CN102399871A - 耐热等温核酸检测试剂及其试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于锁核酸和耐热T7RNA聚合酶的核酸等温检测技术，通过使用含有锁核酸的分子信标，出人意料地克服了耐热T7RNA聚合酶在高温反应条件下特异性差的缺陷，大大降低了反应的非特异信号，提高了反应温度，缩短了反应时间，减少了实验步骤，有效的避免了样品前处理后需开盖加酶所带来的模板污染，并在此基础上实现了病毒RNA的一步法等温检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种等温核酸检测试剂，及含有该试剂的检测试剂盒。本发明同时还涉及一种等温核酸检测方法。
背景技术
现有体外诊断方法大致可以分为病原培养和分离、免疫学检测技术和核酸检测技术等，一直以来，病原微生物的体外培养是病原体诊断的“金标准”，但是据微生物学家的估计，采用目前的培养技术，仅有约1%的病原微生物可以培养。为满足体外诊断的巨大需求，近一个世纪以来已建立了众多的快速检测技术。
现有的快速检测技术主要有两类：第一类为免疫学方法，包括酶联免疫吸附法、免疫荧光法、同位素标记抗体法、乳胶凝集法、免疫传感器法、免疫扩散法及免疫色谱法等；第二类是以核酸为基础的分子生物学方法，主要有核酸探针法和聚合酶链反应法（Polymerase Chain Reaction，PCR）。其中的PCR方法是核酸扩增技术的典型代表，该技术是由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullin等人于1985年发明的，在过去的二十年里，PCR技术作为分子生物学的核心得到了迅猛的发展和应用，特别是在疾病的临床诊断中，PCR技术以其快速、灵敏和特异的优势，不仅日益取代了传统的诊断方法，而且使以往无法完成的诊断成为了可能。
尽管PCR技术长期以来占据着核酸扩增垄断技术的地位，新近研发的一系列等温核酸扩增检测技术正逐渐成为PCR技术的替代技术而被广泛应用。与PCR技术相比，核酸等温扩增技术的特点是可在特定温度条件下实现核酸的扩增。由于扩增反应的全过程均在同一温度下进行，使它们对仪器的要求大大简化，可通过加热模块、水浴槽等简单的，甚至是非专业的设备完成反应。目前常用的等温技术有以下几类：
依赖核酸序列扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）
自主序列复制技术（Self-sustained Sequence Replication ，3SR）
转录介导扩增技术（Transcription mediated amplification，TMA）
单引物等温扩增技术（Single Primer Isothermal Amplification，SPIA）
滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）
环介导的等温扩增技术 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）
链替代扩增技术（Strand displacement amplification，SDA）
这些核酸扩增技术（PCR技术、等温扩增技术等）的扩增产物为DNA或RNA，与之相对应的扩增产物检测方法主要有以下几种：
电泳分析：常规凝胶电泳后用EB或SYBR GreenⅠ染色，在1%-1.5%琼脂糖凝胶中可以轻易识别。目前该方法已很少使用；
杂交技术：产物通过与特异性探针标记的序列杂交，如32P标记的寡核苷酸序列与扩增产物进行Northern 杂交以检测扩增产物；
酶联凝胶（enzyme-linked gel assay，ELGA）技术：用非放射性的辣根过氧化物酶（HRP）标记的探针检测扩增产物。未杂交的探针通过在凝胶电泳中得以分离，然后将凝胶置于有HRP底物的溶液中孵育，则可目测反应结果；
电化学发光（electro-chemiluminescence，ECL）技术：5’端标记有生物素的捕获探针将扩增产物固定在链霉亲和素结合的磁珠上，下游引物的5’末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列。扩增产物与ECL探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光（ECL）反应。已杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的扩增产物总量成比例对应，由此可以对扩增产物进行检测和定量；
