CN101480504A - 一种细菌纤维素复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物材料领域,公开一种细菌纤维素复合材料及其制备方法和应用。本发明在具有纳米纤维网络的细菌纤维素纤维表面接枝了带磷酸根基团的多肽。本发明的细菌纤维素复合材料在体液环境中可营造吸引钙阳离子沉降的磷酸根负离子域,诱导羟基磷灰石晶体在纳米纤维表面直接矿化,而纳米纤维网络所构成的纳米空隙结构可作为支架利于成骨细胞的黏附、增殖和分化,因此本发明的细菌纤维素复合材料可用作人体骨缺损的填充修复材料。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域,更具体地说,本发明涉及一种在体液环境中有促进骨修复功能的细菌纤维素复合材料及其制备方法。
背景技术
细菌纤维素(BC)由细菌分泌而成的天然聚合物,具有高的结晶度、高的持水性、超细纳米纤维网络、高抗张强度和弹性模量等独特的物理化学性质,已被研究用于人工血管、人工皮肤、治疗皮肤损伤和组织工程支架等方面;作为骨组织工程支架,BC工艺简单价格便宜,湿态强度高且可原位成型,因此成为近年来国际上医用生物材料界的研究热点。美国Tufts大学[A Svensson,E Nicklasson,T Harrah,B Panilaitis,D L Kaplan,M Brittberg,P Gatenholm.Bacterial cellulose as a potential scaffold for tissue engineering of cartilage.Biomaterials.2005,26:419-431]用牛软骨细胞培养评估了天然的或经化学修饰的BC作为骨组织工程支架材料的潜力。未经修饰的天然BC在保持良好的机械性能下,支持软骨细胞高的增殖和生长水平,但BC经过磷酸化及硫酸化修饰并未提高软骨细胞的生长水平,不管修饰与否都BC未导致显著性的致炎细胞因子活化,因此认为未修饰的BC可能更适合于人组织工程软骨的开发。国内天津大学[Y Z Wan,L Hong,S R Jia,Y Huang,Y Zhu,Y L Wang,H J Jiang.Synthesis andcharacterization of hydroxyapatite-bacterial cellulose nanocomposites.Compos Sci Technol.2006,66:825-1832;Y Z Wan,Y Huang,C D Yuan,S Raman,Y Zhu,H J Jiang,F He,C Gao.Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedicalapplications.Mat Sci Eng C-Bio S.2007,27:855-864]尝试用BC经模拟体液培养仿生制备BC/纳米羟基磷灰石(nHA)复合材料,发现没经处理的BC只在内表面诱导少量nHA,磷酸化处理的BC纳米纤维表面布满nHA晶体,结晶度低于1%,类似于天然骨的组成和结构。美国Tennessee大学[S A Hutchens,R S Benson,B R Evans,H M ONeill,C J Rawn.Biomimeticsynthesis of calcium-deficient hydroxyapatite in a natural hydrogel.Biomaterials.2006,27:4661-4670]利用BC凝胶仿生沉降缺钙磷灰石模拟天然骨结构,研究表明相对比例为50-90%的缺钙磷灰石均匀布满BC凝胶中,并与BC表面的羟基共价结合。矿化过程中先形成磷酸八钙前驱,再堆积成10-50nm的各向异性晶体并沿C轴取向排列形成缺钙磷灰石,与天然骨的形成过程很相似,说明BC凝胶可以作为很好的模板仿生制备类骨羟基磷灰石。细菌纤维素具有高强度纳米纤维结构营造了吸引钙阳离子沉降的羟基负离子域,强迫磷灰石C轴沿纤维轴向取向生长,细菌纤维素作为骨组织工程支架具有很好的成骨诱导性质,但不具备诱导成骨细胞黏附、增殖和分化的能力(即骨诱导能力)。瑞典Chalmers大学[ABodin,LAhrenstedt,HFink,H Brumer,B Risberg,P Gatenholm.Modification of nanocellulose with a xyloglucan-RGDconjugate enhances adhesion and proliferation of endothelial cells:implications for tissueengineering.Biomacromolecules.2007,8:3697-3704]利用甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(GRGDS)五肽接枝木葡聚糖(XG)与BC复合,但对BC的细胞黏附性和骨诱导能力提高有限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在体液环境中有促进骨修复功能的细菌纤维素复合材料。
