CN101492356A - 利用褐多孔菌的发酵液分离制备化合物2,4-二羟基-5-甲基-苯乙酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用褐多孔菌(Polyporus picipes)的发酵液进行分离制备化合物2，4－二羟基－5－甲基－苯乙酮的方法，该方法采用平皿转瓶液体培养的方法，首先用去皮马铃薯，葡萄糖，蒸馏水，pH7.2左右，灭菌制成培养基；然后培养发酵得发酵液，用乙酸乙酯萃取发酵液得到浸膏，用柱层析分离，以氯仿－甲醇***梯度洗脱；经过多次正相硅胶柱层析、反相C18柱、Sephadex LH－20凝胶柱层析以及重结晶法进行分离，得到纯化合物2，4－二羟基－5－甲基－苯乙酮(II)。本发明可以将化合物2，4－二羟基－5－甲基－苯乙酮(II)开发成为抗病原真菌抗生素的原药，并解决2，4－二羟基－5－甲基－苯乙酮的原料来源问题，具有培养条件温和、培养基配制简单易行、发酵时间短等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种化合物的制备方法，特别涉及一种利用褐多孔菌的发酵液进行分离制备化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法。本发明制备的化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)是一新的天然产物，可抑制多种植物病原真菌的生长，对棉花枯萎病菌，玉米弯孢病菌，苹果炭疽病菌有很好的抑制作用。
背景技术
高等真菌包含子囊菌纲(Ascomycetes)的部分种和担子菌纲(Basidiomycetes)真菌。由于长期协同进化作用，很多高等真菌形成了自己特有的化学防御体系。一旦受伤即启动***分泌酶将次生代谢物转化为有活性的物质。一个有趣的现象是：很多大型真菌的子实体从来不被昆虫侵袭。其中一个典型的例子是：乳菇属中无活性的stearoyl velutinal受损反应后立刻转化为具有很强活性的抗生素isovelleral。此外，人们通过实验对比受伤和未受伤的子实体，发现子实体在受伤后很快产生大量的次生代谢产物，这些产物具有抗真菌、杀虫等多种活性。由此看来，高等真菌也是生物源农药研究和开发的重要资源。
从高等真菌发酵物中寻找具有杀虫抑菌作用的先导化合物已引起国内外学者的极大关注。一方面是因为从大型真菌中不断发现结构新颖和具有显著生物活性的化合物，且结构变化大。这种结构多样性对于药物(或农药)的发现有重要意义。另一方面，大型真菌不仅可以直接采来作为研究材料用，而且可以较方便地通过菌丝体或孢子发酵培养，其优点是可以进行工业化连续生产、规模大、产量高、发酵周期短、生产效益高。这为今后可能的工业化生产提供了资源保证，相对于受资源的限制植物源农药这是一个潜在的优势。改进发酵过程中的条件，促进发酵过程朝向提高目的产物的方向进行，提高产物品质，降低发酵成本，使投入产出比达到最小，是液体发酵研究的一个方向。药用真菌在液体发酵过程中，除菌丝或孢子会大量增殖外，还会在发酵液中产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、植物激素及具有抗生素作用的各种化合物。这些物质分别对心血管、肝脏、神经***、性器官等人体器官具有防病治病的作用，并有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗溃疡等功效。人们对药用真菌的液体发酵，除获得菌丝体外，还以获取上述具有活性的次生代谢产物为目的。
利用高等真菌开发农药已有商业成功的先例：如德国学者从高等真菌嗜球果伞(Strobilurus tenacellus)中发现了具有杀霉菌活性的先导化合物strobilurin，但该项目险些被中断，因为该化合物在田间实验中显示的活性并不强。从化学的角度讲，strobilurin含有共轭双键，不稳定，易被氧化。依此为母体合成了约10000个化合物，从中德国巴斯夫公司(BASF)开发出的一类新农药Kresoxim-methyl(商品名Brio，Allegro，Diskus，Juwel，Mentor等杀霉菌剂)，另一家公司Zeneca也一直进行类似的研究，该公司最后成功地合成了化合物ICIA5504，也具有非常好的活性，商品名为Amistar。现在这类化合物全世界每年的销售额已达到5亿多美元。这类化合物可抑制线粒体的呼吸而致效，对子囊菌、担子菌、不完全菌及卵纲菌等广范围病原菌具有杀菌效果，除水稻稻瘟病外，还对水稻纹枯病、穗枯病、叶枯病等水稻病害具有抑制效果。
褐多孔菌(Polyporus picipes Fr)为担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，属木腐菌，生于阔叶树腐木上，有时也生于针叶树上，导致桦、椴、水曲柳、槭或冷杉的木质部形成白色腐朽。子实体大。盖直径4-16cm，厚2-3.5mm，扇形、肾形、近圆形至圆形，稍凸至平展，基部常下凹，粟褐色，中部色较深，有时表面全呈黑褐色，光滑，边缘薄而锐，波浪状至瓣裂。菌柄侧生或偏生，长2-5mm，粗0.3-1.3cm，黑色或基部黑色，初期具细绒毛后变光滑。菌肉白色或近白色，厚0.5-2mm。菌管延生，长0.5-1.5mm，与菌肉色相似，干后呈淡粉灰色。管口角形至近圆形，每毫米5-7个。子实层中菌丝体无色透明，菌丝粗1.2-2μm。孢子椭圆形至长椭圆形，一端尖狭，无色透明，平滑，5.8-7.5μm×2.8-3.5μm。它分布于辽宁、吉林、黑龙江、河北、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、广西、福建、四川、云南、贵州、西藏等地。它能调节内分泌功能，软化血管，调节血压，溶化血栓，防治心肌梗死和脑血栓，并具有预防和延缓心脏老化，增强人体免疫功能，调节大脑神经功能，抗衰老之功效。褐多孔菌配方的心脑血管系列汤剂可治疗高心病、冠心病、风心病、肺心病、心肌炎、心肌劳损、心肌梗死以及脑梗塞、脑积水、脑震荡后遗症等。大兴安岭原始森林的褐多孔菌及其系列煎剂，旨在改善或恢复心脑血管内在的供给机制和代谢机制、溶栓和恢复胶原蛋白的活力，使血液中的甘油三脂、胆固醇等恢复正常，疗效确切。
