CN101460614A - 踝节菌属emersonii菌酶*** - Google Patents

Abstract

本发明涉及为热稳定的和编码热稳定性酶的踝节菌属emersonii菌的株系。所述酶在高于55℃的温度下保持活性。这些株系和酶用于从减少废物至产生新的食物成分和产生生物燃料的多种方法。

Description

踝节菌属emersonii菌酶***

技术领域

本发明涉及踝节菌属emersonii菌(Talaromyces Emersonii)的株系和可从其分离的酶和酶***，所述酶和酶***用于环境和废物处理、化学和生物化学生产及处理、生物技术方法、用于检测或诊断试剂盒、益生剂(prebiotics)和合生剂(synbiotics)、医疗保健产品、功能和新食品以及饮料、表面活性剂产品、农业和园艺应用。

背景技术

目前欧洲面临着废物处理危机，每年产生20亿吨废物。该废物中的大部分是来源于植物材料(生物质)的有机物，富含碳水化合物(糖类)，从而当分解在其组分糖时，代表了有价值的资源。其他类型的废物例如水果废物腐烂，从而造成环境危害。通常交该废物与猪饲料混合，从其提取一些有价值的东西，虽然认为这是一种低成本的浪费。

生物质代表了高度变化和可变的原料，然而是地球上最丰富的可再生能源原料。如果被利用，其可为终将耗尽(ever-depleting)的化石燃料贮藏提供足可支撑的选择。将生物质中的能储转化成使用方便的能量形式引起了全球的兴趣。然而主要的焦点一直以来是生物燃料例如用于运输目的生物乙醇的生产，同时也已确定了在生物燃料生产过程产生的有价值的副产品(例如，CO₂、富含木质素的残渣、化学原料)的市场。目前，在美国，每年从玉米产生大约30亿加仑的乙醇，主要用于运输燃料部分。这仅仅代表了大约1％的总的汽车燃料消费，预计到2010年前，生物乙醇产量将增加7倍，这将包括其他生物质底物例如木材残渣(woody-residue)。如果木材残渣来源于通常视为‘灌木’或柴(brushwood)的快速可再生的“废物”源，可在两者处理成本方面产生相当大的价值，满足了生产目标和和地方环境问题。作为石油和其他化石燃料的清洁和环境友好型选择的生物乙醇的有利方面是清洁。全球采用生物乙醇作为主要的汽车燃料将抵消许多作为人口稠密的市区的特征的空气污染问题。现代轿车可容易地适应依靠乙醇/汽油混合物(汽油醇(gasohol))运行，可获得可使用纯乙醇作为唯一的燃料原的新型发动机。

植物生物质，包括软木材种类，富含可通过酶或化学方法分解成简单的可发酵糖的复杂碳水化合物(多糖)。例如，软木材例如西加云杉(Sitka spruce)和松树包含(％干重)大约41-43％的纤维素(β-1，4-连接的葡萄糖单位的聚合物)、20-30％半纤维素(包含多糖的甘露糖、半乳糖、木糖和***糖的混合物)和25-30％的木质素、高卡值的非碳消化化合物多酚聚合物。因此大约65-70％的木材残渣的干重是可用于提供用于发酵成生物乙醇的富含糖的原料的复杂的碳水化合物。

真菌代表分解此类材料的最重要的微生物生命形式中的一种生命形式。踝节菌属emersonii菌是在堆肥堆(compost heap)和降解富含生物质的材料的其他生态***中天然发现的嗜热需氧真菌。热稳定性是迄今为止分离的许多踝节菌属emersonii菌酶***的特征。考虑到为可将靶向植物材料的所有部分的‘软腐烂(soft-rot)’种类，该真子囊菌(euasomycete)产生广泛的修饰碳水化合物的酶***，包括分解纤维素的、分解半纤维素的、分解果胶的(pectinolytic)和分解淀粉的酶，以及氧化酶/氧化还原酶和蛋白水解活性的组合(array)。因此踝节菌属emersonii菌可接近在其天然栖息地(habitat)遇到的复杂的生长底物(growth substrate)。

PCT申请WO 01/70998和WO 02/24926公开了从来自踝节菌属emersonii菌的纤维素酶和特别地具有β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性的纤维素酶的分离。这些酶的不利方面是它们只能靶向一种类型(或有限数目的)的底物的组分。因此为了代谢某些底物，必需鉴定该底物的组分，产生具有适合于代谢这些组分的酶活性的肽，通过常规方法例如重组技术产生需要的量的多肽，如果需要，修饰多肽以改变例如酶的热稳定性或pH最适条件，表达多肽和使用所得的酶靶向该底物的该组分。这些方法非常耗时和浪费工序。

此外，这些方法没有考虑一些酶可展示多种活性或当与另一种酶组合使用是可具有改变的效率的事实。因此这些方法可导致不需要的酶的过度产生，从而也导致过度消耗和时间成本。因此存在对从踝节菌属emersonii菌分离的酶和酶***以及分离克服上述不利方面的酶和酶***的方法的需要。

本发明的目的是发展最优化的酶组合物，特别地热稳定酶组合物，以产生用于生物质至生物乙醇的起始的富含可发酵糖的‘糖浆’。随着用于生物乙醇生产的靶生物质底物或原料可以从废物流(wastestream)(例如VFCW和OFMSW(收集的底物的植物部分(VegetableFraction of Collected Wastes)和市政固体废物的有机部分(OrganicFraction of Municipal Solid Wastes))变化至农作物(例如玉米、甜菜、草等)至木质生物质，以低处理成本获得正确的酶制剂，从而获得可发酵糖的最大产率是重要的挑战。许多年来，用于在通过微生物发酵产生生物乙醇之前转化生物质的酶的成本一直是个主要的负因素。因此目的是产生用于这些目的的低成本酶制剂。

本发明的酶制剂来源于嗜热的，通常是公认安全(GRAS)的真菌来源，然而迄今为止商业和研究性生物乙醇应用中使用的真菌的酶主要来自嗜温来源(例如木霉(Trichoderma sp.)/胶枝霉(Gliocladiumsp.)、曲霉(Aspergillus sp.)和青霉菌(Penicillium sp.))。

本发明的进一步目的是提供在更高的反应温度下工作的酶制剂，即热稳定性酶允许更短的反应时间/酶促处理步骤，允许同时进行水解产物的巴斯德灭菌，导致显著的总体水解/糖化，具有减少酶用量的潜能，和/或回收利用酶制剂的潜能，所有这些可用于减少与这些酶的使用相关的成本。

发明内容

本发明涉及2005年11月22日由国际真菌研究所(CABIBioscience UK)在编号IMI 393751下保藏的踝节菌属emersonii菌的株系

使用踝节菌属emersonii菌作为酶源的有利方面是，其为‘公认安全的’(GRAS)微生物和在食品、饮料、农业饲料和制药部门具有悠久的使用史。

该踝节菌属emersonii菌的新株系的有利方面是来源于其的酶在54℃至85℃之间具有最适活性，一些酶在高至95℃的温度下仍保持活性。从而甚至当希望或需要高处理温度时，例如生产用于生物化学、生物制药(biopharma)、化学或生物燃料产品(乙醇和甲烷)的富含糖的原料时，这些酶仍保持活性，其中65-90℃的反应温度促进同时更高的反应速度，更快的底物转化和原料的同时巴氏灭菌，这增强了贮存和运输潜能。此外，由于对于这些酶可更高的温度，因此各过程具有更短的反应时间，从而节省了时间和费用。进一步的有利方面是如果温度足够高，将发生巴氏灭菌，从而杀死不能经受住这样的高温的任何不希望的微生物。额外地，从该株系纯化的酶已显示具有更长的贮存期限。

根据本发明，进一步提供了包含纤维二糖水解酶I或纤维二糖水解酶II或其混合物、β-葡糖苷酶1、木聚糖酶和内切-β-(1，3)4-葡聚糖酶的酶***。本发明还提供了使用该酶***生物转化植物或植物来源的材料和随后用于生物燃料(生物乙醇和生物气)的产生的方法，所述植物或植物来源的材料是例如陆生和海洋来源的未用过的植物材料和其废物流，包括corree、茶、酿渣和饮料残渣(beverage residue)、水果和水果的剥皮/削皮、蔬菜剥皮、提供伙食(catering)和食品处理、叶/园艺废物、花卉栽培者(florist)的废物、谷物和谷物处理残留物、其他农业和园艺废物、面包方产品和商店废物、纸产品例如光泽鲜艳的杂交和彩色新闻纸、黑白新闻纸、白色、彩色和回收循环纸、牛皮纸、纸盒、卡片和厚纸板、纸杯和纸盘、印相纸、擦拭纸、玻璃纸和

可生物降解的包装、富含纤维素的医院废物例如绷带、纸、擦拭纸、绷带、防毒面具(mask)、织品例如睡衣和毛巾料。

本发明还涉及包含纤维二糖水解酶I或纤维二糖水解酶II或其混合物、β-葡糖苷酶1、木聚糖酶和内切-β-(1，3)4-葡聚糖酶的酶***。本发明还提供了在从植物残留物产生用于产生高质量产物的富含单糖的原料中使用该酶***的方法，所述高质量产物是例如抗生素、抗体和抗病毒剂、类胡萝卜素、抗氧化剂、溶剂和其他化学试剂和生物化学试剂，包括食品级组分、用于化妆品的添加剂、用于研究和功能糖组学(glycomics)的寡糖和糖肽。

本发明提供了具有30至90℃的生长温度范围(最适范围30-55℃)和在高于55℃的温度下活跃地产生酶的踝节菌属emersonii菌的A嗜热株系。在编号IMI 393751下保藏踝节菌属emersonii菌的株系。本发明涉及其也编码热稳定性酶(由株系产生的在高于55℃的温度下保持活性的酶)的突变体。酶可选自修饰碳水化合物的酶、蛋白水解酶、氧化酶和氧化还原酶。

本发明还提供了包含纤维二糖水解酶I或纤维二糖水解酶II或其混合物、β-葡糖苷酶1、木聚糖酶和内切-β-(1，3)4-葡聚糖酶的酶组合物。酶组合物可包含0.5至90％的纤维二糖水解酶I或纤维二糖水解酶II或其混合物、0.1至33％的β-葡糖苷酶1、0.6至89％的木聚糖酶和0.4至68％的内切-β-(1，3)4-葡聚糖酶。

还可提供了包含CBH I(10-30％)、CBH II(10-15％)、β-(1，3)4-葡聚糖酶(20-45％)、β-葡糖苷酶(2-15％)和木聚糖酶(18-55％)的酶***。组合物还可包含一种或多种下列物质：β-木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、外切木聚糖酶、α-L-***呋喃糖酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、半纤维素酶、淀粉修饰酶(starchmodifying enzyme)、氧化还原酶/氧化酶和酯酶和蛋白酶。

本发明还提供了木料、木材来源的产品的处理和回收利用中使用该酶***的方法。该酶***对于高度木质化的木质材料是有效的，且抗存在于木质残渣和经处理的材料(例如提取物、树脂、木质素分解产物、糠醛和羟基糠醛衍生物)中的潜在的抑制剂分子。

本发明还涉及包含CBH I(15-30％)、CBH II(10-40％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(15-40％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(15-30％)和1-8％的β-木糖苷酶的酶***。组合物还可包含一种或多种下列物质：外切木聚糖酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶、果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶(rhamnogalacturonase)、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶、淀粉修饰活性、其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶和蛋白酶。本发明还提供织物处理和回收再利用中使用该酶***的方法。

还提供了包含CBH I(5-55％)、CBH II(8-50％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(10-30％)、β-葡糖苷酶(0.5-30％)、木聚糖酶(5-30％)和β-木糖苷酶(0.1-10％)的酶***。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-L-***呋喃糖酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、其他水解酶，包括选择的果胶分解酶、酯酶、蛋白酶和氧化酶。本发明还提供了在造纸废水的糖化中使用该酶***的方法。

本发明还涉及包含CBH I(2-10％)、CBH II(2-10％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(10-45％)、β-葡糖苷酶(5-10％)和木聚糖酶(1-30％)的酶***。组合物还可包含一种或多种下列物质：N-乙酰葡糖胺糖苷酶、壳多糖酶、β(1，3)6-葡聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶、果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶、淀粉修饰活性、其他半纤维素酶，包含半乳糖苷酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶和蛋白酶。本发明还提供了在环境、医学和***门(例如干腐的控制)以及果浆和造纸工业(例如粘土控制)的抗真菌的生物控制(biocontrol)和粘土控制策略中使用该酶***的方法。

还提供了包含CBH I(1-20％)、CBH II(1-28％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(15-40％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(18-55％)、β-木糖苷酶(0.1-10％)和α-L-***呋喃糖酶(0.5-5.0％)的酶***。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶、淀粉修饰活性、其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶、蛋白酶、外切木聚糖酶、其他水解酶，包括果胶分解酶、酚酸和乙酰基(木聚糖)酯酶、蛋白酶和木质素修饰氧化酶活性。本发明还提供了在园艺应用(例如用于生长促进和疾病抗性的新型生物活性化合物的产生)中使用该酶***的方法。例如该***可用于释放生物活性黄酮苷、从富含果胶的材料产生寡半乳糖醛酸、从寡半乳糖醛木糖葡聚糖产生半乳糖寡糖、从植物木聚糖产生取代的木寡糖或从真菌细胞壁β-葡聚糖或藻类昆布糖产生1，3-葡萄糖寡糖(昆布寡糖)，以促进植物的生长、激活抗植物原原体的植物防御反应机制和增加对疾病的抗性，因为这些寡糖中的一些(例如昆布寡糖)可起始和介导为抗真菌、抗细菌和抗线虫的生物活性特性。

本发明还涉及包含CBH I(5-30％)、CBH II(1-15％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(10-40％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(18-48％)、0.1-20％β-木糖苷酶、1-10％的α-葡萄糖醛酸苷酶以及0.1-5.0％的α-L-***呋喃糖酶的酶***。组合物还可包含一种或多种下列物质：外切木聚糖酶、果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶、淀粉修饰活性、其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。本发明还提供在动物饲料产品中使用该酶***以提高基于谷类的饲料的消化率的方法。该***将基于谷类的饲料的纤维组分降解成寡糖和(简单的糖)，其中一些在肠内被吸收和代谢。***还产生了促进益生菌的生长的‘益菌生(prebiotic)’寡糖(例如来自非纤维素谷类β-葡聚糖的混合连接的寡葡萄糖(glucooligosaccharide))，和可释放抗氧化剂，例如阿魏酸，以及产生对已知产生致癌分子(例如苯酚、胺等)的肠内微生物的种类具有抗菌效果的寡糖(来自谷类木聚糖的取代的glucurono-寡聚木糖)。

还提供了包含CBH I(0.5-10％)、CBH II(0.5-10％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(15-43％)、β-葡糖苷酶(2-10％)、木聚糖酶(30-88％)、0.1-2.0％β-木糖苷酶、0.1-3.0％α-葡萄糖醛酸苷酶、0.1-4.0％α-L-***呋喃糖酶的酶***。组合物还可包含一种或多种下列物质：果胶分解酶、淀粉修饰活性、氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。本发明还提供在用于单胃动物的基于低戊糖含量的谷类的饲料(所述饲料具有提高的消化率和低非纤维素β-葡聚糖含量)的生产中使用该酶***的方法。来自谷类的非纤维素β-葡聚糖和***木聚糖具有高度结合水的能力和产生高度粘稠的溶液。单胃动物(例如狗和家禽)不能降解这些碳水化合物，这减少了重要营养物的吸收和生物利用度，增加了消化酶的扩散，削弱了肠内容物的充分混合和充当存在于这些饲料中的蛋白质和淀粉的物理屏障。总之，这些多糖可导致发育不全(poor growth)的性能特征。本发明中的酶***可催化谷类***木聚糖和非纤维素β-葡聚糖的降解，从而产生寡糖(主要为DP3-10)，其中一些具有潜在的益生菌性质，不释放戊糖(***糖和木糖)，所述寡糖难以被单胃动物代谢和可具有抗营养效应。因此本发明提供了使用可选择的谷类例如高粱和玉米作为饲料的方法。

本发明还涉及包含CBH I(3-15％)、CBH II(3-15％)、(1，3)4-葡聚糖酶(25-45％)、α-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(18-55％)、0.5-7.0％β-木糖苷酶、0.5-10％、α-葡萄糖醛酸苷酶和0.1-5.0％α-L-***呋喃糖酶的酶***。组合物还可包含一种或多种下列物质：外切木聚糖酶、果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶、淀粉修饰活性、其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。本发明还提供了在具有用于兽医和人医疗保健的生物活性潜能的功能饲料的生产中使用该酶***的方法。该***可从具有GRAS状态的原料产生用于动物医疗保健(伴侣和大型动物)的生物活性寡糖，包括来自陆生和海洋植物和真菌的免疫刺激性β-葡寡聚糖(glucooligo-saccharide)、来自陆生和海洋植物的具有益菌生和抗微生物特性的寡聚木糖、来自甲壳动物和真菌细胞壁的抗微生物和抗病毒潜能以及具有抗氧化剂潜能的酚类化合物。

还提供了包含CBH I(1-15％)、CBH II(1-15％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(10-45％)、α-葡糖苷酶(2-10％)、木聚糖酶(1-55％)、0.5-12％β-木糖苷酶的酶***。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶、β(1，3)6-葡聚糖酶、N-乙酰葡糖胺酶、壳多糖酶果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶、淀粉修饰活性、其他半纤维素，包括半乳糖苷酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶、蛋白酶。本发明还提供了在专业化酷农业(specialised dairy)产品或食品例如用于老年人和婴儿医疗保健的食品和饮料的生产中使用该酶***的方法。例如，该***可用于生产用于老年人和婴儿营养物的富含益生菌、易于消化的食品，也用于生产用于患有半乳糖血症的个体或不耐受乳糖的个体的不含乳糖的产品。

本发明还进一步涉及包含CBH I(1-10％)、CBH II(5-15％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(15-40％)、α-葡糖苷酶(2-30％)、木聚糖酶(15-55％)、1-12％的β-木糖苷酶、1-8％的α-葡萄糖醛酸苷酶和0.5-5.0％的α-L-***呋喃糖酶的酶***。组合物还可包含一种或多种下列物质：果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶、淀粉修饰活性、其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。本发明还提供了在面包店和糖果店部门中和在新的保健食品面包店产品的配制(formulation)中使用该酶***的方法。选择的酶***适合用于使用亲的谷类/原料例如黑麦、玉米和高粱。酶***可通过选择性修饰谷类面粉的***木聚糖组分来增加面包块的体积和增加贮存期限，产生益菌生和免疫刺激性寡糖和实现抗氧化剂分子(例如阿魏酸和香豆酸)的释放，以及改变面包店和糖果店产品的质地、香味和感觉性质。

还提供了包含CBH I(1-20％)、CBH II(1-40％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(15-45％)、α-葡糖苷酶(2-30％)、木聚糖酶(10-55％)、0.5-10％的β-木糖苷酶、0.1-5％的α-L-***呋喃糖酶的酶***。组合物可包含一种或多种下列物质：β(1，3)6-葡聚糖酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、壳多糖酶α-葡萄糖醛酸苷酶、果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶、淀粉修饰活性、氧化还原酶/氧化酶和酯酶、蛋白酶。本发明还提供了在食品工业中使用该酶***通过释放物质产生风味、香味和感觉前体化合物的方法，所述释放的物质是可发酵成多种产物(包括柠檬酸、香兰素等)的单糖和二糖、来自水果/果浆的风味糖缀合物(风味前体)(例如在几种水果包括甜瓜中发现的葡萄糖基化的芳香醇以及香叶醇、柠檬烯等)、具有开胃味道、苦味和甜味的肽、转化成增甜剂的氨基酸(例如苯丙氨酸)和具有风味、香味或感觉特性或为可生物转化成呋喃酮(具有草莓风味的分子)的此类产物的前体例如鼠李糖的酚类分子(肉桂酸、黄酮苷例如槲皮素-3-0-鼠李糖苷)。此外，这些分子中的一些例如黄酮苷具有抗氧化剂和抗微生物(抗原生动物的)活性。

