CN101495142A - 延长EGF或TGF-α水平升高的癌症患者的存活 - Google Patents

Abstract

本申请描述了通过用HER二聚化抑制剂(诸如Pertuzumab)治疗癌症患者来延长该患者的存活，其中该患者产生升高水平的EGF或TGF－α。

Description

延长EGF或TGF-α水平升高的癌症患者的存活

发明领域

本发明涉及通过用HER二聚化抑制剂(诸如Pertuzumab)治疗癌症患者来延长该患者的存活，其中所述患者产生升高水平的EGF或TGF-α。

发明背景

HER受体及针对它的抗体

HER受体酪氨酸激酶家族是细胞生长、分化或存活的重要介质。该受体家族包括四个截然不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR、ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2或p185^neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。

人们认为由erbB1基因编码的EGFR与人恶性肿瘤具有因果关系。具体而言，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤中观察到EGFR表达升高。EGFR受体表达升高常常与同一肿瘤细胞的EGFR配体即转化生长因子α(TGF-α)的产量升高有关，通过自分泌刺激途径导致受体活化。参见Baselga和Mendelsohn，Pharmac.Ther.64：127-154(1994)。针对EGFR或其配体TGF-α和EGF的单克隆抗体已经在此类恶性肿瘤的治疗中作为治疗剂进行了评估。参见例如Baselga和Mendelsohn，见上文；Masui等，CancerResearch 44：1002-1007(1984)；Wu等，J.Clin.Invest.95：1897-1905(1995)。

HER家族的第二个成员p185^neu最初鉴定为来自化学处理大鼠的成神经细胞瘤的转化基因的产物。活化形式的neu原癌基因源自所编码蛋白质跨膜区中的点突变(缬氨酸变成谷氨酸)。在乳腺癌和卵巢癌中观察到neu的人同系物的扩增，而且这与不良预后有关(Slamon等，Science 235：177-182(1987)；Slamon等，Science 244：707-712(1989)；美国专利第4,968,603号)。迄今为止，对于人肿瘤尚无与neu原癌基因中类似的点突变的报道。在其它癌中也已观察到HER2的过表达(频繁但不均一，原因在于基因扩增)，包括胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰和膀胱的癌。参见King等，Science 229：974(1985)；Yokota等，Lancet 1：765-767(1986)；Fukushige等，Mol.Cell Biol.6：955-958(1986)；Guerin等，Oncogene Res.3：21-31(1988)；Cohen等，Oncogene 4：81-88(1989)；Yonemura等，Cancer Res.51：1034(1991)；Borst等，Gynecol.Oncol.38：364(1990)；Weiner等，Cancer Res.50：421-425(1990)；Kern等，Cancer Res.50：5184(1990)；Park等，Cancer Res.49：6605(1989)；Zhau等，Mol.Carcinog.3：254-257(1990)；Aasland等，Br.J.Cancer 57：358-363(1988)；Williams等，Pathobiology 59：46-52(1991)；McCann等，Cancer 65：88-92(1990)等等。HER2可在***癌中过表达(Gu等，Cancer Lett.99：185-9(1996)；Ross等，Hum.Pathol.28：827-33(1997)；Ross等，Cancer 79：2162-70(1997)；Sadasivan等，J.Urol.150：126-31(1993))。

针对大鼠p185^neu和人HER2蛋白质产物的抗体已有记载。

Drebin及其同事制备了针对大鼠neu基因产物p185neu的抗体。参见例如Drebin等，Cell 41：695-706(1985)；Myers等，Meth.Enzym.198：277-290(1991)；WO 94/22478。Drebin等，Oncogene 2：273-277(1988)报道了与p185^neu的两个不同区域有反应性的抗体混合物对植入裸小鼠的neu转化的NIH-3T3细胞产生协同抗肿瘤效果。还可参见1998年10月20日公告的美国专利第5,824,311号。

Hudziak等，Mol.Cell.Biol.9(3)：1165-1172(1989)记载了一组HER2抗体的生成，并使用人乳瘤细胞系SK-BR-3进行了表征。将SK-BR-3细胞暴露于抗体后72小时通过细胞单层的结晶紫染色测定了相对细胞增殖。使用这种测定法，用称作4D5的抗体获得了最大抑制，它抑制细胞增殖达56％。该组其它抗体在这种测定法中以较低程度降低细胞增殖。还发现抗体4D5使过表达HER2的乳瘤细胞系对TNF-α的细胞毒性作用敏感。还可参见1997年10月14日公告的美国专利第5,677,171号。Hudziak等人的文章中所讨论的HER2抗体在以下文献中进行了进一步表征：Fendly等，Cancer Research 50：1550-1558(1990)；Kotts等，In Vitro 26(3)：59A(1990)；Sarup等，Growth Regulation 1：72-82(1991)；Shepard等，J.Clin.Immunol.11(3)：117-127(1991)；Kumar等，Mol.Cell.Biol.11(2)：979-986(1991)；Lewis等，Cancer Immunol.Immunother.37：255-263(1993)；Pietras等，Oncogene 9：1829-1838(1994)；Vitetta等，Cancer Research54：5301-5309(1994)；Sliwkowski等，J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994)；Scott等，J.Biol.Chem.266：14300-5(1991)；D′souza等，Proc.Natl.Acad.Sci.91：7202-7206(1994)；Lewis等，Cancer Research 56：1457-1465(1996)；Schaefer等，Oncogene 15：1385-1394(1997)。

鼠HER2抗体4D5的重组人源化型式(huMAb4D5-8、rhuMAb HER2、Trastuzumab或

美国专利第5,821,337号)在临床上对患有HER2过表达的转移性乳腺癌并已接受广泛现有抗癌疗法的患者起作用(Baselga等，J.Clin.Oncol.14：737-744(1996))。Trastuzumab在1998年9月25日得到了美国食品和药品管理局的销售许可，可用于治疗其肿瘤过表达HER2蛋白质的转移性乳腺癌患者。

以下文献中记载了具有各种特性的其它HER2抗体：Tagliabue等，Iht.J.Cancer 47：933-937(1991)；McKenzie等，Oncogene 4.543-548(1989)；Maier等，Cancer Res.51：5361-5369(1991)；Bacus等，Molecular Carcinogenesis3：350-362(1990)；Stancovski等，PNAS(USA)88：8691-8695(1991)；Bacus等，Cancer Research 52：2580-2589(1992)；Xu等，Int.J.Cancer 53：401-408(1993)；WO 94/00136；Kasprzyk等，Cancer Research 52：2771-2776(1992)；Hancock等，Cancer Res.51：4575-4580(1991)；Shawver等，Cancer Res.54：1367-1373(1994)；Arteaga等，Cancer Res.54：3758-3765(1994)；Harwerth等，J.Biol.Chem.267：15160-15167(1992)；美国专利第5,783,186号；Klapper等，Oncogene14：2099-2109(1997)。

同源性筛选使得HER受体家族的两个其它成员得以鉴定：HER3(美国专利第5,183,884和5,480,968号；Kraus等，PNAS(USA)86：9193-9197(1989))和HER4(欧洲专利申请第599,274号；Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1746-1750(1993)；Plowman等，Nature 366：473-475(1993))。这两种受体都在至少有些乳腺癌细胞系中表现出表达升高。

HER受体在细胞中通常以多种组合出现，而且认为异二聚化增加了对各种HER配体的细胞应答的多样性(Earp等，Breast Cancer Research andTreatment 35：115-132(1995))。EGFR受到6种不同配体的结合：表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白(amphiregulin)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、β细胞调节素(betacellulin)和上皮调节蛋白(epiregulin)(Groenen等，Growth Factors 11：235-257(1994))。由单一基因的可变剪接产生的一个调蛋白(heregulin)蛋白质家族是HER3和HER4的配体。调蛋白家族包括α、β和γ调蛋白(Holmes等，Science 256：1205-1210(1992)；美国专利第5,641,869号；Schaefer等，Oncogene 15：1385-1394(1997))；neu分化因子(NDF)；神经胶质生长因子(GGF)；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)；及感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)。有关综述参见Groenen等，Growth Factors 11：235-257(1994)；Lemke G，Molec.&Cell.Neurosci.7：247-262(1996)；Lee等，Pharm.Rev.47：51-85(1995)。最近鉴定了另外三种HER配体：神经调节蛋白(neuregulin)-2(NRG-2)，据报道它结合HER3或HER4(Chang等，Nature387：509-512(1997)；Carraway等，Nature 387：512-516(1997))；神经调节蛋白-3，它结合HER4(Zhang等，PNAS(USA)94(18)：9562-7(1997))；和神经调节蛋白-4，它结合HER4(Harari等，Oncogene 18：2681-89(1999))。HB-EGF、β细胞调节素和上皮调节蛋白也结合HER4。

虽然EGF和TGFα不结合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成异二聚体，它在异二聚体中活化EGFR并导致HER2的转磷酸。二聚化作用和/或转磷酸作用似乎活化HER2酪氨酸激酶。参见Earp等，见上文。同样，当HER3与HER2共表达时，形成有活性的信号复合物，针对HER2的抗体能够破坏此复合物(Sliwkowski等，J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994))。另外，在与HER2共表达时，HER3对调蛋白(HRG)的亲和力升高到更高的亲和力状态。关于HER2-HER3蛋白质复合物还可参见Levi等，Journal of Neuroscience15：1329-1340(1995)；Morrissey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1431-1435(1995)；Lewis等，Cancer Res.56：1457-1465(1996)。与HER3一样，HER4与HER2形成有活性的信号复合物(Carraway和Cantley，Cell 78：5-8(1994))。

涉及HER抗体的专利出版物包括：US 5,677,171，US 5,720,937，US5,720,954，US 5,725,856，US 5,770,195，US 5,772,997，US 6,165,464，US6,387,371，US 6,399,063，US 2002/0192211 A1，US 6,015,567，US 6,333,169，US 4,968,603，US 5,821,337，US 6,054,297，US 6,407,213，US 6,719,971，US6,800,738，US 2004/0236078 A1，US 5,648,237，US 6,267,958，US 6,685,940，US 6,821,515，WO 98/17797，US 6,127,526，US 6,333,398，US 6,797,814，US6,339,142，US 6,417,335，US 6,489,447，WO 99/31140，US 2003/0147884 A1，US 2003/0170234 A1，US 2004/0037823 A1，US 2005/0002928 A1，US6,573,043，US 6,905,830，US 2003/0152987 A1，WO 99/48527，US2002/0141993 A1，US 2005/0244417 A1，US 6,949,245，US 2003/0086924，US2004/0013667 A1，WO 00/69460，US 2003/0170235 A1，US 7,041,292，WO01/00238，US 2006/0083739，WO 01/15730，US 6,627,196 B1，US 6,632,979B1，WO 01/00244，US 2002/0001587 A1，US 2002/0090662 A1，US 6,984,494B2，WO 01/89566，US 2002/0064785，US 2003/0134344，WO 2005/099756，US2006/0013819，WO 2006/07398 A1，US 2006/0018899，WO 2006/33700，US2006/0088523，US 2006/0034840，WO 04/24866，US 2004/0082047，US2003/0175845 A1，WO 03/087131，US 2003/0228663，WO 2004/008099 A2，US2004/0106161，WO 2004/048525，US 2004/0258685 A1，WO 2005/16968，US2005/0038231 A1，US 5,985,553，US 5,747,261，US 4,935,341，US 5,401,638，US 5,604,107，WO 87/07646，WO 89/10412，WO 91/05264，EP 412,116 B1，EP494,135 B1，US 5,824,311，EP 444,181 B1，EP 1,006,194 A2，US 2002/0155527A1，WO 91/02062，US 5,571,894，US 5,939,531，EP 502,812 B1，WO 93/03741，EP 554,441 B1，EP 656,367 A1，US 5,288,477，US 5,514,554，US 5,587,458，WO 93/12220，WO 93/16185，US 5,877,305，WO 93/213 19，WO 93/21232，US5,856,089，WO 94/22478，US 5,910,486，US 6,028,059，WO 96/07321，US5,804,396，US 5,846,749，EP 711,565，WO 96/16673，US 5,783,404，US5,977,322，US 6,512,097，WO 97/00271，US 6,270,765，US 6,395,272，US5,837,243，WO 96/40789，US 5,783,186，US 6,458,356，WO 97/20858，WO97/38731，US 6,214,388，US 5,925,519，WO 98/02463，US 5,922,845，WO98/18489，WO 98/33914，US 5,994,071，WO 98/45479，US 6,358,682 B1，US2003/0059790，WO 99/55367，WO 01/20033，US 2002/0076695 A1，WO00/78347，WO 01/09187，WO 01/21192，WO 01/32155，WO 01/53354，WO01/56604，WO 01/76630，WO 02/05791，WO 02/11677，US 6,582,919，US2002/0192652 A1，US 2003/0211530 A1，WO 02/44413，US 2002/0142328，US6,602,670 B2，WO 02/45653，WO 02/055106，US 2003/0152572，US2003/0165840，WO 02/087619，WO 03/006509，WO 03/012072，WO 03/028638，US 2003/0068318，WO 03/041736，EP 1,357,132，US 2003/0202973，US2004/0138160，US 5,705,157，US 6,123,939，EP 616,812 B1，US 2003/0103973，US 2003/0108545，US 6,403,630 B1，WO 00/61145，WO 00/61185，US6,333,348 B1，WO 01/05425，WO 01/64246，US 2003/0022918，US2002/0051785 A1，US 6,767,541，WO 01/76586，US 2003/0144252，WO01/87336，US 2002/0031515 A1，WO 01/87334，WO 02/05791，WO 02/09754，US 2003/0157097，US 2002/0076408，WO 02/055106，WO 02/070008，WO02/089842和WO 03/86467。

诊断剂

用HER2抗体Trastuzumab治疗的患者是基于HER2过表达/扩增而选择接受治疗的。参见例如WO99/31140(Paton等)、US2003/0170234A1(Hellmann，S.)和US2003/0147884(Paton等)；以及WO01/89566、US2002/0064785和US2003/0134344(Mass等)。关于检测HER2过表达和扩增的免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)还可参见美国专利第6,573,043号；美国专利第6,905,830号；和US2003/0152987(Cohen等)。

WO2004/053497和US2004/024815A1(Bacus等)，以及US2003/0190689(Crosby和Smith)涉及测定或预测对Trastuzumab疗法的响应。US2004/013297A1(Bacus等)涉及测定或预测对ABX0303 EGFR抗体疗法的响应。WO2004/000094(Bacus等)涉及测定对GW572016(一种小分子，EGFR-HER2酪氨酸激酶抑制剂)的响应。WO2004/063709(Amler等)涉及用于测定对盐酸Erlotinib(一种EGFR抑制剂)的敏感性的生物标志和方法。US2004/0209290和WO04/065583(Cobleigh等)涉及用于乳腺癌预后的基因表达标志。还可参见WO03/078662(Baker等)和WO03/040404(Bevilacqua等).。WO02/44413(Danenberg，K.)涉及测定EGFR和HER2基因表达以决定化疗方案。

可基于HER活化或二聚化选择患者来接受用Pertuzumab进行的治疗。涉及Pertuzumab及用其治疗的患者的选择的专利出版物包括：美国专利第6,949,245号，WO01/00245，US2005/0208043，US2005/0238640，US2006/0034842，和US2006/0073143(Adams等)；US2003/0086924(Sliwkowski，M.)；US2004/0013667A1(Sliwkowski，M.)；及WO2004/008099A2和US2004/0106161(Bossenmaier等)。

Cronin等，Am.J.Path.164(1)：35-42(2004)记载了档案石蜡包埋组织中基因表达的测量法。Ma等，Cancer Cell 5：607-616(2004)记载了使用取自档案原代活检的肿瘤组织切片的分离RNA通过基因寡核苷酸微阵列的基因概况分析。

Pertuzumab(又称为重组人单克隆抗体2C4；OMNITARGTM，Genetech，Inc，South San Francisco)是一类称为HER二聚化抑制剂(HDI)的新作用剂中第一个问世的，它的功能是抑制HER2与其它HER受体(诸如EGFR/HER1、HER3和HER4)形成活性异二聚体的能力，而且不论HER2表达水平如何它都有活性。参见例如Harari和Yarden，Oncogene 19：6102-14(2000)；Yarden和Sliwkowski，Nat Rev Mol Cell Biol 2：127-37(2001)；Sliwkowski，Nat StructBiol 10：158-9(2003)；Cho等，Nature 421：756-60(2003)；Malik等，Pro Am SocCancer Res 44：176-7(2003)。

已经证明，Pertuzumab对肿瘤细胞中HER2-HER3异二聚体形成的阻断抑制关键性的细胞信号传导，导致肿瘤扩增和存活降低(Agus等，Cancer Cell2：127-37(2002))。

Pertuzumab已在临床上作为单一药剂进行了检验，其中在患有晚期癌症的患者中进行Ia期试验，在患有卵巢癌和乳腺癌以及肺癌和***癌的患者中进行II期试验。在I期研究中，对具有标准治疗期间或之后发展的，不可治愈的、局部发展为晚期的、复发性的或转移性的实体瘤的患者每三周静脉内给予Pertuzumab进行治疗。对Pertuzumab的耐受普遍较好。在响应可评估的20名患者中有3名实现了肿瘤消退。两名患者证实有部分响应。在21名患者中有6名观察到持续超过2.5个月的病情稳定(Agus等，Pro Am Soc Clin Oncol22：192(2003))。在2.0-15mg/kg的剂量，Pertuzumab的药动学是线性的，平均清除的范围是2.69-3.74mL/天/kg，平均终末消除半衰期的范围是15.3-27.6天。没有检测到针对Pertuzumab的抗体(Allison等，Pro Am Soc Clin Oncol22：197(2003))。

发明概述

本发明提供了来自经HER二聚化抑制剂Pertuzumab治疗的人癌症患者的临床数据。对患者评估了多种血清生物标志的表达水平，并评价了此类表达水平和响应Trastuzumab治疗的临床益处之间的相关性。临床数据表明，产生升高的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)水平的卵巢癌患者相对于具有正常EGF或TGF-α水平的患者在Pertuzumab治疗响应中显示出存活益处。在另一项正在进行的临床试验中有类似的益处，该临床试验包括铂耐药性卵巢癌、原发性腹膜癌和输卵管癌患者。

