糖胺聚糖(GC)基质覆盖伤口的步骤，以利于间充质细胞和血管从移植的GC基质内下面的健康组织的渗透。随后，将从取自动物或人未受伤位点的表皮细胞生长而来的培养的上皮自体移植物片(sheet)应用于体表。得到的移植具有极好的包合率并具有正常皮肤的外观、生长、成熟和分化。

美国专利第5,716,616号提供治疗患有特征在于骨、软骨或肺缺陷的疾病、病症或疾患的接受者的方法。所述方法包括静脉内施用分离自正常的、同基因个体的基质细胞，或在修正分离自所述接受者的基质细胞中的遗传缺陷之后静脉内施用所述分离的细胞。还公开了将基因导入接受者个体的方法。所述方法包括获取所述接受者个体或匹配的同基因供体的骨髓样品，和从所述样品中分离贴壁细胞。分离之后，用基因转染供体贴壁细胞并静脉内施用至接受者个体。也公开了包含分离的基质细胞的组合物，所述分离的基质细胞包括可操作地连接至调节序列的外源基因。

在上述各个实例中，均使用非造血干和祖细胞作为补充器官的缺失或受损细胞的外部细胞来源。所述使用需要纯化的干和祖细胞组合物以成功应用于所建议的治疗。由于这一对大量纯化的干和祖细胞群体的紧迫需求，本发明方法和应用解决了上述美国专利中公开的任何方法重要遗留问题(critical niche)。

间接体内和体内应用的其他实例：

干和祖细胞扩增的其他应用包括皮肤再生、肝再生、肌肉再生和刺激骨生长以应用于骨质疏松。

预期在此专利的期限中，将会发展出许多相关的促凋亡剂，术语凋亡诱导剂的范围意在预先包括所有此类新技术。

如本文所用，术语“约”指±10％。

检查下列实施例之后，本发明的其他目标、优点和新特征将对本领域普通技术人员是明显的，所述实施例意不在限制。此外，上文描述的和下文权利要求部分要求保护的本发明的各个不同实施方案和方面得到下列实施例的实验支持。

实施例

现在参考下列实施例，其与上文的描述一起以非限制性方式说明本发明。

一般地，本文使用的术语和本发明采用的实验程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。所述技术在文献中已充分阐明。参见，例如“Molecular Cloning：A laboratory Mannal”(分子克隆实验手册)Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”(分子生物学最新方案)I-III卷，Ausubel，R.M.编(1994)；Ausubel等，“Current Protocolsin Molecular Biology”(分子生物学最新方案)，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”(分子克隆实用指南)，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”(重组DNA)，Scientific American Books，New York；Birren等编，“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series”(基因组分析实验手册丛书)1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；如美国专利第4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057号所述的方法；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”(细胞生物学实验手册)I-III卷，Cellis，J.E.编(1994)；“Current Protocols inImmunology”(免疫学最新方案)I-III卷，Coligan J.E.编(1994)；Stites等编，“Basic and Clinical Immunology”(基础和临床免疫学)，(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi编，“SelectedMethods in Cellular Immunology”(细胞免疫学中的选择方法)，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中已有广泛描述，参见例如，美国专利第3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853，987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521号；“Oligonucleotide Synthesis”(寡核苷酸合成)，Gait，M.J.编(1984)；“NucleicAcid Hybridization”(核酸杂交)，Hames，B.D.和Higgins S.J.编(1985)；“Transcription and Translation”(转录和翻译)，Hames，B.D.和Higgins S.J.编(1984)；“Animal Cell Culture”(动物细胞培养)，Freshney,R.I.编(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”(固定化细胞和酶)，IRL Press，(1986)；“APractical Guide to Molecular Cloning”(分子克隆实用指南)Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷，Academic Press；“PCRProtocols：A Guide To Methods And Applications”(PCR方案：方法和应用指南)，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual”(蛋白质纯化和鉴定策略实验课程手册)，CSHL Press(1996)；其均通过引用结合入本文，如同完全在本文对其进行描述。其他一般的参考文献贯穿本文件提供。认为其中的程序在本领域为公知，并提供它们以方便读者。其中包含的所有信息通过引用结合入本文。

一般材料和方法

动物准备和移植：此研究中使用的小鼠为C57B1/6J(B6、H2b、CD45.2)、B6.SJL-Ptprc^a Pepc^b/BoyJ(H2K^b、CD45.1)、B6.MRL-Faslpr/J(lpr、H2K^b、CD45.2)、B6Smn.C3-Tnfsf6gld/J(gld、H2k^b、CD45.2)和C57BL/6-TgN(ACTbEGFP)1Osb(GFP、H2k^b)，购自Jackson Laboratories。将小鼠饲养于屏障设施中。通过使用X-射线照射仪(RadSource 2000)以106拉德/min的速率进行亚致死(850拉德)和致死(950拉德)全身照射调理接受者。小鼠在移植前进行18-24小时调理。X-射线照射的清髓剂量和毒性显著不同于γ-照射。对于移植，将悬浮于0.2ml磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)的细胞注入侧尾静脉。

细胞分离、鉴定和染色：在无菌条件下从股骨(femurs)和胫骨收获完整的骨髓细胞(wBMC)于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，Beit Haemek)中。对谱系阴性(lin^-)BMC的免疫磁性分离，将细胞与饱和量的CD5、B220、TER-119、Mac-1、Gr-1和NK1.1特异性的大鼠抗小鼠单克隆抗体(mAb)在4℃温育45分钟。除Ter-119和NK1.1(eBioscience)外，所有抗体均获自杂交瘤细胞培养物。将抗体包被的细胞用含有1％胎牛血清(FCS，Biological Industries)的PBS洗涤两次，然后与偶合至M-450磁珠的绵羊抗大鼠IgG按每个细胞4颗磁珠的比例温育(Dynal)。通过暴露于磁场收集未偶合的lin^-BMC，使用针对谱系标志物的荧光素异硫氰酸酯(isothyocyanate)(FITC)标记的mAb(eBioscience和BD Pharmingen)的混合物通过流式细胞术再次评估分离的效率。为了得到更高的纯度(＞95％)，一些情况下会重复免疫磁性分离。

使用Beckman离心机，J-6转子通过逆流离心淘洗分离长期(LTR)和短期(STR)造血重建细胞。收获自股骨和胫骨的wBMC在15、25(Fr25)、29和33ml/min的流速，3000rpm和远离转子(STR)的条件下进行分选。通过在4℃与针对AA-4、CD5、GR-1、Mac-1、B220(来自杂交瘤细胞系)大鼠抗小鼠mAb和纯化的TER119(eBioscience)温育对Fr25细胞进行谱系清除，以获得LTR群体。使用荧光染料标记的mAb的混合物(BD Pharmingen，eBioscience)通过流式细胞术再次评估LTR细胞的谱系清除效率。

对于使用细胞内染料的染色，将细胞与2.5μM5-(和-6-)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE，Molecular Probes)温育20分钟、洗涤并重悬。