本发明还涉及包含CBH I(1-15％)、CBH II(1-15％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(10-45％)、β-葡糖苷酶(2-30％)、木聚糖酶(1-55％)、0.5-12％β-木糖苷酶的酶***。组合物可包含一种或多种下列物质：α-L-***呋喃糖酶、β(1，3)6-葡聚糖酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、壳多糖酶α-葡萄糖醛酸苷酶、果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶、淀粉修饰活性、其他半纤维素，包括半乳糖苷酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。本发明还提供了方法，所述方法使用该酶***产生功能食品，特别地改变植物碳水化合物(陆生植物和一些海洋植物)以产生具有增强的促进健康的性质的食品，例如富含免疫刺激性葡萄糖寡糖、寡聚木糖、大豆寡糖、(***)半乳寡糖、(半乳糖)和/或(葡糖)甘露寡糖、龙胆寡糖(gentiooligosaccharides)、异麦芽寡糖和帕拉金糖寡糖(palatinose oligosaccharide)和促进抗氧化剂分子例如类胡萝卜素和酚类物质(肉桂酸、儿茶素和黄酮苷)的释放的食品。

还提供了包含CBH I(1-15％)、CBH II(1-15％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(10-45％)、β-葡糖苷酶(1-15％)、木聚糖酶(1-30％)、0.5-20％的β-木糖苷酶的酶***。组合物可包含一种或多种下列物质：α-L-***呋喃糖酶、β(1，3)6-葡聚糖酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、壳多糖酶、α-葡萄糖醛酸酶(Glucuronidase)、果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶、淀粉修饰活性、氧化还原酶/氧化酶和酯酶、蛋白酶。本发明还提供了使用该酶***生产新设计者非酒精性和酒精性饮料、果汁和健康饮料的方法。该***可修饰β-(1，3)4-葡聚糖、果胶物质、***聚糖、木聚糖、乳糖、蛋白质和酚类物质以产生低热量的非酒精性和酒精性啤酒/淡啤酒(lagers)、果汁和具有改良的感觉、抗氧化剂、免疫加强、抗细菌、抗病毒潜能的健康饮料。例如，包含具有生物活性的混合连接的葡萄糖寡糖和肉桂酸(抗氧化剂)的具有低残留β-葡聚糖含量以防止混浊形成(但具有足够的β-葡聚糖以提供口感特征(mouthfeel characteristics))的清淡啤酒(light beer)、或富含具有益菌生效应的果胶片段(寡糖)和提供氧化剂潜能的肉桂酸和选择的黄酮苷的果汁。

本发明提供了包含CBH I(1-25％)、CBH II(1-28％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(18-40％)、β-葡糖苷酶(2-30％)、木聚糖酶(15-55％)和β-木糖苷酶(0.7-20％)的酶组合物。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶(1-10％)、α-L-***呋喃糖酶(0.1-5.0％)、1-15％的外切木聚糖酶、5-25％的果胶分解酶、2-12％的淀粉修饰活性、2-11％的半纤维素酶、1-15％的氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及2-15％的蛋白酶。组合物可用于从植物残渣产生富含单糖的原料。

本发明提供了包含CBH I(12-55％)、CBH II(15-30％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(12-26％)、β-葡糖苷酶(5-12％)、木聚糖酶(5-30％)、β-木糖苷酶(0.1-10％)和α-L-***呋喃糖酶(0.5-3.0％)的酶组合物。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶、其他水解酶包括果胶分解酶、酚酸和乙酰基(木聚糖)酯酶、蛋白酶和修饰木质素的氧化酶活性、蛋白酶和氧化酶。组合物可用于处理和回收再利用木材、纸产品和纸。

本发明提供了包含CBH I(3-15％)、CBH II(3-15％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(15-45％)、β-葡糖苷酶(1-15％)、木聚糖酶(16-55％)和β-木糖苷酶(0.5-7％)的酶组合物。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶、外切木聚糖酶、果胶分解酶、具有淀粉修饰活性的酶、半纤维素酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。组合物可用于产生生物药物，例如来自陆生和海洋植物、植物残渣、真菌和废物流或富含单糖的副产品的生物活性寡糖(包括混合的连接1，3(4)和1，3(6)-葡寡聚糖、半乳寡聚糖木糖葡萄糖寡糖、果胶寡糖、分支和线性的寡聚木糖、(半乳糖)葡糖甘露糖寡糖)、糖肽和黄酮苷。

本发明还涉及包含CBH I(1-20％)、CBH II(1-40％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(15-45％)、β-葡糖苷酶(2-12％)、木聚糖酶(1-35％)和β-木糖苷酶(1-5％)的酶组合物。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶、外切木聚糖酶、果胶分解酶、淀粉修饰活性、半纤维素酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。组合物可用于增加具有天然抗菌和抗病毒活性的生物分子(包括黄酮类化合物和生氰糖苷、皂苷、寡糖和酚类化合物(包括阿魏酸和/或香豆酸，表儿茶精、儿茶素、焦性没食子酸等)的生物利用度。

本发明还涉及包含CBH I(3-15％)、CBH II(3-15％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(25-45％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(10-30％)和β-木糖苷酶(0.5-8％)的酶组合物。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶、外切木聚糖酶、果胶分解酶、淀粉修饰活性、半纤维素酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。组合物可用于增加来自所有植物材料、残渣、废物(包括各种水果和浆果)的天然抗氧化剂分子例如类胡萝卜素、蕃茄红素、叶黄素、花青素、酚类化合物和糖苷的生物利用度。

本发明还涉及包含CBH I(1-25％)、CBH II(1-40％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(15-40％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(18-35％)和β-木糖苷酶(0.5-12％)的酶组合物。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶、果胶分解酶、淀粉修饰活性、半纤维素酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。组合物可用于从原始植物材料、植物残渣和废物产生用于通过真菌和细菌，包括青霉菌(Penicillium sp)和链霉菌(Streptomyces sp.)进行的抗生素的微生物生产的原料。

本发明还涉及包含CBH I(1-30％)、CBH II(1-40％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(15-40％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(18-35％)和β-木糖苷酶(0.5-8％)的酶组合物。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶、果胶分解酶、淀粉修饰活性、半纤维素酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶、外切木聚糖酶和蛋白酶。组合物可用于从原始植物材料、植物残渣产生用于柠檬酸的微生物生产的原料。

本发明还涉及包含CBH I(2-15％)、CBH II(2-15％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(20-45％)、β-葡糖苷酶(2-25％)、木聚糖酶(1-30％)和β-木糖苷酶(0.5-8％)的酶组合物。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶、果胶分解酶、淀粉修饰活性、半纤维素酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶、外切木聚糖酶和蛋白酶。组合物可用于从藻类多糖(algal polysaccharide)(例如昆布糖和岩藻聚糖硫酸酯)产生寡聚糖，和通过公认为安全的方法从植物的提取物产生化妆品制剂中的添加剂。

本发明还涉及包含CBH I(3-30％)、CBH II(1-10％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(10-45％)、β-葡糖苷酶(2-12％)、木聚糖酶(1-48％)和β-木糖苷酶(0.1-8％)的酶组合物。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶、果胶分解酶、淀粉修饰活性、半纤维素、氧化还原酶/氧化酶和酯酶、外切木聚糖酶和蛋白酶。组合物可用于产生用作研究试剂的寡糖和糖肽，用于生物传感器的产生和用作在功能糖组学中探测受体-配体相互作用的工具和用于产生表征酶-底物特异性的底物文库。

本发明还涉及包含CBH I(5-15％)、CBH II(5-30％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(20-45％)、β-葡糖苷酶(1-12％)、木聚糖酶(10-30％)和β-木糖苷酶(0.5-8％)的酶组合物。组合物还可包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶、果胶分解酶、具有淀粉修饰活性的酶、半纤维素酶、氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。组合物可用于产生经修饰的纤维素和β-葡聚糖、纤维寡糖、经修饰的淀粉和麦芽寡糖、乳果糖和多元醇(例如甘露醇、山梨醇或卫矛醇(dulcitol)、木糖醇、***糖醇)。

本发明还提供了由上述方法的任一方法产生的底物(无论何时通过该方法产生的)用作产生生物燃料和生物乙醇或生物气例如甲烷或二氧化碳的原料的用途。使用该酶***产生生物乙醇或生物气的有利方面是，这是个有成本效益的从几乎无价值的废品产生可用于从许多工业的有价值的产品的方法。同时当产生有价值的产品时，废物的减少反过来具有正面的环境影响。

可使用此处定义的酶组合物或用此处描述的微生物株系进行上述所有方法。

本发明还提供了使用进一步包含来源于其他真菌种类(包括嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile)和耐热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的酶的它们的酶组合物干燥方法。

优选微生物株系选自一种或多种踝节菌属emersonii菌(Talaromyces emersonii)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile)和耐热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)。

更优选，微生物株系是踝节菌属emersonii菌IMI 393751或其突变体，所述突变体也能够在或高于55℃的温度下产生能够具有活性的酶。

根据本发明，还提供了用于获得适合用于转化靶底物的酶***的方法，该方法包括：获得靶底物的样品；允许微生物株系的接种物在靶底物上生长和分泌酶；回收在靶底物上生长期间分泌的酶；确定酶的活性和酶的性质；构建基因表达谱；鉴定酶蛋白和构建蛋白质表达谱；将基因表达与蛋白表达谱比较；纯化酶。然后贮存酶。方法还可包括分析酶；和/或设计酶***。

发明详述

参照附图，根据仅以举例的方式给出的其实施方案的下列描述，将更清楚地理解本发明，其中：

图1：用于设计适合转化靶底物的酶***的方法的过程概述

图2：通过苹果浆/苹果渣的嗜热酶处理进行的用于生物燃料生产的富含糖的原料的产生。

图3：在纸杯水解期间产生的产物的薄层层析。

图4：在用踝节菌属emersonii菌纸杯诱导酶混合物处理之前(第0小时)和之后(第24小时)，纸杯的电子显微镜检查证明靶底物在大量水解。

图5A-D：由393751株系和野生型CBS 549.92(以前为CBS814.70)株系产生的木聚糖酶产物的比较。

图6A-E：由393751株系和野生型CBS 549.92株系产生的葡聚糖酶和(半乳糖)甘露聚糖酶产物的比较。

图7：在50℃下进行24小时后，由10种酶的混合物催化的经灭菌的富含纤维素的临床废物的体积减小。

图8：在70℃下进行24小时后，由10种酶的混合物催化的经STG灭菌的富含纤维素的临床废物的体积减小。

图9A-B：未处理的富含纤维素的废物(A)和酶促处理的废物(B)。

图10A-B：由酿酒酵母在通过用混合物5(A)和混合物8(B)在70℃处理已灭菌的富含纤维素的临床废物24小时(60％的湿度)获得的水解产物上进行乙醇生产。

图11A：T.emersonii混合物中pH对纤维素酶活性的影响。

图11B：pH对T.emersonii混合物中的木聚糖酶活性的影响。

图12：温度对T.emersonii混合物中的纤维素酶活性的影响。

图13：温度对T.emersonii混合物中的木聚糖酶活性的影响

图14：纯化的新木聚糖酶针对不同木聚糖的活性。OSX，燕麦木聚糖、WSX，小麦杆木聚糖、LWX，落叶松木材木聚糖、BWX，桦木聚糖、RM，红皮藻(Rhodymenan)(红藻1，3；1，4-β-D-木聚糖)。活性表示为相对于燕麦木聚糖(100％)的百分数。

图15A-B：纯化的(A)Xyn IV和(B)Xyn VI针对不同木聚糖的活性。活性表示为相对于燕麦木聚糖(100％)的百分数。

图15C-D：纯化的(C)Xyn VII和(D)Xyn VIII针对不同木聚糖的活性。活性表示为相对于燕麦木聚糖(100％)的百分数。

图15E-F：纯化的(E)Xyn IX和(F)Xyn X针对不同的木聚糖的活性。活性表示为相对于燕麦木聚糖(100％)的百分数。

图15G：纯化的Xyn XI针对不同的木聚糖的活性。活性表示为相对于燕麦(Oat spelts)木聚糖(100％)的百分数。

图16：纯化的Xyn XII针对多种纯化的多糖的百分数相对活性。OSX，燕麦木聚糖；BBG，大麦β-葡聚糖；LIC，地衣多糖；CMC，羧甲基纤维素；LAM，Laminarin；D1，葡聚糖；D2，糊精；INU，菊粉；ARA，***聚糖；GAL L，半乳聚糖(Lupin)；GAL P，半乳聚糖(马铃薯)；RG，半乳糖醛酸鼠李聚糖；LWAG，落叶松木材***半乳聚糖(Larchwood arabino-galactan)。

图17：纯化的Xyn XII针对芳基β-木糖苷和芳基和芳基β-葡糖苷的特异性活性。

图18：由IMI393751和CBS549.92表达的选择的木聚糖酶针对作为测定底物的OSX的特异性活性的比较。

参考图1，提供了用于设计用于转化靶底物的酶***的方法概述。在步骤1中获得靶底物。在步骤2中，用微生物接种靶底物，所述微生物培养在靶底物上以提供培养物。微生物分泌酶，在步骤3中通过获得培养物的样品回收这些酶。在步骤4中将培养物产品分成细胞级分和培养物滤液。在步骤5中，分析细胞级分(mRNA)以确定酶活性和性质。在步骤6中，基于步骤5的分析构建基因表达谱。在步骤7中，就蛋白质活性筛选培养物滤液以及在步骤8中，构建蛋白质表达谱。在步骤9中，比较基因和蛋白质表达谱。在步骤10中，纯化酶。在步骤11中，可贮藏酶，在步骤12中，可进一步分析酶，在步骤13中，设计酶***。

已发现，当将真菌用作微生物时，当有真菌的菌丝体接种底物时，获得更好的结果。优选在发酵罐中进行培养，反应条件将取决于所使用的微生物和底物的种类而变化。培养可以以液态发酵或固状发酵的形式存在。对于踝节菌属emersonii菌，45℃至65℃的范围内的培养温度是优选的，酶呈现最适活性直至85-90℃。

在通过液态发酵产生的酶的情况下，使用离心或借助于用于更大的培养的细胞分离***，通过将细胞(真菌)生物质与细胞外培养滤液分开来从靶底物回收酶。然后通过将已知重量的生物质匀浆化在两倍体积的缓冲液中来从细胞生物质级分回收酶。合适的缓冲液包含50mM的醋酸铵、pH4.5-6.0或50mM磷酸钠、pH7.0-8.0。关于对于固态培养物的酶的提取，将培养物与10倍体积的100mM的包含0.01％(v/v)Tween 80的柠檬酸盐磷酸盐缓冲液、pH5.0混合，匀浆，然后通过在室温下以140rpm振荡2小时来进行提取。然后通过离心回收富含酶的提取物。

必需在基因组和蛋白质组水平上进行酶***的比较，即，比较鉴定的基因、表达产物(mRNA)和蛋白质。这归因于事实，即可能存在在mRNA水平上表达，但在蛋白质水平上未翻译成功能性蛋白质的遗传信息。转录组学、基因组学和蛋白质组学分析对于确定某些酶的相对丰度是非常重要的。

2005年11月22日，为了专利程序的目的，国际真菌研究所(IMI)(CABI Bioscience UK)，Bakeham Lane，Englefield Green，Egham，Surrey TW20 9TY，United Kingdom保藏了已从其分离出本发明的一些酶的丝状真菌株系的分离株-保藏号IMI 393751。在酶纯化后，可任意地将它们贮藏或直接进行分析以获得(a)关于个体在一般的催化和功能性质方面的热稳定性/热活性(thermal activity)的详细信息，(b)关于它们的作用和催化潜能(个体的和组合的)的模式的详细信息，(c)关地协同相互作用的信息，(d)帮助基因克隆的部分序列信息，和(e)在一些情况下获得足够的蛋白质以帮助3-D结构数据的收集。然后将这些酶的分析用于鉴定关键的酶***和这些***的最适宜收获时间。可在关键活性的水平和关键的酶混合物、性能特征和条件(在实验室规模上)方面最优化***以用于靶应用。

实施例1T.emersonii IMI393751、分离

将新收获的(大约200g)干净的草(草坪)切屑和其他混合的植物生物质置于封闭的容器中以模拟堆肥环境，和在恒定温度的气候箱中在65℃下温育大约2小时(底物的组合的巴氏灭菌和平衡)。将湿度/含水量保持在-65-70％。用容器通过管线间隔性提供低脉冲的湿润、滤过空气。在2小时后，将T.emersonii(来源于CBS814.70的12年之久的分离株的实验室原种(laboratory stock))的孢子悬液(2％的无菌水中1 x 10⁸个孢子)用于接种生物质的中心区域。将温度保持在65℃进行2天，此后每24小时以2℃的间隔增加直至气候箱内部的空气温度达到70℃。在无菌地下取出接种的‘热点(hot-spot)’或中心区的样品且转移至琼脂板(用于踝节菌属emersonii菌的Emerson琼脂培养基)之前将培养物再培养7天，然后传代培养，以确保培养物的纯度；通过显微镜分析来再确认纯度。用1cm²的来自36小时的旧琼脂板培养物的菌丝体丛碎片接种包含基本营养物(Tuohy等人，1992；Moloney等人，1983)的液体培养基和2％(w/v)的葡萄糖的液体培养基。在以220rpm振荡的条件下，将液体培养物在55℃下在250mL埃伦迈尔烧瓶(装有100mL的生长培养基)中生长36小时。在36小时后取出菌丝体悬浮物的等分(2.0mL)，用无菌水进行无菌清流洗，转移至无菌陪替培养皿(10mm的直径)，以时间间隔(10-60秒)用紫外光进行辐照。用经辐照的真菌菌丝体的样品接种无菌琼脂培养基(包含0.2％ w/v的分解代谢产和阻遏物，例如2-脱氧葡萄糖的诺布尔琼脂)。在45和58℃下温育复制式培养。小心地选择单个集落(松散的白色外观)，在无菌状况下转移至萨布罗右旋糖琼脂板和通过几个转移对其进行进一步纯化。株系IMI 393751代表了从58℃下温育的反获得的分离株。就增加的热稳定性和酶产生在与亲本生物的比较研究中评估突变体，该研究显示了两个株系之间在培养物外观、孢子形成的能力(株系IMI 393751是非孢子形成的)、亲热性和稳定性、在相同生长条件下的酶产生模式、个体酶活性的不同表达和水平方面的明显的差异。

CBS 814.70和IMI 393751之间的生理学/真菌学差异

在不同琼脂培养基上生长期间培养物的外观：当在Emerson琼脂上培养时，CBS 814.70具有该种的典型特征(Stolk & Samson，1972)，即淡白色的、奶油色的/浅黄色的颜色，在琼脂表面(围绕接种区)附近淡黄色(pale yellowish)逐渐变暗，随着培养物成熟，这转变成更深的暗淡黄色(dark buff)/赤褐色颜色，且由许多子囊器的致密的菌丝体丛组成。相反地，IMI 393751要白得多，培养物具有非常‘松散的’外观。

孢子形成方面的差异-CBS 814.70是T.emersonii的产生分生孢子、子囊和子囊孢子的孢子形成株系。分生孢子在菌丝(颜色为淡黄色和具有隔膜)上表现为垂直的分支。子囊或包含孢子的囊在形状上大概为椭圆体，通常可在链中发现；子囊孢子是光滑的，形状为椭圆形(在电子显微镜照片中呈现绿色)。相反地，IMI393751菌丝体产生非常少的经典分生孢子、子囊和子囊孢子。与CBS814.70完全相反，IMI 393751只在极端和十分特殊的条件下产生数目极少的孢子，然而株系CBS 814.70在几种不同培养基上产生孢子。

在嗜热性和最适生长温度范围方面的差异。

CBS 814.70具有35至55℃的严格生长范围，在更低或更高的温度下生长不良，最适生长范围是40至45℃。IMI393751，在另一方面，展示30至65℃的更宽的生长温度范围，在80℃、85℃和至90℃生长良好，最适温度为48至55℃。IMI393751在高于55℃下生长非常良好，并且继续产生高水平的真菌生物质(菌丝体)和活跃地分泌大量不同的蛋白质。