因而，在一个方面中，本发明涉及一种用于延长癌症患者存活的方法，包括以延长该患者存活的量给该患者施用HER二聚化抑制剂，其中该患者测定为产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)，且该癌症选自卵巢癌、腹膜癌和输卵管癌。

在另一个方面中，本发明涉及一种用于延长卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌患者存活的方法，包括以延长该患者存活的量给该患者施用Pertuzumab，其中该患者测定为产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)。

在又一个方面中，本发明涉及一种用于延长卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌患者无进展存活(PFS)的方法，包括以延长该患者PFS的量给该患者施用Pertuzumab，其中该患者的血清测定为其中具有升高水平的表皮生长因子(EGF)。

在还一个方面中，本发明涉及一种用于延长卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌患者无进展存活(PFS)的方法，包括以延长该患者PFS的量给该患者施用Pertuzumab，其中该患者的血清测定为其中具有升高水平的表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGF-α)。

在一个别的方面中，本发明涉及一种为HER二聚化抑制剂治疗选择患者的方法，包括如果该患者测定为产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)，则用该HER二聚化抑制剂治疗该患者。

对于所有的方面，在一个具体的实施方案中，在患者血清中发现该患者具有升高水平的EGF。

在另一个实施方案中，在患者血清中发现该患者具有升高水平的TGF-α。

在另一个实施方案中，所述HER二聚化抑制剂是HER2二聚化抑制剂。

在还另一个实施方案中，所述HER二聚化抑制剂抑制HER异二聚化。

在又一个的实施方案中，所述HER二聚化抑制剂是HER抗体，其可以例如结合选自EGFR、HER2和HER3的HER受体。

在一个具体的实施方案中，所述抗体结合HER2，诸如HER2胞外结构域的结构域II或HER2胞外结构域的结构域I、II、III间的连接处。

在一个具体的实施方案中，所述HER二聚化抑制剂是Pertuzumab。

所述癌症可以是例如晚期(advanced)、顽固性(refractory)或复发性(recurrent)卵巢癌、铂耐药性(platinum-resistant)卵巢癌、原发性腹膜癌或输卵管癌。

HER二聚化抑制剂可以作为单一抗肿瘤剂或者与第二种治疗剂联合地施用于患者。

所述第二种治疗剂可以是例如化疗剂、HER抗体、针对肿瘤相关抗原的抗体、抗激素化合物、保心药、细胞因子、靶向EGFR的药物、抗血管发生剂、酪氨酸激酶抑制剂、COX抑制剂、非类固醇抗炎药、法尼基转移酶抑制剂、结合癌胚蛋白CA 125的抗体、HER2疫苗、HER靶向疗法、Raf或ras抑制剂、脂质体多柔比星(doxorubicin)、托泊替康(topotecan)、紫杉烷(taxane)、双重酪氨酸激酶抑制剂、TLK286、EMD-7200、治疗恶心的药物、预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮疗法、治疗或预防腹泻的药物、降低体温的药物、和造血生长因子。

在一个具体的实施方案中，所述第二种治疗剂是化疗剂，诸如抗代谢物类化疗剂，例如吉西他滨(gemcitabine)、曲妥单抗(Trastuzumab)、Erlotinib或贝伐单抗(Bevacizumab)。

优选在存活方面测量临床益处，所述存活包括总体存活(overall survival，OS)和无进展存活(progression free survival，PFS)，优选PFS。

在另一个方面中，本发明涉及一种试剂盒，该试剂盒包括HER二聚化抑制剂和包装插页或标签，其指出该HER二聚化抑制剂的临床益处，如果待治疗的患者产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)，其中该临床益处优选是延长的存活，特别是延长的PFS。

在又一个方面中，本发明涉及一种宣传HER二聚化抑制剂治疗产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)的患者的方法，其中该宣传可采用任何形式，包括书面材料的形式，诸如包装插页。

附图简述

图1提供了HER2蛋白质结构的示意图，及其胞外结构域的结构域I-IV的氨基酸序列(分别为SEQ ID No.19-22)。

图2A和2B描绘了鼠单克隆抗体2C4的轻链可变(V_L)域(图2A)和重链可变(V_H)域(图2B)的氨基酸序列(分别为SED ID No.1和2)、变体574/Pertuzumab的V_L和V_H域的氨基酸序列(分别为SED ID No.3和4)、及人V_L和V_H共有框架(hum κ1，轻链κ亚组I；hum III，重链亚组III)的氨基酸序列(分别为SED IDNo.5和6)的比对。星号标明了Pertuzumab与鼠单克隆抗体2C4的可变域之间或者Pertuzumab与人框架的可变域之间的不同之处。互补决定区(CDR)括在括号中。

图3A和3B显示了Pertuzumab轻链(图3A；SEQ ID NO.13)和重链(图3B；SEQ ID NO.14)的氨基酸序列。CDR以粗体显示。轻链和重链的计算分子量为23,526.22 Da和49,216.56 Da(半胱氨酸为还原形式)。碳水化合物模块附着于重链的Asn299。

图4示意性的描绘了2C4在HER2的异二聚体结合位点处结合，从而阻止与活化的EGFR或HER3二聚化的情形。

图5描绘了HER2/HER3与MAPK和Akt途径的偶联。

图6比较了Trastuzumab与Pertuzumab的多种活性。

图7A和7B分别显示了Trastuzumab轻链(图7A；SEQ ID No.15)和重链(图7B；SEQ ID No.16)的氨基酸序列。

图8A和8B分别描绘了一种变体Pertuzumab轻链序列(图8A；SEQ IDNo.17)和一种变体Pertuzumab重链序列(图8B；SEQ ID No.18)。

图9描绘了生物标志HER2、TGF-α、双调蛋白和EGF间的Spearman相关性。

图10展示了标志物的均值/相关性及临床协变量(covariate)。

图11显示了关于HER2、TGF-α、双调蛋白和EGF的使用无进展存活的截留(cutoff)确定。

图12显示了关于HER2、TGF-α、双调蛋白和EGF的使用总体存活的截留确定。

图13反映了依照截留的患者分布。

图14描绘了由HER2标志物的单变量分析中确定的3个标志物截留所分开的KapLan Meir PFS和OS曲线。

图15描绘了由TGF-α标志物的单变量分析中确定的3个标志物截留所分开的KapLan Meir PFS和OS曲线。

图16描绘了由EGF标志物的单变量分析中确定的3个标志物截留所分开的KapLan Meir PFS和OS曲线。

优选实施方案的详述

I.定义

“存活”(survival)指患者保持活着，包括总体存活(overall survival)和无进展存活(progress free survival)。

“总体存活”指保持一定时期诸如1年、5年等活着的患者，自诊断或治疗时起。

“无进展存活”指保持活着且癌症没有进展或恶化的患者。

“延长存活”意味着使接受治疗的患者的总体存活或无进展存活相对于未接受治疗的患者(即相对于未用HER二聚化抑制剂诸如Pertuzumab治疗的患者)、或相对于不表现出HER活化的患者、和/或相对于用已获批准的抗肿瘤剂(诸如托泊替康或脂质体多柔比星，在癌症是卵巢癌时)治疗的患者有延长。

在本文中“病情进展前时间”(time to disease progression)或“TTDP”或“TTP”指自初始治疗(例如使用HER二聚化抑制剂，诸如Pertuzumab)时起，到癌症进展(progress)或恶化(worsen)止的时间，一般以周或月计。这样的进展可以由熟练临床医师来评估。例如，在卵巢癌的情况中，可以通过RECIST来评估进展(参见例如Therasse等，J.Nat.Cancer Inst.92(3)：205-216(2000))。

“延长TTP”意味着使接受治疗的患者的病情进展前时间相对于未接受治疗的患者(即相对于未用HER二聚化抑制剂诸如Pertuzumab治疗的患者)、或相对于不表现出HER活化的患者、和/或相对于用已获批准的抗肿瘤剂(诸如托泊替康或脂质体多柔比星，在癌症是卵巢癌时)治疗的患者有延长。

“客观响应”(obiective response)指可测量的响应，包括完全响应(CR)或部分响应(PR)。

“完全响应”(complete response)或“CR”指癌症的所有体征响应治疗而消失。这并不总是意味着癌症已经治愈。

“部分响应”(partial response)或“PR”指一处或多处肿瘤或损害的大小或体内癌症的程度响应治疗而减小。

“HER受体”是属于HER受体家族的受体蛋白质酪氨酸激酶，包括EGFR、HER2、HER3和HER4受体。HER受体通常将包含胞外结构域，它可结合HER配体和/或与另一HER受体分子二聚化；亲脂性跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；和含有数个可磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号结构域。HER受体可以是“天然序列”HER受体或其“氨基酸序列变体”。优选的是，HER受体是天然序列人HER受体。

术语“ErbB1”、“HER1”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中可互换使用，指例如Carpenter等，Ann.Rev.Biochem.56：881-914(1987)中所披露的EGFR，包括其天然存在的突变体形式(例如Humphrey等，PNAS(USA)87：4207-4211(1990)中的删除突变体EGFR)。erbB1指编码EGFR蛋白质产物的基因。

表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互换使用，指例如Semba等，PNAS(USA)82：6497-6501(1985)和Yamamoto等，Nature 319：230-234(1986)中记载的人HER2蛋白(Genebank编号X03363)。术语“erbB2”指编码人ErbB2的基因，而“neu”指编码大鼠p185^neu的基因。优选的HER2是天然序列人HER2。

在本文中，“HER2胞外结构域”或“HER2 ECD”指HER2在细胞外的结构域，或是锚定于细胞膜或是在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，HER2的胞外结构域可包含4个结构域：“结构域I”(大约第1-195位氨基酸残基；SEQ ID NO：19)、“结构域II”(大约第196-319位氨基酸残基；SEQ ID NO：20)、“结构域III”(大约第320-488位氨基酸残基；SEQ ID NO：21)和“结构域IV”(大约第489-630位氨基酸残基；SEQ ID NO：22)(残基编号不包括信号肽)。参见Garrett等，Mol.Cell.11：495-505(2003)；Cho等，Nature421：756-760(2003)；Franklin等，Cancer Cell 5：317-328(2004)；Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.90：1746-1750(1993)，以及本文中的图1。

“ErbB3”和“HER3”指例如美国专利第5,183,884号和第5,480,968号及Kraus等，PNAS(USA)86：9193-9197(1989)中所披露的受体多肽。

术语“ErbB4”和“HER4”指例如欧洲专利申请第599,274号；Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：1746-1750(1993)；Plowman等，Nature366：473-475(1993)中所披露的受体多肽，包括其同等型(isoform)，例如1999年4月22日公布的WO99/19488中所披露的。

“HER配体”指结合和/或活化HER受体的多肽。本文中特别感兴趣的HER配体是天然序列人HER配体，诸如表皮生长因子(EGF)(Savage等，J.Biol.Chem.247：7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt等，Science223：1079-1082(1984))；双调蛋白(amphiregulin)，也称为施旺细胞瘤或角质形成细胞自分泌生长因子(Shoyab等，Science 243：1074-1076(1989)；Kimura等，Nature 348：257-260(1990)；Cook等，Mol.Cell.Biol.11：2547-2557(1991))；β细胞调节素(betacellulin)(Shing等，Science 259：1604-1607(1993)；Sasada等，Biochem.Biophys.Res.Commun.190：1173(1993))；肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等，Science 251：936-939(1991))；上皮调节蛋白(epiregulin)(Toyoda等，J.Biol.Chem.270：7495-7500(1995)；Komurasaki等，Oncogene 15：2841-2848(1997))；调蛋白(heregulin)(见下文)；神经调节蛋白(neuregulin)-2(NRG-2)(Carraway等，Nature 387：512-516(1997))；神经调节蛋白-3(NRG-3)(Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.94：9562-9567(1997))；神经调节蛋白-4(NRG-4)(Harari等，Oncogene 18：2681-89(1999))；和cripto(CR-1)(Kannan等，J.Biol.Chem.272(6)：3330-3335(1997))。结合EGFR的HER配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白、β细胞调节素、HB-EGF和上皮调节蛋白。结合HER3的HER配体包括调蛋白。能够结合HER4的HER配体包括β细胞调节素、上皮调节蛋白、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和调蛋白。

“调蛋白”(HRG)在用于本文时指由调蛋白基因编码的多肽，如美国专利第5,641,869号或Marchionni等，Nature 362：312-318(1993)中所披露的。调蛋白的例子包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmes等，Science 256：1205-1210(1992)；美国专利第5,641,869号)；neu分化因子(NDF)(Peles等，Cell 69：205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls等，Cell 72：801-815(1993))；神经胶质生长因子(GGF)(Marchionni等，Nature362：312-318(1993))；感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)(Ho等，J.Biol.Chem.270：14523-14532(1995))；γ-调蛋白(Schaefer等，Oncogene 15：1385-1394(1997))。

“HER二聚体”在本文中指包含至少两个HER受体的非共价结合二聚体。在表达两种或更多HER受体的细胞暴露于HER配体时可形成这样的复合物，可通过免疫沉淀来分离并通过SDS-PAGE来分析，如例如Sliwkowski等，J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994)中所记载的。其它蛋白质，诸如细胞因子受体亚基(例如gp130)可与二聚体结合。优选的是，HER二聚体包含HER2。

“HER异二聚体”在本文中指包含至少两个不同HER受体的非共价结合异二聚体，诸如EGFR-HER2、HER2-HER3或HER2-HER4异二聚体。

“HER抑制剂”指干扰HER活化或功能的药剂。HER抑制剂的例子包括HER抗体(例如EGFR、HER2、HER3或HER4抗体)；靶向EGFR的药物；小分子HER拮抗剂；HER酪氨酸激酶抑制剂；HER2和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂，诸如lapatinib/GW572016；反义分子(参见例如WO 2004/87207)；和/或结合下游信号分子诸如MAPK或Akt(见图5)或干扰其功能的药剂。优选的是，HER抑制剂是结合HER受体的抗体或小分子。

“HER二聚化抑制剂”指抑制HER二聚体或HER异二聚体形成的药剂。优选的是，HER二聚化抑制剂是抗体，例如在HER2的异二聚体结合位点结合HER2的抗体。本文中最优选的HER二聚化抑制剂是Pertuzumab或MAb2C4。2C4对HER2的异二聚体结合位点的结合示于图4。HER二聚化抑制剂的其它例子包括结合EGFR并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体(例如EGFR单克隆抗体806，MAb 806，它结合活化的或“未系留的”EGFR；参见Johns等，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))；结合HER3并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体；结合HER4并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体；肽二聚化抑制剂(美国专利第6,417,168号)；反义二聚化抑制剂；等等。

“HER2二聚化抑制剂”指抑制包含HER2的二聚体或异二聚体形成的药剂。

“HER抗体”指结合HER受体的抗体。任选的是，HER抗体还干扰HER活化或功能。优选的是，HER抗体结合HER2受体。本文中特别感兴趣的HER2抗体是Pertuzumab。HER2抗体的另一个例子是Trastuzumab。EGFR抗体的例子包括Cetuximab和ABX0303。

“HER活化”指任何一种或多种HER受体的活化或磷酸化。通常，HER活化导致信号转导(例如由HER受体胞内激酶结构域引起的信号转导，该激酶结构域磷酸化HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基)。HER活化可由结合包含感兴趣HER受体的HER二聚体的HER配体介导。结合HER二聚体的HER配体可活化二聚体中一种或多种HER受体的激酶结构域，由此导致一种或多种HER受体中酪氨酸残基的磷酸化和/或其它底物多肽诸如Akt或MAPK胞内激酶中酪氨酸残基的磷酸化。参见例如图5。

“磷酸化”指对蛋白质诸如HER受体，或其底物添加一个或多个磷酸基团。

“抑制HER二聚化”的抗体指抑制或干扰HER二聚体形成的抗体。优选的是，此类抗体在HER2的异二聚体结合位点处结合HER2。本文中最优选的二聚化抑制性抗体是Pertuzumab或MAb 2C4。2C4对HER2的异二聚体结合位点的结合示于图4。抑制HER二聚化的抗体的其它例子包括结合EGFR并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体(例如EGFR单克隆抗体806，MAb 806，它结合活化的或“未系留的”EGFR；参见Johns等，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))；结合HER3并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体；及结合HER4并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体。

“比Trastuzumab更有效的阻断配体对HER受体之活化”的抗体指比Trastuzumab更有效(例如功效提高至少约2倍)的降低或消除HER配体对HER受体之活化的抗体。优选的是，此类抗体至少大约像鼠单克隆抗体2C4或其Fab片段或者像Pertuzumab或其Fab片段那样有效的阻断HER配体对HER受体之活化。可通过直接研究HER二聚体，或者通过评估由HER二聚化引起的HER活化或下游信号传导，和/或通过评估抗体-HER2结合位点等来评估抗体阻断配体对HER受体之活化的能力。用于筛选有能力比Trastuzumab更有效的抑制配体对HER受体之活化的抗体的测定法记载于Agus等，Cancer Cell2：127-137(2002)和美国专利第6,949,245号(Adams等)。仅作为例示，可测定以下各项：对HER二聚体形成的抑制(参见例如Agus等，Cancer Cell 2：127-137(2002)的附图1A-B和美国专利第6,949,245号)；表达HER二聚体的细胞中HER配体活化的降低(例如美国专利第6,949,245号和Agus等，Cancer Cell2：127-137(2002)的附图2A-B)；对HER配体结合表达HER二聚体的细胞的阻断(例如美国专利第6,949,245号和Agus等，Cancer Cell 2：127-137(2002)的附图2E)；在存在(或缺乏)HER配体时对表达HER二聚体的癌细胞(例如MCF7、MDA-MD-134、ZR-75-1、MD-MB-175、T-47D细胞)的细胞生长抑制(例如美国专利第6,949,245号和Agus等，Cancer Cell 2：127-137(2002)的附图3A-D)；对下游信号传导的抑制(例如对HRG依赖性AKT磷酸化的抑制或者对HRG依赖性或TGFα依赖性MAPK磷酸化的抑制)(例如美国专利第6,949,245号和Agus等，Cancer Cell 2：127-137(2002)的附图2C-D)。还可通过研究抗体-HER2结合位点来评估抗体是否抑制HER二聚化，例如通过评估与HER2结合的抗体的结构或模型，诸如晶体结构(参见例如Franklin等，Cancer Cell 5：317-328(2004))。

