CN101485316B - 一种防治灰霉病的复配杀菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于防治灰霉病的复配杀菌剂。该复配杀菌剂，其活性成分为啶菌恶唑和百菌清，两种活性成分的质量比为(1-8)∶(1-8)，优选质量比为1∶1，1∶2或5∶1，8∶1，最优选比例为1∶1或1∶2。本发明将单作用位点的新型内吸性杀菌剂啶菌恶唑和多作用位点的保护性杀菌剂百菌清进行复配，对于避免或延缓我国创制性杀菌剂啶菌恶唑的田间抗药性产生及扩大其防治谱具有重要的意义，同时可降低啶菌恶唑的使用成本，具有潜在的经济意义。

Description

一种防治灰霉病的复配杀菌剂

技术领域

本发明涉及一种防治灰霉病的复配杀菌剂。

背景技术

番茄灰霉病是一种世界性重要病害，该病主要造成果实腐烂，产量损失。对保护地番茄生产造成极大威胁。该病在我国自20世纪80年代开始发生蔓延以来，目前国内各地均有发生，已经成为番茄设施栽培的限制性障碍。该病的病原为Botrytiscinerea Pers ex Fr(anamorph of Botryotinia fuckeliana(de Bary)Whetz)，为半知菌亚门真菌。该菌可侵染温带地区的至少235种植物，并且能够引起多种重要经济作物(包括蔬菜、花卉、球茎类植物以及果树，尤其是葡萄)的灰霉病。

对于B.cinerea的防治主要有农业防治、生物防治及化学防治等防治措施。由于灰霉病的发生要求有较高的湿度，所以生产上人们常常通过通风以降低大棚的湿度。另外，生物防治也起着一定的作用，孙延忠、曾洪梅等的研究表明：武夷菌素对Botrytis cinerea分生孢子及菌丝均有较好的抑制作用；孙军德，赵春燕等筛选出11个生物防治菌株进行盆栽和田间小区防治番茄灰霉病试验结果表明：细菌B27，真菌F45和F120，放线菌A15和A111，具有较好的预防效果，防治效果均在60％以上。然而，目前对于B.cinerea的防治主要还是依赖于化学防治。

用于B.cinerea防治的化学合成药剂分为五大类：影响真菌呼吸的杀菌剂(如百菌清、福美双、氟啶胺、腈嘧菌酯等)、影响微管功能的杀菌剂(如多菌灵、苯菌灵等)、影响渗透调节的杀菌剂(如腐霉利、异菌脲等)以及影响蛋氨酸合成的杀菌剂(如嘧霉胺、嘧菌胺、嘧菌环胺等)和甾醇合成抑制剂(如咪鲜胺、戊唑醇、十三吗啉、环酰菌胺)等。

由于B.cinerea具有较大的遗传变异及广范围寄主的特点，因此，B.cinerea极容易对药剂产生抗药性。事实也正是如此：1970s B.cinerea对苯并咪唑类杀菌剂产生了抗药性；1981年，又对二甲酰亚胺类杀菌剂产生了中等水平抗性，并对多菌灵表现出高水平抗性；1989年和1996年，在欧洲的几个国家发现对保护性杀菌剂(主要是苯氟磺胺)产生抗药性的B.cinerea菌株；1992年，Y.ELAD在田间检测到对甾醇合成抑制剂戊唑醇和腈苯唑(fenethanil)产生抗性的B.cinerea菌株；从1994年起对法国葡萄园的抗药性监测中检测到3种对苯胺嘧啶类杀菌剂产生抗性的B.cinerea菌株(Ani R1，Ani R2，Ani R3)；2000年，在甾醇合成抑制剂环酰菌胺作为防治灰霉病药剂使用之前，就在法国的葡萄园检测到对其产生抗性的B.cinerea菌株；2000年，在日本的豆类作物上检测到对新型药剂氟啶胺产生高抗药水平的B.cinerea菌株。显而易见，B.cinerea对防治它的几大类药剂均产生了抗药性。