在更高的pH值下的生长方面的差异-CBS 814.70在高于pH6-6.5(以前的数据，Tuohy & Coughlan，1992)的pH值下生长不良(事实上开始相继死亡)，甚而IMI393751在达到pH9.0的pH下生长良好且分泌高水平的酶。

在营养物有限/耗尽的条件下的生长。IMI 393751在营养物耗尽的培养基中良好地存活达到55天，然而CBS 814.70从之前的7天开始经历自溶，15天后剩下极少数存在的菌丝体/细胞。通过转移至萨布罗右旋糖琼脂使从55天大小的IMI393751的营养物耗尽的培养物收获的菌丝体复苏，然而不能通过相同的方法使CBS814.70株系(55天大小)的菌丝体残余物复苏。

实施例2：用于转化产纤维素材料的来自踝节菌属emersonii菌的酶***。木糖的完全水解需要木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-***呋喃糖酶和酯酶的协同作用。表1.给出用于本实施例的选择的靶底物(包括废物/残渣)和诱导性碳原的百分数的实例。百分数诱导是指每体积培养基碳源的重量(g/100ml)。

表1：用于通过T.emersonii进行的酶生产的培养底物/诱导性碳源

^包括用于比较目的。

基于获得的结果，使用从踝节菌属emersonii菌纯化的酶设计用于降解半纤维素(木聚糖)或富含木聚糖的木材来源的产物、残渣或废物的酶***。存在于酶***中关键酶的相对量列于表2中。

表2：用于降解半纤维素或富含木聚糖的产物的***

核心活性的相对量、谱和副活性的相对量将随靶底物的组成变化而变化。表3概述了来自踝节菌属emersonii菌的设计用于特殊应用的酶***。

表3：适合用于降解来自木材木聚糖、新闻用纸和木渣的寡糖的特定酶***。

 

酶***和组合物	选择的靶应用/底物	酶剂量**	％碳水化合物的水解
				TE Woodcell(LWX-诱导的)*15-30％木聚糖酶^0.2-1.0％β-木糖苷酶0.1-3.0％α-葡糖苷酸酶0.1-3.0％α-L-***呋喃糖酶7-10％纤维素酶20-35％非纤维素葡聚糖酶、果胶分解酶、酯酶)	来自木材木聚糖的寡糖s新闻用纸的生物转化木材残渣(例如锯屑、削片、未用过的木材、树皮等)的生物转化	15-30nkat/g木聚糖11.5-46.0nkat/g新闻用纸s46.0-150nkat/g木材残渣	91-100％(1-3h)70-85％的存在的碳水化合物％34-50％(70℃/24小时)^^35-55％(80℃/24小时)^^

^使用不同模式木聚糖作为底物测量木聚糖酶水平

*LWX，落叶松木材glucurono***木聚糖

**木聚糖酶水平：对于作为测定底物的落叶松木材木聚糖、桦木聚糖和燕麦木聚糖分别为45.2IU/mL(753.5nkat/mL)，40.9IU/mL(681.8nkat/mL)和27.5IU/mL(458.4nkat/mL)；在收获时，其中nkat＝nanokatals(16.67IU/mL)

^s取决于新闻用纸的等级，即彩色的对黑白、光滑的对粗糙完成的/再循环的等。

^％纤维素，40-55％和半纤维素，25-40％，作为存在的主要类型的碳水化合物。

^^软木材底物(未粉碎的和粗略粉碎的部分，未用稀酸未处理的和用稀酸预处理)的转化百分数。可使用与其他T.emersonii或嗜热毛壳菌的酶***混合的该酶***，或通过加入重组酶扩大关键酶的活性来增加总的百分数转化(达到74％)。

实施例3：用于转化谷类、甜菜浆以及富含***木聚糖和乙酰化半纤维素的其他材料(包括废物)的来自踝节菌属emersonii菌的***。

表4给出了设计用于转化谷类谷类、甜菜浆以及富含***木聚糖和乙酰化半纤维素的其他材料(包括废物)的来自踝节菌属emersonii菌IMI 393751和两个之前鉴定的突变体株系的设计的酶***中不同酶活性的相对量。

表4：用于转化富含***木聚糖和乙酰化半纤维素的材料的***的酶活性

 

酶制剂/组合物	T.emersonii(IMI393751；1:1WB/BP作为诱导物)	T.emersonii(IMI393751；角豆荚粉作为诱导物)	T.emersonii(突变体TC2；WB作为诱导物)	T.emersonii(突变体TC5；茶叶作为诱导物)
						酶活性谱(％)	酶活性谱(％)	酶活性谱(％)	酶活性谱(％)
木聚糖酶外切木聚糖酶β-木糖苷酶α-葡糖苷酸酶α-L-***呋喃糖酶修饰生物聚合物的酶包括乙酰酯酶和乙酰木聚糖酯酶	20-30％5-10％0.5-2.0％0.5-2.0％0.5-2.0％30-45％	15-25％2-5％0.2-1.5％0.2-1.5％0.2-2.0％32-50％	35-50％10-15％0.2-1.5％0.2-1.5％0.2-1.2％20-35％	12-20％2-8％0.1-1.0％0.2-1.5％0.1-1.5％25-60％

实施例4：用于转化非纤维质材料例如茶叶和角豆荚粉的来自踝节菌属emersonii菌的***。三个新的内切葡聚糖酶(EG))的特征，所述内切葡聚糖酶对于多种谷类残渣(包括用于酿造的潜在候选物和动物饲料，例如高粱、玉米和黑麦)的选择性修饰和降解是非常重要的。已从踝节菌属emersonii菌IMI393751纯化出这三种酶。

通过酚硫酸法(Dubois等人)，参照葡萄糖或甘露糖标准曲线(20-100μg.mL^-1)确定纯化的酶制剂的总的碳水化合物含量。

蛋白质分离技术获得高度纯化的EG V、EG VI和EG VII的制剂需要连续的凝胶过滤、离子交换、疏水相互作用和凝集素亲和层析和色谱聚焦(假离子交换(pseudo ion-exchange))。按照本领域技术人员已知的标准技术和相关参考资料(例如Murray等人，2001；Tuohy& Coughlan，.1992，Tuohy等人2002；Maloney等人，2004)进行非变性凝胶电泳和等电点聚焦，然后进行考马斯蓝染色。初步的实验显示EG V-VII的pI值<pH3.5。因此，将用0.025M哌嗪-HCl，pH3.5预平衡的PBE94上的色谱聚焦用于确定EG V-VII的精确pI值。相应于β-葡聚糖酶的洗脱峰的pH被确定为pI。因此可检测到0.01个pH单位的差异对每一种酶产生精确的pI值。

通过在2.5和9.0之间的pH值、50℃下，在离子强度恒定的柠檬酸盐磷酸盐缓冲液中监测酶的活性来确定pH和温度最适值以及稳定性最适pH值。为了估计pH对的EG V-VII的活性的影响，在pH4.0、5.0和6.0下，在50℃下温育各酶的纯化样品。在0、1、2、3、6、9、12、24、36、48和达到336小时(14天)后取出等分，适当地稀释在100mM NaOAc缓冲液，pH5.0(常用测定的pH)中，按照标准的测定法就残留的活性对其进行测定。在底物不存在的情况下，在50℃、60℃、70℃和80℃下检查和纯化的酶的稳定性。EG V-VII不是模块蛋白(modular protein)，因为三种酶中没有一种吸附至纤维素(或其他不溶性碳水化合物，即它们不包含结合的碳水化合物)。

使用常用的β-葡聚糖酶测定方法，通过测量针对广泛的碳水化合物(BBG、地衣多糖、CMC、其他多糖和合成的糖苷)的活性估量不同多糖和合成的糖苷上的底物特异性。

金属离子、化学修饰试剂和潜在的抑制剂的效应通过将酶与化学药品一起温育，然后进行常用的酶测定法，就它们对EG V、EG VI和EG VII的活性的潜在影响对1.0mM的终测定浓度的许多单价、二价和重金属离子进行检查。最后，检查糖苷例如二糖、内酯和黄酮苷对纯化的酶的抑制效应。在常用的测定混合物中包括了各糖苷的特定浓度，通过与对照(无糖苷存在)比较确定残留的活性。

表5中给出了EG V、EG VI和EG VII的纯化的概述以及纯化参数例如得率(％)。

对于EG V和EG VII，得率以及最终的特异性活性值相似，然而以更低的得率获得EG VI，EG VI具有更高的特异性活性。

酶的均一性M_r和pI值使用希夫试剂(结果未显示)的阳性染色表明所有三种酶都是单个亚基的糖蛋白。通过IEF验证各酶制剂的均一性。获得的pI值如下：EG V，2.45；EG VI，3.00；EG VII，2.85.

糖基化的的证据和摩尔消失***的估算对于EG V、EG VI和EGVII，总碳水化合物含量(w/w)分别为22.6±0.1％、14.7±0.1％和65.9±0.04％。计算的摩尔消光系数(ε₂₈₀)值(mol.1.cm^-1)对于EG V为1.04 x 10^-5，对于EG VI为8.80 x 10^-6和对于EG VII为7.05 x 10^-6。

pH和温度最适值和稳定性这三种酶在相对宽的pH范围上是活跃的，但对于EG V、EG VI和EG VII分别展示5.7、5.4和5.7的酸性pH最适值。在T.emersonii粗提物中对于BBG酶活性获得4.5的pH最适值。大约75％的最适活性在pH3.0和7.0(EG V)之间、pH2.5和7.5(EG VI)之间以及pH2.8和7.5(EG VII)之间是明显的。

从BBG释放还原糖：在pH5.0，30至90℃下，10分钟内。对于EG V、EG VI和EG VII，活性的最适温度值分别是78.0℃、78.0℃和76.0℃。根据阿利纽斯作图法估计的活化能(Ea)对于EG V是21.2±0.05kJ.mol^-1，对于EG VI是23.5±0.02kJ.mol^-1，和对于EG VII是26.7±0.05kJ.mol^-1。

在pH5.0、pH5.5和pH6.0(在50℃和70℃)检查pH对酶稳定性的影响。在pH4.0-7.0的范围内，在1小时的温育时间内，pH稳定性最大，在pH<4.0和>7.0下观察到显著的降低，EG V在pH5.0和50℃下在15天的时期内没有损失活性，然而EG VI和EG VII分别损失最低限度的活性(分别为13.0％和11.5％)。然而，在70℃和相同pH下，在60分钟的时间内，各样品EG V、EG VI和EG VII分别损失原始活性的42％、35％和33％。在pH5.5(50℃)下，EG V、EG VI和EG VII在15天的时间内分别损失它们各自的原始活性的30％、22％和8％，但在70℃下，EG V变得进一步不稳定(在60分钟后，原始活性减少58％)，然而60分钟后EG VI和EG VII的活性与在pH5.5和70℃下温育后获得的相似。EG V在pH6.0和50℃下相当不稳定，在15天中损失了其原始活性的63％。EG VI和EG VII在后一种pH下明显更稳定，其稳定性与在pH5.5(对于两种酶损失30％的活性)时确定的稳定性相似。通过将温育温度增加至70℃，EG V的活性在60分钟的温育时间内(在pH6.0下)显著降低(65％)，然而EG VII保持相当大的稳定性，只损失了其原始活性的22％。半衰期(T1/2)值在pH5.0和50℃下超过15天，然而在70℃下，值从67分钟(EG V)变化至大于80分钟(EG VI和EG VII)。

组件结构(modular structure)的证据在pH5.0和4℃(8-15％的吸附)下微弱地吸附至Avicel(微晶纤维素)的EG V、EG VI和EG VII；然而，该吸附的程度表示不存在碳水化合物结合组件(CBM)。

金属离离、化学修饰物和潜在的抑制对酶活性的影响检查1mM终浓度的多种一价、二价和多价阳离子对EG V、EG VI和EG VII的活性的影响。活性表示为相对于对照(温育混合物中不存在金属离子)百分数。通常，认为重金属离子与半胱氨酸、组氨酸或羧基形成共价盐而使酶失活。虽然许多金属离子，例如Mg²⁺、Zn²⁺和Mo⁶⁺增强所有这三种酶的活性，但离子例如Ag⁺、Fe²⁺，特别是Hg²⁺显著地降低EG V-V II的活性，显著的酶内(inter-enzyme)差异对于其他金属离子的效应是显著的。Na⁺和K⁺的盐酸盐对各酶的活性没有影响或轻微地刺激其活性，例如K⁺增加EG VII的活性20％，而Na⁺增加EG V的活性超过39％。Ba²⁺和Ca²⁺分别降低EG V的活性16.5％和21.5-24.6％，而两种离子都分别增加EG VI的活性37.6％和10％。其他二价阳离子例如Cd²⁺、Co²⁺和Cu²⁺对EG V产生显著的抑制效应(大约损失26.5-77.4％的活性)。所有三种酶的活性几乎被Hg²⁺完全抑制表明存在参与催化的必需巯基。注意效价调节活性，例如与Fe²⁺相反，Fe³⁺对所有三种酶的活性产生了更有力的负效应(活力减少35.4-88.0％)，所述Fe²⁺实际增加了EGV的活性20％，对EG VII具有最小效应和减少EG VI的活性38.6％(Fe³⁺减少EG VI的活性53.6-59.3％)。阴离子嵌入(counteranion)的性质，即Cl^-对SO₄ ^2-对活性具有极大的影响，其中检查特定阳离子的两种盐。相对于使用相应的Cl^-盐所观察到的活性，Ca²⁺和Fe³⁺的SO₄ ^2-分别选择性地增加EG VII的活性大约2倍和4.5倍。相比之下，Mg²⁺的SO₄ ^2-盐，与相同阳离子的Cl^-盐相比，显著地减少EG V(54.2％)和EG VI(50.1％)的活性。在底物不存在和存在的情况下，就它们对EG V、EG VI和EG VII的影响检测已知修饰蛋白质中的氨基酸R基的试剂的选择(以该方式可观察到底物保护效应)(参见表6)。

N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)的有效抑制效应表明色氨酸参与结合和/或催化作用。然而，邻苯二醛(另一种色氨酸修饰试剂)对EG V、EG VI或EG VII的活性没有净效应，因此NBS可修饰已知与其具有侧链反应性的另一个氨基酸例如半胱氨酸。此外，底物不能保护酶免受失活可排除色氨酸在结合或催化中的直接作用。因为半胱氨酸和二硫苏糖醇(DTT)都保护酶免受失活，所以NBS的效应可归因于副反应(side-reaction)，例如半胱氨酸的氧化。巯基(sulphydryl)试剂碘乙酰胺、对-羟基汞基-苯甲酸酯和N-己基顺丁烯二酰亚胺在底物存在或不存在的情况下引起微弱的抑制或不引起抑制，这似乎暗示着EGV、EG VI和EG VII不具有必需的巯基。然而，半胱氨酸、DTT和二硫苏糖醇激活所有三种酶，特别是EG VI和EG VII，这可以暗示着氧化的二硫化物的还原在提取和/或酶纯化过程中发生，从而恢复了酶的活性位点区域或作为整体酶分子的天然构象。硼氢化钠(强还原剂)在底物存在的情况下抑制三种酶(特别是EG VI)。相反地，在底物存在的情况下，通过强氧化剂例如高碘酸钠、碘和巯基乙酸的作用氧化活性位点上的其他反应基团显著地增强所有三种酶的活性，对于高碘酸钠和EG VI效果最明显。Woodward试剂K(羧酸盐修饰试剂)增强EGV、EG VI和EG VII的活性，在底物不存在的情况下最有效。

通常，酚类物质例如间-苯基苯酚、(-)表儿茶精、(+)儿茶素、邻香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸和鞣酸等等受试化合物，除了由于其蛋白质沉淀功能而为有效抑制剂的鞣酸外，对酶活性没有显著的抑制作用(在底物存在的情况下)。事实上，一些化合物，例如原儿茶酸、丁香酸、咖啡酸和聚乙烯醇显著地激活所有三种酶(在底物存在的情况下用抑制剂预温育酶期间获得的结果)。然而，当与酶和底物共温育时，注意到几种酚类物质引起大约7-32％的活性减少(底物不保护任何酶免受鞣酸的有效作用)。

通常，大部分受试去垢剂不导致酶活性的损失。然而，牛磺胆酸、牛磺酸脱氧胆酸、Tween 20和Tween 80，当在加入底物之前用酶进行预温育时，都分别减少EG V的活性47.7％、22.7％、12.7％和30.8％。除了Tween 80(34.2％的活性损失)外，与底物同时温育恢复了全部活性。当底物、酶和去垢剂(脱氧胆酸、CHAPS、牛磺酸脱氧胆酸和鹅脱氧胆酸)同时温育时，观察到增加的活性，例如在底物和脱氧胆酸存在的情况下，EG VI的活性增加2倍多。

糖苷例如水杨苷、马栗树皮苷和熊果苷对EG V-VII的活性没有明显的影响，与二糖蜜二糖、麦芽糖、蔗糖和醛醇(alditol)、山梨醇相似。然而，50至75mM的纤维素浓度显著抑制所有三种酶，特别是EG V，乳糖在浓度大于75mM时也抑制所述EG V。乳糖在大约120mM的浓度下也引起大约50％的EG VI和EG VII BBG酶活性的抑制。葡萄糖酸-δ-内酯和葡庚糖-1，4-内酯也抑制EG V-VII，但要在高得多的浓度(对于50％的抑制，需要500至大于750mM)下。

底物特异性T.emersonii的提物催化多种多糖包括纤维素、CMC、BBG、昆布糖、地衣多糖、木聚糖、果胶和合成的糖苷衍生物系列的水解。三种纯化的酶中没有一种对β-D-木吡喃糖苷或α-D-吡喃半乳糖苷的4-硝基苯基衍生物是有活性的(表7)。

此外，EG V、EG VI和EG VII不展示针对滤纸、Avicel、豆角胶半乳甘露聚糖的任何活性和不催化纤维素的氧化，甚至在与底物一起延长温育时间也是如此。结果以相对于对照(针对BBG的活性指定为100％的值)的活性的百分数活性方式表示。所有三种酶都展示针对混合连接的β-葡聚糖、BBG和地衣多糖的最大活性，对后者底物的活性显著更高。当进行长时间温育时所有三种酶对木聚糖展示的痕量活性可解释为这样的事实，即所使用的燕麦木聚糖制剂包含少量的、污染量的β-葡聚糖。

在对每一个表达的酶进行相似的分析后，使用从踝节菌属emersonii菌纯化的酶设计用于降解非纤维素材料例如茶叶、角豆荚粉和其他相似材料的酶***。

表8给出了不同酶活性对于该酶***的相对量的实例。

表8：用于转化非纤维素材料例如茶叶、角豆荚粉的***。

 

酶组合物	酶活性谱(％)
		β-葡聚糖酶	45.0-55.0
木聚糖酶	16.5-42.0
		β-葡糖苷酶	0.5-2.0
β-木糖苷酶	0.1-1.0
		蛋白酶	0.1-1.0
额外的半纤维素酶包括β-半乳糖苷酶、酯酶、α-葡糖苷酸酶等	10.0-18.0

实施例5：用于转化纤维素、富含纤维的废物和纤维寡糖的来自T.emersonii的***

将踝节菌属emersonii菌IMI 393751在多种作为底物的废纸和纸产品上培养。提取分泌的酶，通过蛋白质组学和转录组学分析和通过全面的功能测定系列来监测和定量酶的表达。几种废纸经证明是纤维素酶(和补充活性，例如淀粉水解酶，其中使用涂覆纸(coatedpaper)/光泽纸(finished paper)产品)的优良诱导物。在不同的废纸/纸产品诱导的纤维素酶的相对量/类型方面差异是很明显的。获得的数据确认了纤维二糖水解酶I(CBH I)和纤维二糖水解酶II(CBH II)同功酶是最重要的纤维素酶活性，其中靶底物中的纤维素的更完全的糖化/生物转化是想要的(例如，用于生物燃料生产的富含单糖的原料的产生)，β-葡糖苷酶I(BG I)也是非常重要的。