荧光检测技术即分子信标技术：分子信标是根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）现象设计的。分子信标为一茎环结构的寡核苷酸探针，其环状区核苷酸序列长度一般为15～30个碱基，能与目标序列互补，靠近两端的部分序列构成分子信标的茎干区，大约有6-7个碱基对，两端分别标记荧光基团（fluorophore）和淬灭基团（quencher）。没有目标序列存在时，分子信标保持茎环结构，荧光基团与淬灭基团靠近，此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被猝灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当目标序列存在时，分子信标与序列完全互补的靶序列结合形成双链杂交体时，信标茎干互补区被拉开，荧光基团和猝灭基团距离增大，荧光产生。在核酸扩增体系中应用分子信标可随着扩增的进行，均一地产生荧光信号，使分子信标的环状序列不断与扩增子杂交产生荧光信号进行实时检测。分子信标中常用4-（4’- 二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团，德克萨斯红（TexasRed）、荧光素（Fluoresein）等作为荧光基团。
其中基于T7 RNA聚合酶、AMV逆转录酶及RNA酶H的NASBA等温扩增技术因其灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时测定而得到了一定的运用。但是目前的NASBA等温扩增技术存在一些技术上的缺陷，主要表现为如下几方面：
1、反应体系采用的T7 RNA聚合酶不耐热，体系温度高于41℃，酶活性迅速下降；
2、反应分为样品处理和扩增两部分进行，在65℃ 5分钟，41℃ 5分钟样品处理后，需开盖加酶，操作繁琐，存在模板污染的风险；
3、反应时间偏长，整个检测过程需要2小时左右。
近年来研究人员在传统T7 RNA酶的基础上通过点突变开发了耐高温T7 RNA聚合酶，但是目前的这种耐高温T7 RNA聚合酶存在很严重的非特异性转录，导致反应体系本底信号过高，不能有效区分阴阳性扩增结果，限制了其在等温检测中的应用。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种耐热等温核酸检测试剂。
本发明的另一个目的在于提供使用上述耐热等温核酸检测试剂的检测试剂盒。
本发明的再一个目的在于提供一种耐热等温核酸检测方法。
本发明的再一个目的在于提供一种手足口病病毒EV71的耐热等温检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
耐热等温核酸检测试剂，包括引物、RNA聚合酶、NTP和分子信标，其特征在于：RNA聚合酶为耐热型T7 RNA聚合酶，分子信标中引入有锁核酸，分子信标的Tm值较所述T7 RNA聚合酶的工作温度至少高4℃。
所述分子信标中至少含有1个锁核酸，优选至少含有4个锁核酸。
耐热等温核酸检测试剂盒，含有上述的检测试剂。
一种等温核酸检测方法，包括将待测样品加入上述的耐热等温核酸检测试剂中，之后在40～50℃下等温扩增，实时检测反应信号或检测反应终点信号，确定样品中是否存在待测核酸。
优选的，等温扩增的反应温度为46～49℃。
耐热等温核酸检测试剂盒，含有上述的检测试剂。
手足口病病毒EV71等温检测试剂，每份反应体系中含有Tris (pH 8.5) 40mM、KCl 50mM、MgCl2 12mM、DTT 10mM、dNTP 1mM、rNTP 2mM、DMSO 3μl、山梨糖醇 375mM、分子信标 100nM、耐热T7 RNA聚合酶 32U 、AVM聚合酶 6.4U，余量为水，其中，所述分子信标的序列为 EV71-VP1b: 5’ - GCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGC -3’（SEQ ID NO：1），所述分子信标中的核酸，至少有1个是锁核酸碱基，分子信标的两端分别连接有检测信号基团和淬灭基团。
优选的，上述试剂中还添加有RNA酶抑制剂。
本发明的有益效果是：
1、通过引入耐高温T7 RNA聚合酶有效提高了反应温度：从传统的41℃提高到46℃，显著提高了体系的反应速度，在达到与传统等温检测技术相同检测灵敏度的前提下，将反应时间缩短至45分钟。
2、通过引入锁核酸分子信标有效的降低了耐高温T7 RNA聚合酶的非特异性转录：锁核酸分子信标含有部分或全部锁核酸碱基，具有很强的稳定性和抗核酸酶作用的特性，特别是在反应体系中存在单链结合蛋白或T7 RNA聚合酶的情况下，能显著降低体系的非特异性荧光信号；锁核酸分子信标具有很强的热稳定性，在无目标片段存在时，其背景信号要比普通分子信标低很多，能显著提高反应体系信噪比，提高体系检测灵敏度；在分子信标中引入锁核酸碱基能显著提高其Tm值，与普通分子信标相比，在相同Tm值情况下，锁核酸分子信标具有更短的核酸序列，大大降低了设计的难度。