本发明的另一个目的是提供一种上述细菌纤维素复合材料的制备方法。
一种细菌纤维素复合材料,其特征在于细菌纤维素的纤维表面以化学键连接着带磷酸根基团的多肽。
进一步地,所述磷酸根基团是磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸、磷酸化酪氨酸、磷酸化精氨酸、磷酸化组氨酸、磷酸化赖氨酸、磷酸化天冬氨酸或磷酸化谷氨酸。
进一步地,由于颗粒状更利于骨缺损修复中的填充手术操作,上述细菌纤维素复合材料中的细菌纤维素是指从培养液中取出后经纯化处理的细菌纤维素膜经破碎而成的尺寸小于1mm的颗粒状细菌纤维素。
本发明中的细菌纤维素复合材料中含有细菌纤维素和带磷酸根基团的多肽,其中细菌纤维素纤维表面与带磷酸根基团的多肽以化学键进行连接。细菌纤维素表面与多肽复合后,在体液环境中可营造吸引钙阳离子沉降的磷酸根负离子域,诱导羟基磷灰石晶体在纳米纤维表面直接矿化,而细菌纤维素纳米纤维互穿网络所构成的纳米空隙结构可作为支架利于成骨细胞的黏附、增殖和分化,使本发明的细菌纤维素复合材料同时具有良好的成骨诱导性质和骨诱导能力。因此,本发明中的细菌纤维素复合材料可用作人体骨缺损的填充修复材料。
一种细菌纤维素复合材料的制备方法,其特征在于包括如下制备步骤:
(1)将细菌纤维素膜真空干燥后,用破碎机将细菌纤维素干膜破碎成直径小于1mm的颗粒状;
(2)在氩气保护下,将细菌纤维素颗粒在质量浓度为3~10%的3-氨丙基三乙氧基硅的甲苯溶液中浸泡1.5~5小时,取出细菌纤维素颗粒并用甲苯洗涤,再真空干燥,得到3-氨丙基三乙氧基硅接枝细菌纤维素颗粒;
(3)在氩气保护下,将3-氨丙基三乙氧基硅接枝细菌纤维素颗粒在浓度为0.001~0.005摩尔/升的N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯的二甲基甲酰胺溶液中浸泡2~5小时,取出细菌纤维素颗粒并用二甲基甲酰胺洗涤,再真空干燥,得到N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯和3-氨丙基三乙氧基硅接枝细菌纤维素颗粒;
(4)在氩气保护下,将N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯和3-氨丙基三乙氧基硅接枝细菌纤维素颗粒在带磷酸根基团的多肽的二甲基甲酰胺溶液中浸泡10~20小时,取出细菌纤维素颗粒并用二甲基甲酰胺洗涤,再真空干燥,得到细菌纤维素复合材料。
进一步地,步骤(4)所述磷酸根基团为磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸、磷酸化酪氨酸、磷酸化精氨酸、磷酸化组氨酸、磷酸化赖氨酸、磷酸化天冬氨酸或磷酸化谷氨酸。
进一步地,步骤(4)所述带磷酸根基团的多肽的二甲基甲酰胺溶液的浓度为0.001~0.005摩尔/升。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明,并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
将细菌纤维素膜真空干燥。用破碎机将细菌纤维素干膜破碎成尺寸小于1mm的颗粒。在氩气保护下,将细菌纤维素颗粒在质量浓度为5%的3-氨丙基三乙氧基硅(APTES)的甲苯溶液中浸泡2小时,取出细菌纤维素颗粒并用甲苯洗涤,再真空干燥,得到APTES接枝细菌纤维素颗粒。在氩气保护下,将APTES接枝细菌纤维素颗粒在浓度为0.002摩尔/升的N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯(SMP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中浸泡2小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到SMP和APTES接枝细菌纤维素。在氩气保护下,将SMP和APTES接枝细菌纤维素颗粒在0.001摩尔/升的磷酸化丝氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸多肽(P04SCC)的DMF溶液中浸泡15小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到细菌纤维素复合材料。将所得到的细菌纤维素复合材料压成饼状,用X射线光电子能谱表征细菌纤维素复合材料的表面组成,结果列于表1。