纸板诱导显著的滤纸(FP)降解活性(1573IU/g，其中IU表示形成的μmol产物/分钟反应时间/g诱导性底物)、低内切纤维素酶水平(27.5IU/g)和氏β-葡糖苷酶水平(6.05IU/g)。在转录组学水平上，CBHI是最丰富的/高度表达的纤维素酶，检测到242.0IU/g CBH I类型活性而完成了功能水平上的观察。在纸杯上培养期间产生的酶明显具有更强的外切作用，检测到495.0IU/g FP活性和53.9IU/g β-葡糖苷酶。在后者的实施例中，基因表达和功能测定表明CBH II是关键的纤维素酶(CBH II的转录物和酶水平大约是CBH I酶的相应水平的2倍)。CBH II再次是由牛皮纸、瓦楞纸板和白色办公纸诱导的关键纤维素酶。单个的酶***和其组合(例如，为了扩增关键的外切或副/附属活性)显示为用于转化多种富含纤维素的未用过的原料、次级原料和废料中的纤维素(和半纤维素/其他碳水化合物)的有效工具。

通过常规方法(Walsh，(1997)和等人，2002)分离和分析酶。

在115和170mM之间的NaCl浓度下洗脱包含痕量的作为唯一污染活性的木聚糖酶的CBH IA。汇合级分52-66，将其对4个变化的100mM醋酸铵缓冲液，pH5.0透析16小时，然后在用对-氨基苄基-1-硫代-纤维二糖糖苷取代的CH-琼脂糖4B的柱子(1.4 x 11.3cm)上经历亲和层析。残留的污染性木聚糖酶活性不结合，在应用和洗涤缓冲液中被洗脱。使用0.1M的100mM醋酸铵缓冲液pH5.0中的乳糖洗脱CBH IA。汇合级分13-21，将其对蒸馏水透析以除去乳糖，然后在4℃下贮藏直至使用。

将来自阴离子交换步骤(DE-52，pH5.5)的CBH IB对100mM的醋酸铵缓冲液，pH5.5进行透析和用于与对于CBH IA所使用的一样的亲和柱。残留的污染性活性(主要是内切木糖苷酶)不结合亲和基质，从而在洗涤中被洗脱。使用0.1M的亲和缓冲液中的乳糖特异性洗脱CBH IB。汇合级分43-48，并且将其对蒸馏水透析以除去乳糖，然后在4℃下贮藏直到进一步使用。

基于上述分析，使用从踝节菌属emersonii菌纯化的酶设计用于降解废纸和纸产品以及包含纤维寡糖的其他废物的下列酶***。

表9：用于转化纤维素、富含纤维素的废物和纤维寡糖的***

 

酶组合物	酶活性谱(％)
		纤维二糖水解酶1A和1B	5.0-80.0
纤维二糖水解酶II	6.0-45.0
		内切葡聚糖酶(Cel 45、EGV、EGVI、EGV II)	4.6-66.0
β-木糖苷酶	0.1-2.5
		木聚糖酶	1.0-89.0
其他水解酶(包括果胶修饰酶、***呋喃糖酶、β-半乳糖苷酶)	1.2-20.5

实施例6：来自踝节菌属emersonii菌种类、嗜热毛壳菌嗜热子囊菌的***。

概述的用于设计来自T.emersonii IMI 393751和之前已和的突变体的酶***/嗜热酶(thermozyme)组合物的策略适合用于通过超过23个嗜温和踝节菌属emersonii菌种类产生的修饰碳水化合物的组合物。对通过这些真菌种类产生/诱导有效的半纤维素酶(木聚糖酶、甘露聚糖酶)和富含果胶酶的酶***给予特别的关注。

如早前所描述的，将嗜热毛壳菌和嗜热子囊菌以液态发酵的形式个别地培养在包含1-6％的诱导性碳源的T.emersonii营养培养基上(也检查通过固态发酵进行的酶的生产)。通过在咖啡废物上培养嗜热毛壳菌96至120小时来获得有效的降解甘露聚糖的酶***。表征该***的该组合物，该组合物显示包含45-60％的水解甘露聚糖的活性、0.7-4.0％的果胶修饰酶、35.2-52.0％的木聚糖修饰活性，残余物归因于纤维素酶活性(注意非常低的或痕量的CBH和β-葡糖苷酶)。

在大豆上培养相同的真菌产生有效的木聚糖降解酶***(70.2-86.5％的总活性归因于木聚糖修饰酶)；大约10.6-28.0％和大约8.6-22.5％的剩余的碳水化合物修饰活性归因于纤维素酶、果胶分解酶和低水平的甘露聚糖分解酶。

类似地，在小麦麸皮和甜菜浆(1:1)上培养期间诱导有效的果胶修饰酶***，大于56.5-80.0％的总的碳水化合物修饰活性谱由果胶分解活性提供；该酶***也包含大约22.1-40.1％的木聚糖修饰酶，剩余和主要是纤维素酶/β-葡聚糖修饰活性。相反地，嗜热子囊菌在大豆上的培养诱导有效的木聚糖分解酶***(>62.1-85.8％)，补充以大约3.5-11.0％的果胶修饰酶，剩下的活性主要为β-葡聚糖修饰活性。与嗜热毛壳菌相反，在任一底物上培养期间，嗜热子囊菌不产生显著水平的降解甘露聚糖的酶。

这些酶***，它们自身和相互之间或与其他酶组合(例如T.emersonii)时，都显示实现广泛的不同的农业、食品/蔬菜、饮料、木质/纸和其他富含碳水化合物的未用过的原料和废料的广泛糖化(糖释放)，且可用于产生用于广泛的生物技术应用(例如生物燃料的生产)的特化的寡糖产物或富含糖的原料。

实施例7：用于从食品/饮料、废纸和木质废料产生富含糖的原料以用于生物燃料生产的来自T.emersonii的***。

(a)食品/饮料废物的生物转化：苹果浆/苹果渣

从当地苹果供应商、食品加工和苹果法/饮料生产地获得废苹果(制成浆的)、苹果浆和苹果渣。将T.emersonii培养在2-6％的苹果渣/浆(以固态和液态发酵的方式)，测量高水平的众多碳水化合物修饰酶。该***特征在于高水平的β-聚糖水解酶(主要是非纤维质non-cellulosic β-木糖苷酶(120h液全培养滤液中大约27.4％)、充足量的关键外切糖苷酶和特别高水平的α-***呋喃糖酶(13.3％的总糖酶活性)和β-半乳糖苷酶(22.6％)。也检测到另外的酯酶、果胶和木聚糖修饰酶(大于7.2-33.5％)。因此通过使用上述分析，可能设计适合用于降解苹果废物的酶***。

最初的研究使用包含每3.6Kg底物2,344nkat木聚糖酶、5,472nkat混合连接的β-木糖苷酶和8,529nkat地衣多糖酶的酶用量和使用70℃的反应温度。在70℃获得水解产物的完全巴氏灭菌，将水解产物用于填充嗜温和嗜热向上流动的厌氧反应器(UAHR)。观察到100％的糖原料糖化，副产品为甲烷(50-70％于生物质流中)。随后进行最优化研究，该研究证明在80℃下温育，在轻微的搅拌(大约120rpm)下进行24小时的时间，使用大约2/3的原始酶剂量，获得大约87％的存在的碳水化合物糖化成简单的可发酵糖。

通过该酶***产生的糖可用作用于生物燃料生产的富含单糖的原料。

(b)废纸：纸杯和纸产品的生物转化：

在无补充的情况下以液态发酵(参见实施例5)的形式在多种废纸上培养T.emersonii。纸杯经证明是非常有效的糖酶诱导物，产生有效的多组分酶混合物，所述酶混合物具有高水平的木聚糖酶和淀粉降解酶活性以及比关于常规培养底物所报导的更高的纤维素酶活性水平。通过生物化学试验和扫描电子显微镜技术清楚地举例说明了该酶***有效地释放还原糖和有效地降解废纸的潜能。嗜热酶对底物完整性的影响和使用扫描电子显微镜技术的形态学确认了这些混合物作为用于废纸转化的有效工具的潜能。SEM提供了在用T.emersonii混合物处理富含纤维素的底物后大量纤维素纤维降解(在某些样品中纤维结构完全消失)的明确证据。

在纸杯上培养108小时后由嗜热真菌产生的酶混合物包含成组的降解纤维素酶、半纤维素和淀粉的酶，使用该多组分混合物进行的糖化研究证明了其有效地从常规纤维素和废纸底物释放葡萄糖和其他还原糖的能力。发现该酶混合物对于分析的所有废纸和常规纤维素底物都有活性。虽然所有底物在一段时间里不断降解，但响应于不同的底物组合物其展示不同的生物降解易感性。在任何预处理之前，生物可降解的包装材料显示最强的对酶促水解的易感性，其次是面巾纸(tissuepaper)、纸杯和瓦楞纸板。纸杯诱导的酶***在50℃的温度、pH4.5下，以4mL/g底物的酶剂量和在37rpm下振荡的情况下最适地发挥功能，从废纸释放最高的糖水平。纸杯的匀浆化使水解的水平增加2.3(1.3)倍。在这些实验条件下(36FPU的酶剂量)(滤纸单位)获得85％的总的百分数水解，葡萄糖占释放的还原糖的大约80％。葡萄糖和木糖是主要的释放的产物(参见图3)。然而，将酶剂量减少至9FPU实现总水解的大约76％。电子显微镜检查显示了该混合酶的优异的水解性质(图4)。热处理使由相同的酶***进行的纸板转化增加34％(基于大约88％的释放的还原糖的总碳水化合物的水解)，然而热处理和匀浆化的组合使释放的还原糖增加80％，产生1.47mg/ml葡萄糖(31.7％的释放的总糖)。纸板通过纸杯诱导的酶混合物快速降解，葡萄糖占释放的总糖的大约67％。

已在相继的水解和糖化(SHF)(即先进行酶预处理，然后然后进行酵母发醇以产生乙醇)中和在同时水解和糖化(SSF)(其中连续地产生原料并且立即通过酵母发酵)中检查了纸和食品废物的酶促糖化。酶促预处理反应温度在两个方法中不同，即在SHF中更高，因为水解产物在发酵之前已进行了冷却，且在接近环境温度的温度下进行SSF中的酵母生长和发酵。然而嗜热真菌IMI393751的酶更有效且具有更高的反应速率，获得巴斯德灭菌(和需要更少的酶)，嗜热真菌的酶在25-37°C下工作仍然相当好，并且将所述酶与来自其他真菌源的商业酶制剂充分比较。

发现产生的富含糖的原料适合用于生物燃料(生物乙醇和生物气)的生产。

(c)用于生物乙醇的生产的软木残渣的生物转化

来自一级和二级源(例如树皮、thining和处理的废物，例如刨花和锯屑)的木质残渣和废物代表了巨大的源，差不多65-70％的干重包含包围在木质素中的复杂的碳水化合物例如半纤维素(大约19-28％和主要是木聚糖和甘露糖以及一些其他多糖)和纤维素(大约39-46％)。

以液态或固态发酵方式将嗜热真菌393751培养在木质残渣例如云杉(sitka spruce)锯屑和ash shaving上以产生用于靶废物的转化、具有合适的酶的特征谱的酶***。检查不同的反应/预处理温度和酶剂。估计的酶***包括在嗜热真菌在不同的底物上培养期间获得的混合酶。检查50℃、60℃、70℃和80℃的反应温度，使用许多不同的底物，即未处理的和预处理的木质残渣。也考查酶用量，最初的研究始于60FPU，后来增加至200FPU(FPU：滤纸单位，总纤维素酶活性的测量)。

表10：通过嗜热真菌(WB/BP(1:1)混合酶)进行的木质残渣的糖化

己糖含量表示为在24小时的反应时间内从10g起始批次释放的g数

*混合物＝嗜热真菌(WB/BP(1:1)混合酶+嗜热毛壳菌咖啡废物诱导的

考察在未缓冲和缓冲的条件下的水解，同样地考察反应含水量水平和酶剂量的影响。

酶剂量对理论乙醇得率的影响示于表11中。

表11：酶剂量对百分数转化和理论乙醇得率的影响

 

酶	剂量(FPU)	反应温度	释放的己糖(g)	％转化	理论乙醇产量(L/吨原料)
						混合酶*	60	70℃	4.5	70.0	325.5
混合酶*	200	70℃	5.1	76.4	345.4

*混合物＝嗜热真菌(WB/BP(1:1)混合酶+嗜热毛壳菌咖啡废物诱导的；己糖含量表示为在24小时的反应时间内从10g起始批次释放的g数。

实施例8：木质生物质的糖化

通过在室温下用二氧化流(3％w/v的含水量)浸渍20分钟至获得2.5％w/w的含水量的吸收率来制备受试底物云杉小片(直径2-10mm)。在215℃下用蒸汽处理SO2处理的云杉2至5分钟。半纤维素含量几乎完全水解；固体回收为60-65％的起始原料。酶MGBG嗜热酶：编号为MGBG 1、MGBG 2、MGBG 3和MGBG 4。所使用的商业酶是来自瑞氏木霉(T.reesei)的纤维素酶2L和来自A.niger(Novo Industri A/S，Bagsvaerd，Denmark)的Novozym 188。

酶促水解的估计

在以大约130rpm搅拌的情况下，在37℃、50℃和60℃下在进行标准的酶促水解。酶剂量为每克经缓冲的底物溶液中的纤维素32FPU的各酶(Gilleran，2004)。将反应缓冲液的pH调整至pH5.0(对于MGBG酶)和pH4.8(对于商业制剂)。以定时的间隔取出样品，通过煮沸各反应混合物(和对照)10分钟来结束酶作用。在最低的反应温度(37-50℃)下，进行本发明的2个酶制剂和商业纤维素酶制剂，(ii)MGBG酶中的3个酶的性能在与商业纤维素酶(和纤维素酶/Novozym混合物)相同的范围内。

使用本发明的组合物获得的葡萄糖的得率与最优化的商业制剂相同，但它们比商业酶产生更高水平的额外的可发酵糖。

本发明酶制剂在更高的反应条件(60-70℃)条件下在总体水解程度、产物得率和酶稳定性方面性能优于商业酶/酶混合物。在更高的反应温度下可使用更低的酶剂量获得相似的水解性能(取决于酶制剂，只需要62.5-78％的商业酶用量)。它们还较少地受到存在于蒸汽预处理的底物中的抑制物质和富含糖的水解产物中的更高浓度的葡萄糖和纤维二糖的影响。它们还在60℃下24小时内产生比商业酶在50℃(商业酶的最适工作温度)下72小时内获得的更大量的糖。

酶促水解的至关重要的结果示于表12，而对于各受试商业酶和本发明的酶组合物，最适百分数水解的最适反应温度/反应时间组合示于表13。

表13：对于被考察的各商业酶和MGBG酶，最大百分数水解的反应温度/反应时间的组合

 

酶制剂	最适反应温度(℃)	最适反应时间(小时)	％水解	g/L己糖
					纤维素酶	50.0	48h	77.3	14.1
					细胞+脂肪酶(24:4)	50.0	48h	82.7	20.4
	50.0	72h	87.8	20.8
MGBG 1	50.0	48h	66.6	14.45
						50.0	72h	95.8	21.25
	60.0	24h	98.6	20.55
						70.0	24h	99.4	21.72
					MGBG 2	60.0	24h	94.8	22.12
	70.0	24h	大约100.0	24.11
MGBG 3	70.0	24h	93.5	16.8
MGBG 4	70.0	24h	97.9	20.98
						70.0	24h	96.8	17.38

同时发生的糖化和发酵(SSF)

进行使用云杉水解物的批SSF实验以比较不同酶制剂的性能。在4％的云杉纤维的浓度下进行发酵，用无菌水将预处理的材料稀释至希望的浓度。使用2M NaOH使pH保持在5.0。发酵温度是37℃，搅拌的速度是500rpm。使用氮气(600ml/分钟)喷射反应器介质，使用气体分析剂测量CO₂含量。以25个滤纸单位(FPU)/g纤维素的用量向发酵罐中直接加入酶制剂。发酵介质补充有营养物：0.5g/l(NH₄)₂HPO₄、0.025g/lMgSO_4·7H2O和1.0g/l酵母提取物。所加入的酵母(面包酵母、酿酒酵母)细胞群的浓度是5g/l，所有SSF实验在37℃下进行72小时。在不同的时间间隔取出样品，然后将其在14,000g下在1.5ml的微量离心管中离心5分钟(Z 160 M；Hemle Labortechnik，Germany)，然后制备上清液以进行HPLC分析。

通过HPLC分析在木质纤维的降解期间产生的水解产物。在85℃在聚合物柱子(Aminex HPX-87P)上分离纤维二糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、HMF和糠醛，流动相是以0.5ml/分钟的流速流动的Millipore水。使用配备反射指数检测器的Shimadzu HPLC***，用Aminex HPX-87H柱在60℃下确定甘油和醋酸盐。移动相是以0.5ml/分钟的流速流动的5mM的H₂SO₄水溶液。也使用酶联测定法(r-Biopharm，Germany)确定产生的乙醇。

在两相中进行酵母生长。二氧化碳是乙醇发酵过程的重要副产品，因为1摩尔的葡萄糖的厌氧发酵产生1摩尔的乙醇和2摩尔的二氧化碳。因此，排出气体中的二氧化碳的浓度的测量是发酵速度的间接测量。在第一生长期中，消耗可获得的葡萄糖并且形成乙醇，对存在的葡萄糖的最初的第一反应由CO₂放出中的汹涌现象代表。

在SSF中获得的结果示于表3。如之前所提及的，对于各酶制剂，SSF花费的总时间是72小时，用于SSF的温度是37℃。通过将产生的乙醇的实际浓度(g/L)除以总的理论乙醇浓度(g/L)(当所有可获得的底物转化成可溶性的、可发酵母糖且所有糖转化成乙醇时将产生的乙醇浓度)再自乘以100来确定发酵效率。基于所获得的数据，各酶/SSF组合的乙醇得率示以升乙醇/干吨给出，相应的美国单位是加仑乙醇/干美国吨。

实施例9用于生物乙醇生产的相继的水解和发酵(SHF)策略中商业酶和MGBG酶的比较

就商业酶制剂和本发明的酶制剂考察通过相继的水解和发酵获得的生物乙醇的得率。SSF的一个有利方面是方法由最初的快速发酵和由预处理步骤引起的单糖的代谢组成。一旦葡萄糖通过已加入的水解酶的作用从底物释放，则发酵非常快速，这意味着，在SSF中，游离糖的浓度总是保持低水平。在SSF中，作为通过酶或酵母代谢的抑制(任何一个都是限制速率的)导致的底物转化率的减少的结果，发酵速率最终减少。这些实验中获得的数据概述于表15中。

HPLC分析验证了形成的主要产物是单糖(单体糖，single sugar)和非常少量的形成的高级的寡糖(纤维二糖，其为二糖，是主要的或唯一的存在于水解产物中的高级糖链)。

实施例10动物饲料应用：

使用在振荡或不振荡的情况下，在50至250mL终反应体积中，在pH2.5至7.0和37-85℃下使用5至25g底物(谷类、谷类磨粉或其他植物残渣)在实验规模上进行的模型研究，在个别的靶应用中估量各酶组合物。在使用或不使用底物预处理(即温和的蒸气预处理(105℃，8p.s.i进行5分钟)，使用研钵和研杵研磨，在Parvalux或Ultraturrax中匀浆)的情况下估量酶的性能。对于柔软的水果和蔬菜组织/残渣，在不进行预处理的情况下，通过混合粗略地浸渍底物，并且将其与酶一起温育。通过(i)释放的还源糖的测量以及检测和定量每一种糖的测定，(ii)水解的糖产物的确认性TLC和HPLC分析，(iii)残渣的重量/体积减少的分析，(iv)在酶处理之前和之后的纤维素、半纤维素、淀粉和果胶含量的比较和(v)通过纤维性底物例如废纸和木质废物的扫描电子显微镜术(SEM)对底物降解进行的物理分析来监测底物的水解。

对于富含关至关重要的寡糖的饲料，例如

半乳寡聚糖-MGBG 16酶混合物是最适的

寡葡萄糖-MGBG 16和22是最适的

果糖寡聚糖-MGBG 21混合酶是最适的

对于富含抗氧化剂的饮料制剂，最适的用于处理的混合酶是基于：MGBG 13、16和23制备的混合酶。

实施例11单胃动物的饲料应用

在50至85℃(在以140rpm振荡的情况下)的范围内的温度下，使用粗制的谷类部分(每批1-5g)进行研究。通过定量以周期性间隔从反应混合物中取出的样品中释放的还原糖和形成的产物在24小时内监测使用各酶制剂(每g底物0.5IU的最大剂量)在底物中进行的碳水化合物的水解。