3、建立了基于锁核酸分子信标、耐热T7 RNA聚合酶、AMV逆转录酶及RNA酶H的一步法等温检测技术，简化了操作步骤，缩短了检测时间，有效的避免了样品前处理后需开盖加酶所带来的模板污染。
附图说明
图1不同分子信标的耐高温T7 RNA聚合酶非特异性转录；
图2含不同锁核酸碱基分子信标直接46℃反应90分钟的终点检测结果；
图3含不同锁核酸碱基分子信标65℃ 5分钟，46℃ 5分钟预处理，46℃反应45分钟的终点检测结果；
图4含不同锁核酸碱基分子信标无预处理，直接46℃反应45分钟的终点检测结果；
图5基于耐高温T7 RNA聚合酶的EV71病毒等温扩增实时检测结果；
图6基于耐高温T7 RNA聚合酶的EV71病毒等温扩增终点检测结果。
具体实施方式
1、通过引入耐高温T7 RNA聚合酶，选择合适的等温检测体系反应温度。
所述的合适的等温检测体系反应温度，具体为：根据通过在不同反应温度下（40℃～50℃）检测阳性扩增信号，选择阳性扩增信号最强的反应温度，以获得最佳的信噪比。
2、根据待检目标的序列特征，设计相应检测引物序列。
所述的待检目标的序列特征，具体为：待检序列的GC含量、序列保守性及序列二级结构等特征。
所述的引物序列特征，具体为：针对目标序列设计的两条核酸序列，具有物种特异性及高的扩增效率，其中一条含T7 RNA聚合酶启动序列。
3、根据待检目标的序列特征，设计相应分子信标的环状区序列和需引入的锁核酸碱基数量。
所述的待检目标的序列特征，具体为：待检序列的GC含量、序列保守性及序列二级结构等特征；
所述的设计相应分子信标的环状区序列，具体为：选择待检序列中GC含量在20％和80％之间、序列保守性高同时具有最小二级结构的片段作为分子信标的环状区序列，序列长度在10～45碱基之间；
锁核酸是一种新型的寡核酸衍生物，其中β-D-呋喃核糖的2'-O，4'-C位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥，形成了刚性的缩合结构。该特殊结构使锁核酸具有许多独特的性能，例如与DNA、RNA具有很强的亲和力，与DNA、RNA互补杂交形成的双链具有很强的热稳定性，具有抗核酸酶作用的稳定性等。
所述的需引入的锁核酸碱基数量，具体为：根据待检序列中GC含量高低和所需环状区序列熔接温度（Tm值）确定需引入的锁核酸碱基数量，环状区序列Tm值应比体系反应温度高5℃以上。每增加一个胞嘧啶（C）锁核酸碱基环状区序列Tm值平均上升4.44±1.46℃、每增加一个胸腺嘧啶（T）锁核酸碱基环状区序列Tm值平均上升3.21±1.41℃、每增加一个鸟嘌呤（G）锁核酸碱基环状区序列Tm值平均上升2.83±1.75℃、每增加一个腺嘌呤（A）锁核酸碱基环状区序列Tm值平均上升2.11±1.30℃。环状区序列包含的锁核酸碱基数可以从零至全部采用锁核酸碱基。使用的锁核酸越多，分子信标越稳定，更有利于等温扩增反应的进行。
4、设计合适的分子信标茎干区，并选择相应的标记基团。
所述的设计合适的分子信标茎干区，具体为：所设计的分子信标茎干区序列为互相完全配对的两段核酸序列，茎干区序列可以完全与目标区域无关，也可将茎干区部分序列与环状区序列一起作为目标杂交区域，其Tm值应该比体系反应温度高5℃以上，且不与环状区序列形成复杂的二级结构，分子信标茎干区序列长度为3～15个碱基对，所包含的锁核酸碱基数可以从零至全部采用锁核酸碱基。
所述的选择相应的标记基团，具体为：分子信标的信号产生机制可以分为荧光共振能量转移、波长红移、金属淬灭、接触淬灭、酶促反应及电化学反应等。每种分子信标可根据需要偶联多个荧光基团或淬灭基团，另外还有生物素、辣根过氧化物酶、地高辛、抗原、半抗原、抗体、量子点、二茂铁及纳米金颗粒等标记的分子信标。本领域的技术人员可以根据具体的检测需要选择合适的标记。
5、选择合适的锁核酸分子信标浓度、引物浓度、二硫苏糖醇（DTT）浓度、K+和Mg2+离子浓度用于等温扩增。
所述的合适的锁核酸分子信标使用浓度，具体为：根据等温扩增体系的需要，通过梯度稀释的锁核酸分子信标（10nM－1000nM），选择合适的锁核酸分子信标浓度，以获得最佳的信噪比。
所述的合适的引物使用浓度，具体为：根据等温扩增体系的需要，通过添加不同浓度的引物（25nM－500nM），以获得最佳的信噪比。
所述的合适的DTT使用浓度，具体为：根据等温扩增体系的需要，通过添加不同浓度的DTT（1mM－10mM），以获得最佳的信噪比。
所述的合适的K+使用浓度，具体为：根据等温扩增体系的需要，通过添加不同浓度的K+（10mM－100mM），以获得最佳的信噪比。
所述的合适的Mg2+使用浓度，具体为：根据等温扩增体系的需要，通过添加不同浓度的Mg2+（5mM－25mM），以获得最佳的信噪比。
在本发明所述的技术方案中：可以通过荧光识别仪、质谱、凝胶电泳、分子夹、序列分析、DNA/RNA传感器 、检验层析试纸条、微阵列***或变色反应等方式检测锁核酸分子信标产生的信号，其检测方式可以是实时检测也可以是终点检测。