使用FasL蛋白的凋亡攻击：先前显示链霉亲和素-FasL嵌合蛋白向Fas⁺细胞转导有效的凋亡信号[Yolcu ES等.Immunity 2002；17：795-808]。将细胞在补充StemPro营养补充剂(Stem Cell Technologies)、2mM L-谷氨酰胺、50μM2β-ME的α-MEM培养基中温育(5x10⁶个细胞/ml)24小时。在一些情况下，所述培养基补充10ng/ml干细胞因子(SCF)和100ng/ml血小板生成素(TPO)。所有补充剂均购自PeproTech。通过添加75-250ng/ml链霉亲和素-FasL嵌合蛋白攻击细胞，保持18-24小时，然后通过流式细胞术分析凋亡和死亡。

器官收获：在心内灌注含有100单位肝素的30ml冷PBS之后，收获脾、肺和肝。将所述组织切片并进行处理：肺在37℃下用380u/ml V型胶原酶(Sigma)消化60分钟，肝在37℃下用1500u/ml胶原酶消化20分钟。所有组织包括脾用40μm网孔过滤，细胞悬浮液用PBS洗涤两次。

将FasL蛋白吸附于细胞表面：将细胞在室温下，在于PBS的5μM新鲜配制的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce)中悬浮30分钟。用PBS洗涤两次后，所述细胞与于PBS的链霉亲和素-FasL嵌合蛋白(100ng蛋白/10⁶个细胞)温育。使用二级猪抗山羊IgG(R&D Systems)复染色的初级山羊抗链霉亲和素mAb(Zymed)和抗FasL抗体(克隆MFL-4，BD Pharmingen)通过流式细胞术评估吸附效率。确定阳性染色的对数值，使用同种型对照抗体染色的对照细胞进行归一化。

流式细胞术：测量使用Vantage SE流式细胞仪(Becton Dickinson)执行。根据生产商的说明(Cedarlane)通过菲克梯度离心分离具核外周血和骨髓细胞。细胞在PBS中洗涤，与标记的初级mAb在4℃温育45分钟或用荧光染料标记的二级mAb复染色。使用针对次要抗原CD45.1(克隆A20，eBioscience)和CD45.2(克隆104，eBioscience)的单克隆抗体确定同基因移植物中的供体嵌合占供体和宿主外周血淋巴细胞(PBL)的百分比。

确定与5μg/ml 7-氨基放线菌素-D(7-AAD，Sigma)和膜联蛋白-V(IQ产品，Groningen，The Netherlands)温育的细胞中的细胞死亡和凋亡。

使用初级标记mAb鉴别受体和配体：Fas(CD95)克隆15A7(eBioscience)、TNF-R1(CD120a)克隆HM104(Serotec)、TNF-R2(CD120b)克隆TR75-89(Serotec)、Trail-R2(DR5)克隆MD5-1(eBioscience)和FasL克隆MFLA(BD Pharmingen)。

假定的干细胞的细胞表面标志物鉴别为Sca-1(Ly-6A)克隆D7(eBioscience)和c-kit(CD 117)克隆2B8(eBioscience)。使用偶合至FITC、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)和多甲藻素叶绿素a-蛋白(PerCP，BDPhamingen)的链霉亲和素对生物素化抗体进行复染色。

半定量RT-PCR。使用EZ-RNA II提取试剂或RNeasy微型柱(Qiagen，Hilden，Germany)从细胞中提取总RNA。所述RNA与pd(T)_12-18引物一起用于反转录反应。使用下列引物对组执行PCR步骤：小鼠FAS-正向5′GCCTTGGTTGTTGACCA(SEQ ID NO：1)，反向5′GTACCAGCACAGGAGCA(SEQ ID NO：2)，产生300bp片段；小鼠FAS-配体-正向5′ACCGCCATCACAACCA (SEQ ID NO：3)，反向5′TCAACCTCTTCTCCTCCA(SEQ ID NO：4)，产生500bp片段。β-肌动蛋白的引物用作内部对照并将表达归一化。

体外集落形成单位(CFU)测定。3x10⁴个细胞涂平板于含有20％FBS、1％BSA、0.1mM 2β-ME、10u/ml重组人红细胞生成素(EPO)、20ng/ml重组小鼠(rm)SCF、10ng/ml rm白细胞介素-3(IL-3)和10ng/ml rmGM-CSF(PeproTech)的1.2％甲基纤维素和Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)。7-10天后计数超过50个细胞(CFU-C)的集落。以200-1,500ng/ml范围内的增加浓度添加链霉亲和素-FasL嵌合蛋白，或通过生物素化将其吸附于细胞表面[Yolcu ES等.Immunity 2002；17：795-808；Askenasy N等.Circulation2003；107：1525-1531；Pearl-Yafe M等，Stem Cells 2007；发行中]。添加5ng/ml浓度的重组的人可溶性FasL(SuperFasL，Alexis)。分别通过添加Z-DEVD-fmk和Z-IETD-fmk(R&D Systems)抑制胱天蛋白酶3和8。

统计分析。对每个实验方案，数据均表示为平均值±标准偏差。通过两次测量的线性回归评估每个实验组的结果的重复性。使用事后Scheffe t-检验评估实验方案之间的差异，在p＜0.05下，认为差异显著。

实施例1

造血细胞移入中Fas的生理活化

结果

归结于造血细胞中Fas/FasL相互作用的有害结果表明在造血干和祖细胞(HSPC)移植物环境中的负影响。此相互作用的阻抑活性表明，Fas-缺陷HSPC由于对Fas介导的供体细胞活性的调节和/或阻抑不敏感而具有移入优势。为了检验此可能性，本发明人同基因被移植物中使用Fas-缺陷(lpr)和FasL-缺陷(gld)小鼠，以避开参与移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)的免疫机制并离析此分子对在早期移入过程中的作用。将来自野生型(CD45.1)或Fas-缺陷(lpr，CD45.2)供体的10⁶个lin^-BMC移植入清髓的(950拉德)同基因GFP接受者(CD45.2)，移植后3周在外周血中得到完全的供体嵌合(n＝5)。通过将来自野生型(wt)和lpr供体的5x10⁵个lin^-BMC移植入清髓的同基因GFP接受者(n＝16)执行竞争性移入实验。在这些条件下，嵌合体在3周时呈现59±5％CD45.1和35±4％lpr嵌合(图1A)，移植后14周仍维持此差异。这些数据表明Fas/FasL相互作用在造血细胞移入的早期阶段中具有积极作用，而无证据表明Fas介导的供体细胞活性的阻抑。相反，缺陷移入表明供体细胞Fas的支持作用。

进一步在移植入亚致死照射的(850拉德)接受者以实现混合嵌合的5x10⁵个lin^-BMC同基因移植物中分析移入(图1B)。第一个一般的观察结果是lpr细胞在wt接受者和相反地wt细胞在lpr宿主(p＜0.05)中的缺陷移入。有意思的是，不仅当供体细胞是Fas-缺陷(lpr)时，而且当将wt细胞灌输至lpr接受者时，移入是缺陷的(图1B)，表明超过一种机制涉及Fas/FasL相互作用。此外，当将gld细胞灌输至wt接受者和将wt细胞灌输至gld接受者时，移入也是缺陷的(图1C)。对这些数据的综合解释指向缺乏Fas受体和配体的细胞缺失20-25％的移入。