观察到木聚糖和非纤维质β-葡聚糖部分的显著水解，所述水解导致将基质形成更长链的水解寡糖产物，所述产物也是益生菌微生物的合适的发酵底物。

示例性生物气的生产

将两个10L上流复合式厌氧反应器(upflow anaerobic hybridreactor)(UAHR；Reynolds，1986)(一个保持在37℃，另一个保持在55℃)分别用于通过嗜温和嗜热细菌的个体混合群体进行的生物气的生产。将富含糖的水解产物向上抽吸通过污泥床(sludge bed)并且通过存在的微生物群落进行降解。反应器顶部的分离装置用于将产生的气体与任何可能在厌氧降解过程中离开的污泥颗粒分离。通过在整个650天的操作期中监测COD除去的功效(APHA，1992)、总的碳水化合物的减少(杜博瓦方法(Dubois method))和甲烷的产生来评估两个反应器。通过气相色谱(GC)监测脂肪酸的产生(糖代谢的指标)和甲烷的产生。可从许多原料产生生物燃料。许多这样的原料需要使用不同的酶混合物。MGBG是用于从下面列出的食物和蔬菜废物产生原料的最好的混合酶，所述原料用于通过厌氧降解生产生物气。

表18

 

处理混合物	使用的废料	主要的释放的糖	嗜温的厌氧的消化％碳还原	嗜热的厌氧的消化％碳还原	在生物气中的嗜温的厌氧的消化％甲烷	在生物气中的厌氧的消化％甲烷嗜热的
							MGBG16	角豆胶	木聚糖、葡萄糖甘露糖、纤维二糖	99-100	94.0-96.6	58.0	49.0
	面包	木聚糖、木乙糖、葡萄糖、纤维二糖、	96.1-99.7	96.0-99.3	71.9	69.0

 

	苹果渣	葡萄糖、半乳糖醛酸、果糖、***糖、半乳糖、木聚糖	96.0-99.3	95.4-99.5	58.0	52.0
								卡板纸	木聚糖、葡萄糖(痕量较高少)	95.4-96.9	94.0-96.6	63.0	49.0
MGBG18	混合的蔬菜/水果废料(餐馆)	木聚糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、果糖、***糖、鼠李糖

(*生物气中的百分数甲烷通常最高为50-65％)；

与文献中的报导(其中滞留时间通常在9至30天)相反，在只有3天的滞留时间中获得表18中的数据。滞留时间表示碳水化合物原粒的代谢和生物气的产生所花的时间(或停滞期)。

实施例12  生物乙醇的生产

在以大约130rpm进行搅拌的情况下，在37℃、50℃和60℃下在300mL和1L容器中进行标准的酶促水解。酶剂量为32FPU的各酶制剂/克缓冲底物溶液中的纤维素(如由Gilleran，(NUI，Galway，Ph.D.Thesis，2004)中所描述的，在实验室规模的研究中，处理的总重量＝100g)。将反应缓冲液的的pH调整至pH5.0。以一定的时间间隔取样，通过煮沸10分钟终止酶促作用。在0至72小时的时间内进行下列测量：

·还原糖的释放以及单种糖的检测和定量(表示为g/L)

·水解的糖产物的HPLC分析(以g/L表示产物量)

·残渣的重量/体积减少

·在酶处理之前和之后纤维素纤维的含量

酶处理之前和之后底物完整性的扫描电子显微镜术(SEM)

通过气相色谱(GC)监测糖代谢(通过厌氧菌进行的)过程中关键的脂肪酸的产生和甲烷的产生。使用两种方法(用于乙醇定量的酶联测定试剂盒(r-Biopharm，Germany)以及通过高效液相色谱(HPLC))测量通过酵母发酵产生生物乙醇。

在实验室规模的研究中检测云杉水解产物、废纸和木质残渣(松木类残渣主要是云杉类的残渣的混合物)。研究两种乙醇生产形式，SHF(相继的水解和发酵)和SSF(同时糖化和发酵)。

表19.用于生物乙醇生产的酶混合物的组成

 

酶	MGBG1a％	MGBG 2b％	MGBG 3c％	MGBG 4d％
					CBH ICBH IIβ-(1，3)4-葡聚糖酶β-葡糖苷酶木聚糖酶β-木糖苷酶，α-葡糖苷酸酶α-L-***呋喃糖-苷酶(其他水解酶，包括果胶分解酶，酚酸和乙酰(木聚糖)酯酶，蛋白酶木质素降解氧化酶活性)	20-2815-2020-2510-1220-255-105-80.5-2.08-15	15-2020-2820-2610-1118-308-108-100.5-2.06-17	15-1722-262511-1524-2710-126-82-4.012-15	12-1524-3020-22～10.020-305-88-101.5-3.010-15

来自SHF和SSF中的1L实验室规模的研究的数据；水解值基于底物中可获得的纤维素和任何残留的半纤维素。

上面所列的几种混合酶已用于广泛的其他应用中。在这些应用中，混合酶的用途中的主要差异在于(a)各处理中使用的酶的剂量或量，和(b)温育的持续时间。例如，MGBG 18非常适合用于处理某些废物流以及非常适合用于营养制品应用。在‘废物’处理/糖化步骤中，使用更高的酶剂量，处理时间为大约18至24小时(大约25至32个滤纸单位)。最终的目的是获得靶残渣至可发酵单糖的充分分钟。相反地，当需要产生生物活性的寡糖(寡葡萄糖或寡聚木糖)和/或结果变成面包状时，则需要更低的酶浓度和可采用不超过1(最大2)小时的修饰(或反应)时间，以获得希望的终点。

当靶底物主要富含纤维素时，酶的浓度基于‘滤纸单位或FPU’。当将产生生物活性寡糖(例如非纤维质β-寡葡萄糖)时，酶的浓度基于片段化靶底物所需的主要活性(例如来自真菌或藻类来源的非纤维质、混合连接的β-1，3；1，4-葡聚糖或β-1，3；1，6-葡聚糖)。

实施例13在液态发酵期间通过踝节菌属emersonii菌株系进行的酶的产生

所检查的踝节菌属emersonii菌株系是：

IMI(Imperial Mycological Institute(CABI Bioscience))393751(专利株系(Patent strain))、IMI 393753(CBS(CentraalBureau voor Schimmelcultures)180.68)、IMI 393755(CBS 355.92)、IMI 393756(CBS 393.64)、IMI 393757(CBS 394.64)、IMI 393758(CBS 395.64)、IMI 393759(CBS 397.64)、IMI 393760(CBS 472.92)、IMI 393752(CBS 549.92)、IMI 393761(CBS 759.71)。

液态发酵；在45℃下，在由Moloney等人，(1983)和Tuohy&Coughlan(1992)描述的培养基中，在非受控pH的条件下培养单个踝节菌属emersonii菌的重复液体培养物。所选择的四个碳源是：葡萄糖(单糖)、燕麦木聚糖(***葡糖醛酸木聚糖)、碳粉和1:1的茶叶/纸板混合物(在捣碎器(blender)中捣碎大约15至20秒，回收培养物上清液(Tuohy & Coughlan，1992；Murray等人，2002)和用于分析细胞外酶的产生。酶的测定；酶的活性表示为国际酶单位(IU)/克诱导性碳源。1个单位IU释放1微摩尔的产物(还原糖，4硝基酚等)/分钟。如之前所描述的(Tuohy & Coughlan，1992；Tuohy等人，1994，2002；Murray等人，2002；Gilleran，2004)进行所有外切葡糖苷酶和内切水解酶测定。除非另外指出，在50℃和pH5.0下进行所有初始活性的测量。外切葡糖苷酶的活性包括：β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-岩藻糖苷酶、α-***呋喃糖酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、α-鼠李吡喃糖苷酶(Rhamnopyranosidase)、α-半乳糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、α-***吡喃糖酶(Arabinopyranosidase)、α-甘露糖苷酶和α-木糖苷酶。通过还原糖方法，使用还原性糖醛酸(aldouronic acid)的混合物(Mega zyme International Ltd)作为底物测定α-葡萄糖醛酸酶的活性。该底物以大约40:40:20的比例包含还原性艾木三糖酸(aldotriouronic acid)、艾木四糖酸(aldotetrauronic acid)和艾木四糖酸(aldopentauronic acid)。使用5mg/ml该混合物的原液在pH5.0下测量活性。通过DNS法检测在30分钟的温育期间释放的还原性基团。当一些酶样品包含可测量的β-木糖苷酶活性(该活性可从糖醛酸释放木糖残基)，重复测定，反应混合物中包含的木糖抑制β-木糖苷酶活性。

还测量另外的外切作用木聚糖降解酶例如：α-***木聚糖***呋喃水解酶(使用酶联测定测量***糖从小麦杆***木聚糖的释放)、乙酰基酯酶(acetyl esterase)(使用乙酸4-硝基苯酯和乙酸4-甲基伞形酯底物)、乙酰木聚糖酯酶活性(监测乙酸从乙酰化的山毛榉材木聚糖的释放)、阿魏酸酯酶(分光光度计测量法和HPLC测定法)。

内切水解酶的活性包括：β-D-(1，3；1，4)-木糖苷酶(来自大麦的β-葡聚糖(BBG)或地衣多糖作为测定底物)、Xylo木糖苷酶(tamarind xyloglucan)、昆布糖酶(来自掌状海带(Laminariadigitata)的昆布糖)、内切-1，4-β-木糖苷酶(称为CMC酶)(基于抗商业底物羧甲基纤维素的活性)、β-甘露聚糖酶(长豆角半乳甘露聚糖)果胶酶和多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖(大豆鼠李半乳糖醛酸聚糖(rhamnogalacturonan))、半乳聚糖酶(羽扇豆(lupin)和马铃薯果胶半乳聚糖作为底物)、***糖酶(甜菜***糖)、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和糊精酶。

最适温度/pH和稳定性：通过在常用的测定缓冲液(100mMNaOAc，pH5.0)中，在30至100℃范围内以一定的温度增量进行合适的标准测定来确定对于活性的最适温度。考虑pH和温度的变化。使用下列缓冲液pH2.2至7.6：McIlvaine型恒定离了强度的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液、pH7至pH10的Tris-HCl缓冲液确定最适pH。无论pH如何，使用KCl将所有缓冲液调整至相同的离子强度。

如之前所述(Tuohy等人，1993；Gilleran，2004；Braet，2005)确定温度和pH稳定性。

蛋白质确定：通过Lowry的方法的Bensadoun和Weinstein修饰(Bensadoun和Weinstein，1976；Lowry等人，1951)，使用BSA级分V作为标准估计酶样品(粗制培养物产品)中的蛋白质浓度(Murray等人，2001)。

电泳和酶谱法：为确定存在于培养物滤液中的蛋白质的谱，通过冻干法浓缩已知体积的各样品，然后通过非变性SDS-PAGE(NativeSDS-PAGE)和/或复性SDS-PAGE(renaturing SDS-PAGE)或等电聚焦(IEF；Tuohy & Coughlan，1992)进行分析。使用MacKenzie & Williams(1984)，(Tuohy & Coughlan，1992)的凝胶叠合技术(gel overlaytechnique)的改进技术鉴定复性SDS-PAGE凝胶和IEF凝胶中的内切聚糖酶活性条带。为检测外切葡糖苷酶活性，立即在50-100μM的适当的4-甲基伞形基糖苷衍生物溶液中温育凝胶(2-30分钟的反应时间)。使用Fluor-S^TM Multimager(Bio-Rad)在紫外光下显现酶活性条带。

结果：

在不同的时间期限进行的独立实验中重复株系的液体培养至少3次。就酶的活性测定从重复的培养瓶(用于各株系/碳源组合)收获(120小时)的培养物滤液；在多种酶稀释度上测定多个重复。此外，通过intra-assay和inter-assay测量以及大量数据试验(volume test)的独立性验证结果。在培养物的表观和生长模式方面培养物之间存在明显的差异。例如，IMI393751株系在葡萄糖上快速地产生相当致密的、丝状培养物，然而几中其他株系(例如CBS180.68、CBS355.92、CBS393.64、CBS395.64、CBS397.64、CBS 549.92和CBS 759.71)展示有限的生长和非典型的形态学，即不存在正常的丝状生长和形成粘液样、有限的培养物团。株系CBS394.64产生更少的菌丝体生物质，但生长为丝状培养物，而CBS472.92在相同的培养条件下采用小球状形态学。选择第120小时的培养时间点，因为之前的研究已显示：在大多数碳源上在踝节菌属emersonii菌的生长过程中，存在大量的外切糖甘酶和内切寡糖酶活性(在非受控pH条件中，已观察到关键的活性的‘峰和谷(peaking and troughing)’。然而，通常在接近发酵周期结束时检测到最大活性)。对于许多株系来说，在120小时时葡萄糖的使用只有大约15至25％。株系CBS 394.64使用大约50至55％的培养基中的葡萄糖，而CBS472.92(其展示小球状形态学)使用大约20至25％的培养基中的葡萄糖。相反地，在72小时时，本发明的株系(IMI393751)使用了大约95％的培养基中的葡萄糖，在第120小时的收获时间点上在培养基中未检测到葡萄糖。

表31A-D显示由株系产生的选择的外切糖苷酶的产量。如结果所显示的，在外切糖苷酶产量方面可在本发明的株系与其他踝节菌属emersonii菌株系之间看到明显的差异。

葡萄糖不完全抑制踝节菌属emersonii菌株系产生外切糖苷酶(表31A)。在葡萄糖上生长期间，株系393751产生比其他株系显著更高水平的β-葡糖苷酶(BG酶)和产生第二高水平的N-乙酰葡糖胺酶(NAG酶)。获得的393751株系的生产模式与CBS549.92(之前称为CBS814.70)株系的生产模式呈现显著差异。通过后者株系进行的几种外切糖苷酶活性的产生被葡萄糖抑制。应当指出，在未透析的和已透析的培养物滤液中测量外切糖苷酶的活性水平以防培养基中残残留的葡萄糖抑制存在的BG酶和/或NAG酶(在已透析的样品中观察到相似的模式)。

长豆角诱导株系差异产生细胞外糖苷酶(表31B)。除了α-***呋喃糖外，株系CBS 394.64相对地不产生外切糖苷酶活性。株系CBS 393.64、CBS 395.64和CBS 549.92产生低水平的所有外切糖苷酶。393751株系产生显著水平的多种外切糖苷酶(最高活性的某些活性，例如果胶修饰外切糖苷酶β-岩藻糖苷酶)。

踝节菌属emersonii菌株系中内切寡糖酶的产生

A.木聚糖酶产物：转化植物生物质和富含非淀粉多糖的废渣所必需的两种主要类型的内切水解酶活性是木糖苷酶和木聚糖酶。在所有测定的降解多聚聚糖的活性中，葡聚糖酶和木聚糖酶是存在的主要寡糖酶活性。

表32A-D提供了由在相同的碳源上的所有株系产生的木聚糖酶的值。之前的研究已显示野生型(CBS814.70)和其他突变株系产生复杂的木聚糖降解酶***(Tuohy等到，1993；1994)，具有多种内切木聚糖酶。几种分离的木聚糖酶展示对不同类型的木聚糖例如***木聚糖、***葡糖醛酸木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、更多取代的木聚糖对非取代的木聚糖(根据之前的结果和使用来自本发明的株系的酶正在获得的结果)的选择特异性。如结果所显示的，葡萄糖在所有踝节菌属emersonii菌株系中是木聚糖酶表达的强抑制剂。393751株系表达显著水平的针对燕麦***木聚糖(OSX)的木聚糖酶活性。该组分不是抗黑麦或小麦***木聚糖的活性。

主要富含半乳甘露聚糖(包含一些木聚糖)的长豆角是393751株系中高水平的抗所有木聚糖底物的木聚糖酶活性的有效诱导物。基于其组成的知识不可预期长豆角作为有效的木聚糖酶活性的诱导物的作用。对于许多CBS株系获得的培养物的外观(在第120小时后)是显著不同的，在393751和CBS549.92株系之间可观察到明显的形态学差异，即对于IMI 393751致密的菌丝体(丝状)生长和对于CBS549.92株系粘液样、有限的(非丝状)培养生物质的形成。如表31B中所示，393751株系的木聚糖酶水平显著高于任何其他株系。与393751株系相反，长豆角在CBS394.64、CBS395.64和CBS549.92株系中是木聚糖酶的非常差的诱导物。可在由长豆角诱导的木聚糖酶活性的类型中看到另一种显著的差异。在393751株系中，产生了抗所有木聚糖的有效活性。在其他株系中，通常产生非常低的或不产生针对黑麦和小麦***木聚糖的活性。除了393751株系外，只有两个株系产生可测量的水平的针对这两种木聚糖的活性，即CBS472.92和CBS759.71。393751株系培养物滤液的酶谱分析显示高水平的多个木聚糖酶活性条带，包括已分离的新型双功能木聚糖酶。

也证明叶/纸板(TL/PPL)混合物在393751株系中是木聚糖酶活性的有效诱导物(表32C)，尽管该混合物在其他株系中确实诱导木聚糖酶的表达，但水平显著更低。如使用长豆角时所观察到的，393751株系产生针对所有木聚糖的有效活性，获得了几乎是高于1.8倍的针对黑麦***木聚糖(Rye AX)的活性和更低的针对OSX和桦木聚糖的活性。这表明TL/PPL和长豆角诱导物诱导的个体木聚糖酶的差异表达(这由随后的酶谱分析所支持)。TL/PPL还在393751株系中但不在其他株系中诱导多组分木聚糖降解酶***和补充的酯酶和/氧化酶/过氧化物酶活性。这些补充活性增强了经最优化用于主要生物质(例如谷类、植物废物、木质残渣、纸品)降解应用的酶混合物中的多糖水解酶的功效。与长豆角相比，TL/PPL在所有株系中诱导更高的木聚糖酶的产生(特别是针对***木聚糖的活性)，但水平比393751株系的要低得多。尽管已知OSX在真菌中是木聚糖酶的诱导物且在所有5个株系中诱导酶的产生，但其对于393751株系具有最显著的诱导作用。然而，与393751株系相反，只有OSX诱导高木聚糖酶活性，TL/PPL在472.92株系中是木聚糖酶产生的极差的诱导物。在OSX上酶产生的模式与使用长豆角和TL/PPL获得的不同。总的说来，在OSX上木聚糖酶产生的结果表明393751株系可非常快速地代谢粗制底物和有效地产生木聚糖酶的可溶性诱导物。更复杂的粗制底物中的半纤维素更易于进入该株系。结果也表明由393751株系在此类复杂的底物上产生的酶的混合物可以更适合于复杂粗制植物材料和残渣的水解。目前调查的模型研究和应用(例如，木质生物质转化、富含碳水化合物的食物和蔬菜废物以及OFMSW和谷类的糖化)已确认了这些混合酶的潜能。

最后，图32A-D比较和对比了在所有四种碳源上393751株系与样本株系CBS549.92(也称为CBS814.70)中针对不同测定底物(即，OSX、Rye AX等)的木聚糖酶的产生。

B.木糖苷酶和甘露聚糖酶的产生：之前的研究已显示野生型(CBS 814.70)和其他突变株系产生了复杂的葡聚糖酶***(Murray等人，2001，2004；Tuohy等人，2002；McCarthy等人，2003，2005)，该酶***包括纤维素酶和许多非纤维质β-葡聚糖转化活性。如对于木聚糖降解***所指出的，取决于碳源，产生了多种内切木糖苷酶。几种分离的β-木糖苷酶展示了对于不同类型的β-葡聚糖的选择性特异性。

表7A-D显示了针对修饰的商业β-1，4-葡聚糖CMC(SigmaAldrich)、来自大麦(BBG；Megazyme)和地衣冰岛地衣(Cetrariaislandica)(地衣多糖；Sigma Aldrich)的β-1，3；1，4-葡聚糖、来自Tamarind的木葡聚糖(β-1，4-葡聚糖主链；Megazyme)和来自长豆角的半乳甘露聚糖(Megazyme)的活性。非纤维质β-葡聚糖以显著的浓度存在于许多植物残渣(特别是来源于谷类的植物残渣)的非淀粉多糖组分中。表7A-D举例说明了株系中各自活性的差异诱导，在更复杂(粗制)碳源上诱导的模式完全不同。