相关文献[A.A.Morais，R.B.Fo，S.V.Fraiz Jr.Synthesis of threenatural 1，3-diarylpropanes：Two revised structures，Phytochemistry，1989，28(1)：239-242]和[蔡孟深，王兰明.碳苷研究—XXVI.异黑豆素类似物的合成，化学学报，1990，48，1191-1198]仅报道了2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮作为人工合成的中间体；但未见其作为天然产物与抗植物病原真菌活性的相关报道。申请人曾经首次报道了褐多孔菌发酵代谢物的抑菌活性初步研究(董艳红，张鞍灵，马慧妮，李晓明，高锦明，西北林学院学报，2007，22(2)：105-108)，但是，发酵液中抗菌活性化合物尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种利用褐多孔菌的发酵液进行分离制备化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法。
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
一种利用褐多孔菌的发酵液进行分离制备化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法，其特征在于，该方法采用平皿转瓶液体培养的方法，首先用去皮马铃薯、葡萄糖、蒸馏水，经灭菌制成培养基，液体培养基的pH值为7.2；然后培养发酵得发酵液，用乙酸乙酯萃取发酵液得到浸膏；通过有机溶剂浸提，经加压正相硅胶层析，用CHCl3/MeOH梯度洗脱，常压柱层析采用湿法装柱和硅胶拌样上柱，根据薄层展开情况选择洗脱溶剂***，经过多次正相硅胶柱层析、反相C18柱、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及薄层制备与重结晶法进行分离，得到化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)纯品。
具体按下述步骤进行：
1)菌株的发酵和发酵液的浓缩
从经活化的固体平板菌种(28℃，培养5～6d)取8～10mm2大小的菌饼2～3块接入以去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蒸馏水1000mL，pH7.2左右，121℃灭菌30min制成的液体PDA培养基(装液量为50mL/150mL三角瓶)内，于28℃旋转摇床(150r/min)培养3～4天形成菌球后以10％的接种量转接于发酵瓶中(装液量为150mL/500mL三角瓶)，发酵11～13d，共得到发酵液50L，将50L发酵液于55℃下减压浓缩减半；
2)粗提物的制备
发酵物浓缩液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏16g；
3)选取乙酸乙酯浸膏为材料，通过有机溶剂浸提，经加压正相硅胶层析，用CHCl3/MeOH梯度洗脱，常压柱层析采用湿法装柱和硅胶拌样上柱，根据薄层展开情况选择洗脱溶剂***，经过多次正相硅胶柱层析、反相C18柱、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及薄层制备与重结晶法进行分离，得到纯化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)。
本发明的方法具有培养条件温和、培养基配制简单易行、发酵时间短等优点。将本发明制备的化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)开发成抗植物病原真菌抗生素的原药，可抑制多种植物病原真菌菌丝体的生长，对棉花枯萎病菌，玉米弯孢病菌，苹果炭疽病菌具有显著的抑制作用，能够解决2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮的原料来源问题。
附图说明
图1是褐多孔菌发酵液分离制备化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)的流程图；
图2～图11是化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮的结构鉴定图，其中，图2是化合物II红外光谱图；图3是化合物II紫外光谱图；图4是化合物II的1HNMR；图5是化合物II的13CNMR；图6是化合物II的HMBC；图7是化合物II的H-HCOSY；图8是化合物II的HSQC；图9是化合物II的NOESY；图10发酵原液中化合物II的HPLC色谱图；图11化合物II抑菌曲线图。
以下结合附图对本发明作进一步详细描述。
具体实施方式