HER2上的“异二聚体结合位点”指在HER2与EGFR、HER3或HER4形成二聚体时，HER2胞外结构域中与EGFR、HER3或HER4胞外结构域中某区域接触或形成介面的区域。已发现所述区域在HER2的结构域II中。Franklin等，Cancer Cell 5：317-328(2004)。

HER2抗体可以比Trastuzumab更有效的(例如功效提高至少2倍)“抑制HRG依赖性AKT磷酸化”和/或抑制“HRG依赖性或TGFα依赖性MAPK磷酸化”(参见例如Agus等，Cancer Cell 2：127-137(2002)和美国专利第6,949,245号)。

HER2抗体可以是像Pertuzumab那样“不抑制HER2胞外结构域切割”的抗体(Molina等，Cancer Res.61：4744-4749(2001))。另一方面，Trastuzumab可抑制HER2胞外结构域切割。

“结合HER2的异二聚体结合位点的”HER2抗体结合结构域II中的残基(任选还结合HER2胞外结构域的其它结构域，诸如结构域I和III中的残基)，且至少在一定程度上可在空间上阻碍HER2-EGFR、HER2-HER3或HER2-HER4异二聚体的形成。Franklin等，Cancer Cell 5：317-328(2004)表征了存放在RCSB蛋白质数据库(ID Code IS78)的HER2-Pertuzumab晶体结构，图解了结合HER2的异二聚体结合位点的例示性抗体。

“结合HER2的结构域II”的抗体结合结构域II中的残基和任选HER2的其它结构域，诸如结构域I和III中的残基。优选的是，结合结构域II的抗体结合HER2的结构域I、II和III之间的连接处。

蛋白质“表达”指基因中所编码的信息转换成信使RNA(mRNA)，然后转换成蛋白质。

在本文中，“表达”感兴趣蛋白质(诸如HER受体或HER配体)的样品或细胞指其中测定出存在编码该蛋白质的mRNA或蛋白质包括其片段的样品或细胞。

“聚合酶链式反应”或“PCR”技术在用于本文时一般指其中如1987年7月28日公告的美国专利第4,683,195号中所记载的，扩增微量的核酸，RNA和/或DNA特定片段的规程。通常，需要获知感兴趣区域末端或以外的序列信息，从而可设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上将与待扩增模板的对立链相同或相似。两条引物的5’末端核苷酸可与所扩增物质的末端一致。PCR可用于从总基因组DNA和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等扩增特定RNA序列、特定DNA序列。一般参见Mullis等，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.51：263(1987)；Erlich编，PCR Technology，Stockton Press，NY，1989。在用于本文时，PCR视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应方法的一个但非唯一的例子，包括使用已知核酸(DNA或RNA)作为引物并利用核酸聚合酶来扩增或生成特定核酸片段，或者扩增或生成与特定核酸互补的特定核酸片段。

“定量实时聚合酶链式反应”或“qRT-PCR”指PCR的一种形式，其中在PCR反应的每个步骤测量PCR产物的量。这种技术已经记载于多份出版物，包括Cronin等，Am.J.Pathol.164(1)：35-42(2004)；Ma等，Cancer Cell.5：607-616(2004)。

术语“微阵列”指可杂交阵列元素，优选多核苷酸探针在基片上的有序排列。

术语“多核苷酸”在以单数或复数使用时一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，可以是未经修饰的RNA或DNA或者是经过修饰的RNA或DNA。如此，例如，本文中所定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包含单链区和双链区的DNA、单链和双链RNA、及包含单链区和双链区的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子，它可以是单链的，或者更典型的是双链的，或者包含单链区和双链区。另外，术语“多核苷酸”在用于本文时指包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区。此类区中的链可来自相同分子或来自不同分子。所述区可包含一种或多种分子的整个，但是更典型的是只包含有些分子的一个区。三股螺旋区的分子之一常常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”明确包括cDNA。该术语包括包含一种或多种经修饰碱基的DNA(包括cDNA)和RNA。如此，主链为稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA也是“多核苷酸”该术语在本文中的意图所在。此外，包含罕见碱基诸如肌苷或经修饰碱基诸如氚化碱基的DNA或RNA也包括在本文中所定义的术语“多核苷酸”内。一般而言，术语“多核苷酸”涵盖未修饰多核苷酸的所有化学、酶学和/或代谢修饰形式，以及病毒和细胞，包括简单和复杂细胞的特征性的DNA和RNA的化学形式。

术语“ 寡核苷酸”指相对较短的多核苷酸，包括但不限于单链脱氧核糖核苷酸、单链或双链核糖核苷酸、RNA:DNA杂合物、及双链DNA。寡核苷酸，诸如单链DNA探针寡核苷酸，常常通过化学方法来合成，例如使用商品化的自动化寡核苷酸合成仪。然而，寡核苷酸可通过多种其它方法来制备，包括体外重组DNA介导的技术和通过DNA在细胞和生物体中的表达。

短语“基因扩增”指通过它在特定细胞或细胞系中形成基因或基因片段的多个拷贝的过程。所复制区域(一段扩增的DNA)常常称为“扩增子”。通常，所生成的信使RNA(mRNA)的量也按所表达特定基因生成的拷贝数的比例升高。

杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针与可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果，可推出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，1995。

“严格条件”或“高严格性条件”，如本文中所定义的，通常：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，于50℃；(2)在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，于42℃；或(3)采用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸右旋糖苷，于42℃，及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中洗涤，接着于55℃在含EDTA的0.1x SSC中进行高严格性洗涤。

“中等严格条件”可以如Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，New York，Cold Spring Harbor Press，1989中所述来鉴定，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的例子是于37℃在含20％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5x Denhardt氏溶液，10％硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于大约37-50℃在1x SSC中洗涤滤膜。熟练技术人员将认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。

“天然序列”多肽指与衍生自自然界的多肽(例如HER受体或HER配体)具有相同氨基酸序列的多肽，包括天然存在的或等位的变体。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。如此，天然序列多肽可具有天然存在人多肽、鼠多肽、或来自任何其它哺乳类物种的多肽的氨基酸序列。

术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指来自一群基本上同质的抗体的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体通常以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中结合靶物的多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择结合靶物的单一多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler等，Nature 256：495(1975)；Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，第2版1988；Hammerling等，于：Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas，563-681，Elsevier，N.Y.，1981)、重组DNA法(参见例如美国专利第4,816,567号)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等，Nature 352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；Lee等，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利第5,545,806号；第5,569,825号；第5,591,669号(都是GenPharm的)；美国专利第5,545,807号；WO 1997/17852；美国专利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；和第5,661,016号；Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利第4,816,567号；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类(例如旧大陆猴类(Old World Monkey)、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体，以及“人源化”抗体。

非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个这样的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

人源化HER2抗体包括huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或Trastuzumab

如美国专利第5,821,337号表3中所记载的，明确收入本文作为参考；人源化520C9(WO 93/21319)；及人源化2C4抗体，诸如Pertuzumab，如本文所述。

为了本发明的目的，“Trastuzumab”、

和“huMAb4D5-8”指包含分别在SEQ ID No.15和16中示出的轻链和重链氨基酸序列的抗体。

在本文中，“Pertuzumab”和“OMNITARG^TM”指包含分别在SEQ ID No.13和14中示出的轻链和重链氨基酸序列的抗体。

Trastuzumab与Pertuzumab之间的功能差异示于图6。

“完整抗体”在本文中指包含两个抗原结合区及Fc区的抗体。优选的是，完整抗体具有功能性Fc区。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(V_H)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(V_L)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。

术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。

术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是除此处定义的高变区残基外的那些可变域残基。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，各可变域的三个高变区相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。

根据其恒定域氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可能变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至C末端的区段。Fc区的C末端赖氨酸(残基447，根据EU编号***)可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程。因而，完整抗体组合物可包括消除了所有K447残基的抗体群体、一点没有消除K447残基的抗体群体、或者混合了有和没有K447残基的抗体的抗体群体。

除非另有说明，本文中免疫球蛋白重链中残基的编号方式是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中(明确收入本文作为参考)的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。

“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能通常要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)联合，而且可使用多种测定法来评估，例如本文中所公开的。

“天然序列Fc区”包含与自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc区、及天然序列人IgG4 Fc区，及其天然存在变体。

“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰，优选一处或多处氨基酸替代而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区具有与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中将优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80％的同源性，更优选至少约90％的同源性，最优选至少约95％的同源性。

根据其重链恒定域氨基酸序列，完整抗体可归入不同的“类”。完整抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的抗体对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶胞。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利第5,500,362或5,821,337号中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并执行效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液或PBMC，如本文中所描述的。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述

Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)；Kim等，J.Immunol.24：249(1994))，并调控免疫球蛋白的体内稳态。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶物的能力。补体激活途径是由补体***第一组分(C1q)结合与相关抗原复合的分子(例如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，Fv多肽在V_H和V_L结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Plückthun，于：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。HER2抗体scFv片段记载于WO93/16185；美国专利第5,571,894号；美国专利第5,587,458号。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H-V_L)中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。

“裸抗体(裸露的抗体)”指未偶联异源分子，诸如细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。

“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

“亲和力成熟的”抗体指在其一个或多个高变区中具有一处或多处改变且导致抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔水平的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier等，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins等，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。

术语“主要种类抗体”在本文中指组合物中在数量上占主要的抗体分子/抗体结构。在一个实施方案中，主要种类抗体是HER2抗体，诸如结合HER2的结构域II的抗体、比Trastuzumab更有效的抑制HER二聚化的抗体、和/或结合HER2的异二聚体结合位点的抗体。本文中主要种类抗体的优选实施方案是包含SEQ ID No.3和4中的轻链和重链可变域氨基酸序列的抗体，最优选包含SEQ ID No.13和14中的轻链和重链氨基酸序列的抗体(Pertuzumab)。

“氨基酸序列变体”抗体在本文中指具有与主要种类抗体不同的氨基酸序列的抗体。通常，氨基酸序列变体将与主要种类抗体具有至少约70％的同源性，优选的是，它们将与主要种类抗体至少约80％，更优选至少约90％同源。氨基酸序列变体在主要种类抗体氨基酸序列内部或邻近的某些位置具有替代、删除和/或添加。本文中氨基酸序列变体的例子包括酸性变体(例如脱酰胺抗体变体)、碱性变体、在其一条或两条轻链上具有氨基末端前导延伸(例如VHS-)的抗体、在其一条或两条重链上具有C-末端赖氨酸残基的抗体等，包括重链和/或轻链氨基酸序列变异的组合。本文中特别感兴趣的抗体变体是相对于主要种类抗体在其一条或两条轻链上包含氨基末端前导延伸的抗体，任选还包含其它氨基酸序列和/或糖基化差异。

“糖基化变体”抗体在本文中指附着有一种或多种或者一个或多个碳水化合物模块且所述碳水化合物与附着于主要种类抗体的一种或多种或者一个或多个碳水化合物模块不同的抗体。本文中糖基化变体的例子包括其Fc区附着有G1或G2寡糖结构代替G0寡糖结构的抗体、其一条或两条轻链附着有一种或两种或者一个或两个碳水化合物模块的抗体、其一条或两条重链没有附着碳水化合物的抗体等，及糖基化改变的组合。

若抗体具有Fc区，则抗体的一条或两条重链，例如残基299处(298，Eu残基编号方式)可附着有寡糖结构。对于Pertuzumab，G0是主要的寡糖结构，而在Pertuzumab组合物中找到的其它寡糖结构诸如G0-F、G-1、Man5、Man6、G1-1、G1(1-6)、G1(1-3)和G2的量较少。

除非另有说明，“G1寡糖结构”在本文中包括G-1、G1-1、G1(1-6)和G1(1-3)结构。

“氨基末端前导延伸”在本文中指在抗体的任何一条或多条重链或轻链的氨基末端存在的一个或多个氨基酸残基的氨基末端前导序列。例示性的氨基末端前导延伸包含三个氨基酸残基，VHS或由其组成，它们存在于抗体变体的两条轻链中的一条或两条上。

“脱酰胺”抗体指其中一个或多个天冬酰胺残基衍生成例如天冬氨酸、琥珀酰亚胺或异天冬氨酸的抗体。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、施旺氏细胞瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌和肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括转移性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、***癌、外阴癌、甲状腺癌、***癌、***癌、睾丸癌、食道癌、胆管肿瘤、及头和颈癌。

“晚期”(advanced)癌症指通过局部侵入或转移而扩散到最初的部位或器官之外的癌症。

“顽固性或不应性”(refractory)癌症指即使对癌症患者施用抗肿瘤剂，诸如化疗剂，仍然发生进展的癌症。顽固性癌症的一个例子是铂不应性癌症。

“复发性”(recurrent)癌症指在对初始治疗的响应之后，在初始部位或远端部位再次生长的癌症。

在本文中，“患者”指人患者。患者可以是“癌症患者”，即患有或有风险患上癌症的一种或多种症状的患者。

“肿瘤样品”在本文中指衍生自患者肿瘤或包含来自患者肿瘤的肿瘤细胞的样品。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、循环中的肿瘤细胞、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如***固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。

“固定的”肿瘤样品指已经使用固定剂以组织学方法保存的肿瘤样品。

“***固定的”肿瘤样品指已经使用甲醛作为固定剂保存的肿瘤样品。

“包埋的”肿瘤样品指用坚固的且通常是硬的介质诸如石蜡、蜡、火棉或树脂包围的肿瘤样品。包埋使得有可能切出薄片供显微镜检查或生成组织微阵列(TMA)。

“ 石蜡包埋的”肿瘤样品指用衍生自石油的固体碳氢化合物的纯化混合物包围的肿瘤样品。

在本文中，“冷冻的”肿瘤样品指冷冻的或冷冻过的肿瘤样品。

“展示出HER表达、扩增或活化”的癌症或生物学样品指在诊断测试中表达(包括过表达)HER受体，具有扩增的HER基因，和/或以其它方式展现出HER受体活化或磷酸化的癌症或生物学样品。

“展示出HER活化”的癌症或生物学样品指在诊断测试中展现出HER受体活化或磷酸化的癌症或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA来测量HER磷酸化)或间接(例如通过基因表达概况分析或通过检测HER异二聚体，如本文中所述)测定。

在本文中，“基因表达概况分析”(gene expression profiling)指评估一种或多种基因的表达，代替直接测定HER磷酸化。

“磷酸-ELLSA测定法”(phosho-ELISA assay)在本文中指在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中评估一种或多种HER受体，尤其是HER2的磷酸化的测定法，其中使用检测磷酸化的HER受体的试剂(通常是抗体)、底物或下游信号分子。优选的是，使用检测磷酸化HER2的抗体。该测定法可以对细胞溶胞物，优选来自新鲜的或冷冻的生物学样品的细胞溶胞物进行。

“HER受体过表达或扩增”的癌细胞指与同一组织类型的非癌性细胞相比，具有显著更高水平的HER受体蛋白质或基因的癌细胞。此类过表达可以是由基因扩增或者转录或翻译增加引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的HER蛋白质水平的升高(例如通过免疫组化测定法；IHC)来测定HER受体的过表达或扩增。或者/另外，可测量细胞中编码HER的核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公布的WO98/45479)、Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如定量实时PCR(qRT-PCR)。还可通过测量生物学流体诸如血清中的脱落抗原(例如HER胞外结构域)来研究HER受体过表达或扩增(参见例如1990年6月12日公告的美国专利第4,933,294号；1991年4月18日公布的WO 91/05264；1995年3月28日公告的美国专利第5,401,638号；Sias等，J.Immunol.Methods 132：73-80(1990))。在上述测定法之外，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估该抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活检。

相反，“HER受体不过表达或扩增”的癌症指与同一组织类型的非癌性细胞相比，没有高于正常水平的HER受体蛋白质或基因的癌症。抑制HER二聚化的抗体，诸如Pertuzumab，可用于治疗不过表达或扩增HER2受体的癌症。

在本文中，“抗肿瘤剂”指用于治疗癌症的药物。本文中的抗肿瘤剂的非限制性例子包括化疗剂、HER二聚化抑制剂、HER抗体、针对肿瘤相关抗原的抗体、抗激素化合物、细胞因子、靶向EGFR的药物、抗血管发生剂、酪氨酸激酶抑制剂、生长抑制剂和生长抑制性抗体、细胞毒剂、诱发凋亡的抗体、COX抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、结合癌胚蛋白CA125的抗体、HER2疫苗、Raf或ras抑制剂、脂质体多柔比星、托泊替康、紫杉烷、双重酪氨酸激酶抑制剂、TLK286、EMD-7200、Pertuzumab、Trastuzumab、Erlotinib、和Bevacizumab。

“已批准的抗肿瘤剂”指已经得到管理机构诸如食品和药品管理局(FDA)或其相当的外国机构的上市批准，用于治疗癌症的药物。

若HER二聚化抑制剂作为“单一抗肿瘤剂”施用，则它是唯一施用来治疗癌症的抗肿瘤剂，即它不与另一抗肿瘤剂诸如化疗联合施用。

“护理标准”(standard of care)在本文中意指常规用来治疗特定形式的癌症的一种或多种抗肿瘤剂。例如，对于铂耐药性卵巢癌，护理标准是托泊替康或脂质体多柔比星。

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是表达HER的癌细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的表达HER的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长***类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、***(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见TheMolecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel编，章1，题为“Cell cycleregulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”，Murakami等，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。

“生长抑制性”抗体的例子是那些结合HER2并抑制过表达HER2的癌细胞生长的抗体。优选的生长抑制性HER2抗体在约0.5-30μg/ml的抗体浓度对细胞培养物中SK-BR-3乳瘤细胞的生长抑制超过20％，优选超过50％(例如约50％至约100％)，其中生长抑制是在SK-BR-3细胞暴露于抗体后6天测定的(参见1997年10月14日公告的美国专利第5,677,171号)。该专利及下文中更详细的描述了SK-BR-3细胞生长抑制测定法。优选的生长抑制性抗体是鼠单克隆抗体4D5的人源化变体，例如Trastuzumab。