葡萄糖在几乎所有株系中是葡聚糖酶和甘露聚糖酶产生的有效抑制剂(表33A)。对于所有样品，测量经透析的和未透析的样品的活性。如结果显示，长豆角在393751株系中是高水平的β-1，3；1，4-葡聚糖酶(针对BBG性地衣多糖)的有效诱导物，对于所有受试株系是最高的水平(表33B)。

由393751株系产生的β-1，4-葡聚糖酶(针对CMC)的水平比针对BBG的活性低大约10倍(当与其他株系比较时，该株系的CMC酶的水平更高)。甚至检测到更低的木葡聚糖酶，对于393751株系获得的水平最高。酶谱分析确认了各个踝节菌属emersonii菌培养物滤液中的内切葡聚糖酶组分的类型、葡聚糖酶组分的表达模式和表达的相对水平显著不同。在长豆角上生长期间所有株系产生了低水平的(半乳聚糖)甘露聚糖酶。

TL/PPL是393751株系中甚至更有效的β-1，3，1，4-糖苷酶(BBG酶和地衣多糖酶)和(半乳聚糖)甘露聚糖酶的更有效的诱导物(表33C)。总的说来，这些结果突出了踝节菌属emersonii菌株系中β-木糖苷酶的产生的不对等现象，确认了393751株系是不同β-葡聚糖酶活性的优良来源，TL/PPL混合物诱导这些活性的有效混合物。

OSX(表33D)，如所预期的，诱导比长豆角和TL/PPL低得多的水平的β-葡聚糖酶。对于393751和CBS 549.92株系，酶产生的模式不同。在表33D中，除了CBS 397.64(其产生高于393751株系2倍的水平(以OSX为诱导物))外，对于大多数株系β-1，4-葡聚糖的水平(羧甲基纤维素酶活性)更低，且在四个株系(即CBS 393.64、CBS394.64、CBS 395.64和CBS 549.92)的培养物滤液中未被检测到。393751株系(低于使用TL/PPL作为诱导物)和CBS 472.92在OSX上生长期间产生显著的(半乳聚糖)甘露聚糖酶活性。

图6A-E比较和对比了在概述的实验条件下393751和CBS814.70株系中葡聚糖酶和甘露聚糖酶的产生。

总之，结果表明：

393751株系是高水平的多种非常重要的酶活性的有效生产者，393751株系是在低成本的诱导物(长豆角和TL/PPL)诱导时产生非常高水平的具有两种关键的解聚半纤维素活性的木聚糖酶和β-1，3；1，4-葡聚糖酶的唯一的踝节菌属emersonii菌株系，在粗制碳源上获得最高的活性水平，从而证明了393751株系是有效的多种酶混合物的成本有效的来源。

实施例14：来自具有用于生物能生产的潜能的踝节菌属emersonii菌IMI393751的嗜热酶

目的是减少已灭菌的富含纤维素的临床废物的生物可降解组分，从而减少废物变成垃圾的体积，回收酶处理后富含糖的液体产品和回收以生物燃料形式存在的能量。

废物流包含高比例的纤维素(>50％)，其主要由纸、印相纸、医疗拭子和富含棉花的绷带和布、原棉等组成。废物流中的主要‘纤维’是纤维素，但许多产品是用多糖包衣、粘合剂以及充填剂‘抛光的’，因此辅助酶(accessory enzyme)(即半纤维素酶、果胶酶和淀粉降解酶)的混合物是增加纤维素的可及性以及提高废物减少或转化成简单的、可溶性的糖(例如葡萄糖、半乳糖、木糖等)所必需的。

实验方法：

确定来源于393751株系的10个嗜热酶混合物的各混合物中的内切水解酶(endohydrolase)和外切糖苷酶的谱(Tuohy & Coughlan 1992；Tuohy等人，1993，1994，2002；Murray等到，2001，2004)。表34概述了选择的混合酶中确定的关键活性的相对水平。在50℃和70℃下，以不同的浓度向100g STG处理的富含纤维素的废物批次中加入酶制剂，并且温育24至48小时(在50至60％的湿度水平下)。如由Tuohy等人，1993，1994，2002；Murray等人，2001，2004，Gilleran(2004)和Braet(2005)所描述的，在48小时内定期取出富含糖的液体的样品(和富含纤维素的材料例如印相纸等)，就(i)重量和体积的减少，(ii)回收的富含糖的液体的体积，(iii)释放的还原糖，(iv)酶处理后底物的物理结构(使用扫描电子显微镜)，(v)通过TLC进行的释放的糖的类型的定性分析，(vi)通过HPLC、GC-MS和ESI-Q-TOF-MS进行的产生的糖的定量分析，(vii)对发酵微生物(生物能量的产生)具有潜在毒性的物质，(viii)水解产物的无菌性，(ix)生物乙醇的产生和(x)生物气的产生对其进行分析。

结果：

A.记录重量和体积的减少、回收的富含糖的液体的体积、酶处理前和后释放的还原糖的重量，对于所有酶制剂估计记录的体积的减少。在图7中举例说明使用相同的反应参数(酶用量，60％的湿度和24小时的反应时间)在50℃下获得的体积减少的数据和还原糖。

简而言之，对于所有混合酶在体积减少方面，在70℃下进行24小时@60％的湿度产生最适结果。在使用6个选择的混合酶(和使用重复试验)的重复研究中，取决于混合酶，体积减少是一致的，在大约60至75％之间(参见图8)。将释放的还原糖转化成存在的纤维素的百分数水解或转化，所述纤维素的水解或转化在存在于初始灭菌的废物中的富含纤维素的级分的66至82％之间。在实验室试验中获得60-75％的体积减少。

每100g批次，加入大约70至100mL加入的水分(H₂O)以使最终的湿度达到50至60％。酶水解后的液体回收体积为69至105mL。也在75至85℃的反应温度下和不同的pH值下完成实验。高于70℃，当与在70℃下获得的值比较时，总的水解中的轻微增加(大约2至5.5％)是明显的，而pH3.5至4.0产生最值的水解水平，值不显著大于(<5％)使用H₂O获得的值。

B.底物完整性的实质损失(Physical loss)、产生的糖产物和各类型糖的相对量。SEM证明纤维素纤维结构的显著消失(图9B)

水解产物：通过TLC定性分析；通过HPLC定量分析

对于7个最适的混合酶，大于76于92％的释放的糖是单糖，该糖主要由葡萄糖和一些半乳糖、甘露糖和木糖组成。例如，糖的水平在0.2至0.55g/mL之内，由HPLC确定的单糖浓度范围如下(取决于嗜热酶混合物和废物批次)：

葡萄糖：43至70％；甘露糖：5至15％；半乳糖：4至10％；木糖：20至30％；纤维素：4至12％和更高的寡糖：5至26％。

C.在发酵前和发酵后筛选对于发酵微生物(生物能量的产生)具有潜在毒性的物质，分析水解产物的无菌性和以及生物乙醇和生物气的产生

回收的液体级分显示对经筛选用于将富含糖的水解产生发酵成生物乙醇的酵母品种没有毒性，即不阻止酿酒酵母(面包酵母)、嗜单宁管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、毕赤酵母(Pichia sp.)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)和马克斯克鲁维酵母(Kluveromyces marxianus)的生长。此外，乙醇产量的分析(使用酶联测定试剂盒)表明酵母产生乙醇。

将琼脂平板(包含适当的琼脂培养基)与富含糖的液体以及残渣废物的样品一起温育，在重组条件(用于微生物)下进行温育，就集落(细菌和酵母)和径向生长(丝状真菌)的存在对其进行分析。在与富含糖的液体和废物样品(来自70℃的酶处理)一起温育的板中没有发生微生物的生长，即不发生废物水解产物的微生物造成的腐败(和糖损失)。

生物乙醇的产生

估计不同的酵母品种例如酿酒酵母、嗜单宁管囊酵母、毕赤酵母、休哈塔假丝酵母和马克斯克鲁维酵母(和菌株)中从富含糖的原料产生的生物乙醇的产量。测量的终点包括酵母生长(和酵母生物质)、糖的利用、产生的CO₂和乙醇的估计。在1L实验室规模的培养中，选择70℃的酶降解物中的两种(由图8中的混合酶5和8产生的水解产物)作为用于通过所有酵母品种进行的生物乙醇生产的受试原料。

图10A和B举例说明了使用酿酒酵母获得的乙醇产生谱。使用两种原料的乙醇产量相似，尽管嗜热酶混合物8在水解产物中产生稍微更多的单糖。然而与由嗜热酶5产生的降解物相比，来自混合酶8的降解物包含更高的戊糖(不通过酿酒酵母发酵)。嗜热酶混合物5降解物包含一些容易被酵母代谢的纤维二糖(和更少量的纤维寡糖)。

表34  许多酵母+富含糖的降解物的组合的结果

 

酵母品种	嗜热酶混合物5的降解物	嗜热酶混合物8的降解物
			酿酒酵母：	9.2g/L 乙醇	9.4g/L 乙醇
嗜单宁管囊酵母	8.5g/L 乙醇	8.8g/L 乙醇
			马克斯克鲁维酵母	9.6g/L 乙醇	8.4g/L 乙醇
A.pullulans	6.7g/L 乙醇	7.4g/L 乙醇
			休哈塔假丝酵母	6.3g/L 乙醇	5.4g/L 乙醇

潜在的有毒的发酵终产物的分析

使用许多技术(HPLC、MS)特别是GC-MS确定潜在有毒的发酵终产物的存在。对于酿酒酵母，除了富含戊糖(木糖、***糖)的降解物，获得几乎完全的糖利用，检测到常见的发酵终产物，即甘油、醋酸盐和一些痕量副产品(溶剂)。

生物气的产生

制备更大批次的混合酶5和8的降解物以为嗜温和嗜热性上流式厌氧污泥床反应器(UAHR)厌氧消解器进料。测量两个反应器的流入液和流出液的总碳水化合物水平(Dubois等人1956；Laboratoryprotocol)。确定存在于流入和流出样品中的还原糖(Tuohy等人，1994)。为了确定化学需氧量(COD)，使用重铬酸钾(浓硫酸，硫酸银作为催化剂)在2个小时内氧化已知体积的水解产物(国际试验方法；实验室方案)。通过用硫酸亚铁铵的标准溶液滴定来确定剩余的重铬酸盐。在整个试验中测量(每日取样)COD和碳水化物的去除效果。使用压力传感器技术分析(Colleran和Pistilli，1994；Coates等人1996)分析淤渣的比产甲烷活性(SMA)。通过废气排出口从淤渣取出淤渣的样品，在37℃(对于嗜温反应器淤渣)或55℃(对于嗜热反应器淤渣)下进行试验。

存在于酶促产物的降解物中的糖被嗜温(37℃)和嗜热(55℃)UAHR中的细菌迅速降，即在非最优化条件下以4.5g COD/m³/天的上样速率的碳水化合物的95至97％的减少。获得的生物气流中的甲烷的水平在55至61％之间，估计的代射所有糖和达到最到甲烷水平所花的滞留时间(天)为大约3.0至4.0在。监测流出液的pH，来自任一反应器的流出液的pH没有显著的变化。

C.用于处理富含纤维素的临床废物流的嗜热酶***的最优化

基因组学和功能蛋白组学的组合用于鉴定最适的生长条件和使用的底物(基于来自用于初始实验中的10种混合酶的信息)，从而获得所有关键酶组分具有最适水平的酶混合物。选择两种诱导物组合：1:1的失效的茶叶和废纸板的混合物以及1:1的高粱和未糖蜜化的甜菜浆的混合物。也制备来自上面使用的10种混合酶的选择的混合酶的另外的混合物。在酶组分和它们催化商业纤维素、半纤维素和已灭菌的富含纤维素的废物至简单的可发酵糖的充分转化的能力方面表征新型混合酶和混合物。确定用于最大酶反应性的最适pH和温度、最优化的酶***和混合的混合酶的热稳定性以及由反应终产物、单糖或潜在的毒性分子(酚类化合物/苯的衍生物)导致的潜在抑制。

最适温度：75至80℃，取决于酶制剂/混合物，在85℃下保持大于70至85％的活性(在90至95℃仍检测到酶活性)。

热稳定性：在50℃下在24小时后没有活性的真实损失，在相同的温度下在1周后损失少于5至10％的活性。

在70℃下，在第一个24小时后，损失小于2至20％的活性，此后在5天的时间内进一步损失小于10％的活性。

最适pH：尽管酶在pH4对5之间最具活性，但在pH3.0和pH6.8观察到大于60％的活性，所有酶在pH7.0仍展示活性。酶制剂在pH3.5至6.0之间(4至50℃，在1周的时间内)最稳定。

尽管当存在高浓度的葡萄糖和其他单糖时反应/底物转化成单糖的速率减少或达到平台，但酶制剂在高浓度在高浓度(达到100mM)的单糖(葡萄糖、木糖、***糖、半乳糖)存在的情况下仍然非常中活跃。此外，尽管酚类化合物/苯衍生物减少混合酶的总体活性，但试验中所使用的浓度显著大于废物中潜在存在的高。然而，在这些化合物存在的情况下，某些混合酶和最优化的酶混合物展示显著的活性(大于50至70％)。

总体上，获得大约65至75％的水解值所需的各酶的浓度令人吃惊地低(9至16个纤维素酶单位/10g废物)，尽管是混合酶/混合物依赖性的，但更高的剂量(达到60个纤维素酶单位)不显著增加终水解程度。酶处理至100和10Kg批次的扩大产生相似的终水解程度以及糖产物的相似谱和浓度。获得的最优化混合酶的最好体积减少是73至80％，而相应的纤维质级分转化成单糖的百分数水解值是72至81％。两种最优化的混合物在体积减少和纤维素水解方面产生相似的终点。对于酿酒酵母获得的乙醇是195至210L/公吨，对于嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus)是215-220L/公吨。通过蒸馏可回收大约80至85％的生物乙醇，但这可以提高。

实施例15：来自踝节菌属emersonii菌IMI393751的用于从富含纤维素的纸和印相纸废物产生富含糖的原料的嗜热酶

酶活性的测量：

就多种不同的木质纤维素水解酶活生分析粗制的酶制剂，对于内切作用的酶使用10至30mg/mL浓度伯相关底物，对于‘滤纸酶(filterpaperase)’(通常纤维素)使用50mg滤纸/mL反应体积或使用1mM的适当的4-硝基苯基-糖苷衍生物(Tuohy等人，2002；Murray等人，2001)。

以一式三份重复进行测定。所有结果代表使用不同粗制的酶制剂的两个相同的实验。

活性和稳定性所需的pH和温度：

酶活性和稳定性所需的pH和温度估计在2.6至7.6的pH范围内，和在30至90℃的温度范围内，使用常用的测定方法。

模型尺度的水解研究：

在适当的pH和反应温度下，将包含5至60FPU(或2至20个木聚糖酶单位，视情况而定)的个别酶的等分与1g靶底物一起温育，进行24小时。按时间间隔取出样品，分析糖含量(还原糖)和组成。

被检查的富含纤维素的底物：混合的面巾纸和便纸(lavatorypaper)或办公用纸废物、牛皮纸、混合的新闻用纸。

结果概述：嗜热酶混合物在广谱的碳水化合物底物上展示高度的活性，从而反映了踝节菌属emersonii菌IMI393751中酶产生的复杂性和效率。特定的嗜热酶的产生反映了诱导性底物的组成和变化(表35)。

MGBG 2，来源于在1:1的失效的茶叶/纸板的混合物上生长108小时的踝节菌属emersonii菌培养物；MGBG 3，来源于在1:1的高粱/甜菜浆的混合物上生长120小时的踝节菌属emersonii菌培养物；MGBG 4，来源于在1:1的小麦麸/甜菜浆的混合物上生长120小时的踝节菌属emersonii菌培养物；MGBG 5，来源于在1:1的纸板/甜菜浆的混合物上生长120小时的踝节菌属emersonii菌培养物；MGBG 6，来源于在(2:1:1)的牛皮纸/纸板/甜菜浆的混合物上生长120小时的踝节菌属emersonii菌培养物；MGBG 7，来源于在1:1的黑麦片/小麦麸的混合物上生长120小时的踝节菌属emersonii菌培养物；MGBG8，来源于在1:1的甜菜浆/失效的茶叶的混合物上生长120小时的踝节菌属emersonii菌培养物。

嗜热酶混合物中的纤维素酶在pH4.0(图11A)附近和70℃与80℃(图12)之间活性最高。各酶制剂中的纤维素酶组分在宽广的pH范围(小于pH2.6至大于pH6.5)内具有活性。存在于相同混合酶中的木聚糖酶活性在pH4.0至5.0(图11B)和75至85℃之间(图13)活性最高。然而，混合酶中的木聚糖酶活性在宽广的pH范围(少于pH-2.6至大于pH7.0)内具有活性，同时在90℃和50℃下观察到相似的活性水平。

几种MGBG混合酶(cocktails)(表35中所列的)的热稳定性反映在50℃和70℃下的长半衰期值，即在50℃下只在缓冲液(pH5.0)中温育后内切木聚糖酶或内切纤维素酶活性没有有效损失或损失最少。所有混合酶是粗制的酶制剂且未加入稳定剂或增强剂。存在于混合酶2、5、6和8中的木聚糖酶活性在70℃下特别稳定(在25小时后只有大约小于2至20％的木聚糖酶活性损失)。例如，70℃下混合酶I的t_1/2超过6天。由于高水平的eqolisin蛋白酶的存在，混合酶3和4和至更低程度的混合酶7在70℃下的稳定性更低(2小时、12小时和25小时的t_1/2值)。在底物(即粗制废物)存在的情况下，所有这三种混合酶的稳定性显著更高即(22小时、46小时和72小时的t_1/2值)。MGBG混合酶对纤维素和半纤维素底物的一般性能非常高(表36)。随着反应温度从50℃增加至70℃(表37)水解的水平显著增加。在更高的反应温度(例如70℃)下，在18小时内获得百分数水解，该百分数水解与50℃(表37)下24小时后获得的百分数水解相似，和某些情况下大于其。该发现突显了与来自嗜温生物的酶(该酶在更低的温度下具有活性)相比嗜热酶的有利方面。

表36：富含纤维素的材料的百分数水解

表37：富含纤维素的面巾纸的百分数降解

 

	MGBG2	MGBG3	MGBG4	MGBG5	MGBG6	MGBG7	MGBG8
								在50℃下24小时后	70	87	51	79	80	66	71
在70℃下18小时后	68	89	68	66	74	61	67

通过TLC分析的纤维素和半纤维素的时程水解的产物已确认了MGBG嗜热酶的高转化效率。多糖底物最初降解为寡糖，最终降解成葡萄糖，所述葡萄糖几乎是水解的唯一产物，存在于富含纤维素的废物例如面巾纸中的纤维素类似地几乎完全水解成葡萄糖。

用于基于生物乙醇的工业的这些结果的含意是有意义的且表现踝节菌属emersonii菌的嗜热酶***的潜能。

实施例16：甜菜浆至用于生物乙醇生产的富含糖的水解产物的生物转化

从最初的20个混合酶的范围选择8个嗜热酶混合物。确定来源于393751株系的8个嗜热酶混合物中的每一个混合物中的内切水解酶和外切糖苷酶的谱(Tuohy & Coughlan，1992，Tuohy等人，1993，1994，2002；Murray等人，2001，2004)。

将酶制剂以不同的浓度或剂量与1g使用不同的提取法制备的甜菜级分混合。级分如下：

A.甜菜顶部和茎(1g干重/10ml总体积)

B.甜菜浆(1g干重/10ml总体积)

C.甜菜果实(1g干重)

D.甜菜果皮(1g干重)

在韦林搅切器(2 x 30秒破裂)中匀浆甜菜级分A-D。向10ml(使用自来水，pH7.2)的终总反应体积中加入酶的等分即2ml和5ml的酶溶液(1-8)，并且在63℃下进行初步温育。进行进一步实验以最优化反应温度(75℃)、pH(pH4.0)，和减少温育时间(16小时)。在16至48小时的温育中按时间间隔采集样品，对样品进行离心，通过在100℃下煮沸10分钟来终止酶反应。变释放的还原糖分析上清液级分。

