CN104542713A - 一种枯草芽孢杆菌组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种枯草芽孢杆菌组合物，所述组合物组分为枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂和6%春雷霉素可湿性粉剂，它们的质量比为1:0.1-10；所述草芽孢杆菌组合物可应用于防治水稻稻瘟病和稻曲病；本发明首次针对水稻穗期重大病害进行防治，经室内检测和田间药效试验发现该合物能够有效防治水稻穗颈瘟和稻曲病，提高了防治效果而且减少了化学药剂使用量，降低农药残留，改善生态环境。

Description

一种枯草芽孢杆菌组合物及其应用

技术领域

本发明涉及农药技术领域，特别是枯草芽孢杆菌组合物及其应用。

背景技术

粮食安全是关系我国国民经济发展、社会和谐稳定的重大战略问题，随着人民生活改善，对粮食安全性的要求也越来越高。保障无公害、优质安全的粮食供给和实现农业资源的可持续发展利用是新世纪农业生产面临的最大挑战，近年来，由于种植条件的改善及气候等因素的影响，水稻穗期重大真菌病害(稻瘟病、稻曲病)频繁发生，不仅严重影响了稻米的产量和品质，而且利用化学药剂防治水稻病害会给生态环境造成污染，增加了稻米中农药化学物质的残留，给人类健康造成一定的危害，近年来我国频发爆出的农药中毒事件也是在给社会敲响警钟，减少粮食作物的化学农药残留已经成为各级政府、学者和农民共同关注的热点，开发出一种安全、环保的绿色杀菌剂已经是刻不容缓的责任。

生物农药具有无污染、无残留、环境相容性好且不易使病原菌产生抗药性等特点，已经日益引起人们的重视，但是在田间使用生物农药仍然存在一些问题，例如：容易受到气候和环境的影响导致防效不稳定、药效作用较缓慢等，目前有效解决这一问题的方法之一是开展生物农药与其他低毒农药复配，构建协同控制水稻病害的技术体系。这样既可以高效、快速的杀灭植物病原菌，另外杀菌剂中的有益微生物还可以改善微环境，诱导植物产生抗病性等作用，可以有效持久的控制水稻作物病害的发生和流行。

江苏省农科院植保所从水稻田间土壤中分离获得一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)T-500，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC NO：6058，该菌株已于2012年9月7日申请专利，申请号为201210328716.5，经室内平板测定及盆栽实验证明，该菌株对水稻稻瘟病、稻曲病及纹枯病均有良好的防治效果，目前，江苏省农业科学院植保所已经研发了100亿/克枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂，相关制备方法已于专利201310301606.4公开。

春雷霉素又名春日霉素，英文名(kasugamycin，KSM)，化学名称为(5-氨基-2-甲基-6-(2，3，4，5，6-羟基环己基氧代)四氢吡喃-3-基)氨基-α-亚氨醋酸。熔点：236～239℃，原药为浅黄色粉末，在有机溶剂中难溶，在25℃水中溶解12.5％(W/V)，原药对人、畜、家禽的急性毒性均低，大白鼠急性经口毒性22000mg/kg，小白鼠急性经口为20000mg/kg，兔则为20900mg/kg，对鱼、虾类的毒性很低，只有滴滴涕的八千分之一，属于低毒杀菌剂。春雷霉素对水稻上的稻瘟病有优异防效和治疗作用，水稻抽穗期和灌浆期施药，对结实无影响。

申请号为201310697647.X的中国专利公开一种有效活性成分为春雷霉素与枯草芽孢杆菌的组合物，虽然也涉及了水稻稻瘟病，主要是针对水稻叶瘟病开展防效试验，对于水稻穗期其他重要病害并未涉及；目前，用于同时防治水稻穗颈瘟和稻曲病的有效组合物并未见诸报道。

发明内容

针对目前大量使用化学农药防治稻瘟病、稻曲病，污染生态环境，严重影响稻米品质的现状，提出一种对水稻稻瘟病、稻曲病具有良好防治效果的杀菌剂，该杀菌剂抑菌效果迅速，农药残留少，本发明是这样实现的：

一种枯草芽孢杆菌组合物，枯草芽孢杆菌组合物的组分为枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂和6％春雷霉素可湿性粉剂，它们的质量比为1:0.1-10。