在37℃下用1.5倍的模拟体液(SBF)浸泡实施例1中得到的细菌纤维素复合材料来进行矿化处理,浸泡时间为15天,每3天更换新鲜的模拟体液,以保持模拟体液的过饱和状态。将矿化后的细菌纤维素复合材料用去离子水浸泡干净,经冷冻干燥后压成饼状,用X射线光电子能谱表征矿化后的细菌纤维素复合材料的表面组成,结果列于表1。
表1 经XPS测定的矿化前后细菌纤维素复合材料的原子质量组成(%)
% | C | O | Si | N | Ca | P |
矿化前的细菌纤维素复合材料 | 58.6 | 32.0 | 5.6 | 3.8 | - | - |
矿化后的细菌纤维素复合材料 | 39.7 | 50.2 | 3.1 | 1.9 | 1.4 | 3.7 |
从表1可以看出,本实施例制备的细菌纤维素复合材料具备优良的成骨诱导性质。
用骨祖细胞在实施例1所得的细菌纤维素/多肽复合材料和纯细菌纤维素上按文献(RJMajeska,M Port,TA Einhorn.Attachment to extracellular matrix molecules by cells differing in theexpression of osteoblastic traits.J Bone Miner Res.1993,8:3)进行细胞粘附能力评价实验,具体是将被测样置于细胞培养基板中,并以空白塑料培养基板为对照样,以20000个/平方厘米的细胞密度将骨祖细胞播种在两培养基板中,经3小时粘附后用PBS缓冲液冲洗,用显色底物(对硝基苯基-β-D-氨基葡萄糖苷、柠檬酸钠和曲拉通X-100的混合溶液)显色,再用EDTA/氨基乙酸缓冲液中止显色反应,最后测定被测样和对照样在405nm的吸光度。用骨祖细胞在实施例1所得的细菌纤维素/多肽复合材料和纯细菌纤维素上按文献(T Mosmann.Rapidcolorimetric assay for growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.JImmunol Methods.1983,65:55)进行细胞增殖能力评价实验,具体是将被测样置于细胞培养基板中,并以多聚赖氨酸覆盖塑料培养基板作为对照样,以6000个/平方厘米的细胞密度将骨祖细胞播种在两培养基板上,经14天细胞培养后,通过MTT法测定被测样和对照样在540nm的吸光度。细胞粘附能力评价实验和细胞增殖能力评价实验结果列于表2。从表2可以看出,本实施例制备的细菌纤维素复合材料具备优良的骨诱导能力。
表2 细菌纤维素/多肽复合材料和纯细菌纤维素的细胞粘附和增殖实验比较
实施例2
将细菌纤维素膜真空干燥。用破碎机将细菌纤维素干膜破碎成尺寸小于1mm的颗粒。在氩气保护下,将细菌纤维素颗粒在质量浓度为8%的3-氨丙基三乙氧基硅(APTES)的甲苯溶液中浸泡3小时,取出细菌纤维素颗粒并用甲苯洗涤,再真空干燥,得到APTES接枝细菌纤维素颗粒。在氩气保护下,将APTES接枝细菌纤维素颗粒在浓度为0.005摩尔/升的N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯(SMP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中浸泡3小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到SMP和APTES接枝细菌纤维素。在氩气保护下,将SMP和APTES接枝细菌纤维素颗粒在0.002摩尔/升的磷酸化苏氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸多肽(P04TCC)的DMF溶液中浸泡10小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到细菌纤维素复合材料。
实施例3