“诱导凋亡”的抗体指根据膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊(称作凋亡小体)形成的测定，诱导程序性细胞死亡的抗体。所述细胞通常是过表达HER2受体的细胞。优选的是，所述细胞是肿瘤细胞，例如***、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰或膀胱细胞。在体外，所述细胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu 3细胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3细胞。有多种方法可用于评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰丝氨酸(PS)易位；可通过DNA梯化(laddering)来评估DNA断裂；及可通过亚二倍体细胞的任何增加来评估伴随着DNA断裂的核/染色质浓缩。优选的是，诱导凋亡的抗体是在使用BT474细胞的膜联蛋白结合测定法(见下文)中导致对膜联蛋白的结合相对于未处理细胞诱导约2至50倍，优选约5至50倍，最优选约10至50倍的抗体。诱导凋亡的HER2抗体的例子有7C2和7F3。

“表位2C4”指HER2的胞外结构域中抗体2C4所结合的区域。为了筛选结合2C4表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane，1988中所记载的。优选的是，抗体将2C4对HER2的结合阻断约50％或更多。或者，可进行表位作图以评估抗体是否结合HER2的2C4表位。表位2C4包含来自HER2胞外结构域中结构域II的残基。2C4和Pertuzumab在结构域I、II和III的连接处结合HER2的胞外结构域。Franklin等，Cancer Cell 5：317-328(2004)。

“表位4D5”指HER2的胞外结构域中抗体4D5(ATCC CRL 10463)和Trastuzumab所结合的区域。此表位接近HER2的跨膜结构域，且在HER2的结构域IV内。为了筛选结合4D5表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，EdHarlow和David Lane，1988中所记载的。或者，可进行表位作图以评估抗体是否结合HER2的4D5表位(例如HER2 ECD的大约第529位残基至大约第625位残基区域(含两端点)内的任何一个或多个残基，残基编号方式包括信号肽)。

“表位7C2/7F3”指HER2的胞外结构域的结构域I内N末端处7C2和/或7F3抗体(各自保藏于ATCC，见下文)所结合的区域。为了筛选结合7C2/7F3表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane，1988中所记载的。或者，可进行表位作图以确定抗体是否结合HER2上的7C2/7F3表位(例如HER2 ECD的大约第22位残基至大约第53位残基区域内的任何一个或多个残基，残基编号方式包括信号肽)。

“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处置和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括那些早就患有癌症的以及那些要预防癌症的。因此，本文中待治疗的患者可能已经诊断为患有癌症或者可能有患上癌症的倾向性或易感性。

术语“有效量”指在患者中有效治疗癌症的药物量。有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓和优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓和优选阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与癌症有关的症状。就药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞而言，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。有效量可延长无进展存活(例如根据实体瘤的响应评估标准(Response Evaluation Criteria for Solid Tumors，RECIST)或CA-125变化的测量)，导致客观响应(包括部分响应，PR或完全响应，CR)，增加总体存活时间，和/或改善癌症的一种或多种症状(例如根据FOSI的评估)。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和

环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烃基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；TLK 286(TELCYTA^TM)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol)，

)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)

CPT-11(伊立替康(irinotecan)，

)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))和蒽环类抗生素(anthracyclines)诸如annamycin、AD 32、alcarubicin、柔红霉素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、DX-52-1、表柔比星(epirubicin)、GPX-100、伊达比星(idarubicin)、KRN5500、美诺立尔(menogaril)、dynemicin包括dynemicin A、埃斯波霉素(esperamicin)、新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、

多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、脂质体多柔比星和脱氧多柔比星)、依索比星(esorubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinicacid)(leucovorin)；醋葡醛内酯(aceglatone)；抗叶酸抗瘤剂，诸如

LY231514培美曲塞(pemetrexed)、二氢叶酸还原酶抑制剂诸如甲氨喋呤(methotrexate)、抗代谢物类，诸如5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)及其前体药物诸如UFT、S-1和卡培他滨(capecitabine)，及胸苷酸合酶抑制剂和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶抑制剂诸如雷替曲塞(raltitrexed)(TOMUDEX^TM，TDX)；二氢嘧啶脱氢酶抑制剂诸如恩尿嘧啶(eniluracil)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；

多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)和紫杉烷类(taxanes)，例如

帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANE^TM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(AmericanPharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和多西他塞(docetaxel)(

-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)

6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂(platinum)；铂类似物或基于铂的类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)

依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)

长春花生物碱类(vinca alkaloid)；长春瑞滨(vinorelbine)

能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoid)，诸如视黄酸(retinoic acid)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。

该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如抗***类和选择性***受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括

他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和

托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节***生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、

伏氯唑(vorozole)、

来曲唑(letrozole)和

阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制涉及异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如

疫苗、

疫苗和

疫苗；

rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；

rmRH；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。

“抗代谢物类化疗剂”指在结构上与代谢物相似但不能被身体以生产性方式利用的药剂。许多抗代谢物类化疗剂干扰核酸，RNA和DNA的生成。抗代谢物类化疗剂的例子包括吉西他滨(gemcitabine)

、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)(XELODA^TM)、6-巯基嘌呤、甲氨喋呤(methotrexate)、6-硫鸟嘌呤、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、阿糖胞苷(arabinosylcytosine ARA-C cytarabine)(CYTOSAR-

)、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC-)、偶氮胞嘧啶(azocytosine)、脱氧胞嘧啶(deoxycytosine)、pyridmidene、氟达拉滨(fludarabine)

克拉屈滨(cladrabine)、2-脱氧-D-葡萄糖等。优选的抗代谢物类化疗剂是吉西他滨。

“吉西他滨”或“2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷单盐酸(b-异构体)”是展现出抗肿瘤活性的核苷类似物。盐酸吉西他滨的经验式是C9H11F2N3O4·HCl。盐酸吉西他滨由Eli Lilly以商标

销售。

“基于铂的化疗剂”包括包含铂作为分子的主要部分的有机化合物。基于铂的化疗剂的例子包括卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatinum)。

“基于铂的化疗法”指使用一种或多种基于铂的化疗剂的疗法，任选联合一种或多种其它化疗剂。

“化疗法耐药性”癌症指癌症患者在接受化疗方案时(癌症)有进展(即患者是“化疗不应性”的)，或者患者在完成化疗方案后12个月内(例如6个月内)(癌症)有进展。

“铂耐药性”癌症指癌症患者在接受基于铂的化疗法时(癌症)有进展(即患者是“铂不应性”的)，或者患者在完成基于铂的化疗方案后12个月内(例如6个月内)(癌症)有进展。

“抗血管发生剂”指阻断或一定程度的干扰血管发育的化合物。抗血管发生因子可以是例如结合涉及促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。在本文中优选的抗血管发生因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如Bevacizumab

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠***相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板(衍生)生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；***-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。

在用于本文时，术语“靶向EGFR的药物”指结合EGFR并任选抑制EGFR活化的治疗剂。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRLHB 8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利第4,943,533号，Mendelsohn等)及其变体，诸如嵌合化225(C225或Cetuximab；

)和重构人225(H225)(参见WO 96/40210，ImcloneSystems Inc.)；IMC-11F8，一种完全人的EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利第5,212,290号)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利第5,891,996号中所记载的；及结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF(参见WO 98/50433，Abgenix)；EMD 55900(Stragliotto等，Eur.J.Cancer 32A：636-640(1996))；EMD7200(matuzumab)，一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，其与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合；及mAb 806或人源化mAb 806(Johns等，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可偶联细胞毒剂，如此产生免疫偶联物(参见例如EP 659,439 A2，Merck PatentGmbH)。结合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib(IRESSA；AstraZeneca)；CP-358774或Erlotinib(TARCEVA^TM；Genentech/OSI)；和AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)；EMD-7200。

“酪氨酸激酶抑制剂”指抑制酪氨酸激酶诸如HER受体的酪氨酸激酶活性的分子。此类抑制剂的例子包括上一段中提到的靶向EGFR的药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可从Takeda购买的TAK165；CP-724，714，一种口服的ErbB2受体酪氨酸激酶选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；优先结合EGFR但抑制HER2和EGFR二者过表达细胞的双重HER抑制剂，诸如EKB-569(可从Wyeth购买)；GW572016(可从Glaxo购买)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从Novartis购买)；泛(pan)HER抑制剂，诸如canertinib(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，诸如可从ISISPharmaceuticals购买、抑制Raf-1信号传导的反义剂ISIS-5132；非HER靶向TK抑制剂，诸如可从Glaxo购买的Imatinib mesylate(GLEEVAC^TM)；MAPK胞外调控激酶I抑制剂CI-1040(可从Pharmacia购买)；喹唑啉类，诸如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，诸如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶类，4-(苯氨基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4，5-双(4-氟苯胺基)-酞亚胺)；含硝基噻吩模块的tyrphostines；PD-0183805(Warner-Lambert)；反义分子(例如那些结合HER编码核酸的)；喹喔啉类(美国专利第5,804,396号)；tryphostins(美国专利第5,804,396号)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/ScheringAG)；泛HER抑制剂，诸如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；Imatinib mesylate(Gleevac；Novartis)；PKI 166(Novartis)；GW2016(GlaxoSmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或任何以下专利出版物中所记载的：美国专利第5,804,396号；WO 99/09016(American Cyanimid)；WO 98/43960(American Cyanamid)；WO 97/38983(Warner Lambert)；WO 99/06378(Warner Lambert)；WO 99/06396(WarnerLambert)；WO 96/30347(Pfizer，Inc.)；WO 96/33978(Zeneca)；WO 96/3397(Zeneca)；WO 96/33980(Zeneca)。

本文中，化疗剂的“固定的”(fixed)或“平坦的”(flat)剂量指不考虑患者的体重(WT)和体表面积(BSA)而施用于人类患者的剂量。因此，固定的或平坦的剂量不是作为mg/kg剂量或mg/m²剂量提供的，而是作为治疗剂的绝对量提供的。

“加载”(loding)剂量在本文中一般包括施用于患者的治疗剂的初始剂量，后续其一个或多个维持剂量。一般而言，施用单个加载剂量，但本文中还涵盖多个加载剂量。通常，所施用的加载剂量的量超过所施用的维持剂量的量，和/或加载剂量的施用比维持剂量更频繁，从而比使用维持剂量更早达到治疗剂的期望稳态浓度。

“维持”(maintenance)剂量在本文中指在治疗期间施用于患者的一个或多个剂量的治疗剂。通常，维持剂量以一定的治疗间隔施用，例如大约每周一次，大约每两周一次，大约每三周一次，或大约每四周一次。

II.抗体的生产

由于在优选的实施方案中，HER二聚化抑制剂是抗体，下文描述了用于生成依照本发明使用的HER抗体的例示性技术。用于生成抗体的HER抗原可以是例如可溶形式的HER受体胞外结构域或其包含期望表位的部分。或者，在其细胞表面表达HER的细胞(例如经转化而过表达HER2的NIH-3T3细胞；或癌瘤细胞系，诸如SK-BR-3细胞，参见Stancovski等，PNAS(USA)88：8691-8695(1991))可用于生成抗体。可用于生成抗体的其它形式HER受体对于本领域技术人员将是显而易见的。

(i)多克隆抗体

多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂、或R¹N＝C＝NR(其中R和R¹是不同的烃基)，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔

蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。

通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于家兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。

(ii)单克隆抗体

本领域有多种方法可用于制备本文中的单克隆抗体。例如，单克隆抗体可使用最初由Kohler等，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法、通过重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)来制备。

在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。

优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生成人单克隆抗体也已有记载(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1987)。

可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

可通过常规抗体纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。

编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外生成抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)及Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。

在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌体抗体库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)及Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。

还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利第4,816,567号；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价接合。

典型的是，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。

(iii)人源化抗体

本领域已经记载了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们典型的取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中本质上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型的是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。

用于构建人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993))。

更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。

美国专利第6,949,245号记载了结合HER2并阻断配体对HER受体之活化的例示性人源化HER2抗体的生成。本文中特别感兴趣的人源化抗体基本上像鼠单克隆抗体2C4(或其Fab片段)一样有效的阻断EGF、TGF-α和/或HRG介导的MAPK激活，和/或基本上像鼠单克隆抗体2C4(或其Fab片段)一样有效的结合HER2。本文中的人源化抗体可例如包含掺入人重链可变域的非人高变区残基，而且还可在选自69H、71H和73H的位置包含框架区(FR)替代，采用的是Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中列出的可变域编号***。在一个实施方案中，人源化抗体在69H、71H和73H的两个或所有位置包含FR替代。

本文中感兴趣的例示性人源化抗体包含重链可变域互补决定残基GFTFTDYTMX，其中X优选是D或S(SEQ ID NO：7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO：8)；和/或NLGPSFYFDY(SEQ ID NO：9)，任选包含那些CDR残基的氨基酸修饰，例如其中修饰基本上保持或改善抗体的亲和力。例如，感兴趣抗体变体可在上述重链可变域CDR序列中具有约1处至约7处或者约5处氨基酸替代。此类抗体变体可通过亲和力成熟来制备，例如如下文所述。最优选的人源化抗体包含SEQ ID NO：4中的重链可变域氨基酸序列。

例如，在前一段中的那些重链可变域CDR残基之外，人源化抗体还可包含轻链可变域互补决定残基KASQDVSIGVA(SEQ ID NO：10)；SASYX¹X²X³，其中X¹优选是R或L，X²优选是Y或E，而X³优选是T或S(SEQID NO：11)；和/或QQYYIYPYT(SEQ ID NO：12)。此类人源化抗体任选包含上述CDR残基的氨基酸修饰，例如其中修饰基本上保持或改善抗体的亲和力。例如，感兴趣抗体变体可在上述轻链可变域CDR序列中具有约1处至约7处或者约5处氨基酸替代。此类抗体变体可通过亲和力成熟来制备，例如如下文所述。最优选的人源化抗体包含SEQ ID NO：3中的轻链可变域氨基酸序列。

本申请还涵盖亲和力成熟的抗体，它结合HER2并阻断配体对HER受体之活化。亲本抗体可以是人抗体或人源化抗体，例如所含轻链可变域和/或重链可变域序列分别为SEQ ID NO：3和4(即包含Pertuzumab的VL和/或VH)的抗体。亲和力成熟的抗体优选以优于鼠2C4或Pertuzumab的亲和力结合HER2受体(例如根据使用HER2胞外结构域(ECD)ELISA的评估，例如亲和力提高约2倍或约4倍至约100倍或约1000倍)。例示性的用于替代的重链可变域CDR残基包括H28、H30、H34、H35、H64、H96、H99，或者两个或更多(例如这些残基中的2个、3个、4个、5个、6个或7个)的组合。用于改变的轻链可变域CDR残基的例子包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97，或者两个或更多(例如这些残基中的2个至3个、4个、5个或直到约10个)的组合。

涵盖各种形式的人源化抗体或亲和力成熟的抗体。例如，人源化抗体或亲和力成熟的抗体可以是抗体片段，诸如Fab，它任选与一种或多种细胞毒剂偶联以产生免疫偶联物。或者，人源化抗体或亲和力成熟的抗体可以是完整抗体，诸如完整的IgG1抗体。优选的完整IgG1抗体包含SEQ ID NO：13中的轻链序列和SEQ ID NO：14中的重链序列。

(iv)人抗体

作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J_H)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.7：33(1993)；及美国专利第5,591,669号、第5,589,369号和第5,545,807号。或者，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)所记载的技术，由未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利第5,565,332号和第5,573,905号。

如上所述，还可通过体外激活B细胞来生成人抗体(参见美国专利第5,567,610号和第5,229,275号)。

1998年6月30日公告的美国专利第5,772,997号和1997年1月3日公布的WO 97/00271中记载了人HER2抗体。

(v)抗体片段

已经开发了用于生成包含一个或多个抗原结合区的抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)₂片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)₂片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利第5,571,894号；美国专利第5,587,458号。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利第5,641,870号中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

(vi)双特异性抗体

双特异性抗体指具有对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合HER2蛋白质的两种不同表位。其它此类抗体可将HER2结合位点与EGFR、HER3和/或HER4的结合位点组合在一起。或者，可将HER2臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合在一起，使得细胞防御机制聚焦于表达HER2的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达HER2的细胞。这些抗体拥有HER2结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨喋呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)₂双特异性抗体)。

WO 96/16673记载了一种双特异性HER2/FcγRIII抗体，美国专利第5,837,234号披露了一种双特异性HER2/FcγRI抗体IDM1(Osidem)。WO98/02463显示了一种双特异性HER2/Fcα抗体。美国专利第5,821,337号教授了一种双特异性HER2/CD3抗体。MDX-210是一种双特异性HER2/FcγRIII抗体。

用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)中披露了类似的规程。

依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域。优选的是，在至少一种融合物中，第一重链恒定区(CH1)包含轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA***分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列***同一个表达载体。

在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，Methodsin Enzymology 121：210(1986)。

依照美国专利第5,731,168号中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定域的C_H3结构域。在该方法中，将第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。

双特异性抗体包括交联的或“异源偶联的”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫***细胞靶向不想要的细胞(美国专利第4,676,980号)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起披露于美国专利第4,676,980号。

文献中还记载了自抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)₂片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂***的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

最新的进展便于从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了生成完全人源化的双特异性抗体F(ab′)₂分子。每个Fab′片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳瘤靶物的溶胞活性。

还记载了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域与另一个片段上的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。

涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。

(vii)其它氨基酸序列修饰

涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或***和/或替代。只要最终的构建物具有期望的特性，可进行删除、***和替代的任意组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989)所记载的。这里，鉴定了一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展现出功能敏感性的氨基酸位置。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在给定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描诱变或随机诱变，并对所表达的抗体变体筛选期望活性。

氨基酸序列***包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围从一个残基至包含上百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它***变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶(例如用于ADEPT)或提高抗体血清半衰期的多肽。

另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但也涵盖FR改变。保守替代在表1中显示在标题“优选替代”下。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可以引入表1中称为“例示替代”的更多实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。