本发明中所述枯草芽孢杆菌组合物中，所述枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂的活菌量为8×10⁹cfu/g。

本发明所述枯草芽孢杆菌组合物在防治水稻稻瘟病和稻曲病中的应用。

本发明所述所述枯草芽孢杆菌组合物应用中，所述的稻瘟病为穗稻瘟病。

本发明所述所述枯草芽孢杆菌组合物应用中，将组合物的稀释500-2000倍数后使用。

本发明将枯草芽孢杆菌T500与春雷霉素混合后室温放置，经活性检测，枯草芽孢杆菌T500活菌量不受影响，与春雷霉素具有良好的生物相容性，可以实现长期共存；枯草芽孢杆菌T500和春雷霉素复配后可以优势互补，既能发挥春雷霉素高效快速的抑菌作用，又能发挥枯草芽孢杆菌T500在水稻植株定殖诱导植株产生抗病性、持久控制水稻稻瘟病和稻曲病的作用；本发明首次针对水稻穗期重大病害进行防治，经室内检测和田间药效试验发现该合物能够有效防治水稻穗颈瘟和稻曲病，提高了防治效果而且减少了化学药剂使用量，降低农药残留，改善生态环境。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂与春雷霉素的生物相容性检测结果示意图。

具体实施方式

实施例中涉及水稻稻瘟病、稻曲病菌由江苏省农科院植保所生防研究室提供；

枯草芽孢杆菌T500由专利201210328716.5公开，江苏省农科院植保所提供；

枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂由专利201310301606.4实施例3公开，活菌量为8×10⁹cfu/g，江苏省农科院植保所提供；

55％春雷霉素、6％春雷霉素可湿性粉剂均由延边春雷生物药业有限公司生产；

实施例中涉及培养基：

PDA培养基：马铃薯20g、葡萄糖20g、琼脂12g，蒸馏水1000ml，pH5.5-6.5；

PDA液体培养基：马铃薯20g、葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，pH5.5-6.5；

YPGA培养基：葡萄糖5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，琼脂12g，蒸馏水1000ml，pH7.0；

YPG培养液：葡萄糖5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，蒸馏水1000ml，pH7.0；

实施例1枯草芽孢杆菌T500发酵液对水稻病害(稻瘟病、稻曲病)的抑制作用

供试菌株：将水稻稻瘟病、稻曲病菌菌株分别用PDA培养基，于28℃培养1周备用；

供试药剂：将枯草芽孢杆菌T500在YPGA培养基上活化，然后将活化菌株接种到YPG培养液中,置于140r/min、30℃摇床内培养48h制备发酵液，发酵液中菌含量为1～8×10⁹cfu/ml。

测定方法：

(1)对稻瘟病菌的抑菌活性测定：在室内条件下，采用平板对峙法，将PDA培养基培养好的稻瘟病菌，在无菌条件下用直径5mm的灭菌打孔器，自菌落边缘切取菌饼，用接种器将菌饼接种到PDA培养基平板中央，菌丝面朝上，置于28℃恒温箱内培养3-4天，然后在PDA培养基上对峙三点放置6mm无菌滤纸片,将枯草芽孢杆菌T500发酵液吸取10ul于滤纸片上,置于28℃恒温箱内培养，同时设立无菌水处理为对照，每处理重复3次，计算各处理抑菌率：

(2)水稻稻曲病菌的抑菌活性测定：将稻曲病菌接入PDA液体培养基中，置于140r/min、28℃摇床培养5～7d，待孢子量达到1×10⁶cfu/mL，吸取330μL于PDA平板上，使用无菌L棒涂布均匀，平板中央放入6mm无菌滤纸片，吸取10μL枯草芽孢杆菌发酵液于滤纸片上，置于28℃恒温箱内培养，设无菌水处理为对照，每处理重复3次，待对照病原菌长满平板时，测量抑菌圈直径，计算抑制率。

试验测定结果如表1所示，表明枯草芽孢杆菌T500发酵液对水稻稻瘟病菌、稻曲病菌的菌丝生长均具有显著的抑菌活性。

表1 T500对水稻瘟病菌、稻曲病菌菌丝生长的抑制作用

实施例2枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂对稻瘟病、稻曲病的抑制作用

本实施例中供试药剂为枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂，将其以无菌水分别稀释10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶倍进行试验；供试菌株与测定方法与实施例1相同，同时设立无菌水组(CK)进行对照试验，试验结果如表2所示：