本发明说明书中所使用的技术术语解释：
核酸：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的通称。
T7 RNA聚合酶：是一种RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的DNA序列。
熔解温度：指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，不同序列的DNA Tm值不同，DNA中GC含量越高，Tm值越高，成正比关系。
标记：将可检测的信号分子（如荧光、抗原等）与寡核苷酸相偶联的方法。
抗原和半抗原：具备免疫原性的物质，通称为大分子蛋白质或细胞组分，但有些小分子也具备免疫原性，被称为半抗原。
抗体：能与抗原或半抗原特异性结合的蛋白质分子。
量子点：是近几年发展起来的一种半导体荧光纳米颗粒，它们是处于分子与块状固体之间的一种中间状态，具有许多优良的光谱性能。
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：含耐高温的T7 RNA聚合酶检测体系的非特异性扩增结果
选择针对不同微生物的分子序列，分别在含耐热T7 RNA聚合酶的检测体系中进行等温扩增，以检测耐热T7 RNA聚合酶的非特异性扩增结果。所涉及的分子信标及目的基因序列如下：
（1）针对手足口病病毒EV71 UTR序列的分子信标及目的基因序列
1）分子信标序列
EV71-UTRb: 5’ FAM - CGTACGGATGAGTCACCGCATTCCCCACGTACG – DABCYL 3’ （SEQ ID NO：2）（斜体代表发卡序列）
2） 检测目的基因的序列特征：
长度：171碱基
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线形
分子类型：DNA（SEQ ID NO：3）
最初来源：肠道病毒71型
AGAGCTTCGTTCAGCACTTCCCCAGTGTAGATCAGGCTGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGGCGCTCTAATACGGACATGGTGCGAAGAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATT（SEQ ID NO：3）
黑体代表分子信标EV71-UTRb结合部位，斜体表示T7 RNA聚合酶启动子序列。
（2）针对流感病毒NA序列的引物及分子信标及目的基因序列
1）分子信标序列
SF-NAb: 5’ FAM – CGTACGCAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAACGTACG – DABCYL 3’ （SEQ ID NO：4）（斜体代表发卡序列）
2） 检测目的基因的序列特征：
长度：146碱基
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线形
分子类型：DNA
最初来源：流感病毒A型
CAACGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGAAACAATATATTGAGAACACAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGGTTCTTGCTTTACTGTAATGACCGATGGACCAAGTAATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATT （SEQ ID NO：5）
黑体代表分子信标SF-NAb结合部位，斜体表示T7 RNA聚合酶启动子序列。
（3）针对手足口病病毒EV71 VP1序列的分子信标及目的基因序列
1）分子信标序列
EV71-VP1b: 5’ BHQ1 - GCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGC – FAM 3’ （SEQ ID NO：1）（斜体代表发卡序列）
2） 检测目的基因的序列特征：
长度：131碱基
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线形
分子类型：DNA
最初来源：肠道病毒71型
ACACAGGTGAGCAGTCATCGATTGGACACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGATGAGAGCATGATTGAGACTTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATT（SEQ ID NO：6）