将细菌纤维素膜真空干燥。用破碎机将细菌纤维素干膜破碎成尺寸小于1mm的颗粒。在氩气保护下,将细菌纤维素颗粒在质量浓度为3%的3-氨丙基三乙氧基硅(APTES)的甲苯溶液中浸泡5小时,取出细菌纤维素颗粒并用甲苯洗涤,再真空干燥,得到APTES接枝细菌纤维素颗粒。在氩气保护下,将APTES接枝细菌纤维素颗粒在浓度为0.001摩尔/升的N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯(SMP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中浸泡5小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到SMP和APTES接枝细菌纤维素。在氩气保护下,将SMP和APTES接枝细菌纤维素颗粒在0.003摩尔/升的磷酸化酪氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸多肽(P04YCC)的DMF溶液中浸泡12小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到细菌纤维素复合材料。
实施例4
将细菌纤维素膜真空干燥。用破碎机将细菌纤维素干膜破碎成尺寸小于1mm的颗粒。在氩气保护下,将细菌纤维素颗粒在质量浓度为10%的3-氨丙基三乙氧基硅(APTES)的甲苯溶液中浸泡1.5小时,取出细菌纤维素颗粒并用甲苯洗涤,再真空干燥,得到APTES接枝细菌纤维素颗粒。在氩气保护下,将APTES接枝细菌纤维素颗粒在浓度为0.005摩尔/升的N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯(SMP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中浸泡2小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到SMP和APTES接枝细菌纤维素。在氩气保护下,将SMP和APTES接枝细菌纤维素颗粒在0.005摩尔/升的磷酸化精氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸多肽(P04RCC)的DMF溶液中浸泡10小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到细菌纤维素复合材料。
实施例5
将细菌纤维素膜真空干燥。用破碎机将细菌纤维素干膜破碎成尺寸小于1mm的颗粒。在氩气保护下,将细菌纤维素颗粒在质量浓度为3%的3-氨丙基三乙氧基硅(APTES)的甲苯溶液中浸泡2小时,取出细菌纤维素颗粒并用甲苯洗涤,再真空干燥,得到APTES接枝细菌纤维素颗粒。在氩气保护下,将APTES接枝细菌纤维素颗粒在浓度为0.002摩尔/升的N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯(SMP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中浸泡3小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到SMP和APTES接枝细菌纤维素。在氩气保护下,将SMP和APTES接枝细菌纤维素颗粒在0.002摩尔/升的磷酸化组氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸多肽(P04HCC)的DMF溶液中浸泡20小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到细菌纤维素复合材料。
实施例6
将细菌纤维素膜真空干燥。用破碎机将细菌纤维素干膜破碎成尺寸小于1mm的颗粒。在氩气保护下,将细菌纤维素颗粒在质量浓度为5%的3-氨丙基三乙氧基硅(APTES)的甲苯溶液中浸泡2小时,取出细菌纤维素颗粒并用甲苯洗涤,再真空干燥,得到APTES接枝细菌纤维素颗粒。在氩气保护下,将APTES接枝细菌纤维素颗粒在浓度为0.002摩尔/升的N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯(SMP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中浸泡2小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到SMP和APTES接枝细菌纤维素。在氩气保护下,将SMP和APTES接枝细菌纤维素颗粒在0.001摩尔/升的磷酸化丝氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸多肽(P04KCC)的DMF溶液中浸泡15小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到细菌纤维素复合材料。
实施例7