表2 T500干悬浮剂对水稻瘟病菌、稻曲病菌菌丝生长的抑制作用

实施例3枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂与春雷霉素的生物相容性检测

检测方法：将55％春雷霉素与枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂以质量比例1:1置于混合器充分混合均匀，然后置于室温条件下，分别于第10、30、60、120天检测枯草芽孢杆菌T500的活菌数，检测春雷霉素对枯草芽孢杆菌的活芽孢数的影响，同时以碳酸钙代替春雷霉素作为对照组，检测结果如图1所示，结果显示：将枯草芽孢杆菌T500和55％春雷霉素复配后，经过120天检测春雷霉素对枯草芽孢杆菌T500没有抑制作用，和碳酸钙对照相比，芽孢数差异不显著，具有良好的生物相容性，可以复配使用。

实施例4不同配比的春雷霉素和T500干悬浮剂对水稻稻瘟病、稻曲病的抑菌增效作用测定供试菌株与实施例1相同；

测定方法：将6％春雷霉素可湿性粉剂配成40ug/ml、4ug/ml、0.4ug/ml、0.04ug/ml，分别加入PDA培养基中，测定单独使用6％春雷霉素的防效。

将枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂配成1×10⁶cfu/ml、1×10⁵cfu/ml、1×10⁴cfu/ml、1×10³cfu/ml，分别加入的PDA培养基中，测定单独使用枯草芽孢杆菌T500的防效。

将6％春雷霉素和枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂按照质量比10:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，1:10共7个配比，均分别稀释1000，2000，4000，8000，16000倍，制成不同浓度的PDA平板，测定对水稻稻瘟病、稻曲病的抑菌增效活性。以各处理的杀菌剂浓度对数为x，以相应处理对病原菌菌丝生长抑制率的等值偏差为y，应用统计回归方法，拟合浓度对数-抑制百分率的回归方程，计算EC50和增效指数(SR)。其中增效指数参考wadley公式(增效指数SR＝混合物的预期EC50exp/混合物的实测EC50)，其中(EC50exp)通过下式计算；EC50exp＝(a+b)/[(a/EC50A)+(b/EC50B)]，a和b为混剂中单剂的绝对数量；如果SR>1.5则表现增效作用,0.5≤SR≤1.5则表现相加作用，SR≤0.5为拮抗作用。

表3春雷霉素·枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂对稻瘟病菌菌丝生长抑制增效作用测

表4春雷霉素·枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂对稻曲病菌菌丝生长抑制增效作用测定

实施例5枯草芽孢杆菌组合物的配制

制备过程：将6％春雷霉素可湿性粉剂与枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂分别按照质量比10:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，1:10置于混合器充分混合均匀，然后经粉碎机粉碎，制备成不同配比的杀菌组合物。

实施例6枯草芽孢杆菌组合物抑制稻瘟病菌生长的增效作用测定

枯草芽孢杆菌组合物组成：由实施例5获得，枯草芽孢杆菌T500与6％春雷霉素质量比2:1。增效测定：方法与实施例4相同

所的结果如表5所示：

表5枯草芽孢杆菌组合物对稻瘟病菌菌丝生长抑制增效作用测定

实施例7枯草芽孢杆菌组合物抑制稻曲病菌生长的增效作用测定

枯草芽孢杆菌组合物组成：由实施例5获得，枯草芽孢杆菌T500与6％春雷霉素质量比1:3。

增效测定：方法与实施例4相同

所的结果如表6所示：

表6枯草芽孢杆菌组合物对稻曲病菌菌丝生长抑制增效作用测定

实施例8枯草芽孢杆菌组合物对成株期水稻稻瘟病(穗颈瘟)的小区防治效果试验

时间：2013年9月

试验地点：江苏省淮安市泾口镇、农科院南京试验田

实验品种：淮稻5号，南粳46

试验药剂：

①杀菌组合物：由实施例5获得，枯草芽孢杆菌T500与6％春雷霉素质量比2:1；

②枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂；

③6％春雷霉素可湿性粉剂；

④75％三环唑可湿性粉剂(江苏丰登农药有限公司)。

田间分区：试验一共设置7个处理，每个处理小区试验面积30m²，三个重复，共计21个小区，各小区田间随机分布排列。

施药方法：在水稻破口前一周，预先接种水稻稻瘟病孢子，半小时后将各处理药品按30-45kg/667m²的用水量稀释，稀释倍数500-2000倍，以清水为空白对照，用手动喷雾器对各小区喷雾施药，具体处理见表7。