表1

原始残基	例示替代	优选替代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Asp；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu；Asn	Glu
			Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
			Glu(E)	Asp；Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
			Ieu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Val；Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger，于：Biochemistry，第2版，pp.73-75，Worth Publishers，New York，1975)：

(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)

(2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)

(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)

(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)

或者，基于共同的侧链特性，可将天然存在残基如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。

任何不牵涉保持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。

特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改良的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法牵涉使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单的说，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体与人HER2之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，就如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。

抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。改变意味着删除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。

抗体的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。

若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请US 2003/0157108 A1(Presta，L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621 A1(Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd.)。WO 03/011878(Jean-Mairet等)和美国专利第6,602,684号(Umana等)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 97/30087(Patel等)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 98/58964(Raju，S.)和WO 99/22764(Raju，S.)。

可能希望在效应器功能方面改良本发明的抗体，例如增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改进的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中记载的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶胞和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer DrugDesign 3：219-230(1989)。

WO 00/42072(Presta，L.)记载了在存在人效应细胞时具有改进的ADCC功能的抗体，其中所述抗体在其Fc区中包含氨基酸替代。优选的是，具有改进的ADCC的抗体在Fc区的位置298、333和/或334(Eu残基编号方式)包含替代。优选的是，改变的Fc区是在这些位置中的一个、两个或三个处包含替代或由其组成的人IgG1 Fc区。任选将此类替代与一处或多处增加C1q结合和/或CDC的替代结合起来。

WO 99/51642、美国专利第6,194,551 B1号、美国专利第6,242,195 B1号、美国专利第6,528,624 B1号和美国专利第6,538,124号(Idusogie等)中记载了具有改变的C1q结合和/和补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体。所述抗体在其Fc区的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334(Eu残基编号方式)中的一个或多个处包含氨基酸替代。

为了延长抗体的血清半衰期，可将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)，如例如美国专利第5,739,277号中所记载的。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。

WO 00/42072(Presta，L.)和US2005/0014934A1(Hinton等)中记载了具有改进的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合和延长的半衰期的抗体。这些抗体包含其中具有一处或多处改进Fc区对FcRn结合的替代的Fc区。例如，Fc区可在一个或多个以下位置具有替代：238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428或434(Eu残基编号方式)。优选的具有改进的FcRn结合的含Fc区抗体变体在其Fc区的位置307、380和434(Eu残基编号)中的一个、两个或三个处包含氨基酸替代。

还涵盖具有三个或更多(优选四个)功能性抗原结合位点的工程改造抗体(美国申请号US 2002/0004587 A1，Miller等)。

编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

(viii)筛选具有期望特性的抗体

上文已经描述了用于生成抗体的技术。如果需要，可以进一步选择具有某些生物学特性的抗体。

为了鉴定阻断配体对HER受体之活化的抗体，可测定抗体阻断HER配体结合表达HER受体(例如连同另一种HER受体，该HER受体与感兴趣HER受体形成HER异寡聚体)的细胞的能力。例如，可将天然表达或者经转染而表达HER异寡聚体的HER受体的细胞与抗体一起温育，然后暴露于经标记的HER配体。然后可评估抗体阻断配体结合HER异寡聚体中的HER受体的能力。

例如，可以以24孔板的形式在冰上使用单层MCF7培养物进行HER2抗体对HRG结合MCF7乳瘤细胞系的抑制，基本上如美国专利第6,949,245号中所记载的。可将HER2单克隆抗体添加到每个孔中并温育30分钟。然后可加入¹²⁵I标记的rHRGβ_1177-224(25pm)，并可继续温育4-16小时。可绘制剂量-应答曲线，并可计算感兴趣抗体的IC₅₀值。在一个实施方案中，阻断配体对HER受体之活化的抗体在此测定法中抑制HRG结合MCF7细胞的IC₅₀为约50nM或更低，更优选10nM或更低。若抗体是抗体片段诸如Fab片段，则在此测定法中抑制HRG结合MCF7细胞的IC₅₀可以是例如约100nM或更低，更优选50nM或更低。

或者/另外，可评估抗体阻断HER配体刺激HER异寡聚体中存在的HER受体的酪氨酸磷酸化的能力。例如，可将内源表达或者经转染而表达HER受体的细胞与抗体一起温育，然后使用抗磷酸酪氨酸单克隆(任选偶联有可检测标记物)测定HER配体依赖性酪氨酸磷酸化活性。美国专利第5,766,863号中记载的激酶受体活化测定法也可用于测定HER受体活化和抗体对该活性的阻断。

在一个实施方案中，可以筛选在MCF7细胞中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的抗体，基本上如美国专利第6,949,245号中所记载的。例如，可将MCF7细胞分配到24孔板中，并将HER2的单克隆抗体加入每个孔中，于室温温育30分钟；然后可向每个孔中加入rHRGβ_1177-244至终浓度0.2nM，并可继续温育8分钟。从每个孔中吸走培养基，通过加入100μl SDS样品缓冲液(5％SDS，25mM DTT，25mM Tris-HCl，pH 6.8)来终止反应。可在4-12％梯度凝胶(Novex)上对每一份样品(25μl)进行电泳，然后通过电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上。可对抗磷酸酪氨酸(以1μg/ml)免疫印迹显影，并通过反射密度法(reflectance densitometry)对分子量约180,000的主要反应性条带的强度定量。在此测定法中，所选抗体优选将HRG刺激p180酪氨酸磷酸化显著抑制至对照的大约0-35％。可绘制通过反射密度法测定的对HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的抑制作用的剂量-应答曲线，并可计算感兴趣抗体的IC₅₀。在一个实施方案中，阻断配体对HER受体之活化的抗体在此测定法中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的IC₅₀为约50nM或更低，更优选10nM或更低。若抗体是抗体片段诸如Fab片段，则在此测定法中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的IC₅₀可以是例如约100nM或更低，更优选50nM或更低。

还可评估抗体对MDA-MB-175细胞的生长抑制效果，例如基本上如Schaefer等，Oncogene 15：1385-1394(1997)中所记载的。依照此测定法，可将MDA-MB-175细胞用HER2单克隆抗体(10μg/mL)处理4天，并用结晶紫染色。与HER2抗体的温育对此细胞系显示的生长抑制效果可能与使用单克隆抗体2C4所展示的相似。在还有一个实施方案中，外源HRG不会显著逆转这种抑制作用。优选的是，存在和缺乏外源HRG时，该抗体都将能够以大于单克隆抗体4D5的程度(并且任选以大于单克隆抗体7F3的程度)抑制MDA-MB-175细胞的细胞增殖。

在一个实施方案中，根据免疫共沉淀实验的测定，诸如美国专利第6,949,245号中所记载的，感兴趣HER2抗体可在MCF7和SK-BR-3细胞中阻断调蛋白依赖性的HER2与HER3结合，实质上比单克隆抗体4D5更有效，优选实质上比单克隆抗体7F3更有效。

为了鉴定生长抑制性HER2抗体，可筛选抑制HER2过表达的癌细胞生长的抗体。在一个实施方案中，在约0.5-30μg/ml的抗体浓度，所选生长抑制性抗体能够将细胞培养物中SK-BR-3细胞的生长抑制约20-100％，优选约50-100％。为了鉴定此类抗体，可进行美国专利第5,677,171号中记载的SK-BR-3测定法。依照此测定法，在补充有10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素链霉素的培养基DMEM和F12的1∶1混合液中培养SK-BR-3细胞。将SK-BR-3细胞以20,000个细胞分配入35mm细胞培养皿(2ml/35mm培养皿)。每个培养皿加入0.5-30μg/ml HER2抗体。6天后，使用电子COULTER^TM细胞计数器对细胞数计数，与未处理细胞进行比较。可选择那些将SK-BR-3细胞的生长抑制约20-100％或约50-100％的抗体作为生长抑制性抗体。关于用于筛选生长抑制性抗体诸如4D5和3E8的测定法，参见美国专利第5,677,171号。

为了选择诱导凋亡的抗体，可利用使用BT474细胞的膜联蛋白结合测定法。如前一段所讨论的，在培养皿中培养和接种BT474细胞。然后除去培养基，只用新鲜培养基或者含有10μg/ml单克隆抗体的培养基替换。在3天温育期后，用PBS洗涤细胞单层，并通过胰蛋白酶消化脱离。然后如上文关于细胞死亡测定法所讨论的，将细胞离心，重悬于Ca²⁺结合缓冲液，并等分到试管中。然后往试管中加入经标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白V-FTIC)(1μg/ml)。可使用FACSCAN^TM流式细胞计数仪和FACSCONVERT^TMCellQuest软件(Becton Dickinson)来分析样品。选择那些相对于对照诱导统计学显著水平的膜联蛋白结合的抗体作为诱导凋亡的抗体。在膜联蛋白结合测定法之外，还可利用使用BT474细胞的DNA染色测定法。为了进行此测定法，将已经如前两段所述用感兴趣抗体处理过的BT474细胞与9μg/ml HOECHST33342^TM于37℃温育2小时，然后在EPICS ELITE^TM流式细胞计数仪(CoulterCorporation)上使用MODFIT LT^TM软件(Verity Software House)进行分析。可选择在此测定法中诱导的凋亡细胞百分比变化为未处理细胞的2倍或更高(优选3倍或更高)(直到100％凋亡细胞)的抗体作为促凋亡抗体。关于用于筛选诱导凋亡的抗体诸如7C2和7F3的测定法，参见WO 98/17797。

为了筛选结合HER2上感兴趣抗体所结合的表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow和David Lane，1988中所记载的，以评估所述抗体是否交叉阻断诸如2C4或Pertuzumab等抗体与HER2的结合。或者/另外，可通过本领域知道的方法进行表位作图和/或可研究抗体-HER2结构(Franklin等，Cancer Cell 5：317-328(2004))以了解抗体结合HER2的哪个/哪些结构域。

(ix)Pertuzumab组合物

在HER2抗体组合物的一个实施方案中，该组合物包含主要种类Pertuzumab抗体及其一种或多种变体的混合物。本文中Pertuzumab主要种类抗体的优选实施方案是包含SEQ ID No.3和4中的轻链和重链可变域氨基酸序列，最优选包含选自SEQ ID No.13和17的轻链氨基酸序列及选自SEQ IDNo.14和18的重链氨基酸序列的抗体(包括那些序列的脱酰胺和/或氧化变体)。在一个实施方案中，组合物包含主要种类Pertuzumab抗体及其包含氨基末端前导延伸的氨基酸序列变体的混合物。优选的是，所述氨基末端前导延伸位于抗体变体的轻链上(例如位于抗体变体的一条或两条轻链上)。所述主要种类HER2抗体或抗体变体可以是全长抗体或抗体片段(例如Fab或F(ab’)₂片段)，但优选二者都是全长抗体。本文中的抗体变体可以在其任何一条或多条重链或轻链上包含氨基末端前导延伸。优选的是，所述氨基末端前导延伸位于抗体的一条或两条轻链上。所述氨基末端前导延伸优选包含VHS-或由其组成。组合物中氨基末端前导延伸的存在可通过多种分析技术来检测，包括但不限于N-末端序列分析、电荷异质性的测定法(例如阳离子交换层析或毛细管区带电泳)、质谱等。组合物中抗体变体的量通常在如下范围内，从构成用于检测变体的任何测定法(优选N-末端序列分析)的检出限的量至少于主要种类抗体量的量。通常，组合物中约20％或更少(例如从约1％至约15％，例如从5％至约15％)的抗体分子包含氨基末端前导延伸。这样的百分比量优选使用定量N-末端序列分析或阳离子交换分析(优选使用高分辨率、弱阳离子交换柱，诸如PROPAC WCX-10^TM阳离子交换柱)来测定。在氨基末端前导延伸变体之外，还涵盖主要种类抗体和/或变体的氨基酸序列改变，包括但不限于在其一条或所有两条重链上包含C-末端赖氨酸残基的抗体、脱酰胺抗体变体等。

此外，主要种类抗体或变体还可包含糖基化变异，其非限制性例子包括包含附着于其Fc区的G1或G2寡糖结构的抗体、包含附着于其轻链的碳水化合物模块的抗体(例如一种或两种碳水化合物模块，诸如葡萄糖或半乳糖附着于抗体的一条或两条轻链，例如附着于一个或多个赖氨酸残基)、包含一条或两条非糖基化重链的抗体、或包含附着于其一条或两条重链的唾液酸化寡糖的抗体等。

组合物可从表达HER2抗体的基因工程细胞系回收，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，或者可通过肽合成来制备。

(x)免疫偶联物

本发明还涉及包含抗体且其与细胞毒剂偶联的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、毒素(例如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体)或放射性同位素(即放射偶联物)。

上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素的偶联物，诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美国专利第5,208,020号)、单端孢菌毒素(trichothene)和CC1065。

在本发明的一个优选实施方案中，将抗体与一个或多个美登素分子偶联(例如每个抗体分子偶联约1个至约10个美登素分子)。例如，可将美登素转变为May-SS-Me，后者可还原为May-SH3并与经修饰抗体反应(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992))以生成美登木素生物碱类-抗体免疫偶联物。

另一种感兴趣的免疫偶联物包含抗体且其与一个或多个加利车霉素分子偶联。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和θ^I ₁(Hinman等，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode等，CancerResearch 58：2925-2928(1998))。还可参见美国专利第5,714,586号；第5,712,374号；第5,264,586号和第5,773,001号，明确收入本文作为参考。

可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(PhytolacaAmericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。

本发明还涵盖抗体与具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。

有多种放射性同位素可用于生成放射偶联的HER2抗体。例子包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、p³²和Lu的放射性同位素。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体与细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己胺-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯-2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可制备蓖麻毒蛋白免疫毒素，如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所记载的。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992))。

或者，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体与细胞毒剂的融合蛋白。

本文还涵盖其它免疫偶联物。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物中的一种连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。还可将抗体包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递***中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编，1980。

本文公开的抗体还可配制成免疫脂质体。可通过本领域知道的方法来制备包含抗体的脂质体，诸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；1997年10月23日公布的WO 97/38731中所记载的。美国专利第5,013,556号中披露了循环时间延长的脂质体。

特别有用的脂质体可用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有限定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联，如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所记载的。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等，J.National CancerInst.81(19)：1484(1989)。

III.选择接受治疗的患者

本文中的患者在治疗前进行诊断测试。一般而言，如果进行诊断测试，那么可以从需要治疗的患者获得样品。若受试者患有癌症，则样品可以是肿瘤样品或其它生物学样品，诸如生物学流体，包括但不限于血液、尿液、唾液、腹水或衍生物诸如血清和血浆等等。

若对肿瘤样品进行诊断测定法，则肿瘤样品可以来自卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌、转移性乳腺癌(MBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、***癌或结肠直肠癌肿瘤样品等。本文中的生物学样品可以是经过固定的样品，例如***固定、石蜡包埋的(FFPE)样品，或者是冷冻的样品。

在一个实施方案中，评估患者中的EGF和/或TGF-α水平，其中EGF和/或TGF-α水平与正常水平相比升高表明该患者是接受HER二聚化抑制剂治疗的候选者。此类EGF和/或TGF-α水平可以在体内评估或者在取自患者的各种生物学样品中评估。优选的是，所测试的生物学样品是血清或血浆样品。

用于测定mRNA或蛋白质表达的方法有多种，包括但不限于基因表达概况分析、聚合酶链式反应(PCR)包括定量实时PCR(qRT-PCR)、微阵列分析、基因表达系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)、MassARRAY、通过大量平行签名测序(Massive Parallel Signiture Sequencing，MPSS)进行的基因表达分析、蛋白质组学、免疫组化(IHC)等。优选对mRNA定量。所述mRNA分析优选使用聚合酶链式反应(PCR)技术或通过微阵列分析来进行。若采用PCR，则优选的PCR形式是定量实时PCR(qRT-PCR)。在一个实施方案中，如果上文提到的一种或多种基因的表达处于中值或高于中值，例如与相同肿瘤类型的其它样品相比，那么认为是阳性表达。可以在与基因表达的测量基本上同时测定中值表达水平，或者可以事先测定。

多篇已发表的期刊论文(例如Godfrey等，J.Molec.Diagnostics 2：84-91(2000)；Specht等，Am.J.Pathol.158：419-29(2001))中给出了使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源的代表性基因表达概况分析方案的步骤：包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增。简单的说，一种代表性方法首先将石蜡包埋的肿瘤组织样品切成约10微米厚的切片。然后提取RNA并除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，如果需要可以包括RNA修复和/或扩增步骤，并使用基因特异性启动子逆转录RNA，然后PCR。最后分析数据，根据所检验肿瘤样品中鉴定的特征性基因表达模式来确定患者可用的最佳治疗选项。

实施例1提供了一种特定的血清ELISA生物测定法方案。

还可利用体内诊断测定法来评估EGF和/或TGF-α，例如通过施用结合待检测分子且标记有可检测标记物(例如放射性同位素)的分子(诸如抗体)，然后对患者进行外部扫描以定位所述标记物。

在评估EGF和/或TGF-α之外，可以测定癌症中的HER表达或扩增。多种诊断/预后测定法可用于此目的。在一个实施方案中，可通过IHC来分析HER过表达，例如使用

(Dako)。可将来自肿瘤活检的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法并对照如下HER2蛋白质染色强度标准：

得分0：未观察到染色或者在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。

得分1+：在超过10％的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。所述细胞只在其部分膜中有染色。

得分2+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。

得分3+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。

那些HER2过表达评估得分为0或1+的肿瘤可表征为HER2未过表达，而那些得分为2+或3+的肿瘤可表征为HER2过表达。

HER2过表达的肿瘤可根据对应于每个细胞表达的HER2分子拷贝数的免疫组化得分进行定级，并且可通过生化方法测定：

0＝0-10,000个拷贝/细胞，

1+＝至少约200,000个拷贝/细胞，

2+＝至少约500,000个拷贝/细胞，

3+＝至少约2,000,000个拷贝/细胞。

导致酪氨酸激酶的配体依赖性活化的3+水平的HER2过表达(Hudziak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7159-7163(1987))发生于约30％的乳腺癌中，而且在这些患者中，无复发存活和总体存活减少(Slamon等，Science244：707-712(1989)；Slamon等，Science 235：177-182(1987))。