人们习惯于将不同类型和不同作用机制的药剂(尤其是具有负交互抗药性的药剂)进行复配或者交替使用进行抗药性的治理，以延缓抗药性的产生或对已经发生抗药性的田块进行治理。1970s末B.cinerea对苯并咪唑类杀菌剂(尤其是多菌灵)产生抗药性以后，由于多菌灵和乙霉威具有负交互抗药性，于是人们将多菌灵和乙霉威按一定比例进行复配进行抗药性治理，然而，在其使用不到两年，在法国就发现对该复配制剂产生抗药性的B.cinerea菌株。可见，B.cinerea对生产上使用的各种类型的药剂(包括复配制剂)均产生了不同程度的抗药性。因此，寻找新的复配制剂或交替用药模式或新的防治药剂势在必行。

啶菌恶唑就是一种新型的替代药剂，它是由我国沈阳化工研究院创制的一种对灰霉病有特效的药剂，具有很好的内吸性。韩平(2006)的研究表明：啶菌恶唑对番茄灰霉病菌的麦角甾醇合成具有显著的抑制作用，因此推测啶菌恶唑作用于真菌的麦角甾醇合成。司乃国等(2004)田间试验结果也表明，啶菌恶唑对B.cinerea有较好的防治效果。因此，啶菌恶唑有可能成为今后生产上用于防治B.cinerea的新型替代药剂。鉴于B.cinerea是一个具有高抗药性风险的菌，有必要将啶菌恶唑与已有的杀菌剂(尤其是具有负交互抗药性的药剂或保护性的杀菌剂)进行复配，以延缓B.cinerea对啶菌恶唑的抗药性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于防治灰霉病的复配杀菌剂。

本发明所提供的复配杀菌剂，其活性成分为啶菌恶唑和百菌清，所述啶菌恶唑和百菌清的质量比为(1-8)∶(1-8)，优选质量比为1∶1、1∶2、5∶1或8∶1，最优选比例为1∶1、1∶2。

按照所述杀菌剂质量比进行复配后，还可按需要添加不同的填料和助剂，加工成任何可接受的剂型。例如可以是悬浮剂、水乳剂、可湿性粉剂、乳油、(水分散)粒剂。

本发明的另一个目的是提供复配杀菌剂的用途。

本发明所提供的所述复配杀菌剂的用途是该杀菌剂在防治灰霉病中的应用。

其中，所述灰霉病是由Botrytis cinerea病原菌引起的。

本发明的研究表明：啶菌恶唑与保护性杀菌剂百菌清之间存在负交互抗药性，这一研究结果为啶菌恶唑与百菌清复配提供了理论依据。而且，百菌清是一个具有多作用位点的保护性杀菌剂，病原菌对其不易产生抗药性。这一复配模式对于避免或延缓啶菌恶唑的抗药性，扩大啶菌恶唑的防治谱，及其降低啶菌恶唑的使用成本具有重要的意义；此外，百菌清在全球的使用量很大，这也为这一复配制剂的推广提供了宽阔的平台。因此，本发明将啶菌恶唑与百菌清进行了复配，研究了其复配的最佳比例。为生产中啶菌恶唑和百菌清的复配产品的使用提供了理论依据。

将具有不同作用机制的药剂，尤其是具有负交互抗药性的药剂进行复配，是进行抗药性治理和延缓药剂抗药性产生的一项重要的措施。本发明复配杀菌剂有以下优点：1、该杀菌剂将单作用位点的新型内吸性杀菌剂啶菌恶唑和多作用位点的保护性杀菌剂百菌清进行复配，对于避免或延缓我国创制性杀菌剂啶菌恶唑的田间抗药性产生及扩大其防治谱具有重要的意义。2、由于百菌清是一个保护性的杀菌剂，具有防治谱很广，生产成本较低等特点，因此，本发明复配杀菌剂还能够很好地扩大啶菌恶唑的防治谱，降低啶菌恶唑的使用成本，具有潜在的经济意义。