通过TLC对释放的糖的类型进行定性分析，通过HPLC对产生的糖进行定量分析。就生物乙醇的产量评估富含糖的原料(Tuohy等到，1993，1994，2002；Murray等到，2001，2004；Gilleran，2004；Braet，2005)。

结果：

最适反应条件是75℃否pH4.0。表38提供了在最适条件下16小时后释放的还源糖。在果皮和果实级分的情况下，使温育增加至48小时增加了百分数水解。酶用量条件的最优化使得温育时间能够减少一半(即24小时)，产量显示于表39中。

表38：在75℃下16小时后存在的碳水化合物的百分数水解

表39：在使用最优化的酶用量的情况下，在75℃下24小时后存在的碳水化合物的百分数水解

使用基因组学和功能蛋白组学的组合(基于来自最初的实验中所使用的8个混合酶的信息)发展和最优化进行水解的酶混合物。产生两个混合酶，标记的MGBG SB#1和MGBG SB#2。将通过两个最优化的混合酶进行的总的甜菜植物和总的果实组分的水解与来自之前的实验的混合酶3和5进行比较。在对于两个新型混合酶的最适条件即71℃和pH4.5下进行反应。表40给出了各反应中包含的酶的相对水平/g底物(即总的甜菜植物或总的果实组分)。表41和42概述了获得的水解结果。

表40：每g甜菜底物的酶用量

 

活性	混合酶3	混合酶5	MGBG SB#1	MGBG SB#2
					木聚糖酶	4.8	4.98	0.68	0.20
纤维素(FP酶)	1.64	1.12	0.12	1.22
					果胶酶	0.96	2.26	0.30	0.56

最优化的混合酶与混合酶3和5之间的主要差异在于关键活性特别是外切糖苷酶的相对量。

表41：24小时后基于释放的还原糖(71℃，pH4.5)的百分数水解

表42：相应于葡萄糖的释放的总糖的百分数

两种新型混合酶从完整的植物的匀浆释放高水平的还原糖。在释放的还原糖中大约88至90％是单糖，大约43至67％的所述单糖是葡萄糖。

发酵成生物乙醇

进行研究以调查生物从完整的植物和甜菜的水解产物产生生物乙醇。酿酒酵母将90％多的存在于完整的植物水解产物中的葡萄糖转化成生物乙醇(从40g/L可发酵糖获得大约9.0g/L的乙醇)。就生物乙醇的产量(好气条件)调查其他酵母品种例如嗜单宁管囊酵母。后一种酵母利用在重复的发酵(超过92至95％的代谢)中释放的葡萄糖和戊糖(木糖和***糖)。然而，乙醇产量比使用酿酒酵母稍低((从40g/L可发酵糖获得大约6.7g/L乙醇)。

新型混合酶的选择的生物化学性质

最适温度：75至80℃，取决于混合酶，在85℃下保持大于75至87％的活性。

热稳定性：在50℃下24小时后无活性的真实损失，在50℃下3周后小于10％的活性损失。在71℃下，在最初的24小时内大约4至9％的活性损失，在5天的时间内小于5至7％的活性进一步损失。

最适pH和稳定性：尽管两个混合酶在pH4.5的活性最高，但在pH<2.6时观察到超过55％的活性和在pH6.8下观察到超过50至60％的活性；两种酶在pH7.0展示显著(超过48至58％)的活性。酶制剂在pH3.5至6.0(4至50℃，在一个月内)之前最稳定。

实施例17：由踝节菌属emersonii菌IMI393751产生的新型双功能木聚糖酶的鉴定和选择的性质

当在适当的碳源上生长时，踝节菌属emersonii菌分泌14至20种不同的内切木聚糖酶组分。这些内切木聚糖酶中的13种已纯化至均一且在催化性质方面对其进行表征。纯化的内切木聚糖酶的分子量在30-130kDa之间变化。木聚糖酶和葡聚糖酶的表达在10个踝节菌属emersonii菌株系(在相同的条件下在相同的培养基和碳诱导物上生长的)之间是不相等的。已鉴定了新分子量的木聚糖酶，来自木聚糖降解***踝节菌属emersonii菌IMI393751株系的Xyn XII(17.5kDa)。对于许多其他细菌和真菌种类已报导了具有低于或等于20kDa的M_r值的木聚糖酶的分泌，但在此之前对于踝节菌属emersonii菌未报导过该现象。

酶的纯化和表征

在45℃下以210rpm(或可选择地在固态(静态)发酵中进行11天，33％的底物：67％的湿度；45℃)在1:1的小麦麸皮和甜菜浆的混合物上培养踝节菌属emersonii菌IMI393751，进行120小时。如之前所描述的(Tuohy & Coughlan，1992；Tuohy等人，1993，1994；Murray等人，2001)分析粗制酶样品和分级分离的酶样品的木聚糖酶和蛋白质含量。如之前所描述的(Tuohy & Coughlan，1992)收获粗制的酶提取物。将使用配备有H1P 10-43中空纤维透析仪的Amicon DC2***的超滤用于将新型木聚糖酶(渗透部分)与更高分子量的木聚糖酶(滞留物)分离。使用分级分离技术的组合将Xyn XII纯化至均一，所述分级分离技术的组合包括使用(NH₄)₂SO₄(0至90％的截断)的‘盐析’或沉淀，在Sephacryl S-200SF(100mM NaOAc缓冲液，pH5.0作为洗脱剂)上进行的凝胶渗透层析(GPC)，在Whatman DE-52(用30mM NaOAc缓冲液，pH5.0平衡的；通过线性缓冲的0.0至0.3M的NaCl梯度洗脱木聚糖)上进行的离子交换层析(IEC)，然后在Phenyl SepharoseCL-4B(用15％的30mM NaOc，pH5.0中的(NH₄)₂SO₄平衡的)上进行疏水作用层析(HIC)。在HIC之前，用(NH₄)₂SO₄将木聚糖酶样品‘盐渍’至15％(w/v)的终浓度。通过将样品用于Sephadex G-25(此处未显示)除去缓冲盐和(NH₄)₂SO₄。最后，通过在pH7.0下用于DE-52的第二离子交换柱，然后在Sephacryl S-100HR(100mM NaOAc缓冲液，pH5.0用作平衡和冲洗缓冲液)上进行凝胶渗透层析，最后在用50mMNH₄OAc缓冲液，pH5.5(0.0至0.2M NaCl梯度用于洗脱木聚糖酶)预平衡的DEAE-Sepharose上进行分级分离步骤来分级分离富含木聚糖酶的级分。通过用于Sephadex G-25或BioGel P-6除去混合酶的盐分并且在电泳分析之前将其冷冻干燥。

新型双功能木聚糖酶的选择的性质

选择的理化性质

按照Laemmli的方法，通过在15％的(丙烯酰胺/双-丙烯酰胺)凝胶中进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来确认新酶的纯度。通过银染，SDS-PAGE显示相应于估计的17.5kDa的Mr的单个蛋白质条带。此外，通过IEF，获得相应于Xyn XII的pH5.0的pI值的单个蛋白质条带。Xyn XII催化的OSX的降解的最适温度确定为75℃，活性的最适pH确定为pH4.0至4.5。然而，与在pH3.0下10分钟的温育期期间损失25至81％的各自初始活性的Xyn I至XI不同，Xyn XII具有显著的酸稳定性，甚至在pH3.0下长时间的温育中保持超过91％的其初始活性。

选择的催化性质

将适当稀释的Xyn XII的等分与多种多糖(包括不同的木聚糖、β-葡聚糖、果胶聚合物和果聚糖(全部以1.0％(w/v)的浓度存在)一起温育。如上所述定量在延长的30分钟温育期期间释放的还原糖。使用微阵列法(Murray等到，2001)确定针对芳基-糖苷(1.0mM)的活性。通过在常用的测定条件下，使底物木聚糖的浓度在0.2至25mg/ml之间变化来进行确定动力学常数的实步研究。

示于图14中的结果说明针对不同木聚糖的新型木聚糖酶(XynXII)的相对活性。该酶对于来自红藻掌状红皮藻(Palmaria palmata)称为rhodymenan的混合连接、未取代的木聚糖(1，3；1，4-β-D-木聚糖)(称为rhodymenan)最具活性。相反地，在两种谷类***木聚糖即OSX和WSX中，酶展示最大的针对更多取代的WSX的活性。反应性的所有模式是：RM>WSX>LWX>OSX>BWX。如图15A至G所显示的，许多其他木聚糖酶(Xyn IV至Xyn XI)的底物偏爱性与Xyn XII完全不同。

对于Xyn IV，OSX>RM>WSX>LWX>>>BWX(图15A)。与Xyn VI的反应性的顺序是OSX>LWX>RM≥BWX>WSX(图15B)，然而由Xyn VII展示的该顺序是RM>LWX>WSX≥BWX>OSX(图15C)。Xyn VIII的反应性是RM>BWX>WSX>LWX>OSX(图15D)，Xyn IX是RM>LWX>BWX≥OSX>WSX(图15E)。最后，Xyn X展示下列偏爱性RM>>BWX～WSX>OSX>>>LWX(图15F)以及Xyn XI RM≥LWX>WSX>BWX≥OSX(图15G)。

此外，与为严格的只针对木聚糖的活性的Xyn I-XI不同，新型双功能木聚糖酶(Xyn XII)展示针对来自大麦的混合连接的β-葡聚糖(1，3；1，4-β-D-葡聚糖)的显著的活性，即相对于使用OSX(常用的测定底物)(图16)观察到的活性超过55％的活性。与Xyn I-XI相反，新型双功能木聚糖酶展示针对芳基-β-木糖苷4-硝基苯基β-D-木糖苷(4NPX)和氯硝基苯基β-D-木糖苷(CNPX)的活性，针对后一种底物(图17)具有更大的活性。该发现可反映氯部分的吸电子效应(electron-withdrawing effect)，从而使氯硝基苯基成为更好的‘离去基团’。然而，来自踝节菌属emersonii菌的CBS814.70株系的其他新型内切木聚糖醋(Tuohy等人，1993；也由株系IMI393751产生，虽然是差异表达的)具有显著的针对CNPX的活性且针对4NPX展示极小的活性或没有活性。该现象反映了这些酶的部分‘外切’作用特征，还可反映对于Xyn XII的相似特征。此外，观察到针对4NPβ-葡糖苷和CNP-β-纤维二糖糖苷的低活性，这并不出人意料之外，因为Xyn XII具有针对1，3；1，4-β-D-葡聚糖的活性，如果其具有一些外切作用性质(如对于芳基β-木糖苷所观察到的)，预期其可能具有相应的针对芳基β-葡萄)糖苷的活性。未观察到针对其他α或β-连接的芳基糖苷的反应性。

因此，“在体内”，该新型双功能木聚糖酶通过例如在谷类和其他植物、植物残渣和废物中降解混合连接的葡聚糖，可对踝节菌属emersonii菌IMI393751接近植物细胞壁半纤维素起着非常重要的作用。

实施例18：通过踝节菌属emersonii菌株系进行的关键水解酶和其他辅助酶的表达

关键酶在相同的碳源上的表达是不同的

由踝节菌属emersonii菌IMI393751和其他株系产生的木聚糖的数目、类型和相对丰度是不同的。如早期所显示的，培养物滤液中的酶的水平显著不同，暗示着踝节菌属emersonii菌株系产生不同水平的相同木聚糖酶或表达不同的同种型。为了说明这一占，在凝胶SDS-PAGE电泳(如由Tuohy & Coughlan(1992)所述的复性)和IEF之后使用IMI393751和CBS549.92株系培养物滤液进行的酶谱染色。这些研究确认了(i)表达不同的木聚糖酶和(ii)表达的木聚糖同种型的数目显著不同。如下概述获得的聚糖酶在caroo上表达的结果：

检测的木聚糖酶的同种型(关于同种型-pI和M_r，参见Tuohy等人，(1994))

IMI393751：Xyn IV、Xyn V、Xyn VI、Xyn IX和Xyn XI、Xy1 I(β-木糖苷酶)和Xy1 II

CBS549.92：Xyn II、Xyn VII(注意：Xyn VII与早先专利(GenBank登录号AX403831)中公布的序列相同)和非常少量的Xy1 I(β-木糖苷酶)。

此外，IMI393751是在茶叶/纸板上(和只在茶叶上)生长期间产生Xyn XII的唯一株系。

不同碳源上的表达模式是不同的

不同碳源上的木聚糖酶表达的模式是不等同的，即

IMI393751：

葡萄糖作为碳源：Xyn I、Xyn VIII，更少量的Xyn XI，无β-木糖苷酶

长豆角：Xyn IV、Xyn V、Xyn VI、Xyn IX和Xyn XI、XyI l(β-木糖苷酶)和Xy1 II

TL/PPL：Xyn III、Xyn V、Xyn IX、Xyn X、Xyn XII、Xy1 I和Xy1 II

CBS549.92：

葡萄糖：低水平的可与Xyn IV相等的组分，无β-木糖苷酶

长豆角：Xyn II、Xyn VII和非常少量的Xy1 I(β-木糖苷酶)。

TL/PPL：与Xyn I、Xyn VII和Xyn IX相似的蛋白质，一些Xy1 I

此外，观察到表达中的差异的其他明显的实例，例如Xy1 I的表达。在葡萄糖上生长期间，IMI393751、CBS549.92、CBS180.68、CBS393.64、CBS394.64或CBS397.64不表达Xy1 I。相反地，在相同的条件下，Xy1 I由CBS355.92、CBS395.64、CBS472.92和CBS759.71表达。

相似地在长豆角上，Xy1 I由除了CBS394.64外的所有株系表达(虽然以显著不同的水平)。在TL/PPL上生长期间，Xy1 I也由除了CBS180.68和CBS394.64外的所有株系表达。当OSX作为碳源时，Xy1I不由CBS180.68和CBS394.64表达，但由CBS393.64(低水平)和所有其他株系表达。Xy1 I的表达水平和表达模式的总体显著差异在所有诱导性底物之间是显著的(即表达最大量或最小量的Xy1 I的株系)。

由不同株系产生的同源物的特异性活性的差异。

在上述关键木聚糖酶的表达方面比较不同的株系。然而，此外，将存在于IMI393751和CBS549.92的诱导的培养物中的木聚糖酶分开，比较纯化的木聚糖酶组分的特异性活性。在第一种情况下，只有IMI393751显示产生Xyn XII。此外，当比较特异性活性(OSX作为测定底物的结果示于下面)时，清楚地观察到个体酶的特异性活性的一些差异(图18)。

在不同的碳源上生长期间踝节菌属emersonii菌IMI393751中新组分的产生

在多种碳源上培养踝节菌属emersonii菌IMI393751，如上所述，通过使SDS-PAGE和IEF复性，然后进行酶谱染色对其进行表征。下面是一些获得的结果的样品：

(i)茶叶作为诱导物：Xyn III、Xyn V、Xyn IX、一些Xyn X和Xyn XII；Xy1 I和Xy1 II

(ii)长豆角：Xyn IV、Xyn V、Xyn VI、Xyn IX和Xyn XI、Xy1I(β-木糖苷酶)和Xy1 II

(iii)黑麦片：Xyn IV、Xyn V、Xyn VI、Xyn IX，pI 6.5的额外的新‘木聚糖酶’组分；Xy1 I(β-木糖苷酶)和Xy1 II

(iv)零售面粉(Retail flour)：Xyn III、Xyn VI、Xyn VIII、Xyn IX、Xyn X、Xy1 I(β-木糖苷酶)和Xy1 II，pI 5.8的额外的新‘木聚糖酶’组分

(v)高梁：Xyn I、Xyn VIII、Xyn IX、Xyn X、Xyn XI、一些Xy1 I(β-木糖苷酶)和Xy1 II

(vi)木糖：Xyn I和Xyn VIII、Xy1 I

(vii)葡萄糖：Xyn I、Xyn VIII、更少量的Xyn XI，无β-木糖苷酶

实施例19：踝节菌属emersonii菌株系中其他辅助酶的差异表达

谷胱甘肽过氧化物酶

将培养物滤液样品(未浓缩的和浓缩的样品)在7.5％的天然PAGE凝胶上进行电泳，在50℃于还原型谷胱甘肽中浸渍，然后与0.002％的H₂O₂一起温育。然后用1％的氯化铁/1％的铁***对凝胶染色。也通过对培养物滤液进行酶测定来与补充酶谱染色。

IMI393751产生细胞外谷胱甘肽过氧化物酶(Mr大约45kDa)，对于许多碳诱导物(号码1至18代表不同的诱导物)观察到差异表达。相反地，对于任何一种其他踝节菌属emersonii菌株系，甚至在浓缩的样品中，未观察到细胞外活性。株系IMI393751在TL/PPL上生长期间也产生显著水平的细胞外谷胱甘肽过氧化物酶。

过氧化氢酶

将培养物滤液样品(未浓缩的和浓缩的样品)在7.5％的天然PAGE凝胶上进行电泳，然后与3％的H₂O₂一起温育。然后用1％的氯化铁/1％的铁***对凝胶染色(过氧化氢酶条带显现为黄色条带)。也通过使用标准的公布的方法对培养物滤液进行酶测定来与补充酶谱染色。

IMI393751产生细胞外过氧化氢酶(M_r大约230kDa)，对于许多碳诱导物(号码1至18代表不同的诱导物)观察到差异表达。相反地，对于任何一种其他踝节菌属emersonii菌株系，甚至在浓缩的样品中，未观察到细胞外活性。

IMI393751的培养物滤液中这些酶活性的存在在影响底物的结构中具有潜在的重要性，而且还在除去可能氧化关键的水解酶活性例如木聚糖酶或葡聚糖酶的任何化合物中具有潜在的重要性。

实施例20：不同固体(琼脂)培养基上10个踝节菌属emersonii菌株系的表型的比较

B.琼脂培养基

1.萨布罗右旋糖琼脂(Oxoid Ltd.，UK)

2.马铃薯麦芽糖琼脂(Oxoid Ltd.，UK)

3.Czapek Dox(Oxoid Ltd.，UK；pH未调整)

4.Cornmeal Agar(Oxoid Ltd.，UK)

5.麦芽浸出液琼脂(Oxoid Ltd.，UK)

6.营养琼脂(Difco Ltd.，UK)

7.爱默生琼脂(酵母钾可溶性淀粉；YpSs)

向1L蒸馏H₂O中加入下列组分：

15.0g可溶性淀粉(Sigma-Aldrich，Dublin，Ireland)

4.0g酵母提取物(Oxoid Ltd.，UK)

1.0g磷酸二氢钾(KH₂PU₄)

0.5g硫酸镁七水合物(MgSO_4·7H₂O)

20.0g琼脂1号(Oxoid Ltd.，UK)

8.酵母葡萄糖琼脂(YGA)

向1L蒸馏水中加入下列成分：

20.0g葡萄糖(Sigma-Aldrich，Dublin，Ireland)

10.0g酵母提取物(Oxoid Ltd.，UK)

15.0g琼脂1号(Oxoid Ltd.，UK)

用10个不同的踝节菌属emersonii菌株系接种琼脂板(每一种类型的琼脂)。一批板在45℃下温育，第二批在55℃下温育(空气的湿度为大约20至30％)下温育。每天检查培养物，记录下列结果：

(a)培养物直径的测定(使用测径器)

(b)使用7.0M像素的数码相机进行照片记录

(c)可见的表型变化/差异的记录

(d)孢子形成(显微镜分析)或其他的显示

结果：

踝节菌属emersonii菌株系在不同琼脂培养基上的培养显示了393751株系和其他9个株系之间在下列方面的明显的差异：

表43和44：在45℃下生长的速率和程度的概述-在第2和第5天进行的培养物直径测量。

表45：在55℃下生长的速度-在第5天进行的培养物直径的测量

表46：可见的表型变化和孢子形成的证据的概述

重要观察1：许多IMI/CBS株系产生多种颜色的培养物。然而，验证这些培养物的纯度。产生的颜色/色素和产生的模式代表许多种类的青霉菌，例如嗜松青霉(P.pinophilum)。