或者/另外，可对***固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定法诸如INFORM^TM(Ventana，Arizona)或PATHVISION^TM(Vysis，Illinois)以测定肿瘤中HER2扩增的程度(如果有的话)。

在一个实施方案中，所述癌症是表达(可以是过表达)EGFR的癌症，可对所述表达进行评估，如上文所述用于评估HER2表达的方法。

IV.药用配制剂

依照本发明使用的HER二聚化抑制剂的治疗用配制剂可通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编，1980)混合，通常以冻干剂型或水溶液的形式制备供贮存。还涵盖抗体晶体(参见美国专利申请2002/0136719)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。WO97/04801中记载了冻干抗体配制剂，明确收入本文作为参考。

优选用于治疗用途的Pertuzumab配制剂在20mM乙酸组氨酸，120mM蔗糖，0.02％聚山梨醇20，pH 6.0中含有30mg/mL Pertuzumab。一种备选的Pertuzumab配制剂含有25mg/mL Pertuzumab，10mM组氨酸-HCl缓冲剂，240mM蔗糖，0.02％聚山梨醇20，pH 6.0。

本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。下面“方法”一节中描述了可以与HER二聚化抑制剂组合的多种药物。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递***中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编，1980。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

V.使用HER二聚化抑制剂的治疗

本发明提供了用于在产生升高水平的EGF和/或TGF-α的癌症患者中延长存活的方法，包括对患者施用延长该患者的存活的量的HER二聚化抑制剂。优选的是，所述HER二聚化抑制剂是HER2二聚化抑制剂和/或抑制HER异二聚化。

用于鉴定HER二聚化抑制剂疗法候选患者的方法已经在上文节III中讨论。

可以用HER二聚化抑制剂治疗的多种癌症的例子已在上文定义部分列出。优选的癌症适应证包括卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌、乳腺癌包括转移性乳腺癌(MBC)、肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)、***癌和结肠直肠癌。在一个实施方案中，所治疗的癌症是晚期的、顽固性的、复发性的、化疗耐药性的和/或铂耐药性的癌症。

HER二聚化抑制剂疗法延长TTP和/或存活。在一个实施方案中，HER二聚化抑制剂疗法使TTP或存活比通过施用针对所治疗癌症的批准的抗肿瘤剂或护理标准而实现的TTP或存活多延长至少约5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％。

在优选的实施方案中，本发明提供了用于在患有卵巢、腹膜或输卵管癌症且其癌症表现出HER2活化的患者中延长病情进展前时间(TTP)或存活的方法，包括对患者施用延长该患者的TTP或存活的量的Pertuzumab。该患者可患有晚期的、顽固性的、复发性的、化疗耐药性的和/或铂耐药性的卵巢、腹膜或输卵管癌症。对患者施用Pertuzumab可以例如使TTP或存活比对此类患者施用托泊替康或脂质体多柔比星而实现的TTP或存活多延长至少约5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％。

HER二聚化抑制剂依照已知方法施用于人类患者，诸如静脉内施用，例如推注或一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面或吸入路径。优选静脉内施用抗体。

对于癌症的预防或治疗，HER二聚化抑制剂的剂量将取决于如上定义的待治疗癌症的类型、癌症的严重程度和进程、施用抗体是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抗体的响应、及主治医师的判断。

在一个实施方案中，施用固定剂量的HER二聚化抑制剂。合适的是，固定剂量可以一次性施用或经过一系列治疗施用于患者。若施用固定剂量，则该剂量优选在约20mg到约2000mg HER二聚化抑制剂的范围内。例如，固定剂量可以是约420mg、约525mg、约840mg、或约1050mg HER二聚化抑制剂，诸如Pertuzumab。

若施用多剂，则可以是例如约每周、约每两周、约每三周、或约每四周施用，但优选约每三周施用。固定剂量可以例如持续施用直至病情进展、不良事件、或医师确定的其它时间为止。例如，可以施用约2剂、3剂、或4剂、直到约17剂或更多剂固定剂量。

在一个实施方案中，施用一个或多个加载剂量的抗体，随后是一个或多个维持剂量的抗体。在另一个实施方案中，对患者施用多个相同的剂量。

根据本发明的一个优选实施方案，施用约840mg(加载剂量)固定剂量的HER二聚化抑制剂(例如Pertuzumab)，随后是一个或多个约420mg(维持剂量)剂量的所述抗体。维持剂量优选约每三周施用，总共施用至少2剂，直到17剂或更多剂。

根据本发明的另一个优选实施方案，施用一个或多个约1050mg固定剂量的HER二聚化抑制剂(例如Pertuzumab)，例如每三周施用。根据该实施方案，施用一个、两个或更多个固定剂量，施用例如可长达1年(17个周期)及所需更长时间。

在另一个实施方案中，施用约1050mg固定剂量的HER二聚化抑制剂(例如Pertuzumab)作为加载剂量，随后是一个或多个约525mg的维持剂量。根据本实施方案，每三周对患者施用约1个、2个或更多个维持剂量。

尽管可以作为单一抗肿瘤剂来施用HER二聚化抑制剂，但是任选用HER二聚化抑制剂与一种或多种化疗剂的组合来治疗患者。优选的是，至少一种化疗剂是抗代谢物类化疗剂，诸如吉西他滨。联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用或同时施用，及任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。如此，可在施用HER二聚化抑制剂之前或之后施用抗代谢物类化疗剂。在此实施方案中，至少一次抗代谢物类化疗剂的施用与至少一次HER二聚化抑制剂的施用之间的计时优选为约1个月或更短，最优选约2周或更短。或者，以单一的配制剂或分开的配制剂同时对患者施用抗代谢物类化疗剂和HER二聚化抑制剂。化疗剂(例如抗代谢物类化疗剂，诸如吉西他滨)与HER二聚化抑制剂(例如Pertuzumab)的联合治疗可对患者产生协同的、或者大于叠加的治疗效益。

抗代谢物类化疗剂，如果施用的话，通常以其已知剂量施用，或者任选由于药物的联合作用或者由于施用抗代谢物类化疗剂造成的不良副作用而降低。可依照制造商的说明书使用此类化疗剂的制备和剂量给药时间表，或者由熟练从业人员凭经验确定。若抗代谢物类化疗剂是吉西他滨，优选的是，例如在三周周期的第1天和第8天施用约600mg/m²至1250mg/m²之间(例如约1000mg/m²)的一剂。

在HER二聚化抑制剂和抗代谢物类化疗剂之外，还可联合其它治疗方案。例如，可施用第二(第三、第四等)化疗剂，其中第二种化疗剂或是另一种不同的抗代谢物类化疗剂，或是非抗代谢物的化疗剂。例如，第二种化疗剂可以是紫杉烷(诸如帕利他塞或多西他塞)、卡培他滨或基于铂的化疗剂(诸如卡铂、顺铂或奥沙利铂)、蒽环类抗生素(诸如多柔比星，包括脂质体多柔比星)、托泊替康、培美曲塞、长春花生物碱类(诸如长春瑞滨)和TLK 286。可以施用不同化疗剂的“鸡尾酒”。

可以与HER二聚化抑制剂联合的其它治疗剂包括以下任一种或多种：第二种不同的HER二聚化抑制剂(例如生长抑制性HER2抗体诸如Trastuzumab或诱导HER2过表达细胞凋亡的HER2抗体诸如7C2、7F3或其人源化变体)；针对不同肿瘤相关抗原诸如EGFR、HER3、HER4的抗体；抗激素化合物，例如抗***化合物诸如他莫昔芬，或芳香酶抑制剂；保心药(以预防或减轻与治疗有关的任何心肌功能障碍)；细胞因子；靶向EGFR的药物(诸如

或Cetuximab)；抗血管发生剂(尤其是Genentech以商标AVASTIN^TM销售的Bevacizumab)；酪氨酸激酶抑制剂；COX抑制剂(例如COX-1或COX-2抑制剂)；非类固醇抗炎药，Celecoxib

法尼基转移酶抑制剂(例如可从Johnson and Johnson购买的Tipifarnib/ZARNESTRA^TM R115777或可从Schering-Plough购买的LonafarnibSCH66336)；结合癌胚蛋白CA 125的抗体，诸如Oregovomab(MoAb B43.13)；HER2疫苗(诸如Pharmexia的HER2 Auto Vac疫苗，或Dendreon的APC8024蛋白质疫苗，或GSK/Corixa的HER2肽疫苗)；其它HER靶向疗法(例如Trastuzumab、Cetuximab、ABX-EGF、EMD7200、Gefitinib、Erlotinib、CP724714、CI1033、GW572016、IMC-11F8、TAK165等)；Raf和/或ras抑制剂(参见例如WO 2003/86467)；盐酸多柔比星脂质体注射液拓扑异构酶I抑制剂诸如托泊替康；紫杉烷；HER2与EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂诸如lapatinib/GW572016；TLK286EMD-7200；治疗恶心的药物，诸如血清素拮抗剂、类固醇或苯并二氮卓；预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮疗法，包括表面或口服抗生素；治疗或预防腹泻的药物；降体温药物，诸如醋氨酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)或麦啶(meperidine)；造血生长因子等。

任何上述共施用药剂的合适剂量就是那些目前所使用的剂量，而且可以由于该药剂与HER二聚化抑制剂的联合作用(协同作用)而降低。

在上述治疗方案之外，还可对患者进行手术去除癌细胞和/或放疗。

若抑制剂是抗体，优选的是，所施用的抗体是裸抗体。然而，所施用的抑制剂可以与细胞毒剂偶联。优选的是，所偶联的抑制剂和/或其结合的抗原受到细胞的内在化，导致该偶联物杀伤其所结合的癌细胞的治疗功效提高。在一个优选的实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子包括美登木素生物碱类(maytansinoids)、加利车霉素(calicheamicin)、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。

本申请涵盖通过基因疗法来施用HER二聚化抑制剂。参见例如1996年3月14日公布的WO 96/07321，它关注使用基因疗法来生成胞内抗体。

有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内(in vivo)和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射到患者体内。对于回体治疗，取出患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患者体内(参见例如美国专利第4,892,538号和第5,283,187号)。有多种技术可用于将核酸导入可存活细胞。这些技术根据是将核酸转移至体外培养细胞还是目的宿主的体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。

目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的***(可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在有些情况中，希望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸源，所述试剂诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入，例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中发生内在化的蛋白质的抗体、及靶向细胞内定位和延长细胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞技术记载于例如Wu等，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)；Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990)。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson等，Science 256：808-813(1992)。还可参见WO 93/25673及其引用的参考文献。

VI.材料保藏

以下杂交瘤细胞系已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA)(ATCC)：

抗体名称    ATCC号           保藏日

7C2         ATCC HB-12215    1996.10.17

7F3         ATCC HB-12216    1996.10.17

4D5         ATCC CRL 10463   1990.05.24

2C4         ATCC HB-12697    1999.04.08

这些保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty)及其(布达佩斯条约)实施细则的规定进行的。这保证了自保藏之日起保存保藏的存活培养物30年。保藏物可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从Genentech公司与ATCC之间的协议，它保证了在有关美国专利授权后，保***对公众获取所保藏材料施加的所有限制将不可撤回的取消，保证了在有关美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申请向公众公开后，以两者中居先者为准，公众可永久且不受限制的获得保藏培养物的后代，而且保证了依据35 USC§122及依照它的管理章程(包括37 CFR§1.14，特别要提及886 OG 638)由美国专利和商标局长批准的个人将有资格获得保藏培养物的后代。

下文非限制性实施例例示了本发明的更多详情。本说明书中的所有引文的公开内容明确收入本文作为参考。

实施例

实施例1：用Pertuzumab治疗的卵巢癌患者中的临床血清生物标志分析

研究设计

实施了标签公开的(open-label)、单组的(single-arm)、多中心的(multicenter)II期研究以评估基于肿瘤的HER2活化对rhuMAb 2C4(Pertuzumab)在患有晚期、顽固性或复发性卵巢癌的受试者中的功效的影响。

在试验分组(cohort)1中，登记了65位患有对先前的化学疗法不应或在先前的化学疗法后复发的晚期卵巢癌的受试者，他们每个周期接受420mgrhuMAb(Pertuzumab)。其中，61位受试者接受了治疗，4位受试者从研究中退出且没有接受任何Pertuzumab治疗。

分组1中登记且达到入选标准的受试者经受了肿瘤组织的活组织检查或自腹水吸出肿瘤细胞。通过ELISA对该组织分析了HER2磷酸化，即定量测量样品中的磷酸化HER2和总HER2。

以单次使用的配制剂提供了Pertuzumab，即在10mM L-组氨酸(pH 6.0)、240mM蔗糖和0.02％聚山梨醇酯20中含有25mg/mL rhuMAb 2C4。每个10cc小瓶装有约175mg rhuMAb 2C4(7.0mL/瓶)。接收后，将小瓶冷藏于2℃-8℃，直至使用。因为配制剂不含防腐剂，所以给出了仅能刺穿小瓶封口一次的指示。丢弃任何残余溶液。在装有0.9％氯化钠注射液的PVC聚乙烯和非PVC聚烯烃袋(USP)中稀释的输注用rhuMAb 2C4溶液容许在使用前在2℃-8℃贮存24小时。

为没有显示出进行性疾病证据的受试者以IV输注方式每3周施用Pertuzumab直至1年(17个周期)。受试者接受840mg加载剂量(loading dose)(第1个周期)，接着第2个及后续周期为420mg。

在完成分组1的登记后，开始分组2的登记。分组2中达到入选标准的受试者接受1050mg Pertuzumab，其以IV输注方式每3周施用直至1年(17个周期)。分组2中的受试者没有经受肿瘤组织的活组织检查或自腹水吸出肿瘤细胞。

在6周、3个月及此后每3个月后评价了响应。在18周(4.5个月)时仅对分组2中的受试者另外评价了响应。

通过临床评估和CT扫描或等效手段，使用实体瘤的响应评估标准(RECIST)评价了可测量的疾病(参见例如Therasse等，J.Nat.Cancer Inst.92(3)：205-216(2000))。依照CA-125变化和疾病的临床和放射学证据评价了患有可评估(evaluable)但不是可测量(measurable)疾病的受试者的响应。

主要的功效终点：

在开始Pertuzumab治疗后的研究过程中任何时间的最佳总响应，其在开始Pertuzumab治疗后由调查人员使用RECIST的评价或CA-125变化来测定。

次要的功效终点：

病情进展前时间(time to disease progression，TTDP)，

响应持续时间，

存活时间(总体存活，OS)，和

3、6和12个月时没有疾病进展的受试者的百分比(无疾病存活，DFS)。

疾病进展定义为有记录的进行性(progressive)疾病或死亡，以先发生者为准。

病情进展前时间(TTDP)定义为自研究药物治疗的第一天(第1天)直至有记录的疾病进展或死亡时间之间的时间。

存活的持续时间定义为自第1天直至死亡时间之间的时间。

响应持续时间定义为自初始完全或部分响应至疾病进展或死亡时间之间的时间。

为本研究中3、6和12个月后没有进展的受试者的百分比设立了95％精确置信区间(exact confidence interval)。

使用Kaplan-Meier存活方法计算了病情进展前时间和存活持续时间的中值。

此试验中掺入了生物学标志物的探索性评价。该评价的目的是找到一种或多种可预测哪些受试者会或不会响应Pertuzumab治疗的治疗前(pre-treatment)生物学标志物，或者鉴定一种或多种可充当Pertuzumab活性生物标志的治疗后(post-therapeutic)生物学标志物。具体而言，生物学标记物评价容许鉴定尤其有可能自Pertuzumab治疗受益的患者群体，所述受益通过一种或多种重要终点来测量，诸如总体存活(OS)或无疾病存活(DFS)。

如此，已经对正常卵巢上皮组织和卵巢上皮肿瘤进行了基因表达概况分析(profiling)。对在本研究中获得的卵巢肿瘤样品进行了RNA表达概况分析以探索RNA表达和对Pertuzumab响应间的关系。

血清生物标志的测量

对用Pertuzumab治疗的、表达HER2的转移性乳腺癌患者的血清评价了双调蛋白、EGF、TGF-α和脱落的HER2(HER2 ECD)水平，正如下文所述的。

用于评价血清生物标志的试剂盒：

方案

HER2-ECD

依照制造商的推荐实施HER2-ECD ELISA。

双调蛋白

遵循制造商的说明书来准备试剂、标准品稀释液和样品。将EvenCoat山羊抗小鼠IgG微量板条(microplate strip)(R&D，产品目录号CP002；不是该试剂盒所提供的)附着于平板以构建ELISA平板。将100μl稀释的捕捉抗体(该试剂盒所提供的；在PBS中1∶180)添加至每个孔，并将孔在室温温育1小时。

抽吸并清洗每个孔，并将该过程重复3次，总计4次清洗。如下清洗孔，即使用多管分液器用400μl洗涤缓冲液(PBS中0.05％Tween-20)充满每个孔，随后吸出。最后一次清洗后，通过抽吸除去任何剩余的洗涤缓冲液。然后将平板颠倒并在干净纸巾上吸干。

向每孔添加100μl标准品稀释液或稀释的样品(见下文)。在每次移液步骤后更换枪头。用胶带(该试剂盒所提供的)覆盖平板，并于室温在摇床(rocking platform)上温育2小时。此后，如上文所述重复抽吸和清洗步骤。

用实验室消毒剂处理吸出的样品和清洗溶液。

向每孔添加100μl检测抗体(该试剂盒所提供的)，其在试剂稀释剂(1％BSA，Roth；清蛋白成分V，产品目录号T844.2，在PBS中)中1∶180稀释，并将平板在室温温育2小时。此后，如上文所述重复抽吸和清洗步骤。

将100μl链霉亲合素-HRP工作稀释液添加至每个孔(该试剂盒所提供的；在试剂稀释剂中1∶200稀释)，并将孔用新的胶带覆盖且在室温温育20分钟。如上文所述重复抽吸和清洗步骤。

将100μl底物溶液(R&D，产品目录号DY999；不是该试剂盒所提供的)添加至每个孔，并将孔在无光照条件下在室温温育20分钟。

将50μl停止溶液(1.5M H₂SO₄，reinst，Merck，产品目录号713)添加至每个孔，接着小心混合。使用设置成450nm的微量板读板仪，立即测定每个孔的光密度。