表7：枯草芽孢杆菌组合物对水稻稻瘟病(穗颈瘟)的防治效果

结果分析：用药45天后调查水稻发病情况和防治效果，每小区采用普查取样法进行调查，计算病情指数和防效指数。采用国际水稻所穗颈瘟统一调查标准：0级，发病率0，无病斑；1级，发病率5％以下，个别枝梗发病；3级，发病率6％～20％，1/3枝梗发病；5级，发病率21％～50％，穗颈或主轴发病，谷粒半瘪；7级，发病率51％～70％，穗颈发病，大部分瘪谷；9级，发病率71％～100％，穗颈发病，造成白穗。

病情指数＝(各级发病数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100％

防治效果(％)＝(对照病情指数－防治病情指数)/对照病情指数×100％

田间小区试验结果(表7)表明：在南京、淮安两地，单剂枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂对(亩用量50克)水稻稻瘟病的防治效果分别为69.87％和63.1％；单剂6％春雷霉素(亩用量25克)水稻稻瘟病的防治效果分别为68.22％和79.1％。枯草芽孢杆菌组合物(亩用量50克)对水稻稻瘟病的防效可达77.32％和77.6％，达到单剂防治效果。当亩用量75克时对稻瘟病的防治效果分别为83.27％和78.5％，防效优于单剂，综合防治效果，田间推荐用量为50克/亩时，可以起到有效防治水稻稻瘟病的效果。

实施例9枯草芽孢杆菌组合物对成株期水稻稻瘟病(穗颈瘟)的大田防治效果。

试验时间：2013年9月

试验地点：江苏省淮安市泾口镇

实验品种：淮稻5号

大田面积：50亩

试验药剂：枯草芽孢杆菌组合物中，枯草芽孢杆菌T500与6％春雷霉素的质量比2:1；

施药方法：在水稻破口前一周，采用常规施药技术，将枯草芽孢杆菌组合物参照50克/亩的用量，稀释800倍后，用电动喷雾器喷洒大田。

调查方法：参照实施例4，

调查结果：大田规模条件下稻瘟病防治效果可达80.23％，能有效的防治稻瘟病。

实施例10枯草芽孢杆菌组合物对成株期水稻稻曲病的小区防治效果

试验时间：2014年9月

试验地点：农科院南京试验田

实验品种：南粳9108

试验药剂：

①枯草芽孢杆菌组合物中，枯草芽孢杆菌T500与6％春雷霉素的质量比1:3；

②枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂

③6％春雷霉素可湿性粉剂(吉林延边春雷生物药业有限公司)

④纹曲宁水剂(江苏省苏科农化有限公司)

田间分区：试验一共设置7个处理，每个处理小区试验面积30m²，三个重复，共计21个小区，各小区田间随机分布排列。

施药方法：在水稻破口前一周，预先喷雾接种水稻稻曲病孢子，半小时后将各处理药品按30-45kg/667m²的用水量稀释，稀释倍数500-2000倍，以清水为空白对照，用手动喷雾器对各小区喷雾施药，具体处理见表8。

表8：枯草芽孢杆菌组合物对水稻稻曲病的防治效果

上各实施例不是对本发明限制，具体实施时，可以依据本领域的基本常识，根据权利要求的公开的组分配置组合物，选择适当的药物配比以及稀释比例稀释后用于防治水稻稻曲病和稻瘟病。

Claims (5)

1.一种枯草芽孢杆菌组合物，其特征在于，枯草芽孢杆菌组合物的组分为枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂和6%春雷霉素可湿性粉剂，它们的质量比为1:0.1-10。

2.根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌组合物，其特征在于所述枯草芽孢杆菌T500干悬浮剂的活菌量为8×10⁹cfu/g。

3.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌组合物在防治水稻稻瘟病和稻曲病中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的稻瘟病为穗稻瘟病。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特在于，将枯草芽孢杆菌组合物稀释500-2000倍后使用。