附图说明

图1A为实施例1中紫外诱变菌丝块获得的突变体

图1B为实施例1中紫外诱导孢子获得的突变体

图2为实施例1中啶菌恶唑单剂对供试菌株的EC₅₀的对数值与百菌清单剂对供试菌株的EC₅₀的对数值(1g)的回归曲线。

具体实施方式

实施例1、啶菌恶唑与百菌清交互抗性测定

1、供试菌株

供试菌株来自于山东、河南、北京、天津、南京等未施用过啶菌恶唑和其它甾醇合成抑制剂的地区。其中包括11株敏感菌株，6株田间自然突变体和28株紫外诱导抗药突变体。共计45株菌株用于交互抗药性测定。

上述菌株按照如下方法获得：

2006年5月分别在北京地区、南京、山东、河南及天津等地未使用过啶菌恶唑及同类药剂(其它甾醇合成抑制剂)的大棚采集番茄灰霉病病果。采用5点法取样以降低采集到同一菌株的几率。用灭菌的解剖刀将病果腐烂的外皮去掉，取新鲜的发病果肉，将其切成小块，于1.5％的NaCl0中消毒1分钟，然后用无菌水清洗3遍后，放在灭菌的滤纸片上将组织表面的水吸干，然后放在YG培养基(酵母粉5g，琼脂粉12.5g，葡萄糖18g，1000ml去离子水)上，于20℃～22℃、黑暗培养；待其产孢后，进行单孢分离，每个病叶或病果上分离一株B.cinerea。经单孢分离的菌株编号后保存在YG斜面上，加石蜡油于室温长期保存。

1)敏感菌株的筛选

在含有1.0μg/ml啶菌恶唑的YG培养基平板上可以生长的菌落为抗药性菌株，不能生长的为敏感菌株。

2)田间自然突变体的筛选

将来自不同地区的番茄灰霉病菌菌株(亲本菌株)，在YG培养基(酵母粉5g，琼脂粉12.5g，葡萄糖18g，1000ml去离子水)上培养，使其产孢，使用无菌水配制浓度为5×10⁶个孢子/ml的孢子悬浮液，不经任何处理，直接涂布在含有浓度为1.0μg/ml啶菌恶唑的YG培养基平板上，每个平板涂布100ul。然后于20～22℃、黑暗培养。7-10d后检查结果，当有菌落长出时，则为疑似抗药突变体，进行突变体的验证。

将疑似抗药突变体转移到无药的YG平板上，待其形成菌落，连续转代3次，再回接到含有1.0μg/ml啶菌恶唑的YG培养基平板上验证，如果还能形成菌落，则为突变体，否则不是。将确认后的突变体待其产孢后，挑取单孢，备用。

3)紫外诱导抗药突变体的筛选

选择来自于不同地区的番茄灰霉病菌敏感菌株进行紫外诱导。

A、紫外诱导孢子：

将敏感菌株(亲本菌株)在YG培养基(酵母粉5g，琼脂粉12.5g，葡萄糖18g，1000ml去离子水)上培养，使其产孢，使用无菌水配制浓度为5×10⁶个孢子/ml的孢子悬浮液，取5ml置于培养皿(Φ9cm)皿底，将其置于20w、254nm的紫外灯下4.5cm处照射45sec后，黑暗条件下放置1h左右(防止光修复导致突变恢复)，涂布在含有浓度为1.0μg/ml啶菌恶唑的YG培养基平板上，每个平板涂布100ul。平板中按400ml培养基加入500～700ul的85％～90％的乳酸，以抑制细菌的生长。然后于20～22℃、黑暗条件下培养。10～15d后检查结果，当有菌落长出时，则为疑似抗药突变体，进行突变体的验证。

将疑似抗药突变体转移到无药的YG平板上，待其形成菌落，连续转代3次，再回接到含有浓度为1.0μg/ml啶菌恶唑药剂浓度平板上验证，如果还能形成菌落，则为突变体，否则不是。将确认后的突变体(图1B)待其产孢后，挑取单孢，备用。