双调蛋白标准曲线：

在PBS中的1％BSA中制备40ng/ml双调蛋白储液，分成小份并贮存在-80℃。PBS中20％BSA中的双调蛋白溶液超过2周就不稳定，因此不被使用。在每次实验前，自小份双调蛋白储液，在PBS中的20％BSA中新鲜准备双调蛋白标准曲线。最高浓度为1000pg/ml(双调蛋白储液的1∶40稀释液)。ELISA试剂盒所提供的标准品产生线性标准曲线。基于Excel的曲线分析容许确定每次ELISA的曲线方程。

双调蛋白样品：

在将样品在试剂稀释剂中1∶1稀释后，所有样品都在ELISA的线性范围内。一式两份测量每个样品。根据数据质量和足够的血清量，在需要时在随后的实验中重复测定。

EGF

遵循制造商的说明书来准备试剂、标准品稀释液和样品。自框架除去过量的抗体包被的微量滴定板条(该试剂盒所提供的)以构建ELISA平板。在确定需要的孔数目和平板规划后，将50μl测定稀释剂RD1(该试剂盒所提供的)添加至每个孔。然后给每个孔添加200μl标准品稀释液或稀释的样品(例如在校准液稀释剂RD6H中1∶20)。在每次移液步骤后更换枪头。

将平板用胶带(该试剂盒所提供的)覆盖，并在摇床上在室温温育2小时。

抽吸并清洗每个孔，并将该过程重复3次，总计4次清洗。如下实施清洗，即使用多管分液器用400μl洗涤缓冲液(该试剂盒所提供的)充满每个孔，随后吸出。最后一次清洗后，通过抽吸去除任何剩余的洗涤缓冲液。然后将平板颠倒并在干净纸巾上吸干。

用实验室消毒剂处理吸出的样品和清洗溶液，并将200μl偶联物(该试剂盒所提供的)添加至每个孔。然后将平板用新胶带覆盖，并在室温温育2小时。

如先前所述重复抽吸和清洗步骤。

将200μl底物溶液(该试剂盒所提供的)添加至每个孔，接着在无光照条件下在室温温育20分钟。将50μl停止溶液(该试剂盒所提供的)添加至每个孔，接着小心混合。

使用设置成450nm的微量板读板仪，在30分钟内测定每个孔的吸光度。

EGF标准曲线：

ELISA试剂盒所提供的标准品产生线性标准曲线。非常小的浓度亦显示出可检测的结果。

EGF样品：

用样品实施了总共4次测定。对每个样品测量2-5次，测定的数目取决于结果的质量(平均值+/-SD)和足够量血清的可获得性。

在将样品在校准液稀释剂RD6H中1∶20稀释后，所有样品都在ELISA的线性范围内。

TGF-α

遵循制造商的说明书来准备试剂、标准品稀释液和样品。自框架去除过量的抗体包被的微量滴定板条(该试剂盒所提供的)以构建ELISA平板。在确定需要的孔数目和平板规划后，将100μl测定稀释剂RD1W(该试剂盒所提供的)添加至每个孔，接着给每个孔添加50μl标准品稀释液或样品。在每次移液步骤后更换枪头。

将平板用胶带(该试剂盒所提供的)覆盖，并在摇床上在室温温育2小时。

抽吸并清洗每个孔，并将该过程重复3次，总计4次清洗。在如下清洗步骤中，使用多管分液器用400μl洗涤缓冲液(该试剂盒所提供的)充满每个孔，随后抽吸。最后一次清洗后，通过抽吸去除任何剩余的洗涤缓冲液，并将平板颠倒并在干净纸巾上吸干。

用实验室消毒剂处理吸出的样品和清洗溶液。

将200μl TGF-α偶联物(该试剂盒所提供的)添加至每个孔，并将平板用新胶带覆盖，并在室温温育2小时。

如上文所述重复抽吸和清洗步骤。此后，将200μl底物溶液(该试剂盒所提供的)添加至每个孔，并在无光照条件下在室温温育30分钟。

将50μl终止溶液(该试剂盒所提供的)添加至每个孔，且小心混合。

使用设置成450nm的微量板读板仪，在30分钟内测定每个孔的光密度。

TGF-α标准曲线：

ELISA试剂盒所提供的标准品产生线性标准曲线。非常小的浓度亦显示出可检测的结果。

TGF-α样品：

用样品实施了总共4次测定。在2-4次独立的测定中测量样品。

结果

使用Spearman氏等级相关系数检验(Spearman’s rank-order correlationcoefficient test)来测试多种标志物间的相关性，且结果显示于图9。依照该检验，将相关性在-1(赋予最大负相关性)和+1(赋予最大正相关性)之间定级。如图9所示，HER2、TGF-α、双调蛋白和EGF的血清水平显示出非常小的相关性，这证明了这些基因充当独立的标志物。

图10显示了用临床协变量检验的标志物的相关性，所述临床协变量包括ECOG得分(BECOG＝基线ECOG得分)、先前的化学疗法(PRITCN)、肿瘤负荷和诊断持续时间(DIAGDUR，即受试者在诊断前患有癌症多久了)。较低的ECOG得分(0和1)表明疾病不太严重，且患者处于相对好的状态。较高的ECOG得分(＞1)表明自得分2至4逐渐增加的严重程度。如图10所示，所测试的标志物的血清水平和疾病严重程度之间没有显著的相关性。另一方面，双调蛋白和EGF血清水平在进行了超过4次先前化学疗法治疗的受试者中显著较高。

依照Kaplan-Meier方法绘制了存活曲线。使用等级对数检验(log-rank test)在患者亚组间比较了这些曲线以确定在定义无进展存活(PFS)和总体存活(OS)的可能性方面给出最佳辨别的截留(cutoff)。关于PFS和OS的结果分别显示于图11和12。如图11所示，依据PFS的截留点对EGF水平是特别清楚的(清楚的正相关性)。

依照截留(使用PFS)的患者分布显示于图13。如图所示，所确定的截留对单独的标志物RGF-α和EGF工作良好，且作为这些标志物组合的函数是特别有用的(particularly useful as a function of these to markers combined)。

通过Kaplan-Meier存活分析计算了存活曲线。通过图14所示的Kaplan-Meier曲线说明了HER2水平对PFS和OS的影响。通过图15所示的Kaplan-Meier曲线说明了TGF-α水平对PFS和OS的影响。通过图16所示的Kaplan-Meier曲线说明了EGF水平对PFS和OS的影响。

实施例2：用Pertuzumab和化学疗法治疗的卵巢癌、原发性腹膜癌或输卵管癌患者中的血清生物标志分析

研究设计

实施了随机化的、安慰剂对照的、双盲的(double-blind)、多中心的II期临床试验以在患有铂耐药性卵巢癌、原发性腹膜癌或输卵管癌的受试者中进行Pertuzumab(rhuMAb 2C4)与化疗剂吉西他滨联合相对于吉西他滨与安慰剂联合的功效的初步评估，正如通过所有受试者的无进展存活(PFS)所测量的。另一个试验目标是在患有铂耐药性卵巢癌、原发性腹膜癌或输卵管癌的受试者中评估Pertuzumab与吉西他滨联合相对于吉西他滨与安慰剂联合的安全性和耐受性。

在接受为晚期疾病施用的基于铂的化疗方案的6个月时或6个月内经历了疾病进展的受试者入选该研究。容许不超过一种针对铂耐药性疾病的先前方案。

以1∶1的比率将受试者随机化分成处理组1(吉西他滨+Pertuzumab)或组2(吉西他滨+安慰剂)。在21天周期的第1天和第8天时施用吉西他滨。在30分钟里(+/-5分钟)以800mg/m²的起始剂量输注吉西他滨。在21天周期的第1天时在吉西他滨施用后30分钟施用盲试研究药物(blinded study drug)(吉西他滨或安慰剂)。Pertuzumab施用的起始加载剂量为840mg(第1个周期)，接着第2个及后续周期为420mg。所施用的匹配安慰剂体积等于准备Pertuzumab剂量所需悬浮液的量。

在该研究中容许没有进行性疾病的受试者接受吉西他滨加盲试研究药物治疗，直至17个周期。在前8个周期每6周评估响应，然后约每3个月一次(即在第2、4、6、8、12和17个周期结束时)。通过临床评估和计算机断层照相术扫描或等效手段，使用实体瘤的响应评估标准(RECIST)评价可测量的疾病。依照CA-125变化和疾病的临床放射学证据评价患有可评估疾病的受试者的响应。

提供额外同意书的患者可选择提供血清和血浆样品，供探索性生物学标志物研究用。这些研究包括HER受体基因家族中潜在突变的评价、HER家族蛋白和与HER信号传导有关的下游蛋白的免疫组织化学、评估HER2活化的二聚化测定法或接近度测定法(proximity assay)、和特定基因的表达水平测定(所述特定基因被鉴定为与HER2信号传导有关或可充当响应的标志物或预测物)。所述研究包括基因表达分析和蛋白质组学技术。

主要结果测量：

无进展存活，其由调查人员使用RECIST的评价或CA-125变化(仅仅是患有不可测量疾病的受试者)来测定。

次要结果测量：

客观响应率(部分响应或完全响应)、响应持续时间、存活时间和在4个月时没有进展。

主要的终点：

主要的功效终点是无进展存活，定义为自随机化至有记录的疾病进展或研究时由任何原因导致的死亡(以先发生者为准)之间的时间。调查人员依照RECIST或CA-125变化分别对患有可测量的和不可测量的疾病的受试者评价疾病进展。研究时的死亡定义为服用最后一剂研究药物后30天内由任何原因导致的死亡。

在最后一次肿瘤或CA-125评价时检查没有疾病进展或死亡的受试者的数据(或者，如果在基线访问后没有实施肿瘤或CA-125评估，那么在随机化的时间加1天时进行)。

使用Kaplan-Meier方法估算每个处理组的无进展存活中值。使用Cox比例风险模型(Cox proportional hazard model)以两种模型(具有和没有随机化分层因子[东部合作肿瘤学小组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)状态、疾病可测性和用于铂耐药性疾病的先前方案数目])估算风险率(即在95％置信区间的治疗效果量级)。分层模型产生主要置信区间(primaryconfidence interval)。使用通过随机化分层因子(ECOG状态、疾病可测性和用于铂耐药性疾病的先前方案数目)分层的等级对数检验实施探索性假设测试(exploratory hypothesis testing)，用于评价处理组间的差异。还提供了非分层的等级对数检验。还对患有可测量疾病的受试者和患有不可测量疾病的受试者提出分开的无进展存活分析；因为每组中受试者的数目可能是少的，所以不可对两组都实施探索性等级对数检验。还对不经受任何用于铂耐药性疾病的先前方案的受试者和经受一种用于铂耐药性疾病的先前方案的受试者实施分开的无进展存活分析；对两组均实施探索性等级对数检验。

次要的终点：

客观响应

客观响应定义为相隔大于等于4周的两个连续时机所测定的完全或部分响应。将没有基线后(post-baseline)肿瘤或CA-125评价的受试者视为非响应者。为每个处理组计算客观响应率估值和95％置信区间(Blyth-Still-Casella)。计算肿瘤响应率差异的置信区间(Santer和Snell，J.Am.Stat.Assoc.75：386-94(1980)；Berger和Boss，J.Am.Stat.Assoc.89：4087-91(1990))。使用Fisher氏精确检验实施探索性假设测试，用于探索处理组间的差异。

客观响应的持续时间

对于具有客观响应的受试者，客观响应的持续时间定义为自初始响应至疾病进展或由研究时任何原因导致的死亡之间的时间。用于操作检查和用于分析的方法与关于无进展存活所述的方法相同。

4个月时没有进展

自无进展存活的Kaplan-Meier曲线估算每个处理组4个月时没有进展的受试者的比例。对每个处理组计算无进展率的估值和95％置信区间(Greemwood，Rep.Pub.Health.Med.Subjects 33：1-26(1926))。使用双向Z检验(two-sided Z-test)实施探索性假设测试，用于评价处理组间的差异。

存活的持续时间

存活的持续时间定义为自随机化直到由任何原因导致的死亡之间的时间。包括所有死亡，无论它们发生在研究时或治疗停止后。对于尚未去世的受试者，在最后一次联系那天检查存活的持续时间。分析方法与关于无进展存活所述的那些方法相同。

根据血清或血浆样品的基因表达分析，产生升高水平的表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因子α(TGF-α)的患者会响应Pertuzumab和吉西他滨治疗而显示出延长的存活(尤其是无进展存活)。

               序列表

<110>健泰科生物技术公司(GENENTECH，INC.)

<120>延长EGF或TGF-α水平升高的癌症患者的存活

<130>39766-0198 PCT

<140>待指定

<141>同上

<150>US 60/811,234

<151>2006-06-05

<160>22

<210>1

<211>107

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>1

Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val

  1               5                  10                  15

Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

                 20                  25                  30

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys

                 35                  40                  45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp

                 50                  55                  60

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile

                 65                  70                  75

Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

                 80                  85                  90

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

                 95                 100                 105

Ile Lys

<210>2

<211>119

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly

  1               5                  10                  15

Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

                 20                  25                  30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu

                 35                  40                  45

Glu Trp Ile Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

                 50                  55                  60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser

                 65                  70                  75

Ser Arg Ile Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp

                 80                  85                  90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

                 95                 100                 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

                110                 115

<210>3

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<400>3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

  1               5                  10                  15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

                 20                  25                  30

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

                 35                  40                  45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser

                 50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

                 65                  70                  75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

                 80                  85                  90

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

                 95                 100                 105

Ile Lys

<210>4

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<400>4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

  1               5                  10                  15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

                 20                  25                  30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

                 35                  40                  45

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

                 50                  55                  60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser

                 65                  70                  75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

                 80                  85                  90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

                 95                 100                 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

                110                 115

<210>5

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<400>5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

  1               5                  10                  15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

                 20                  25                  30

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

                 35                  40                  45

Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

                 50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

                 65                  70                  75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

                 80                  85                  90

Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

                 95                 100                 105

Ile Lys

<210>6

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<400>6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

  1               5                  10                  15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

                 20                  25                  30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

                 35                  40                  45

Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr

                 50                  55                  60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

                 65                  70                  75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

                 80                  85                  90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu

                 95                 100                 105

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

                110                 115

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体序列

<220>

<221>变体

<222>10

<223>Xaa优选是Asp或Ser

<400>7

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Xaa

 1               5                  10

<210>8

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体序列

<400>8

Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys

 1               5                  10                  15

Gly

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体序列

<400>9

Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr

 1               5                  10

<210>10

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体序列

<400>10

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala

 1               5                  10

<210>11

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体序列

<220>

<221>变体

<222>5

<223>Xaa优选是Arg或Leu

<220>

<221>变体

<222>6

<223>Xaa优选是Tyr或Glu

<220>

<221>变体

<222>7

<223>Xaa优选是Thr或Ser

<400>11

Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa

 1               5

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体序列

<400>12

Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr

 1               5

<210>13

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<400>13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

  1               5                  10                  15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

                 20                  25                  30

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

                 35                  40                  45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser

                 50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

                 65                  70                  75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

                 80                  85                  90

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

                 95                 100                 105

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

                110                 115                 120

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

                125                 130                 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

                140                 145                 150

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

                155                 160                 165

Gln Asp SER Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

                170                 175                 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

                185                 190                 195

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn

                200                 205                 210

Arg Gly Glu Cys

<210>14

<211>448

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<400>14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

  1               5                  10                  15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

                 20                  25                  30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

                 35                  40                  45

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

                 50                  55                  60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser

                 65                  70                  75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

                 80                  85                  90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

                 95                 100                 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

                110                 115                 120

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

                125                 130                 135

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

                140                 145                 150

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

                155                 160                 165

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

                170                 175                 180

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

                185                 190                 195

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

                200                 205                 210

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

                215                 220                 225

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

                230                 235                 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

                245                 250                 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

                260                 265                 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

                275                 280                 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

                290                 295                 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

                305                 310                 315

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

                320                 325                 330

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

                335                 340                 345

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

                350                 355                 360

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                365                 370                 375

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

                380                 385                 390

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

                395                 400                 405

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

                410                 415                 420

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

                425                 430                 435

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

                440                 445

<210>15

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<400>15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

  1               5                  10                  15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn

                 20                  25                  30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

                 35                  40                  45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

                 50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

                 65                  70                  75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

                 80                  85                  90

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

                 95                 100                 105

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

                110                 115                 120

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

                125                 130                 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

                140                 145                 150

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

                155                 160                 165

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

                170                 175                 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

                185                 190                 195

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn

                200                 205                 210

Arg Gly Glu Cys

<210>16

<211>449

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<400>16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

  1               5                  10                  15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys

                 20                  25                  30

Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

                 35                  40                  45

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr

                 50                  55                  60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

                 65                  70                  75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

                 80                  85                  90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr

                 95                 100                 105

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

                110                 115                 120

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

                125                 130                 135

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

                140                 145                 150

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

                155                 160                 165

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

                170                 175                 180

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

                185                 190                 195

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

                200                 205                 210

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

                215                 220                 225

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

                230                 235                 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

                245                 250                 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

                260                 265                 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

                275                 280                 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

                290                 295                 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

                305                 310                 315

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

                320                 325                 330

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

                335                 340                 345

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

                350                 355                 360

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

                365                 370                 375

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

                380                 385                 390

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

                395                 400                 405

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

                410                 415                 420

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

                425                 430                 435

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

                440                 445

<210>17

<211>217

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<400>17

Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

  1               5                  10                  15

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

                 20                  25                  30

Asp Val Ser Ilc Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

                 35                  40                  45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly

                 50                  55                  60

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

                 65                  70                  75

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

                 80                  85                  90

Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr

                 95                 100                 105

Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

                110                 115                 120

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

                125                 130                 135

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

                140                 145                 150

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser

                155                 160                 165

Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

                170                 175                 180

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

                185                 190                 195

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

                200                 205                 210

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

                215

<210>18

<211>449

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<400>18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

  1               5                  10                  15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

                 20                  25                  30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