实施例2

异位FasL蛋白的瞬时展示改善了同基因细胞移入

结果

为了确定gld细胞的移入缺陷是否可被FasL恢复，通过生物素化用FasL蛋白包被供体细胞。FasL蛋白在供体gld细胞表面的表达恢复了它们在同基因wt接受者中的移入缺陷(p＜0.001)(图1C)。将表达FasL的wt细胞移植入gld接受者时观察到了相似的效应(p＜0.001)，表明了移入细胞中的供体FasL-宿主Fas相互作用和明显的自分泌Fas/FasL活性。移入的调节归结于FasL的特异性效应，而不是细胞表面蛋白装饰的长期效应。通过生物素化用FasL蛋白装饰wt-BMC改善了(p＜0.005)同基因wt接受者中的早期移入(图1D)，小鼠在移植后16周开始形成完全的供体嵌合。这些结果表明移入BMC对FasL诱导的凋亡不敏感，并且此蛋白的表达改善了短期移入而不损害长期种群恢复细胞。

实施例3

供体细胞FasL的初级靶标是同基因移植物中的骨髓基质

结果

为了确定异位FasL蛋白促进移入的效应是否通过宿主中的Fas信号传递起作用，将野生型小鼠的细胞移植入Fas-缺陷lpr接受者(n＝8)。通过在细胞同种异体移入物表面表达FasL蛋白实现的移入优势丧失，表明所述机制涉及宿主中的竞争性Fas信号传递途径(图1E)。这些结果进一步证明FasL装饰的细胞的增强的移入是FasL的特异性效应，而不是间接体内细胞操作的假象。

FasL装饰的lin^-BMC的否决活性可在全身水平起作用，其中所述否决活性阻止宿主免疫***破坏归巢前的BMC，或在骨髓中起作用，其中所述否决活性可清除在照射中幸存的残留宿主细胞。在同基因移植物中，预期免疫调节不是移入过程的相关变量。可被供体细胞FasL靶向的残留的宿主细胞包括免疫细胞、HSPC和骨髓基质。非免疫机制参与FasL的移入支持效应的证据使本发明人寻找FasL装饰的细胞在宿主(基质或残留的在照射中幸存的宿主HSPC和免疫细胞)中的特异性细胞靶标。本发明人通过将来自GFP供体的10⁷个完整BMC移植入清髓的(950拉德TBI)lpr接受者，产生了具有Fas^-基质和Fas⁺造血细胞的嵌合小鼠。移植后6周，这些小鼠在外周血和骨髓中显示完全的供体造血嵌合(图1F)。为了确定骨髓基质是lpr宿主表型，将骨髓吸出物涂布于长期培养物中。排除掉CD11c⁺和CD45⁺细胞之后，培养物中生长的细胞的主要表型是lpr宿主(GFP^-)来源(图1G)。亚致死照射的(850拉德)嵌合体充当二级同基因CD45.1细胞移植的接受者。移植天然和FasL包被的lin^-BMC后的造血嵌合水平相似(图1H)，并与lpr接受者中FasL介导的移入优势的丧失相似(图1E)。通过排除，这些数据表明供体细胞FasL的初级靶标是小鼠基质，而不是对宿主骨髓中残留的造血细胞的否决活性。

实施例4

FasL的异位表达增强异基因造血细胞的移入

结果

为了确定FasL的供体细胞表达在全身水平的影响，通过生物素化在脾细胞和lin^-BMC的表面表达FasL嵌合蛋白。将这些细胞与10⁶个天然lin^-BMC一起移植入照射的异基因宿主(H2K^d→H2K^b)。与两倍数量的天然lin^-BMC相比，移入水平被FasL蛋白在lin^-BMC上的表达显著改善(p＜0.001)，并进一步被其在供体脾细胞上的表达改善(p＜0.001)(图2A)。这些数据表明，抑制同种异体应答对供体造血细胞移入是有益的。但是仍不清楚移入的细胞是否在lin^-BMC的天然或FasL包被的子集内。

为了确定是否FasL在所有移入的lin^-BMC细胞上的表达都会影响移入，将所述蛋白以几乎完全的效率吸附至供体细胞表面(图2B)。移植1.5x10⁶个FasL装饰的异基因lin^-BMC在3周时得到与未改良的细胞相比更高的供体造血嵌合水平(p＜0.001)(图2C)。所有小鼠均在移植后16周开始形成完全的嵌合，表明所述异位蛋白的瞬时展示并不影响持久造血嵌合的最终建立(图2D)。为了检验改善的早期移入是否造成干细胞的消失，执行了顺序移植。将来自完全嵌合体的lin^-BMC移植入二级清髓的宿主显示移入无显著差异(图2E)。因此，FasL蛋白在供体细胞上的表达被很好地耐受，改善了它们的短期移入，并且不会影响它们的长期造血重建潜能。

实施例5

FasL蛋白的表达以Fas依赖性方式封闭同种异体反应性

支持异基因细胞移入的可能机制是通过宿主免疫细胞的活化诱导的细胞死亡(AICD)过表达FasL蛋白抑制同种异体应答。为了提供FasL的免疫抑制作用的直接证据，将所述蛋白包被的细胞腹膜内注射入异基因宿主。7天后在混合淋巴细胞反应(MLR)中分析接受者脾细胞的反应。FasL装饰的lin^-BMC和脾细胞特异性封闭同种异体反应性应答，但对第三方抗原的应答保持完整(图2F-G)。FasL装饰的脾细胞在抑制同种异体反应性T细胞应答方面比lin^-BMC更加有效。这可能是由于脾中普遍存在专职抗原呈递细胞，能够有效活化同种异体反应性T细胞使其对通过AICD(3，35，36)的FasL介导的杀伤敏感。综合考虑，这些数据证明FasL非常早地参与造血细胞移入过程，其部分是通过全身抑制对移植物的同种异体免疫应答介导的。这与本发明人先前报道的同基因供体细胞比异基因供体细胞具有更好的归巢(1)相一致。

实施例6

死亡受体在供体细胞中被上调

结果

评估了收获自天然C57B1/6和BALB/c小鼠的天然的具核的完整BMC(wBMC)和谱系清除(lin^-)BMC中的Fas、TNF和TRAIL受体水平。突出的差异是lin^-子集中的TNF和TRAIL受体与wBMC相比具有更强的表达(图3A)。为了监控移植后死亡受体表达的变化，使用lin^-BMC，原因是在wBMC移植物中，更加原始的祖细胞与成熟细胞相比优先归巢(1)。将lin^-BMC移植入照射的(850拉德)同基因接受者(CD45.1→CD45.2)之后，通过门控供体和宿主细胞收获和分析骨髓。在照射中幸存(48小时后)的残留宿主细胞显示与这些受体在天然BMC中的分布相比它们的表达变化更小(图3B)，第2天骨髓(BM)归巢的供体细胞显示显著上调的Fas和两种TNF受体(p＜0.001)，这与TRAIL-R2受体相对较小的增加相反(图2C)。随后，死亡受体表达在6天后增加至60-75％的供体细胞(图2D)。平行地，残留的宿主BMC在移植后6天显示下述物质适度的增加：Fas至14.5±3％，TNF-R2至22.5±2.5％和TRAIL 19.5±0.5％(p＜0.001，与基线值相比)。在这些移植条件下，小鼠在3周后形成～50％供体嵌合(n＝15)，并在16周后开始形成完全的供体嵌合。综合考虑，这些数据显示移植后早期死亡受体在供体细胞中的急性表达。