B、紫外诱导菌丝块：将敏感菌株(亲本菌株)在YG平板上于20～22℃、黑暗条件下培养3d，使其菌落长满整个平板，打开培养皿盖，将皿底置于20w、254nm的紫外灯下4.5cm处分别照射40min和50min，在黑暗条件下放置1h(防止光修复导致突变恢复)后用直径为4mm的打孔器在菌落上打取菌饼，将其菌丝面朝下，接种于含浓度为1.0μg/ml啶菌恶唑带毒平板上，每平板放置13个菌丝块，于20～22℃、黑暗培养10～15d，检查是否有疑似突变体产生，并进行突变体的验证。

将疑似抗药突变体转移到无药的YG平板上，待其形成菌落，连续转代3次，再回接到含有浓度为1.0μg/ml啶菌恶唑药剂浓度平板上验证，如果还能形成菌落，则为突变体，否则不是。将确认后的突变体(图1A)待其产孢后，挑取单孢，备用。

2、交互抗药性的测定

选择步骤1的45株菌株用于交互抗药性测定。

采用菌丝生长速率法(如实施例2中的4实验方法)分别测定啶菌恶唑单剂对上述45株供试菌株的EC₅₀及百菌清单剂对上述45株供试菌株的EC₅₀。并将所获得的EC₅₀换算为对数值。

分别以啶菌恶唑单剂对供试菌株的EC₅₀的对数值为横坐标，以百菌清单剂对供试菌株的EC₅₀的对数值为纵坐标，做直线图，求出回归直线方程和相关系数。

如图2所示，随着供试菌株对啶菌恶唑敏感性的降低，而相应地对百菌清的敏感性却增加，R为0.8186，表明啶菌恶唑与百菌清之间存在明显的负交互抗药性。选择合理的配比进行啶菌恶唑与百菌清复配。

实施例2、啶菌恶唑与百菌清复配的联合毒力测定

1、供试菌株

选择实施例1中一株对啶菌恶唑表现为敏感的番茄灰霉病菌(B.cinerea)菌株，一株对啶菌恶唑表现为抗性的番茄灰霉病菌(B.cinerea)的抗药性菌株进行联合毒力测定试验。

2、供试药剂

供试药剂为92％啶菌恶唑原药和90％百菌清原药。啶菌恶唑单剂与百菌清单剂分别按照质量比为1∶0(啶菌恶唑单剂)、1∶1、1∶2、1∶5、1∶8、2∶1、5∶1、8∶1、0∶1(百菌清单剂)的比例复配。

3、供试培养基

YG培养基(酵母粉5g，葡萄糖18g，琼脂粉12.5g，1000ml去离子水)，灭菌。

4、实验方法

采用菌丝生长速率法进行毒力测定。

4.1药液的配置

4.1.1各复配比例母液的配置

分别将啶菌恶唑原药和百菌清原药用丙酮溶解稀释成浓度为10⁴μg/ml的母液，按质量比为1∶0(啶菌恶唑单剂)、1∶1、1∶2、1∶5、1∶8、2∶1、5∶1、8∶1、0∶1(百菌清单剂)的比例混合，就配成了各复配比例药剂的母液。各复配比例梯度药液均用丙酮稀释。

4.1.2敏感菌株各复配比例梯度药剂的配制

将1∶0比例混配的母液稀释成30、50、70、100、200、350μg/ml的梯度药液；将1∶1和2∶1比例混配的母液稀释成10、30、50、100、200、400μg/ml的梯度药液；将5∶1和8∶1比例混配的母液稀释成20、50、70、100、150、200、400μg/ml的梯度药液；将1∶2比例混配的母液稀释成100、200、300、400、600、800μg/ml的梯度药液；将1∶5比例混配的母液稀释成200、500、700、1000、1500、1800μg/ml的梯度药液；将1∶8比例混配的母液稀释成200、500、1000、1300、1600、2000、3000μg/ml的梯度药液；将0∶1比例混配的母液稀释成600、1000、2000、5000、15000、25000μg/ml的梯度药液(其中15000μg/ml和25000μg/ml的药液不用单独配置，分别往60ml培养基中加入90μl和150μl浓度为10⁴μg/ml的母液配置对应的带毒平板)。