申请人首次从褐多孔菌(Polyporus picipes)发酵液中进行分离制备了化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)并测定了它的抗病原真菌活性。EC50值证明，该天然产物可抑制多种植物病原真菌菌丝体的生长，对棉花枯萎病菌，玉米弯孢病菌，苹果炭疽病菌具有显著的抑制作用。
已知的化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮的化学结构如下；
鉴于该化合物在抗病原真菌方面表现出的很好活性，将2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮开发为抗病原真菌抗生素的原料药有深入研究的价值。
申请人在研究中摸索优化了褐多孔菌(Polyporus picipes)的培养基、发酵条件及分离制备过程，从而使该菌种发酵液中2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮成分含量提高，发酵时间缩短(11～13天)。
本发明的利用褐多孔菌的发酵液进行分离制备化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法，所利用的微生物菌株为：
褐多孔菌(Polyporus picipes)，来源于中国科学院昆明植物研究所。
棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.uasinfectum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.niveum)、番茄灰霉病菌(Botrytiscintrea)，小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)，马铃薯干腐病菌(Fusarium oxysporium)，玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，苹果炭疽病菌(Colletotrichumg loeosporioides)，番茄早疫病菌(Alternaria solani)，西瓜枯萎病菌(Fusarium bulbigenum)，由西北农林科技大学微生物研究中心提供。上述微生物均为公开的生物材料。
本发明主要利用的试剂为：
Amphotericin B，购自西安沃尔森生物技术有限公司，生产货号：AB0004，产地：Amresco。
石油醚(60～90)，氯仿，乙酸乙酯，丙酮，甲醇，甲酸，乙酸试剂均为分析纯；乙腈，甲醇试剂为色谱纯。
制备实施例1：
该实施例采用平皿转瓶液体培养的方法，其具体步骤如下：
1)菌株的发酵和发酵液的浓缩
从经活化的固体平板菌种(28℃，培养5～6d)取8～10mm2大小的菌饼2～3块接入以去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蒸馏水1000mL，pH7.2左右，121℃灭菌30min制成的液体PDA培养基(装液量为50mL/150mL的三角瓶)内，于28℃旋转摇床(转速：150r/min)，培养3～4天形成菌球后以10％的接种量转接于发酵瓶中(装液量为150mL/500mL三角瓶)，发酵13d，共得到发酵液50L。将50L发酵液于55℃下减压浓缩减半；
2)粗提物的制备
发酵物浓缩液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏16g；
3)化合物的分离纯化
参见图1，选取乙酸乙酯萃取物为材料，通过有机溶剂浸提乙酸乙酯浸膏，经加压正相硅胶层析，用CHCl3/MeOH梯度洗脱，常压柱层析采用湿法装柱和硅胶拌样上柱，根据薄层展开情况选择洗脱溶剂***，经过多次正相硅胶柱层析、反相C18柱、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及重结晶法进行分离，最后得化合物的结晶。
硅胶柱层析分离4号样品。4号样品：干重4.38g；
①号硅胶柱：柱层析硅胶120g(200-300目)，拌样硅胶6g(100-200目)。依次用氯仿/甲醇＝98∶2，氯仿/甲醇＝95∶5洗脱；洗脱液以120ml为单位接收，减压蒸馏浓缩；经GF254薄层硅胶板检测，相似合并；共得7个组分。其中2，3组分均出现类似结晶合并约500mg，然后上Sephadex LH-20(氯仿/甲醇＝1∶1)凝胶进一步分离纯化。
②号凝胶柱：Sephadex LH-20(氯仿/甲醇＝1∶1)凝胶；用氯仿/甲醇＝1∶1溶解样品，湿法上样。氯仿/甲醇＝1∶1洗脱，经GF254胶板检测，碘粉和5％的硫酸乙醇显色，相似合并；大约250mg。用丙酮溶解后，上③号硅胶柱进一步分离纯化。
③号硅胶柱：柱层析硅胶15g(200-300目)，拌样硅胶0.6g(100-200目)。用氯仿/丙酮＝100∶1洗脱，经GF254薄层硅胶板检测，碘粉和5％的硫酸乙醇显色，相似合并；约230mg。用丙酮溶解后，上④号硅胶柱进一步分离纯化。号硅胶柱：柱层析硅胶15g(200-300目)，拌样硅胶1g(100-200目)。用氯仿/甲醇＝98∶2洗脱，经GF254薄层硅胶板检测，碘粉和5％的硫酸乙醇显色，相似合并；大约180mg。最后将180mg晶体用氯仿/丙酮进行反复重结晶得到白色针状晶体纯化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)。
制备实施例2：
本实施例采用平皿转瓶液体培养的方法，其具体步骤如下：
1)菌株的发酵和发酵液的浓缩