实施例7

死亡受体表达对循环和分化的依赖性

结果

死亡受体的表达可由***和早期分化诱导，因为一些供体细胞早在归巢至骨髓后即参与循环(1)。因此，以CFSE稀释和谱系标志物表达为参照监控近接种过程(proximal seeding process)期间TNF家族受体在供体细胞中的表达。移植前用胞内染料CFSE预标记供体细胞。大约三分之一的细胞显示显著的CFSE稀释，指示归巢至宿主骨髓后的细胞***(图3E)。受体主要表达于与移植后24小时保持CFSE^亮的细胞相比CFSE^暗部分的细胞(p＜0.001)(图3F)。移植后最初48小时内表达谱系标志物的细胞中观察到了相似的不均匀分布(图3G)。移植后2天内BM归巢的1in⁺BMC从5±1.7％至20±2％的增加伴随有死亡受体的表达(图3H)。这些数据指示所述受体的表达主要与归巢至并接种于宿主骨髓后的早期细胞循环和分化相关。

实施例8

Fas/FasL在转录活化后共表达于供体细胞

结果

鉴于死亡受体的急性表达，本发明人试图确定是否同样表达同类配体。TNF超家族中唯一的膜结合配体是FasL。将异基因lin^-BMC移植入照射的宿主(H2K^d→H2K^b)之后两天，收获骨髓归巢的细胞并分析Fas受体和配体的表达。虽然残留的宿主BMC显示适度的这些分子的表达的上调，但是供体细胞在归巢至骨髓后数小时内显示显著的Fas和FasL上调(图4A)。Fas受体和配体的组成型共同表达(图4B)可能是照射的骨髓中被扭曲的细胞因子环境和循环的骨髓细胞上调这些分子的结果。

为了确定Fas和FasL表达的增加是否在RNA转录水平受到调节，对供体细胞执行了RT-PCR分析(在移植前)。具核完整的骨髓细胞表达显著水平的编码Fas的mRNA和痕量的编码FasL的mRNA(图4C)。两种分子的mRNA转录物在用于移植的lin^-BMC中均无法检测。因此，Fas和FasL蛋白在移入的细胞上的出现是在转录水平诱导的。

实施例8

与不同基质相互作用后移入的细胞中Fas/FasL的动态表达

结果

Fas受体和其配体在造血细胞中的表达变化响应多种环境因子和分化事件发生(4-14，23)。骨髓基质是为确定的HSPC移入提供位点的唯一微环境。为了检验Fas和FasL表达的上调是否仅为骨髓归巢的细胞的特征，分析了归巢至同基因宿主的不同器官的供体细胞(CD45.1→CD45.2)。受体和其配体在归巢至骨髓(图4D)和肺(图4E)的供体细胞中上调。不同的是，归巢至脾(图4F)和肝(图4G)的移入细胞主要上调其FasL表达。这些分子瞬时表达于归巢至肺和肝的供体细胞(在移植后24小时达到峰值水平)，而它们进行性表达于骨髓和脾归巢的细胞。平行地，辐射损伤诱导这些分子在这些器官的实质细胞中表达(图4D-G)。不同器官的实质和移入细胞中的伴随性上调表明Fas和FasL的表达部分受由于辐射损伤而释放的因子(趋化因子和细胞因子)的诱导。但是，Fas和FasL表达的其他诱导性刺激因子在不同器官中有所不同。

实施例9

死亡受体受骨髓基质调理和与骨髓基质相互作用的诱导

结果

为了确定影响表达的外部细胞的因子，在灌输至非照射的同基因(CD45.1→CD45.2)接受者后监控受体。在这些条件下，死亡受体和FasL的表达比照射的宿主中低约40-65％，指示基质损伤后趋化因子和细胞因子的释放是死亡受体表达的部分原因。在随后的实验中，将lin^-BMC在股骨中间接体内温育6小时，通过流式细胞术确定表达水平。此短暂的温育程序使Fas表达从3.5±1.2％增加至11.8±3.2％(p＜0.001)，使FasL从6±1.5％增加至12.2±2.8％(p＜0.005)，正面地将细胞-基质相互作用确定为这些分子的重要诱导因子。

实施例10

死亡受体在候选遣血干和祖细胞中的表达

结果

研究了上调死亡受体的细胞的性质和这些细胞是否属于具有造血重建潜能的祖细胞子集。干细胞占完整BMC的～0.5％，因而它们在lin^-细胞中的发生率小，基于表型的分离程序通常产生具有显著的功能异质性的BMC子集。使用两种分离程序富集造血干细胞和祖细胞。

A.表型鉴定的干和祖细胞

鼠HSPC主要归于表型定义为lin^-Sca-1⁺c-kt⁺的子集[37，38]。在移植CFSE⁺lin^-供体细胞后2(n＝7)和6天(n＝5)表达这些标志物的BM归巢的供体细胞子集中测量死亡受体的分布。48小时后，死亡受体主要表达于Sca-1⁺细胞(图5A)并突出表达于c-kit^-细胞(图5B)。虽然Sca-1⁺分数(CFSE⁺lin^-BM-归巢的供体细胞的11.5±2％)和死亡受体表达(图5A)没有显著的变化，但是c-kit⁺子集从第2天的32±5％减至第6天的20±3％(图5B)。此数量的减少伴随着表达所述受体的c-kit⁺细胞分数的相对增加(对于Fas、TNF-R2和TRAIL，p＜0.05)。TNF受体阴性的c-kit⁺细胞的分数和绝对数量的减少是未预料到的，因为技术人员可能预期这些受体介导细胞凋亡。

对由最原始的候选HSPC组成的CFSE⁺lin^-Sca-1⁺c-kit⁺细胞子集的进一步分析揭示所有死亡受体在移植后48小时表达(图5C)。TNF-R1表达的一个实例显示于图5D。同样地，事实上与种群恢复HSPC最对应的所有CFSE⁺lin^-Sca-1⁺c-kit⁺细胞是Fas和FasL阳性(图5E-F)。在lin^-c-kit⁺细胞子集内，～30％表达Fas，～85％表达FasL(图5E)。综合考虑，这些数据指示最原始的鼠祖细胞在移植后不久上调死亡受体，并在接下来的数天内维持此表达。

B.在短期和长期造血重建细胞中的表达

为了纯化具有不同的长期(LTR)和短期造血重建(STR)潜能的两种细胞群体，使用基于密度的分离程序。通过谱系清除处理在25ml/min淘洗流速下收集的小细胞，以产生富集LTR细胞的组分(Fr25lin^-)(图5G)，而大的STR子集则在BMC分馏结束时于远离转子位置收集。大部分移植Fr25lin^-细胞的小鼠在未接受细胞移植物的清髓的小鼠通常观察到的死亡时间段内死亡(8/11)。移植STR细胞的小鼠存活数周的时间段，其中的大部分(5/8)未能建立持久的供体型嵌合。不同的是，移植两种细胞群体(LTR+STR)的小鼠在系列移植中显示持久的移入和胜任的造血作用(未显示)。这些数据与对这些细胞子集的早期和晚期造血重建潜能的先前报告一致。³⁵