重要观察2：如表20中所指出的，在393751株系与其他株系之间在孢子形成方面存在显著的差异。

富含纤维素的灭菌临床废料

临床废料的发热量是～14GJ/公吨。在本表格中，其包括～50-55％富含纤维质的材料，其与废料流中存在的塑料相比，有高水结合能力以及低生热值。使用本发明的耐热酶混合物、例如混合物5和8处理这种废料中的富含纤维素的成分，可以降低～73-81％的废料体积、转化存在的纤维素(79％-84％)并且产生～2.25-2.61GJ/公吨(生热值)。在塑料中富含的残余物可用作潜在生热值至多为34-38GJ/公吨的“分类的”衍生于废料的燃料。

市政固体废料的有机成分

市政固体废料的有机成分的发热量是～9.2-10.2GJ/公吨。在本表格中，其包括～50-65％富含碳水化合物的材料(主要来自食物和纸废料)，其与其它成分，例如废料流中存在的聚苯乙烯、塑料和橡胶相比，有高水结合能力以及低生热值。用本发明的耐热酶混合物处理这种废料中的富含纤维素的成分，可以降低～50-70％的废料体积、转化存在的碳水化合物(71％-91％)并且产生～3.8-7.8GJ/公吨(生热值)。在非生物降解成分(例如，聚苯乙烯、塑料和橡胶)中富含的残余物可用作潜在生热值至多为26-38GJ/公吨的“分类的”衍生于废料的燃料。

因此，在焚化前可以处理市政废料和其它形式的废料。通过这样处理这种原料，可以减少、增加或改变它们的生热值。因此，当处理产生被收集的或移除的液体糖蜡或leechate时，可能减少生热值。生热值的改变可便于这种原料的焚化：例如，通过减少生热值至“设定”水平，使控制焚化过程更容易；通过增加生热值(即，对在处理的原料中作为简单糖存在的糖的处理)，可增加生热值，其意味着减少焚化本身需要的能量的量。例如，通过将富含纤维素的临床废料流转化为简单的糖并移除这些，由于其主要含有塑料、某些金属等，残余物的生热值可以是非常低。将纸废料中的络合物酶转化为简单糖以及简单糖的恢复将显著降低废料的生热值-残余物依然有生热值，但其更低了(并且将非常取决于木素含量)。

因此，本发明的另一方面提供了，通过使用本发明的踝节菌属emer sonii菌或本发明的酶或酶组合物处理废料流，改变废料流的生热值的方法。

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Claims (84)

1.踝节菌属emersonii菌的嗜热株系，该株系具有30至90℃的生长温度范围，其在高于55℃下活跃地分泌酶。

2.权利要求1中所述的具有保藏号IMI 393751的踝节菌属emersonii菌的株系或也编码热稳定性酶的其突变体。

3.由权利要求1或2中所述的株系产生的酶，其在高于55℃的温度下保持活性。

4.权利要求3中所述的酶，其选自碳水化合物转化酶、蛋白水解酶、氧化酶和氧化还原酶。

5.包含纤维二糖水解酶I或纤维二糖水解酶II或其混合物、β-葡糖苷酶1、木聚糖酶和内切-β-(1，3)4-葡聚糖酶的酶组合物。

6.权利要求5中所述的酶组合物，其中酶是权利要求3中所述的酶。

7.权利要求5或6中所述的酶组合物，其中组合物包含0.5至90％的纤维二糖水解酶I或纤维二糖水解酶II或其混合物、0.1至33％的β-葡糖苷酶1、0.6至89％的木聚糖酶和0.4至68％的内切-β-(1，3)4-葡聚糖酶。

8.权利要求5对7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(10-30％)、CBH II(10-15％)、β-(1，3)4-葡聚糖酶(20-45％)、β-葡糖苷酶(2-15％)和木聚糖酶(18-55％)。

9.权利要求8中所述的酶组合物，其还可包含一种或多种下列物质：β-木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、外切木聚糖酶、α-L-***呋喃糖酶、果胶分解酶、半纤维素酶、淀粉修饰活性、氧化还原酶/氧化酶以及酯酶和蛋白酶。

10.权利要求7或8中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：0.1-20.0％的β-木糖苷酶、0.1-10.0％的α-糖苷酸酶，1-15％的外切木聚糖酶、0.1-5.0％的α-L-***呋喃糖酶、2-25％的果胶分解酶、5-10％的半纤维素酶、5-10％的淀粉修饰活性、1-10％的氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及7-25％的蛋白酶。

11.权利要求9或10中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系用于植物或植物来源的材料或废物流包括医院废物的生物转化的用途。

12.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(1-25％)、CBH II(1-28％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(18-40％)、β-葡糖苷酶(2-30％)、木聚糖酶(15-55％)和β-木糖苷酶(0.7-20％)。

13.权利要求12中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡糖苷酸酶(1-10％)、α-L-***呋喃糖酶(0.1-5.0％)、1-15％的外切木聚糖酶、5-25％的果胶分解酶、2-12％的淀粉修饰活性、2-11％的半纤维素酶、1-15％的氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及2-15％的蛋白酶。

14.权利要求12或13中所述的酶组合物、权利要求1或2中所述的微生物株系在从植物残渣生产富含单糖的原料中的用途。

15.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBH I(12-55％)、CBH II(15-30％)、β(1，3)4-木糖苷酶(12-26％)、β-葡糖苷酶(5-12％)、木聚糖酶(5-30％)、β-木糖苷酶(0.1-10％)和α-L-***呋喃糖酶(0.5-3.0％)。

16.权利要求15中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡糖苷酸酶、5-15％：其他水解酶包括果胶分解酶、酚酸和乙酰基(木聚糖)酯酶蛋白酶和木质素修饰氧化酶活性、蛋白酶和氧化酶。

17.权利要求15或16中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系在处理和回收利用木材、纸产品和纸中的用途。

18.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(15-30％)、CBH II(10-40％)、β(1，3)4-木糖苷酶(15-40％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(15-30％)和1-8％的β-木糖苷酶。

19.权利要求18中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：外切木聚糖酶；α-葡萄糖醛酸苷酶；α-L-***呋喃糖酶；果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶；淀粉修饰活性；其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶；氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。

20.权利要求18或19中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系在纺织品处理和回收利用中的用途。

21.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(5-55％)、CBH II(8-50％)、β(1，3)4-木糖苷酶(10-30％)、β-葡糖苷酶(0.5-30％)、木聚糖酶(5-30％)和β-木糖苷酶(0.1-10％)。

22.权利要求21中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-L-***呋喃糖酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、其他水解酶，包括选择的果胶分解酶、酯酶、蛋白酶和氧化酶。

23.权利要求21或22中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系在废纸糖化中的用途。

24.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(2-10％)、CBH II(2-10％)、β(1，3)4-木糖苷酶(10-45％)、β-葡糖苷酶(5-10％)和木聚糖酶(1-30％)。

25.权利要求24中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：N-乙酰葡糖胺糖苷酶；壳多糖酶；β(1，3)6-葡聚糖酶；β-木糖苷酶；α-葡萄糖醛酸苷酶；α-L-***呋喃糖酶；果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶；淀粉修饰活性；其他半纤维素酶，包含半乳糖苷酶；氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。

26.权利要求24或25任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系在抗真菌、生物控制和粘土控制中的用途。

27.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(1-20％)、CBH II(1-28％)、β(1，3)4-木糖苷酶(15-40％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(18-55％)、β-木糖苷酶(0.1-10％)和α-L-***呋喃糖酶(0.5-5.0％)。

28.权利要求27中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶；淀粉修饰活性；其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶；氧化还原酶/氧化酶和酯酶；蛋白酶；外切木聚糖酶；其他水解酶，包括果胶分解酶、酚酸和乙酰基(木聚糖)酯酶；蛋白酶以及木质素修饰氧化酶活性。

29.权利要求27或28任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系用于园艺应用的用途。

30.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(5-30％)、CBH II(1-15％)、β(1，3)4-木糖苷酶(10-40％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(18-48％)、0.1-20％的β-木糖苷酶、1-10％的α-葡糖苷酸酶和0.1-5.0％的α-L-***呋喃糖酶。

31.权利要求30中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：外切木聚糖酶；果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶；淀粉修饰活性；其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶；氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。

32.权利要求31或32任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于提高基于谷类的饲料的消化率的动物饲料的生产。

33.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(0.5-10％)、CBH II(0.5-10％)、β(1，3)4-木糖苷酶(15-43％)、β-葡糖苷酶(2-10％)、木聚糖酶(30-88％)、0.1-2.0％的β-木糖苷酶、0.1-3.0％的α-葡糖苷酸酶、0.1-4.0％的α-L-***呋喃糖酶。

34.权利要求33中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：果胶分解酶、淀粉修饰活性、氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。

35.权利要求33或34任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于生产用于单胃动物的基于低戊糖含量的谷类的、具有提高的消化率和低非纤维质β-葡聚糖含量的饲料。

36.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBH I(3-15％)、CBH II(3-15％)、(1，3)4-葡聚糖酶(25-45％)、α-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(18-55％)、0.5-7.0％的β-木糖苷酶、0.5-10％的α-葡萄糖醛酸苷酶和0.1-5.0％的α-L-***呋喃糖酶。

37.权利要求36中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：外切木聚糖酶；果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶；淀粉修饰活性；其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶；氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。

38.权利要求36或37任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于生产具有用于兽医保健的生物活性潜能的功能性饲料。

39.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(1-15％)、CBH II(1-15％)、β(1，3)4-木糖苷酶(10-45％)、α-葡糖苷酶(2-10％)、木聚糖酶(1-55％)、0.5-12％的β-木糖苷酶。

40.权利要求39中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡萄糖醛酸苷酶；α-L-***呋喃糖酶；β(1，3)6-葡聚糖酶；N-乙酰葡糖胺酶；壳多糖酶；果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶；淀粉修饰活性；其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶；氧化还原酶/氧化酶和酯酶、蛋白酶。

41.权利要求40或41任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于生产专门的乳产品或食品例如用于老年人和婴儿医疗保健的食品和饮料。

42.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(1-10％)、CBH II(5-15％)、β(1，3)4-木糖苷酶(15-40％)、α-葡糖苷酶(2-30％)、木聚糖酶(15-55％)、1-12％的β-木糖苷酶、1-8％的α-葡糖苷酸酶和0.5-5.0％的α-L-***呋喃糖酶。

43.权利要求42中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶；淀粉修饰活性；其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶；氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。

44.权利要求42或43任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于面包店和糖果店部门和在新型保健食品面包店产品的配制。

45.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(1-20％)、CBH II(1-40％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(15-45％)、α-葡糖苷酶(2-30％)、木聚糖酶(10-55％)、0.5-10％的β-木糖苷酶、0.1-5％的α-L-***呋喃糖酶。

46.权利要求45中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：β(1，3)6-葡聚糖酶；N-乙酰葡糖胺糖苷酶；壳多糖酶；α-葡萄糖醛酸苷酶；果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶；淀粉修饰活性、氧化还原酶/氧化酶和酯酶；蛋白酶。

47.权利要求45或46任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其在食品工业中用于产生风味、香味和感觉前体化合物。

48.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(1-15％)、CBH II(1-15％)、β(1，3)4-葡聚糖酶(10-45％)、β-葡糖苷酶(2-30％)、木聚糖酶(1-55％)、0.5-12％的β-木糖苷酶。

49.权利要求48中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：0.1-5.0％的α-L-***呋喃糖酶；β(1，3)6-葡聚糖酶；N-乙酰葡糖胺糖苷酶；壳多糖酶；α-葡萄糖醛酸苷酶；果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶；淀粉修饰活性、其他半纤维素酶，包括半乳糖苷酶；氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及蛋白酶。

50.权利要求48或49任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于生产功能性食物。

51.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(1-15％)、CBH II(1-15％)、β(1，3)4-木糖苷酶(10-45％)、β-葡糖苷酶(1-15％)、木聚糖酶(1-30％)、0.5-20％的β-木糖苷酶。

52.权利要求51中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：0.1-5％的α-L-***呋喃糖酶；β(1，3)6-葡聚糖酶；N-乙酰葡糖胺糖苷酶；壳多糖酶；α-葡萄糖醛酸酶；果胶分解酶，包括半乳糖苷酶、阿魏糖酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖醛外切酶和半乳聚糖酶；淀粉修饰活性；氧化还原酶/氧化酶和酯酶；蛋白酶。

53.权利要求51或52任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于生产新设计者非酒精性和酒精性饮料、果汁和健康饮料。

54.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(3-15％)、CBH II(3-15％)、β(1，3)4-木糖苷酶(15-45％)、β-葡糖苷酶(1-15％)、木聚糖酶(16-55％)和β-木糖苷酶(0.5-7％)。

55.权利要求54中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡糖苷酸酶(0.5-4％)、α-L-***呋喃糖酶(1-5％)、2-10％的外切木聚糖酶、5-25％的果胶分解酶、2-8％的淀粉修饰活性、5-10％的半纤维素酶、1-10％的氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及5-15％的蛋白酶。

56.权利要求54或55任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于从陆生和海洋植物、植物残渣、真菌和废物流生产生物药物，例如生物活性寡糖(包括混合连接的1，3(4)和1，3(6)-葡寡聚糖、半乳寡聚糖木糖葡萄糖寡糖、果胶寡糖、分支和线性的寡聚木糖、(半乳糖)葡糖甘露糖寡糖)、糖肽和黄酮苷或富含单糖的副产品。

57.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(1-20％)、CBH II(1-40％)、β(1，3)4-木糖苷酶(15-45％)、β-葡糖苷酶(2-12％)、木聚糖酶(1-35％)和β-木糖苷酶(1-5％)。

58.权利要求57中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡糖苷酸酶(0.5-10％)、α-L-***呋喃糖酶(1-5％)、1-10％的外切木聚糖酶、5-25％的果胶分解酶、2-15％的淀粉修饰活性、5-10％的半纤维素酶、1-15％的氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及5-15％的蛋白酶。

59.权利要求57或58任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于增加具有天然抗细菌和抗病毒活性的分子，包括黄酮类化合物和生氰的糖苷、皂苷、寡糖和酚类化合物(包括阿魏酸和对香豆酸、表儿茶精、儿茶素、焦性没食子酸等)的生物利用度。

60.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(3-15％)、CBH II(3-15％)、β(1，3)4-木糖苷酶(25-45％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(10-30％)和β-木糖苷酶(0.5-8％)。

61.权利要求60中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡糖苷酸酶(0.5-10％)、α-L-***呋喃糖酶(0.1-5％)、1-5％的外切木聚糖酶、2-15％的果胶分解酶、2-7％的淀粉修饰活性、5-10％的半纤维素酶、1-10％的氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及5-15％的蛋白酶。

62.权利要求60或61任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于增加来自所有植物材料、残渣、废物包括各种水果和浆果的天然抗氧化剂分子例如类胡萝卜素、蕃茄红素、叶黄素、花青素、酚类化合物和糖苷的生物利用度。

63.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(1-25％)、CBH II(1-40％)、β(1，3)4-木糖苷酶(15-40％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(18-35％)和β-木糖苷酶(0.5-12％)。

64.权利要求63中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡糖苷酸酶(0.5-10％)、α-L-***呋喃糖酶(0.5-5％)、5-25％的果胶分解酶、2-12％的淀粉修饰活性、2-10％的半纤维素酶、1-15％的氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及3-15％的蛋白酶。

65.权利要求63或64任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于从原始植物材料、植物残渣和废物产生原料，所述原料用于通过真菌和细菌包括青霉菌和链霉菌进行的抗生素的微生物生产。

66.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(1-30％)、CBH II(1-40％)、β(1，3)4-木糖苷酶(15-40％)、β-葡糖苷酶(2-15％)、木聚糖酶(18-35％)和β-木糖苷酶(0.5-8％)。

67.权利要求66中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡糖苷酸酶(0.5-10％)、α-L-***呋喃糖酶(1-5％)、5-25％的果胶分解酶、5-12％的淀粉修饰活性、3-10％的半纤维素酶、1-15％的氧化还原酶/氧化酶和酯酶、1-12％的外切木聚糖酶和5-15％的蛋白酶。

68.权利要求66或67任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于从原始植物材料、植物残渣和废物产生用于柠檬酸的微生物生产的原料。

69.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(0.4-15％)、CBH II、(0.4-15％)、β(1，3)4-木糖苷酶(7-45％)、β-葡糖苷酶(2-25％)、木聚糖酶(1-78％)和β-木糖苷酶(0.4-8％)。

70.权利要求69中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡糖苷酸酶(0.5-4％)、α-L-***呋喃糖酶(0.1-5％)、2-25％和果胶分解酶、2-15％和淀粉修饰活性、2-10％和半纤维素酶、1-15％和氧化还原酶/氧化酶主酯酶、2-12％和外切木聚糖酶和5-30％的蛋白酶。

71.权利要求66或67任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于从藻类多糖(例如昆布糖和岩藻聚糖硫酸酯)产生寡糖，和通过公认为安全的方法从植物的提取物产生化妆品制剂中的添加剂。

72.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(0.4-30％)、CBH II(0.4-10％)、β(1，3)4-木糖苷酶(7-45％)、β-葡糖苷酶(2-12％)、木聚糖酶(1-78％)和β-木糖苷酶(0.1-8％)。

73.权利要求72中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡糖苷酸酶(0.1-2％)、α-L-***呋喃糖酶(0.1-5％)、2-10％的果胶分解酶、2-15％的淀粉修饰活性、2-10％的半纤维素酶、1-10％的氧化还原酶/氧化酶和酯酶、2-5％的外切木聚糖酶和8-15％的蛋白酶。

74.权利要求72或73任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于产生用作研究试剂的寡糖和糖肽，用于生物传感器的产生和用作在功能糖组学中探测受体-配体相互作用的工具和用于产生表征酶-底物特异性的底物文库。

75.权利要求5至7任一项中所述的酶组合物，其包含CBHI(0.4-15％)、CBH II(0.4-30％)、β(1，3)4-木糖苷酶(7-45％)、β-葡糖苷酶(1-12％)、木聚糖酶(10-78％)和β-木糖苷酶(0.4-8％)。

76.权利要求75中所述的酶组合物，其还包含一种或多种下列物质：α-葡糖苷酸酶(0.5-10％)、α-L-***呋喃糖酶(0.1-5％)、2-15％的果胶分解酶、2-8％的淀粉修饰活性、5-10％的半纤维素酶、1-10％的氧化还原酶/氧化酶和酯酶以及5-15％的蛋白酶。

77.权利要求75或76任一项中所述的酶组合物或权利要求1或2中所述的微生物株系的用途，其用于产生经修饰的纤维素和β-葡聚糖、纤维寡糖、经修饰的淀粉和麦芽寡糖、乳果糖和多元醇(例如甘露醇、山梨醇或卫矛醇、木糖醇、***糖醇)。

78.通过权利要求11、14、17、20、23、26、29、23、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74或77任一项中所述的方法产生的底物用作生物燃料的生产中的原料的用途。

79.无论何时通过权利要求78中所述的方法产生的生物乙醇或生物气。

80.用于获得适合用于转化靶底物的酶***的方法，该方法包括：

获得靶底物的样品；

允许微生物株系的接种物在靶底物上生长和分泌酶；

回收在靶底物上生长期间分泌的酶；

确定酶的活性和酶的性质；

构建基因表达谱；

鉴定酶蛋白和构建蛋白质表达谱；

将基因表达与蛋白表达谱比较；

纯化酶。

81.权利要求80的方法还包括：

分析酶；和

设计酶***。

82.一种木聚糖酶，该酶具有17.5kDa的分子量，4至4.5的最适pH，在pH 3.0保持91％的活性，和具有针对混合连接的D木聚糖和混合连接的D葡聚糖的降解活性。

83.权利要求82中所述的木聚糖酶，其还具有针对芳基-β-木糖苷的活性。

84.权利要求82或权利要求83中所述的木聚糖酶，其来源于具有保藏号IMI393751的踝节菌属emersonii菌株系和大体上与其相似的株系或其突变体。

85.权利要求3或4所述的酶、权利要求5-10中所述的酶的组合物或权利要求1或2中所述的微生物株在改变废物流的生热值中的办法中的用途。

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