从经活化的固体平板菌种(25℃，培养6～7d)取6～8mm2大小的菌饼3～4块接入以去皮马铃薯180g/L，葡萄糖18g/L，蒸馏水1000mL，pH7.2左右，121℃灭菌30min制成的液体PDA培养基(装液量为50mL/150mL的三角瓶)内，于25℃旋转摇床(转速：130r/min)培养4～5天形成菌球后以10％的接种量转接于发酵瓶中(装液量为130mL/500mL的三角瓶)，发酵14d，共得到发酵液10L。将10L发酵液于55℃下减压浓缩减半；
2)粗提物的制备
发酵物浓缩液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏2.78g；
3)化合物的分离纯化
将乙酸乙酯浸膏上硅胶柱分离，以体积比100-85∶0-15的CHCl3/MeOH***梯度洗脱，每30ml为一个流份；在CHCl3/MeOH(体积比92∶8)洗脱部分经反复柱层析得到含2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮的一组混合物；该混合物采用石油醚-丙酮(体积比10∶1)洗脱分离，再用薄层制备，最后用Sephadex LH-20凝胶柱层析(丙酮)，得到化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)纯品。
制备实施例3：
本实施例采用平皿转瓶液体培养的方法，其具体步骤如下：
1)菌株的发酵和发酵液的浓缩
从经活化的固体平板菌种(30℃，培养4～5d)取6～8mm2大小的菌饼2～3块接入以去皮马铃薯250g/L，葡萄糖25g/L，蒸馏水1000mL，pH7.2左右，121℃灭菌30min制成的液体PDA培养基内(装液量为50mL/150mL的三角瓶)，于34℃旋转摇床(170r/min)培养3～4天形成菌球后以10％的接种量转接于发酵瓶中(装液量为170mL/500mL的三角瓶)，发酵11d，共得到发酵液15L。将15L发酵液于55℃下减压浓缩减半；
2)粗提物的制备
发酵物浓缩液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏4.37g；
3)化合物的分离纯化
将乙酸乙酯浸膏上硅胶柱分离，以体积比100-85∶0-15的CHCl3/MeOH***梯度洗脱，每60ml为一个流份；在CHCl3/MeOH(体积比93∶7)洗脱部分经反复柱层析得到含2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮的一组混合物；该混合物采用氯仿-丙酮(体积比99∶1)，石油醚-丙酮(体积比95∶5)洗脱分离，再用Sephadex LH-20凝胶柱层析(丙酮)，最后用氯仿-丙酮反复重结晶得到化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)纯品。
分别对实例1、2、3中所得化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)纯品进行理化及波普数据分析，结果如下：
白色针状结晶(CHCl3)，熔点167-168℃；EI-MS m/z(％)：166(54，[M]+)，167(11.5)，151(100)，95(4)，77(4)，69(4.4)。正TOF-MS-MS-ES：167.0700(计算值为166.0621)；其分子式确定为C9H10O3。1H-NMR(acetone-d6；ppm/δ；500MHz)谱：δ2.20(3H，s，H-9)；2.50(3H，s，H-8)；6.25(1H，s，H-3)；7.64(1H，s，H-6)；9.4(4-OH)；12.6(2-OH)。13C NMR(ppm/δ125 MHz；acetone-d6)谱显示112.8(s，C-1)，163.1(s，C-2)，102.0(d，C-3)，162.7(s，C-4)，117.2(s，C-5)，134.12(d，C-6)，202.5(s，C-7)，26.0(q，C-8)，15.2(q，C-9)。以上数据与文献[Phytochemistry，1989，28(1)：239-242；化学学报，1990，48，1191-1198]中记载一致。中文名称为2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)，结构式为：
此结构经数据库查新，可确认此化合物为一种新的天然产物。
HPLC法测定褐多孔菌(Polyporus picipes)的发酵原液中化合物II的含量分析：
1.1色谱条件
色谱柱：采用Agilent zorbax extend C18(4.6mm×200mm，5um)；流动相：0.3％甲酸的乙腈溶液-水(0.3％甲酸的乙腈溶液50％-100％，水50％-0％)，梯度洗脱1h；流速：0.4mL min-1；柱温18℃；检测波长：254nm。
1.2对照品溶液的制备
取干燥至恒重的化合物II适量，精密称定，用甲醇依次配制成100μg/mL，80μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，10μg/mL等浓度备用。
1.3供试品溶液的制备
将发酵原液取50mL浓缩至干，2mL甲醇超声溶解，微孔滤膜(0.45μm)过滤，然后再稀释5倍备用。
1.4线性关系考察
精密吸取化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)(保留时间tR＝7.486min)对照品溶液15μL(不同浓度下100μg/mL，80μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，10μg/mL)，注入液相色谱仪中，测定峰面积，以对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为：Y＝87.463x+147.13，r＝0.9988，结果表明，化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)进样量0.15～1.5μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