                 35                  40                  45

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

                 50                  55                  60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser

                 65                  70                  75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

                 80                  85                  90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

                 95                 100                 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

                110                 115                 120

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

                125                 130                 135

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

                140                 145                 150

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

                155                 160                 165

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

                170                 175                 180

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

                185                 190                 195

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

                200                 205                 210

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

                215                 220                 225

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

                230                 235                 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

                245                 250                 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

                260                 265                 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

                275                 280                 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

                290                 295                 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

                305                 310                 315

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

                320                 325                 330

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

                335                 340                 345

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

                350                 355                 360

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                365                 370                 375

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

                380                 385                 390

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

                395                 400                 405

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

                410                 415                 420

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

                425                 430                 435

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                440                 445

<210>19

<211>195

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>19

Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala

  1               5                  10                  15

Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly

                 20                  25                  30

Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr

                 35                  40                  45

Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly

                 50                  55                  60

Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln

                 65                  70                  75

Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

                 80                  85                  90

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr

                 95                 100                 105

Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu

                110                 115                 120

Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg

                125                 130                 135

Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile

                140                 145                 150

Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn

                155                 160                 165

Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser

                170                 175                 180

Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg

                185                 190                 195

<210>20

<211>124

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>20

Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro

  1               5                  10                  15

Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro

                 20                  25                  30

Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly

                 35                  40                  45

Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp

                 50                  55                  60

Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly

                 65                  70                  75

Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp

                 80                  85                  90

Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val

                 95                 100                 105

Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro

                110                 115                 120

Cys Ala Arg Val

<210>21

<21l>169

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>21

Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val

  1               5                  10                  15

Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe

                 20                  25                  30

Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala

                 35                  40                  45

Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu

                 50                  55                  60

Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

                 65                  70                  75

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile

                 80                  85                  90

Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln

                 95                 100                 105

Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu

                110                 115                 120

Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe

                125                 130                 135

Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln

                140                 145                 150

Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly

                155                 160                 165

Glu Gly Leu Ala

<210>22

<211>142

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>22

Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro

  1               5                  10                  15

Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys

                 20                  25                  30

Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val

                 35                  40                  45

Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln

                 50                  55                  60

Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val

                 65                  70                  75

Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys

                 80                  85                  90

Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys

                 95                 100                 105

Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys

                110                 115                 120

Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu

                125                 130                 135

Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr

                140

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于延长癌症患者存活的方法，包括以延长该患者存活的量给该患者施用HER二聚化抑制剂，其中所述患者测定为产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)，且所述癌症选自卵巢癌、腹膜癌和输卵管癌。

2.权利要求1的方法，其中所述患者测定为产生升高水平的EGF。

3.权利要求2的方法，其中在所述患者血清中发现该患者具有升高水平的EGF。

4.权利要求1的方法，其中所述患者测定为产生升高水平的TGF-α。

5.权利要求4的方法，其中在所述患者血清中发现该患者具有升高水平的TGF-α。

6.权利要求1的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER2二聚化抑制剂。

7.权利要求1的方法，其中所述HER二聚化抑制剂抑制HER异二聚化。

8.权利要求1的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER抗体。

9.权利要求8的方法，其中所述抗体结合选自EGFR、HER2和HER3的HER受体。

10.权利要求9的方法，其中所述抗体结合HER2。

11.权利要求10的方法，其中所述HER2抗体结合HER2胞外结构域的结构域II。

12.权利要求11的方法，其中所述抗体结合HER2胞外结构域的结构域I、II和III间的连接处。

13.权利要求12的方法，其中所述HER抗体包含SEQ ID No.3的轻链可变域氨基酸序列和SEQ ID No.4的重链可变域氨基酸序列。

14.权利要求13的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是Pertuzumab。

15.权利要求8的方法，其中所述HER抗体是裸抗体。

16.权利要求8的方法，其中所述HER抗体是完整的抗体。

17.权利要求8的方法，其中所述HER抗体是包含抗原结合区的抗体片段。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述癌症是晚期、顽固性或复发性卵巢癌。

19.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述癌症是铂耐药性卵巢癌。

20.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述癌症是原发性腹膜癌或输卵管癌。

21.权利要求1-17中任一项的方法，其中施用所述HER二聚化抑制剂作为单一抗肿瘤剂。

22.权利要求1-17中任一项的方法，包括给所述患者施用第二种治疗剂。

23.权利要求22的方法，其中所述第二种治疗剂选自化疗剂、HER抗体、针对肿瘤相关抗原的抗体、抗激素化合物、保心药、细胞因子、靶向EGFR的药物、抗血管发生剂、酪氨酸激酶抑制剂、COX抑制剂、非类固醇抗炎药、法尼基转移酶抑制剂、结合癌胚蛋白CA 125的抗体、HER2疫苗、HER靶向疗法、Raf或ras抑制剂、脂质体多柔比星、托泊替康、紫杉烷、双重酪氨酸激酶抑制剂、TLK286、EMD-7200、治疗恶心的药物、预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮疗法、治疗或预防腹泻的药物、降低体温的药物、和造血生长因子。

24.权利要求23的方法，其中所述第二种治疗剂是化疗剂。

25.权利要求24的方法，其中所述化疗剂是抗代谢物类化疗剂。

26.权利要求25的方法，其中所述抗代谢物类化疗剂是吉西他滨。

27.权利要求22的方法，其中所述第二种治疗剂是曲妥单抗、Erlotinib或贝伐单抗。

28.权利要求1的方法，其中延长了无进展存活(PFS)。

29.权利要求1的方法，其中延长了总体存活(OS)。

30.一种用于延长卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌患者存活的方法，包括以延长该患者存活的量给该患者施用Pertuzumab，其中所述患者测定为产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)。

31.权利要求30的方法，其中所述患者患有卵巢癌。

32.权利要求30或权利要求31的方法，其中所述患者患有晚期、顽固性或复发性卵巢癌。

33.权利要求30-32中任一项的方法，还包括给所述患者施用化疗剂。

34.权利要求33的方法，其中所述化疗剂是抗代谢物类化疗剂。

35.权利要求34的方法，其中所述抗代谢物类化疗剂是吉西他滨。

36.一种用于延长卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌患者的无进展存活(PFS)的方法，包括以延长该患者PFS的量给该患者施用Pertuzumab，其中所述患者的血清测定为在其中具有升高水平的表皮生长因子(EGF)。

37.一种用于延长卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌患者的无进展存活(PFS)的方法，包括以延长该患者PFS的量给该患者施用Pertuzumab，其中所述患者的血清测定为在其中具有升高水平的表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGF-α)。

38.权利要求26或权利要求37的方法，其中所述癌症是卵巢癌。

39.权利要求38的方法，其中所述卵巢癌是晚期、顽固性或复发性卵巢癌。

40.用HER二聚化抑制剂治疗的患者的选择方法，包括用HER二聚化抑制剂治疗该患者，如果所述患者测定为产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)的话。

41.权利要求40的方法，其中所述患者的存活相对于不产生升高水平的EGF或TGF-α且接受相同治疗的患者的存活是延长的。

42.权利要求41的方法，其中所述存活是总体存活(OS)。

43.权利要求41的方法，其中所述存活是无进展存活(PFS)。

44.权利要求41的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER2二聚化抑制剂。

45.权利要求41的方法，其中所述HER二聚化抑制剂抑制HER异二聚化。

46.权利要求31的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER抗体。

47.权利要求46的方法，其中所述抗体结合选自EGFR、HER2和HER3的HER受体。

48.权利要求47的方法，其中所述抗体结合HER2。

49.权利要求48的方法，其中所述HER2抗体结合HER2胞外结构域的结构域II。

50.权利要求49的方法，其中所述抗体结合HER2胞外结构域的结构域I、II和III间的连接处。

51.权利要求50的方法，其中所述HER抗体包含SEQ ID No.3的轻链可变域氨基酸序列和SEQ ID No.4的重链可变域氨基酸序列。

52.权利要求51的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是Pertuzumab。

53.权利要求46的方法，其中所述HER抗体是裸抗体。

54.权利要求46的方法，其中所述HER抗体是完整的抗体。

55.权利要求46的方法，其中所述HER抗体是包含抗原结合区的抗体片段。

56.权利要求40-55中任一项的方法，还包括用化疗剂治疗所述患者。

57.权利要求56的方法，其中所述化疗剂是吉西他滨。

58.一种试剂盒，该试剂盒包含HER二聚化抑制剂和包装插页或标签，其指出该HER二聚化抑制剂的有益用途，如果待治疗的患者产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)的话。

59.权利要求58的方法，其中所述癌症是卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌。

60.权利要求38的方法，其中所述有益用途是存活的延长。

61.权利要求60的方法，其中所述存活是无进展存活。

62.权利要求58-61中任一项的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是抗体。

63.权利要求62的方法，其中所述抗体是HER2抗体。

64.权利要求63的方法，其中所述抗体是Pertuzumab。

65.一种宣传HER二聚化抑制剂治疗产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)的患者的方法。

66.权利要求65的方法，其中所述宣传是书面材料的形式。

67.权利要求66的方法，其中所述宣传是包装插页的形式。

68.用HER二聚化抑制剂治疗的癌症患者的选择方法，包括测定所述癌症患者中的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)水平，并选择所述癌症患者用所述HER二聚化抑制剂治疗，如果所述患者测定为产生升高水平的EGF或TGF-α的话。

69.权利要求68的方法，其中所述患者测定为产生升高水平的EGF。

70.权利要求69的方法，其中在所述患者的生物学流体中测定出该患者具有升高水平的EGF。

71.权利要求70的方法，其中所述生物学流体选自血液、血浆、血清、尿液、唾液和腹水。

72.权利要求71的方法，其中所述生物学流体是血清。

73.权利要求68的方法，其中所述患者测定为产生升高水平的TGF-α。

74.权利要求73的方法，其中在所述患者的生物学流体中测定出该患者产生升高水平的TGF-α。

75.权利要求74的方法，其中所述生物学流体选自血液、血浆、血清、尿液、唾液和腹水。

76.权利要求75的方法，其中所述生物学流体是血清。

77.权利要求68的方法，其中所述癌症选自卵巢癌、腹膜癌和输卵管癌。

78.权利要求68的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER2二聚化抑制剂。

79.权利要求68的方法，其中所述HER二聚化抑制剂抑制HER异二聚化。

80.权利要求68的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER抗体。

81.权利要求80的方法，其中所述HER抗体结合选自EGFR、HER2和HER3的HER受体。

82.权利要求81的方法，其中所述抗体结合HER2。

83.权利要求82的方法，其中所述抗体结合HER2胞外结构域的结构域II。

84.权利要求82的方法，其中所述抗体结合HER2胞外结构域的结构域I、II和III间的连接处。

85.权利要求82的方法，其中所述抗体包含SEQ ID No.3的轻链可变域氨基酸序列和SEQ ID No.4的重链可变域氨基酸序列。

86.权利要求85的方法，其中所述二聚化抑制剂是Pertuzumab。

87.权利要求80的方法，其中所述抗体是裸抗体。

88.权利要求80的方法，其中所述抗体是完整的抗体。

89.权利要求80的方法，其中所述抗体是包含抗原结合区的抗体片段。

90.权利要求68-89中任一项的方法，其中所述癌症是晚期、顽固性或复发性卵巢癌。

91.权利要求68-89中任一项的方法，其中所述癌症是铂耐药性卵巢癌。

92.权利要求68-89中任一项的方法，其中所述癌症是原发性腹膜癌或输卵管癌。

Claims (67)

1.一种用于延长癌症患者存活的方法，包括以延长该患者存活的量给该患者施用HER二聚化抑制剂，其中所述患者测定为产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)，且所述癌症选自卵巢癌、腹膜癌和输卵管癌。

2.权利要求1的方法，其中所述患者测定为产生升高水平的EGF。

3.权利要求2的方法，其中在所述患者血清中发现该患者具有升高水平的EGF。

4.权利要求1的方法，其中所述患者测定为产生升高水平的TGF-α。

5.权利要求4的方法，其中在所述患者血清中发现该患者具有升高水平的TGF-α。

6.权利要求1的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER2二聚化抑制剂。

7.权利要求1的方法，其中所述HER二聚化抑制剂抑制HER异二聚化。

8.权利要求1的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER抗体。

9.权利要求8的方法，其中所述抗体结合选自EGFR、HER2和HER3的HER受体。

10.权利要求9的方法，其中所述抗体结合HER2。

11.权利要求10的方法，其中所述HER2抗体结合HER2胞外结构域的结构域II。

12.权利要求11的方法，其中所述抗体结合HER2胞外结构域的结构域I、II和III间的连接处。

13.权利要求12的方法，其中所述HER抗体包含SEQ ID No.3的轻链可变域氨基酸序列和SEQ ID No.4的重链可变域氨基酸序列。

14.权利要求13的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是Pertuzumab。

15.权利要求8的方法，其中所述HER抗体是裸抗体。

16.权利要求8的方法，其中所述HER抗体是完整的抗体。

17.权利要求8的方法，其中所述HER抗体是包含抗原结合区的抗体片段。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述癌症是晚期、顽固性或复发性卵巢癌。

19.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述癌症是铂耐药性卵巢癌。

20.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述癌症是原发性腹膜癌或输卵管癌。

21.权利要求1-17中任一项的方法，其中施用所述HER二聚化抑制剂作为单一抗肿瘤剂。

22.权利要求1-17中任一项的方法，包括给所述患者施用第二种治疗剂。

23.权利要求22的方法，其中所述第二种治疗剂选自化疗剂、HER抗体、针对肿瘤相关抗原的抗体、抗激素化合物、保心药、细胞因子、靶向EGFR的药物、抗血管发生剂、酪氨酸激酶抑制剂、COX抑制剂、非类固醇抗炎药、法尼基转移酶抑制剂、结合癌胚蛋白CA 125的抗体、HER2疫苗、HER靶向疗法、Raf或ras抑制剂、脂质体多柔比星、托泊替康、紫杉烷、双重酪氨酸激酶抑制剂、TLK286、EMD-7200、治疗恶心的药物、预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮疗法、治疗或预防腹泻的药物、降低体温的药物、和造血生长因子。

24.权利要求23的方法，其中所述第二种治疗剂是化疗剂。

25.权利要求24的方法，其中所述化疗剂是抗代谢物类化疗剂。

26.权利要求25的方法，其中所述抗代谢物类化疗剂是吉西他滨。

27.权利要求22的方法，其中所述第二种治疗剂是曲妥单抗、Erlotinib或贝伐单抗。

28.权利要求1的方法，其中延长了无进展存活(PFS)。

29.权利要求1的方法，其中延长了总体存活(OS)。

30.一种用于延长卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌患者存活的方法，包括以延长该患者存活的量给该患者施用Pertuzumab，其中所述患者测定为产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)。

31.权利要求30的方法，其中所述患者患有卵巢癌。

32.权利要求30或权利要求31的方法，其中所述患者患有晚期、顽固性或复发性卵巢癌。

33.权利要求30-32中任一项的方法，还包括给所述患者施用化疗剂。

34.权利要求33的方法，其中所述化疗剂是抗代谢物类化疗剂。

35.权利要求34的方法，其中所述抗代谢物类化疗剂是吉西他滨。

36.一种用于延长卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌患者的无进展存活(PFS)的方法，包括以延长该患者PFS的量给该患者施用Pertuzumab，其中所述患者的血清测定为在其中具有升高水平的表皮生长因子(EGF)。

37.一种用于延长卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌患者的无进展存活(PFS)的方法，包括以延长该患者PFS的量给该患者施用Pertuzumab，其中所述患者的血清测定为在其中具有升高水平的表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGF-α)。

38.权利要求26或权利要求37的方法，其中所述癌症是卵巢癌。

39.权利要求38的方法，其中所述卵巢癌是晚期、顽固性或复发性卵巢癌。

40.用HER二聚化抑制剂治疗的患者的选择方法，包括用HER二聚化抑制剂治疗该患者，如果所述患者测定为产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)的话。

41.权利要求40的方法，其中所述患者的存活相对于不产生升高水平的EGF或TGF-α且接受相同治疗的患者的存活是延长的。

42.权利要求41的方法，其中所述存活是总体存活(OS)。

43.权利要求41的方法，其中所述存活是无进展存活(PFS)。

44.权利要求41的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER2二聚化抑制剂。

45.权利要求41的方法，其中所述HER二聚化抑制剂抑制HER异二聚化。

46.权利要求31的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER抗体。

47.权利要求46的方法，其中所述抗体结合选自EGFR、HER2和HER3的HER受体。

48.权利要求47的方法，其中所述抗体结合HER2。

49.权利要求48的方法，其中所述HER2抗体结合HER2胞外结构域的结构域II。

50.权利要求49的方法，其中所述抗体结合HER2胞外结构域的结构域I、II和III间的连接处。

51.权利要求50的方法，其中所述HER抗体包含SEQ ID No.3的轻链可变域氨基酸序列和SEQ ID No.4的重链可变域氨基酸序列。

52.权利要求51的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是Pertuzumab。

53.权利要求46的方法，其中所述HER抗体是裸抗体。

54.权利要求46的方法，其中所述HER抗体是完整的抗体。

55.权利要求46的方法，其中所述HER抗体是包含抗原结合区的抗体片段。

56.权利要求40-55中任一项的方法，还包括用化疗剂治疗所述患者。

57.权利要求56的方法，其中所述化疗剂是吉西他滨。

58.一种试剂盒，该试剂盒包含HER二聚化抑制剂和包装插页或标签，其指出该HER二聚化抑制剂的有益用途，如果待治疗的患者产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)的话。

59.权利要求58的方法，其中所述癌症是卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌。

60.权利要求38的方法，其中所述有益用途是存活的延长。

61.权利要求60的方法，其中所述存活是无进展存活。

62.权利要求58-61中任一项的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是抗体。

63.权利要求62的方法，其中所述抗体是HER2抗体。

64.权利要求63的方法，其中所述抗体是Pertuzumab。

65.一种宣传HER二聚化抑制剂治疗产生升高水平的表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)的患者的方法。

66.权利要求65的方法，其中所述宣传是书面材料的形式。

67.权利要求66的方法，其中所述宣传是包装插页的形式。

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