对新鲜淘洗的细胞的分析揭示FasL在27±4％的Fr25lin^-细胞中表达(图5H)，对污染的淋巴细胞的流式细胞术分析显示在lin^-BMC中的表达。这表明FasL在富集LTR干细胞的组分中组成表达。接下来将两个子集移植入照射的(850拉德)同基因接受者(CD45.2→CD45.1)，两天后收获用于分析。骨髓归巢的Fr25lin^-和STR细胞在归巢至骨髓后显示显著的Fas和FasL上调，在STR祖细胞中具有更高水平的表达(p＜0.001)(图5H)。因此，分别具有长期和短期造血重建潜能的干细胞和祖细胞的最原始的子集在归巢至骨髓后早期表达死亡受体。

实施例11

骨髓归巢的细胞抗Fas介导的凋亡

结果

Fas受体表达的显著上调表明供体细胞变得对凋亡敏感。为了检验这种可能性，向辐射调理的小鼠(850拉德)移植同基因lin^-BMC(CD45.1→CD45.2)，2天后从股骨骨髓收获BM归巢的细胞。将这些细胞在体外缺乏支持性趋化因子和血清的情况下暴露于250ng/ml FasL蛋白的凋亡攻击18小时以增强细胞对凋亡的易感性。FasL攻击揭示骨髓居留细胞对凋亡具有显著的抗性(图6A)。在辐射存活的残留宿主BMC中，预期对FasL诱导的凋亡的抗性是由于低水平的Fas表达。不同的是，大约45％的BM归巢的供体细胞在移植后48小时为Fas阳性。以Fas和谱系标志物表达为参照的凋亡测量(图6B)证明大部分Fas⁺BM归巢的供体细胞对FasL诱导的凋亡不敏感。

相同的凋亡攻击应用于移植淘洗的LTR和STR子集后的BM归巢的细胞(图6C)。第2天BM归巢的细胞显示对FasL蛋白相对不敏感，并且与天然的淘洗的细胞子集相比，凋亡显著降低(p＜0.001)。以Fas表达为参照的凋亡细胞死亡测量(图6D)揭示LTR和STR两个子集中的Fas⁺细胞均对FasL诱导的凋亡不敏感。Fas⁺LTR细胞与Fas⁺STR细胞相比具有更强的对FasL诱导的凋亡的抗性。通过使第2天BM归巢的细胞接触TNF-α和TRAIL执行相似的实验，产生了一致的lin^-BMC对同类受体介导的凋亡的抗性。

实施例12

受体串拢(cross talk)对细胞凋亡敏感性的影响

先前的研究显示TNF诱导Fas受体，其被归结于对造血细胞的活力和功能具有高度有害的结果(15-22，28-30)。TNF受体的早期上调指示～30％的所有供体细胞(图3C)和89-93％的lin^-Sca-1⁺c-kit⁺细胞在2天后表达TNF和FasL的受体(图5C)。因此，以TNF超家族受体的表达为参照，监控1-2天后收获并使用FasL蛋白进行凋亡攻击的BM归巢的细胞的凋亡。为了增加对凋亡的一般敏感性，在不含补充剂和趋化因子的培养基中温育细胞。受体阳性子集内的死亡分数没有显著差异，并且FasL不在TNF和Fas受体染色阳性的细胞中诱导凋亡(图6E)。这些数据表明死亡受体之间的诱导性串扰与特定子集对FasL诱导的凋亡的感知无关。此不敏感性可能是由缺乏受体共表达或某些子集的细胞对Fas介导的凋亡不敏感引起的。鉴于最原始的HSPC共表达所有死亡受体，这些数据指向细胞对凋亡不敏感，而不是缺乏感知凋亡触发的受体。

实施例13

清除凋亡敏感的细胞不会消除祖细胞和干细胞的造血重建潜能

本发明人接下来询问负责清髓的小鼠的持久的和短期的造血重建的干和祖细胞是否居留于BMC的凋亡敏感或凋亡抗性子集内。将在体外与FasL蛋白预温育的细胞移植入亚致死调理的(850拉德)同基因(CD45.1→CD45.2接受者(参见下文的实施例14)。3周时的嵌合水平相等(图6F)，并且所有接受者在移植后14周开始形成完整的供体嵌合(图6G)。使用嵌合体的骨髓细胞作为二级清髓的(950拉德)接受者(CD45.2)的供体。所有二级接受者(n＝7)在12-16周后显示完全的供体嵌合。综合考虑，这些数据指示短期和长期造血重建细胞均不受短暂暴露于促凋亡FasL蛋白的影响。假定祖细胞居留于lin^-组分，通过在移植前使lin^-BMC暴露于FasL执行相同的实验。移植与培养基(66±5.8％)和与FasL蛋白(65±4.1％)温育24小时后的lin^-BMC获得的相似的嵌合水平(n＝6)，提供了祖细胞对凋亡不敏感的直接证据。

为了检验与促凋亡配体预温育是否改善移植结果，灌输了少量细胞。显著地，发现此温育时间段在成熟BMC中诱导Fas表达和诱导凋亡(参见下文的实施例14)。营救清髓的同基因宿主(950拉德)需要的lin^-细胞的数量限制是约2x10⁵个细胞，因此向小鼠灌输1.5x10⁵个BMC(图6H)。同基因移植(CD45.2→CD45.1)后4周，与FasL预温育的细胞的接受者的存活率高于(14/20)移植在(不合FasL)培养基中预温育的BMC的小鼠的存活率(9/20)。在异基因移植物(H2K^b→H2K^d)中观察到了相似的存活率差异，移植FasL预处理的和对照BMC的小鼠的存活率分别为10/20和6/20。因此，与FasL蛋白预温育改善了移入细胞的辐射防护质量。本发明人接下来评估了FasL对造血祖细胞的活化是否消除具有长期重建潜能的干细胞。在第一次移植后12周收获嵌合体的骨髓细胞，将其灌输至二级清髓的同基因接受者(CD45.1)。将股骨细胞内容物的一半移植入各个二级接受者，在16周后得到完全的供体嵌合，指示在与促凋亡配体温育后保留了干细胞的自我更新。

实施例14

天然骨髓细胞对凋亡的敏感性

结果

在一系列实验中检验了天然骨髓细胞在体外响应凋亡刺激因子的行为。wBMC与FasL蛋白温育24小时造成～40％的细胞凋亡性死亡(图7A)，其中凋亡细胞的主要分数包含于lin⁺子集。进一步的分析揭示所有主要的BMC谱系均对Fas介导的凋亡敏感(图7B)。从低死亡受体发生率开始(图3A)，在这些温育条件下Fas的表达在天然wBMC中受刺激(图7C)。但是，显著分数的lin^-Fas⁺细胞对FasL介导的凋亡不敏感。在相同条件下温育lin^-BMC确认了Fas的上调，并进一步显示约50％的lin^-Fas⁺细胞对凋亡不敏感(图7D)。出乎意料的是，FasL比10ng/ml干细胞因子(SCF)和100ng/ml血小板生成素(TPO)的组合更有效地诱导Fas。