1.5发酵液中化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)含量测定
取供试品，按1.3制备样品供试液，按1.1色谱条件，分别进样对照品和供试品溶液，按外标法计算发酵液中化合物II含量，结果发酵液中化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)含量为4.696μg/mL。
生长速率抑制法测定化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)的毒力与EC50(μg/mL)
测定化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)对9种病原菌的毒力时，在无菌条件下，将配制好的样品丙酮溶液用融化的PSA培养基100μg/mL；初筛后对4，6，8，9号病原菌的毒力测定时依次配成0，5，10，20，50，100，200μg/mL系列浓度的带药培养基。阳性对照为Amphotericin B，浓度为200μg/mL。最后根据不同浓度的抑制率计算毒力，得出毒力方程和EC50值。结果见表1、表2及图11。
表1.化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮对9种病原真菌的抑制率
表2.化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮的毒力方程与EC50(μg/mL)
| 菌种名称 | 毒力回归方程 | EC50 | EC90 | R | 95％的置信限 |
| 棉花枯萎病菌)F.oxysporium f.sp.uasinfectum) | Y＝1.92+0.6911x | 86.2 | 551 | 0.996343 | 28.234019 |
| 玉米弯孢病菌)Curvularia lunata)Walk.)Boed) | Y＝1.9582+0.7357x | 62.4 | 356 | 0.967523 | 28.234019 |
| 苹果炭疽病菌)Colletotrichumgloeosporioides) | Y＝0.7316+1.0285x | 63.4 | 221 | 0.934719 | 28.234019 |
综上所述，本发明的方法制备的化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)能够用于制备植物病原真菌抗生素的药物应用。
Claims (4)
1、一种利用褐多孔菌的发酵液进行分离制备化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法，其特征在于，该方法采用平皿转瓶液体培养的方法，首先用去皮马铃薯、葡萄糖、蒸馏水，经灭菌制成培养基，液体培养基的pH值为7.2；然后培养发酵得发酵液，用乙酸乙酯萃取发酵液得到浸膏；通过有机溶剂浸提，经加压正相硅胶层析，用CHCl3/MeOH梯度洗脱，常压柱层析采用湿法装柱和硅胶拌样上柱，根据薄层展开情况选择洗脱溶剂***，经过多次正相硅胶柱层析、反相C18柱、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及薄层制备与重结晶法进行分离，得到纯化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)的制备按下述步骤进行：
1)菌株的发酵和发酵液的浓缩
从经活化的固体平板菌种取8～10mm2大小的菌饼2～3块接入以去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蒸馏水1000mL，pH为7.2，经121℃灭菌30min制成的液体PDA培养基内，于28℃旋转摇床培养3～4天形成菌球后以10％的接种量转接于发酵瓶中，发酵11～13d，共得到发酵液50L，将50L发酵液于55℃下减压浓缩减半；
2)粗提物的制备
发酵物浓缩液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏16g；
3)以乙酸乙酯浸膏为材料，通过有机溶剂浸提，经加压正相硅胶层析，用CHCl3/MeOH梯度洗脱，常压柱层析采用湿法装柱和硅胶拌样上柱，根据薄层展开情况选择洗脱溶剂***，经过多次正相硅胶柱层析、反相C18柱、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及薄层制备与重结晶法进行分离，得到化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)纯品。
3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)为新的天然产物，其分子式为C9H10O3，其化学结构如下：
4、权利要求1或2或3所述的化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)用于制备植物病原真菌抗生素的药物应用。
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