将细菌纤维素膜真空干燥。用破碎机将细菌纤维素干膜破碎成尺寸小于1mm的颗粒。在氩气保护下,将细菌纤维素颗粒在质量浓度为5%的3-氨丙基三乙氧基硅(APTES)的甲苯溶液中浸泡2小时,取出细菌纤维素颗粒并用甲苯洗涤,再真空干燥,得到APTES接枝细菌纤维素颗粒。在氩气保护下,将APTES接枝细菌纤维素颗粒在浓度为0.002摩尔/升的N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯(SMP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中浸泡2小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到SMP和APTES接枝细菌纤维素。在氩气保护下,将SMP和APTES接枝细菌纤维素颗粒在0.001摩尔/升的磷酸化天冬氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸多肽(P04DCC)的DMF溶液中浸泡15小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到细菌纤维素复合材料。
实施例8
将细菌纤维素膜真空干燥。用破碎机将细菌纤维素干膜破碎成尺寸小于1mm的颗粒。在氩气保护下,将细菌纤维素颗粒在质量浓度为5%的3-氨丙基三乙氧基硅(APTES)的甲苯溶液中浸泡2小时,取出细菌纤维素颗粒并用甲苯洗涤,再真空干燥,得到APTES接枝细菌纤维素颗粒。在氩气保护下,将APTES接枝细菌纤维素颗粒在浓度为0.002摩尔/升的N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯(SMP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中浸泡2小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到SMP和APTES接枝细菌纤维素。在氩气保护下,将SMP和APTES接枝细菌纤维素颗粒在0.001摩尔/升的磷酸化谷氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸多肽(P04ECC)的DMF溶液中浸泡15小时,取出细菌纤维素颗粒并用DMF洗涤,再真空干燥,得到细菌纤维素复合材料。
Claims (7)
1、一种细菌纤维素复合材料,其特征在于细菌纤维素的纤维表面以化学键连接着带磷酸根基团的多肽。
2、根据权利要求1所述的细菌纤维素复合材料,其特征在于所述磷酸根基团是磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸、磷酸化酪氨酸、磷酸化精氨酸、磷酸化组氨酸、磷酸化赖氨酸、磷酸化天冬氨酸或磷酸化谷氨酸。
3、根据权利要求1所述的细菌纤维素复合材料,其特征在于细菌纤维素为直径小于1mm的颗粒状。
4、权利要求1所述的细菌纤维素复合材料用作人体骨缺损的填充修复材料。
5、一种细菌纤维素复合材料的制备方法,其特征在于包括如下制备步骤:
(1)将细菌纤维素膜真空干燥后,用破碎机将细菌纤维素干膜破碎成直径小于1mm的颗粒状;
(2)在氩气保护下,将细菌纤维素颗粒在质量浓度为3~10%的3-氨丙基三乙氧基硅的甲苯溶液中浸泡1.5~5小时,取出细菌纤维素颗粒并用甲苯洗涤,再真空干燥,得到3-氨丙基三乙氧基硅接枝细菌纤维素颗粒;
(3)在氩气保护下,将3-氨丙基三乙氧基硅接枝细菌纤维素颗粒在浓度为0.001~0.005摩尔/升的N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯的二甲基甲酰胺溶液中浸泡2~5小时,取出细菌纤维素颗粒并用二甲基甲酰胺洗涤,再真空干燥,得到N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯和3-氨丙基三乙氧基硅接枝细菌纤维素颗粒;
(4)在氩气保护下,将N-琥珀酰亚胺3-马来酸亚胺丙酸酯和3-氨丙基三乙氧基硅接枝细菌纤维素颗粒在带磷酸根基团的多肽的二甲基甲酰胺溶液中浸泡10~20小时,取出细菌纤维素颗粒并用二甲基甲酰胺洗涤,再真空干燥,得到细菌纤维素复合材料。
6、根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于步骤(4)所述磷酸根基团为磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸、磷酸化酪氨酸、磷酸化精氨酸、磷酸化组氨酸、磷酸化赖氨酸、磷酸化天冬氨酸或磷酸化谷氨酸。
7、根据权利要求5或6所述的制备方法,其特征在于步骤(4)所述带磷酸根基团的多肽的二甲基甲酰胺溶液的浓度为0.001~0.005摩尔/升。
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