黑体代表分子信标EV71-VP1b结合部位，斜体表示T7 RNA聚合酶启动子序列。
（4）针对金黄色葡萄球菌16S RNA序列的分子信标及目的基因序列
1）分子信标序列
SA-16Sb: 5’ FAM - CGTCGAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACG - BHQ1 3’ （SEQ ID NO：7）（斜体代表发卡序列）
2） 检测目的基因的序列特征：
长度：106碱基
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线形
分子类型：DNA
最初来源：金黄色葡萄球菌
TCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATT（SEQ ID NO：8）
黑体代表分子信标SA-16Sb结合部位，斜体表示T7 RNA聚合酶启动子序列。
等温反应条件如下：
46℃反应90min，检测终点荧光信号，然后各加入5U RNase H 37℃反应60分钟，检测终点荧光信号。
实施例1的检测结果如附图1所示。
从附图1的结果可以看出采用耐高温T7 RNA聚合酶后，针对不同分子信标序列均能产生很严重的非特异性扩增信号，且阳性扩增信号与非特异性扩增信号之间的比值小于2，不能有效区分阴阳性检测结果。
实施例2：含不同锁核酸碱基的分子信标在耐高温的T7 RNA聚合酶检测体系中的非特异性扩增结果。
针对EV7病毒VP1序列，设计相应检测引物及分子信标，其中的分子信标分别还有0个、4个、8个锁核酸碱基。这三种分子信标分别在含耐热T7 RNA聚合酶的检测体系中进行等温扩增，以检测耐热T7 RNA聚合酶的非特异性扩增结果。所涉及的分子信标及目的基因序列如下：
1）引物序列
LNA－EV71s：5’-ACACAGGTGAGCAGTCATCG -3’ （SEQ ID NO：9）
LNA－EV71a：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT- 3’ （SEQ ID NO：10）
2）分子信标序列
EV71-VP1b: 5’ BHQ1 - GCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGC – FAM 3’ （SEQ ID NO：1）（斜体代表发卡序列）
LNA-EV71b1: 5’BHQ1 - gcttggAcaggtaAggttccAgcactccAagc - FAM 3’ （SEQ ID NO：11）（大写字母代表锁核酸碱基，斜体代表发卡结构序列）
LNA-EV71b2: 5’BHQ1 -gcttggAcAggtaAggTtccAgcAcTccAagc - FAM 3’ （SEQ ID NO：12）（大写字母代表锁核酸碱基，斜体代表发卡结构序列）
(3) 检测目的基因的序列特征：
长度：104碱基
类型：核酸
链型：单链
拓扑结构：线形
分子类型：RNA
最初来源：肠道病毒71型
ACACAGGTGAGCAGTCATCGACTGGATACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGCCGCTGAAATTGGAGCATCATCGAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGAC（SEQ ID NO：13）
序列中下划线部分的字母代表引物LNA－EV71s和LNA－EV71a的位置，黑体代表分子信标EV71-VP1b或LNA-EV71b1、LNA-EV71b2结合部位。
等温反应条件如下：
46℃反应90分钟，检测终点荧光信号；
或65℃ 5分钟，46℃ 5分钟预处理，加酶后46℃反应45分钟，检测终点荧光信号；
或直接46℃反应45分钟，检测终点荧光信号。
实施例2的检测结果如附图2、3、4所示。
从附图中可看出含锁核酸碱基的分子信标能有效减少耐高温T7 RNA聚合酶的非特异性转录，增加反应的信噪比，并且分子信标所含锁核酸碱基数越多，效果越好。
实施例3：锁核酸分子信标在针对手足口病病毒EV71的含耐高温T7 RNA聚合酶等温检测中的应用
实施例中所述研究对象及检测引物与分子信标如实施例2所述。
依赖耐高温T7 RNA聚合酶的等温检测体系的优化
根据耐高温T7 RNA聚合酶的特性，经过优化，选择等温检测的反应温度为46℃，确定的反应体系如下：
65℃ 5分钟，46℃ 5分钟预处理，加酶后46℃反应45分钟，检测实时扩增信号和终点荧光信号；
或直接46℃反应45分钟，检测实时扩增信号和终点荧光信号。
实施例3的检测结果如附图5、6所示。
从附图的结果看出，使用含锁核酸分子信标的耐高温T7 RNA聚合酶等温检测体系能显著的缩短检测时间，减少实验步骤，避免因开盖加酶带来的模板污染。运用该体系不经过预处理，45分钟等温扩增后能分别达到4 PFU/反应（实时检测）和40 PFU/反应（终点检测）的检测灵敏度。