随后的温育执行1、3和5天，并添加SCF+TPO或SCF+TPO+IL-3作为支持造血细胞在培养物中存活的生长因子。一系列的试验性研究指示与TNF-α作为凋亡触发剂预温育的细胞缺乏显著的效应。此外，由于TNF-α在诱导Fas表达中和在感知凋亡中的假定功能，将细胞与此试剂温育3天，并在温育的最后24小时期间添加FasL。细胞的绝对数量下降，但是lin^-BMC的分数很大程度上得到保留(图7E)。以Fas和TNF受体的表达为参照对凋亡进行分析(图7F)。培养基中的温育显示TNF-R2⁺细胞与Fas⁺和TNF-R1⁺细胞相比具有更高的凋亡率(p＜0.001)。培养基中存在TNF-α对Fas⁺和TNF-R2⁺细胞有较小影响，并降低了TNF-R1⁺细胞的凋亡(p＜0.001)，表明此受体参与细胞的刺激而不是抑制。在温育的第三天中暴露于FasL显著增加了凋亡率(p＜0.001)，和与TNF-α的预温育无关。这些体外数据表明Fas介导的凋亡是表达TNF超家族受体的细胞中凋亡的共同效应途径并确定TNF-α在这些细胞的感知中具有相对适度的作用。

在存在SFC+TPO的情况下温育对细胞数量(图7G)和凋亡细胞分数(图7H)有较小影响。但是在存在SCF+TPO+IL-3的情况下，存活细胞的数量显著增加，特别是在lin^-子集中(图7I)。这伴随着受体阳性细胞对凋亡的敏感性的降低(图7J)。进一步的分析显示，表达假定的干细胞标志物Sca-1和c-kit的细胞主要位于细胞的存活组分内。同样地，在于支持培养基中进行的对照温育中，10±2％的LTR细胞和22±4％的STR细胞为膜联蛋白-V染色阳性(图6C)。添加FasL蛋白造成40％新鲜淘洗的STR子集凋亡，而LTR子集显示较小的凋亡增加。显著地，在此温育时间段期间，LTR和STR两种细胞分别上调其Fas表达至18±5％和42±6％。与TNF温育5天并在最后一天加入FasL后，存活lin^-BMC的数量增加2.3倍，指示凋亡性死亡占lin⁺BMC的显著分数(图7K)。这些数据展现了从初始的骨髓接种体富集未分化的细胞组分的不同方法。

实施例15

Fas和TNF受体介导凋亡和非凋亡信号

在生理条件下，具有造血重建潜能的干细胞和祖细胞构成大量祖细胞(处于不同的分化阶段)内含的非常小的部分。在分化的远端阶段，死亡受体在调节扩增克隆的大小中具有重要作用。这些受体已被确定为所有造血谱系终末分化的负调节子(7-14)。移植后早期，在供体细胞对凋亡缺乏敏感性的情况下，死亡受体的急剧上调对这些受体的作用提出了质疑。因此，本发明人评估了在最小刺激条件下，逐级增加FasL和TNF-α对wBMC和lin^-BMC产克隆活性的调节作用。wBMC的活性随着FasL浓度的增加而日益受到阻抑(图8A)，而在存在TNF-α时则很大程度上不受影响(图8B)。这些数据与天然BMC中缺乏TNF-α触发的凋亡信号相一致(参见实施例13)。显著相反，lin^-BMC的产克隆活性逐渐增加，～500ng/ml FasL和TNF-α浓度时分别增加45％和70％。当向培养基添加可溶性FasL寡聚体和通过生物素化将蛋白吸附至细胞表面时均观察到了此行为(图8A)。FasL在～1μg/ml的阈值浓度时变得对lin^-BMC有毒。与先前报告的活化Fas抗体(Jo2)在鼠(17)和人HPSC(5，18)中对集落形成无显著效应相一致，5ng/ml浓度的可溶性superFasL未能削弱lin^-BMC的克隆发生。综合考虑，这些数据表明Fas受体三聚化是生长信号转导必需的。

wBMC和lin^-BMC的相对产克隆活性表明在凋亡敏感的和不敏感的细胞子集中通过Fas受体的伴随性营养和凋亡信号传递。在wBMC培养物中，死亡细胞可抑制祖细胞的产克隆活性。为了检验此可能性，将凋亡wBMC和500ng/ml FasL蛋白一起添加至lin^-BMC培养物。当存活lin^-BMC与死亡BMC的比值为1∶1时，FasL诱导的增强的克隆发生被消除，表明大量细胞的活力影响集落形成。

在凋亡级联的近端和远端阶段执行了进一步的评估。为了确定FasL通过与Fas受体结合影响细胞，对收获自Fas-缺陷(lpr)小鼠的细胞执行了产克隆测定。lpr突变分别使wBMC和lin^-BMC对FasL蛋白的凋亡和营养效应不敏感(图8C)，指示祖细胞活性的调节是由Fas受体连接特异性介导的。将所述细胞与封闭性TNF-R1抗体温育后观察到了相似的下降的克隆发生，表明此受体与TNF-R2相比优先参与营养信号转导。

在凋亡级联的远端，抑制胱天蛋白酶3和8以最大限度降低培养物中的凋亡性死亡。抑制胱天蛋白酶3(DEVD)和8(IETD)在所有FasL浓度下均降低了凋亡并提高了wBMC的产克隆活性(图8D)。抑制这些胱天蛋白酶后，在lin^-BMC的产克隆测定中观察到了一致的结果(图8E)。在不存在FasL的情况下添加胱天蛋白酶抑制剂不显著影响克隆发生。值得注意的是，抑制胱天蛋白酶活性没有消除500ng/ml FasL对lin^-BMC的刺激效应，指示Fas介导的营养(tropism)是由胱天蛋白酶-8活化的近端因子介导的。

对淘洗的细胞群体的分析显示LTR细胞的无产克隆活性(一份培养物中有5个集落和四份空白培养物)与FasL的存在无关，如对这些细胞的预期和先前报告[34，35]。显著不同的是，STR细胞的产克隆活性在存在超致死浓度的500ng/ml FasL蛋白时增加26±6％(p＜0.005)(图8F)。1.5μg/g浓度的FasL完全消除这些祖细胞的产克隆活性。为了评估Fas受体介导的营养和凋亡信号之间的平衡，共同效应子胱天蛋白酶-3(DEVD)的抑制使FasL的促产克隆效应进一步增强至75±5％(p＜0.001，与无胱天蛋白酶-3抑制的天然和培养物相比)。综合考虑，这些数据指示早期造血重建细胞(STR)的子集通过Fas受体接收双重凋亡和营养信号。