4.1.3抗性菌株各复配比例梯度药液的配制

将1∶0比例混配的母液稀释成100、200、500、1000、2000μg/ml的梯度药液；将0∶1比例混配的母液稀释成300、500、1000、5000、10000、15000μg/ml的梯度药液(其中15000μg/ml的药液不用单独配置，在60ml培养基中加入90ul 10⁴μg/ml的母液配置相应的带毒平板)；其余各复配比例的药液均稀释成200、500、1000、1300、1600、2000、3000μg/ml的梯度药液。

4.2带毒平板的制备

用移液枪吸取60μl配置好的各系列梯度浓度溶液，加入已灭菌的冷却至45℃的60ml YG培养基中，制作带毒平板，对照吸取相同体积的丙酮溶液，每个浓度3次重复。

4.3接菌、培养

用直径为4mm的打孔器从20℃、黑暗培养3d的供试菌株的菌落边缘同一圆周上打取菌饼，菌丝面朝下接种于带毒平板中央(每个平板接种一枚)。然后，置于20℃、黑暗培养3d，测定结果。

4.4结果测定及分析

用直尺按十字交叉法量取菌落直径，各浓度取3个重复共6个值的平均值作为该浓度菌落平均直径值。根据下式计算出各浓度药剂对菌丝生长的抑制率。

然后将抑制率数据转换成机率值(Y)、药剂浓度(μg/mL)转换成以10为底的对数值(X)，在Microsoft Excel中作回归直线，分别求出两单剂及其各复配制剂的毒力回归方程(Y＝A+BX)和相关系数(r)，计算出药剂对番茄灰霉菌菌丝生长抑制的有效中浓度(EC₅₀)。

最后根据EC₅₀计算各复配比例药剂的联合毒力。

复配制剂的联合毒力采用孙云沛的共毒系数方法表示：

将各药剂(单剂及复配制剂)中EC₅₀最低的那种药剂的实际毒力指数设定为100；

混配制剂的实际毒力指数＝单剂中最低的EC₅₀/待测比例的EC₅₀×100；

混配制剂的理论毒力指数A＝∑(某药的实际毒力指数×在混剂中该药有效成分的百分率)；

C大于120时为增效作用，小于80时为拮抗作用，80～120时为加和作用；

5、结果

5.1啶菌恶唑和百菌清不同比例混配制剂对番茄灰霉病菌(B.cinerea)的毒力测定

啶菌恶唑和百菌清按质量比1∶0、1∶1、1∶2、1∶5、1∶8、2∶1、5∶1、8∶1、0∶1比例复配制剂对番茄灰霉病菌(B.cinerea)抗性菌株和敏感菌株的毒力回归方程式、相关系数和EC₅₀值见表1和表2。

表1啶菌恶唑和百菌清单剂及复配制剂对抗性菌株的毒力作用

表2啶菌恶唑和百菌清单剂及复配制剂对敏感菌株的毒力作用

5.2啶菌恶唑和百菌清不同比例混配制剂对番茄灰霉病菌(B.cinerea)的共毒系数

根据孙云沛的计算公式求得：啶菌恶唑和百菌清分别按照质量比1∶0、1∶1、1∶2、1∶5、1∶8、2∶1、5∶1、8∶1、和0∶1的配比制成的混剂对番茄灰霉病菌(B.cinerea)抗性菌株和敏感菌株的理论毒力指数A和共毒系数C见表3和表4。

联合毒力测定结果表明：啶菌恶唑和百菌清按质量比1∶1、1∶2、1∶5、1∶8、2∶1、5∶1、和8∶1的比例混配的药剂对啶菌恶唑抗药番茄灰霉病菌菌株的共毒系数位于81.65～113.76，介于80～120之间，均表现出加和作用；对于敏感菌株，啶菌恶唑和百菌清按质量比1∶1、1∶2、5∶1和8∶1的比例混配时，共毒系数位于80.06～108.85，介于80～120之间，同样也表现出加和作用；而两者按1∶5、1∶8和2∶1的比例混配时，共毒系数位于47.12～77.57，小于80，表现出拮抗作用。