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
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aattctaata cgactcacta tagggaagtc tcaatcatgc tctcatcact 50
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工引物
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(7)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (14)..(14)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(21)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (29)..(29)
<223> 锁核酸
<400> 11
gcttggacag gtaaggttcc agcactccaa gc 32
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工引物
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(7)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(9)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (14)..(14)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(17)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(21)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (26)..(26)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (29)..(29)
<223> 锁核酸
<400> 12
gcttggacag gtaaggttcc agcactccaa gc 32
<210> 13
<211> 104
<212> DNA
<213> 肠道病毒71型
<400> 13
acacaggtga gcagtcatcg actggataca ggtaaggttc cagcactcca agccgctgaa 60
attggagcat catcgaatgc tagtgacgag agcatgattg agac 104
Claims (8)
1.耐热等温核酸检测试剂，包括引物、RNA聚合酶、NTP和分子信标，其特征在于：RNA聚合酶为耐热型T7 RNA聚合酶，分子信标中引入有锁核酸碱基，分子信标的Tm值较所述T7 RNA聚合酶的工作温度至少高4℃。
2.根据权利要求1所述的耐热等温核酸检测试剂，其特征在于：所述分子信标中至少含有1个锁核酸碱基。
3.根据权利要求2所述的耐热等温核酸检测试剂，其特征在于：所述分子信标中至少含有4个锁核酸碱基。
4.一种等温核酸检测方法，包括将待测样品加入权利要求1或2任意一项所述的耐热等温核酸检测试剂中，之后在40～50℃下等温扩增，实时检测反应信号或检测反应终点信号，确定样品中是否存在待测核酸。
5.根据权利要求4所述的一种等温核酸检测方法，其特征在于：等温扩增的反应温度为46～49℃。
6.手足口病病毒EV71等温检测试剂，每份反应体系中含有Tris (pH 8.5) 40mM、KCl 50mM、MgCl2 12mM、DTT 10mM、dNTP 1mM、rNTP 2mM、DMSO 3μl、山梨糖醇 375mM、分子信标 100nM、耐热T7 RNA聚合酶 32U 、AVM聚合酶 6.4U，余量为水，其中，所述分子信标的序列为 EV71-VP1b: 5’ - GCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGC -3’（SEQ ID NO：1），所述分子信标中的核酸，至少有1个是锁核酸碱基，分子信标的两端分别连接有检测信号基团和淬灭基团。
7.根据权利要求6所述的手足口病病毒EV71等温检测试剂，其特征在于：所述试剂中还添加有RNA酶抑制剂。
8.耐热等温核酸检测试剂盒，含有权利要求1或2任意一项所述的检测试剂。
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