实施例16

祖细胞在应激造血过程中对凋亡的抗性

结果

天然或移植的骨髓来源的HSPC对凋亡信号的不敏感性提出了死亡受体介导的机制是否在应激造血条件下起作用的问题。5-氟尿嘧啶(5FU)对快速循环的祖细胞有毒，并且它们的杀伤诱导对骨髓中原始造血祖细胞的同步刺激。为了活化和同步造血祖细胞，向小鼠注射150μg/g 5-氟尿嘧啶(5FU)，1、3和5天后收获它们的骨髓细胞。5天后，Sca-1表达的发生率增加至29±2％(p＜0.001，对比天然BMC中为2±1％)，c-kit表达的发生率增加至12±2％(p＜0.05，对比天然BMC中为8±1.5％)，并且Sca-1⁺c-kit⁺的分数增加至5±0.9％(p＜0.001，对比天然BMC中为0.4±0.1)(图9A)。这些变化伴有Fas受体和其配体的上调(p＜0.001)(图9B)，包括在稳态条件下以低水平表达这些分子的lin^-BMC的分数(图9C)。对TNF和TRAIL受体观察到了较小程度的相似变化。在间接体内温育条件下，用FasL蛋白攻击此时收获的细胞另外的18小时的时间段。lin^-和lin⁺子集在与FasL蛋白温育后均显示与收获自天然小鼠的BMC相比显著更高的活力(图9D)。为了展示Fas表达和凋亡之间的关系，间接体内温育注射5FU后1、3和5天收获的细胞后，通过流式细胞术定量所述受体。将细胞死亡分数表示为Fas表达的函数，显示几个特征(图9E-F)。第一，Fas的表达在施用5FU后随时间而增加。第二，与在培养基中温育的细胞(图9E)相比，细胞间接体内暴露于FasL(图9F)进一步增强了所述受体的表达。第三，大多数Fas⁺BMC在5FU处理后对FasL诱导的凋亡不敏感。综合考虑，这些数据指示形成中的祖细胞对FasL诱导的Fas受体的上调更加易感，并且不伴随对凋亡的感知。这些数据指示死亡受体，特别是Fas在应激条件下在造血***的生理功能中发挥营养作用。

讨论

与大多数体细胞不同，干细胞经常需要在受伤和炎症的极端条件下执行分化任务。对成体干细胞参与组织修复、特别是分化和采用受损组织的功能特性的多能性要求，提出了对这些细胞在不利环境下存活和起作用的能力的疑问。公知的程序是造血干和祖细胞(HSPC)移植，其通常在造成对骨髓的严重损伤的侵袭性化疗和辐射之后进行。内源造血细胞很少幸免于清髓性辐射，并且基质受到严重损伤。消融性损伤的后果是，供体HSPC找到其进入宿主骨髓的途径，其接种并移入至宿主骨髓，以重建免疫造血***。在此过程中，在显著分数的供体细胞中发现死亡受体的急剧上调。先前的工作认为死亡受体在造血细胞功能中起有害作用，这是从受体在免疫造血***分化的远端阶段的抑制性功能采用的概念。相反地，本发明人发现了死亡受体在干细胞功能中的积极作用。造血重建细胞通过何种机制在此毁坏环境中繁荣尤其值得关注，因为其可用于提高移入的效率。

总之，本发明人显示：

1.在稳态条件下，死亡受体以低水平表达于骨髓细胞。所述受体在刺激造血包括移植的条件下急剧上调。

2.干和祖细胞的最原始子集表达所有死亡受体。

3.在具有造血重建潜能的祖细胞中，死亡受体不介导凋亡信号。

4.分化的远端阶段和在体细胞中介导死亡的相同受体在大部分原始的造血干和祖细胞中介导营养信号。

5.使用死亡信号消除非干细胞不影响祖细胞的短期造血重建潜能和干细胞的长期重建潜能。

6.死亡受体转录水平的表达受多个内在和外部因子的诱导。这些包括因子响应受伤、与基质相互作用、循环和分化的释放。

7.Fas-配体的组成型和增强型表达通过消除同种异体免疫应答和非免疫机制增加造血细胞移入。

8.死亡受体在间接体内的诱导表达和活化通过凋亡信号有效清除非干细胞。

综合考虑，这些数据指向TNF超家族死亡受体在干和祖细胞中的不同作用模式。在生理条件下，诱导HSPC活化的信号也诱导死亡受体的表达。这可通过5FU同步的祖细胞活性的活化例证，其伴有Fas受体的逐渐表达。但是活化的祖细胞群在很大程度上对Fas介导的凋亡不敏感：Fas⁺细胞的分数增加3-4倍与5天后所述细胞的绝大部分对FasL诱导的凋亡的抗性有关。这些数据表明Fas在施用5FU后早期被上调(可能是由于骨髓内细胞死亡引起的细胞因子环境被扭曲)，并发挥作用以促进造血祖细胞的生长。Fas受体仅在分化特性的远端阶段继续其作为形成中祖细胞群的负调节子的功能(7-14)。

在移植背景中，认为下列情节参与造血细胞移入的早期阶段的Fas/FasL信号传递途径。供体细胞归巢至骨髓后，炎性环境和与基质的相互作用诱导受体和配体的表达。Fas的表达使供体细胞转化为响应调节其活性的环境因子，对造血细胞移入产生支持性而不是有害影响。通过凋亡消除更加分化的祖细胞增加了更原始的干和祖细胞移入的机会。这可被视为接种和早期移入过程中HSPC富集的机制，继续了更早的富集过程归结于HSPC与定向祖细胞相比更好的归巢(1)。对Fas介导的凋亡性死亡的抗性发展为那些成功移入的供体细胞的功能特性。此特性赋予原始祖细胞使用TNF超家族的配体反击免疫反应的能力(32-34)。

TNF超家族死亡受体的表达可能是免疫造血细胞在遭遇不利环境或暴露于应激条件后的生理响应。被赋予这些保护性因子的干和祖细胞保证此发育***中的重要元件的保持。在凋亡抗性祖细胞中，这些受体与帮助募集原始祖细胞进行分化和繁殖的营养信号传递有关。此机制不仅保护了此发育***的最重要元件干细胞，而且参与它们在损伤的极端条件下的活化。先前的研究已证明高水平的抗凋亡因子(包括FLIP、Bc1-2、存活蛋白和独特表达胱天蛋白酶-8L)保护造血祖细胞免受凋亡(5，6)。本发明数据指示，营养信号传递产生自胱天蛋白酶-8活化近端的死亡受体相关的凋亡信号传递的主要途径。

应理解，出于清楚目的而在分开的实施方案环境中描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。反过来，出于简明目的而在单个实施方案环境中描述的本发明的不同特征也可单独地或以任何合适的亚组合提供。

虽然已结合其具体实施方案对本发明进行了描述，但是显然地许多替代、修饰和变化对本领域技术人员是明显的。因此，本发明意在包括落入所附权利要求精神和广义范围内的所有此类替代、修饰和变化。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以及GenBank登录号通过引用在这里整合结合入本说明书，达到如同明确和单独地指出每个具体的出版物、专利和专利申请以及GenBank登录号通过引用结合入本文的程度。此外，本申请中引用或确定的任何参考文献均不应解释为承认所述参考文献可作为本发明的先前技术。

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30.Josefsen D，Myklebust JH，Lynch DH，Stokke T，Blomhoff HK，Smeland EB.Fas ligand promotes cell survival of immature human bcnemarrow CD34+CD38- hematopoietic progenitor cells by suppressing apoptosis(Fas配体通过阻抑凋亡促进未成熟人骨髓CD34+CD38-造血祖细胞的细胞存活).Exp Hematol.1999，27：1451-1459.