可以看出，啶菌恶唑和百菌清按1∶1、1∶2、5∶1和8∶1的比例混配时，对于抗药性菌株和敏感菌株均表现出加和作用，但是两者按1∶1和1∶2的比例混配时能更好地降低药剂成本，因此建议将这两个比例应用于田间施药。

表3啶菌恶唑和百菌清的复配制剂对抗性菌株的共毒系数

表4啶菌恶唑和百菌清的混配制剂对敏感菌株的共毒系数

实施例3、啶菌恶唑和百菌清复配制剂的田间小区防病实验

供试作物品种：番茄，品种为合作908(上海长征良种实验场生产，市售)。该品种属中早熟型，无限型，植物生长旺盛，适用栽培区域广，抗病抗逆性强。

实验设7个处理：I：25％的啶菌恶唑乳油和75％百菌清可湿性粉剂复配制剂，其中啶菌恶唑和百菌清的质量比为1∶2，以600倍稀释液进行喷施；II：25％的啶菌恶唑乳油和75％百菌清可湿性粉剂复配制剂，其中啶菌恶唑和百菌清的质量比为1∶2，以1250倍稀释液进行喷施；III：25％的啶菌恶唑乳油和75％百菌清可湿性粉剂复配制剂，其中啶菌恶唑和百菌清的质量比为1∶1，以600倍稀释液进行喷施；IV：25％的啶菌恶唑乳油和75％百菌清可湿性粉剂复配制剂，其中啶菌恶唑和百菌清的质量比为1∶1，以1250倍稀释液进行喷施；V：25％的啶菌恶唑乳油，以1250倍稀释液进行喷施；VI：75％百菌清可湿性粉剂，以600倍稀释液进行喷施；VII：清水对照。

在前一年有番茄灰霉病菌(B.cinerea)发生的田间，按照农药田间药效试验准则(-)GB/T17980.28-2000-“杀菌剂防治蔬菜灰霉病”准则中番茄灰霉病的病害分级标准和计算方法，于发病之前进行第一次喷药、喷药间隔期为10天，第三次喷药后七天调查各小区病情指数。每小区随机取5点，每点取2株，每小区共计调查10株番茄的全部叶片的发病情况，每片叶按病斑面积占叶面积的百分率分级记录，计算各小区病情指数，最后以病情指数计算供试药剂对番茄灰霉病的防治效果。

经鉴定，该田间病害由是番茄灰霉病菌(B.cinerea)引起的灰霉病。

番茄灰霉病以叶片为单位的病害分级标准及药剂防治效果计算方法如下。

病情调查以叶片为单位进行普查，病害分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：单叶片有病斑3个；

3级：单叶片有病斑4-6个；

5级：单叶片有病斑7-10个；

7级：单叶片有病斑11-20个，部分密集成片；

9级：单叶片有病斑密集占叶面积25％以上；

病情指数＝〔∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)〕×100

防治效果(％)＝〔(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数〕×100

发病率＝发病株数/调查株数。

结果如表5所示，表明本发明的啶菌恶唑和百菌清复配制剂对番茄灰霉病防治效果与啶菌恶唑的防效相当。

表5啶菌恶唑和百菌清复配制剂对番茄灰霉病的田间防治效果

注：R₁、R₂、R₃、R₄表示四次重复；防病效果中，具有相同字母的处理间在p＝0.01水平上无显著差异。

Claims (4)

1.一种防治灰霉病的杀菌剂，其活性成分为啶菌恶唑和百菌清，所述啶菌恶唑和百菌清的质量比为1∶1、1∶2、5∶1或8∶1。

2.根据权利要求1所述的杀菌剂，其特征在于：所述啶菌恶唑和百菌清的质量比为1∶1或1∶2。

3.根据权利要求1或2所述的杀菌剂，其特征在于：所述灰霉病由Botrytis cinerea病原菌引起。

4.权利要求1-3中任一所述的杀菌剂在防治灰霉病中的应用。

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