31.Saheki K，Fujimori Y，Takemoto Y，Kakishita E.Increased expressionof Fas(APO-1，CD95)on CD34+ haematopoietic progenitor cells afterallogeneic bone marrow transplantation(异基因骨髓移植后CD34+造血祖细胞上Fas(APO-1，CD95)表达的增加).Br J Haematol.2000；109：447-452.

32.Gur H，Krauthgamer R，Bachar-Lustig E，Katchman H，Arbel-Goren R，Berrebi A，Klein T，Nagler A，Tabilio A，Martelli MF，Reisner Y.Immuneregulatory activity of CD34+ progenitor cells：evidenee for a deletion-basedmechanism mediated by TNF-alpha(CD34+祖细胞的免疫调节活性：TNF-α介导的基于清除的机制的证据).Blood.2005；105：2585-2593.

33.Whartenby KA，Straley EE，Kim H，Racke F，Tanavde V，Gorski KS，Cheng L，Pardoll DM，Civin CI.Transduction of donor hematopoietic stem-progenitor cells with Fas ligand enhanced short-term engraftment in a murinemodel of allogeneic bone marrow transplantation(使用Fas配体转导供体造血干-祖细胞在异基因骨髓移植的鼠模型中增强了短期移入).Blood.2002；100：3147-3154.

34.Pearl-Yafe M，Yolcu ES，Stein J，Kaplan O，Yaniv I，Shirwan H，Askenasy N.Fas-ligand enhances hematopoietic cell engraftment throughabrogation of alloimmune responses and non-immunogenic interactions(Fas-配体通过消除同种异体免疫应答和非免疫相互作用增强了造血细胞移入).Stem Cells.2007；发行中

35.Bohana-Kashtan O，Civin CI.Fas ligand as a tool forimmunosuppression and generation of immune tolerance(Fas配体用作免疫阻抑和产生免疫耐受性的工具).Stem Cells.2004；22：908-924.

36.Pearl-Yafe M，Yolcu ES，Yaniv I，Stein J，Shirwan H，Askenasy N.Thedual role of Fas-ligand as an injury effector and defense strategy in diabetesand islet transplantation(Fas-配体在糖尿病和胰岛移植中作为损伤效应剂和防御策略的双重作用).Bioessays.2006；28：211-222.

Claims (52)

1.一种从异质细胞群体中选择干细胞的方法，所述方法包括使所述细胞群体与凋亡诱导剂在对非干细胞而言是凋亡的而对干细胞而言是非凋亡的条件下接触，从而从所述异质细胞群体中选择干细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞选自由脐带血干细胞、动员后外周血干细胞、骨髓干细胞和神经干细胞组成的组。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述干细胞是骨髓干细胞。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述骨髓干细胞是造血干细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述接触之前修饰所述干细胞，以生成修饰的干细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述接触之前纯化所述干细胞，以生成纯化的干细胞。

7.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述接触之前扩增所述干细胞，以生成扩增的干细胞。

8.如权利要求3所述的方法，其中所述骨髓干细胞是间充质干细胞。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是成体干细胞。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述凋亡诱导剂选自由TNF-α、FasL、Trail和Tweak组成的组。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述凋亡诱导剂是FasL。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述FasL偶合至表面。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述FasL是不可切割的。

15.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述接触之前上调所述异质细胞群体上凋亡受体的表达。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述凋亡受体选自由Fas受体、TNF-α受体、Tweak受体和Trail受体组成的受体组。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述上调所述凋亡受体的表达是通过使所述异质细胞群体与干扰素γ或TNF-α接触实现的。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述异质细胞群体不包含免疫活化的T淋巴细胞。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述异质细胞群体包含谱系阳性细胞。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述谱系阳性细胞选自由粒细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、成红血细胞、抗原呈递细胞、髓样细胞、淋巴样细胞和巨核细胞组成的组。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述异质细胞群体包含凋亡敏感的恶性细胞。

22.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述接触之后分离所述干细胞。

23.一种将选择的干细胞移植入宿主的方法，所述方法包括：

(a)使异质细胞群体的干细胞与凋亡诱导剂在对非干细胞而言是凋亡的而对干细胞而言是非凋亡的条件下接触，从而选择干细胞；和

(b)将所述选择的干细胞移植入宿主，从而移植所述选择的干细胞。

24.如权利要求23所述的方法，其进一步包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前分离所述选择的干细胞。

25.如权利要求23所述的方法，其中所述干细胞选自由脐带血干细胞、动员后外周血干细胞、骨髓干细胞和神经干细胞组成的组。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述干细胞是骨髓干细胞。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述骨髓干细胞是造血干细胞。

28.如权利要求23所述的方法，其进一步包括在所述接触之前修饰所述干细胞，以生成修饰的干细胞。

29.如权利要求23所述的方法，其进一步包括在所述接触之前纯化所述干细胞，以生成纯化的干细胞。

30.如权利要求23所述的方法，其进一步包括在所述接触之前或所述接触期间扩增所述干细胞，以生成扩增的干细胞。

31.如权利要求26所述的方法，其中所述骨髓干细胞是间充质干细胞。

32.如权利要求23所述的方法，其中所述干细胞是成体干细胞。

33.如权利要求23所述的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞。

34.如权利要求23所述的方法，其中所述凋亡诱导剂选自由TNF-α、FasL、Trail和Tweak组成的组。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述凋亡诱导剂是FasL。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述FasL偶合至表面。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述FasL是不可切割的。

38.如权利要求23所述的方法，其进一步包括在所述接触之前上调所述异质细胞群体上凋亡受体的表达。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述凋亡受体选自由Fas受体、TNF-α受体、Tweak受体和Trail受体组成的组。

40.如权利要求38所述的方法，其中所述上调所述凋亡受体的表达是通过使所述异质细胞群体与干扰素γ或TNF-α接触实现的。

41.如权利要求23所述的方法，其中所述异质细胞群体不包含免疫活化的T淋巴细胞。

42.如权利要求23所述的方法，其中所述异质细胞群体包含谱系阳性细胞。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述谱系阳性细胞选自由粒细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、成红血细胞、抗原呈递细胞、髓样细胞、淋巴样细胞、类红细胞和巨核细胞组成的组。

44.如权利要求23所述的方法，其中所述异质细胞群体包含凋亡敏感的恶性细胞。

45.如权利要求23所述的方法，其中所述干细胞是宿主自体的。

46.如权利要求23所述的方法，其中所述干细胞是宿主同基因的。

47.如权利要求23所述的方法，其中所述干细胞是宿主异基因的。

48.如权利要求23所述的方法，其中所述干细胞是宿主异种的。

49.一种分化干细胞的方法，所述方法包括：

(a)使异质细胞群体的干细胞与凋亡诱导剂在对非干细胞而言是凋亡的而对干细胞而言是非凋亡的条件下接触，从而选择干细胞；和

(b)诱导所述选择的干细胞的分化，从而分化干细胞。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述诱导分化是通过在所述干细胞中表达基因产物实现的。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述基因产物是多肽。

52.如权利要求50所述的方法，其中所述基因产物是多核苷酸。

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