BR112015004118B1 - processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico - Google Patents

Abstract

resumo processo para hidrólise enzimática de material lignocelulósico e fermentação de açúcares a invenção refere-se a um processo para a preparação de um produto de fermentação a partir de material lignocelulósico, que compreende as seguintes etapas: a) opcionalmente pré-tratamento do material lignocelulósico; b) opcionalmente lavagem do material lignocelulósico opcionalmente pré-tratado; c) hidrólise enzimática do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado com o uso de uma composição de enzima que compreende ao menos duas celulases e de modo que a composição de enzima ao menos compreenda gh61; d) fermentação do material lignocelulósico hidrolisado para produzir um produto de fermentação; e e) opcionalmente recuperação de um produto de fermentação; em que, antes de e/ou durante a hidrólise enzimática, o oxigênio é adicionado ao material lignocelulósico.

Description

(54) Título: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO DE AÇÚCAR A PARTIR DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO (51) Int.CI.: C12P 19/14 (30) Prioridade Unionista: 02/07/2013 EP 13174656.2, 09/11/2012 EP 12191957.5, 15/07/2013 EP 13176500.0, 17/09/2013 EP 13184702.2 (73) Titular(es): DSM IP ASSETS B.V.

(72) Inventor(es): BERTUS NOORDAM (85) Data do Início da Fase Nacional: 26/02/2015

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PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO DE AÇÚCAR A PARTIR DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A invenção refere-se a um processo para a hidrólise enzimática de material lignocelulósico e fermentação de açúcares.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] O material vegetal lignocelulósico, também chamado no presente documento de matéria-prima, é uma fonte renovável de energia sob a forma de açúcares que podem ser convertidas em produtos valiosos, por exemplo, açúcares ou biocombustível, tal como bioetanol. Durante esse processo, (ligno ou hemi)-celulose presente na matéria-prima, tal como palha de trigo, restos culturais do milho, cascas de arroz, etc., é convertida em açúcares de redução através de enzimas (hemi)-celulolíticas, os quais são, então, opcionalmente convertidos em produtos valiosos, tais como etanol através de micro-organismos como levedura, bactérias e fungos.

[003] Uma vez que a (hemi) -celulose é cristalina e capturada em uma rede de lignina, a conversão em açúcares de redução é, em geral, lenta e incompleta. Tipicamente, a hidrólise enzimática de matéria-prima não tratada rende açúcares < 20 % de quantidade teórica. Mediante a aplicação de um pré-tratamento químico e termofísico, a (hemi)celulose é mais acessível para as enzimas (hemi)celulolíticas e, desse modo, as conversões são mais rápidas e em rendimentos superiores.

[004] Um rendimento de etanol típico a partir de glicose, derivado a partir de restos culturais do milho

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2/75 pré-tratados, é de 40 galões (151,4 litros) de etanol por 1.000 kg de restos culturais do milho secos (Badger, P, Ethanol from cellulose: a general review, Trends in new crops and new uses, 2002, J. Janick e A. Whipkey (eds.) ASHS Press, Alexandria, VA) ou 0,3 g de etanol por g de matéria-prima. O rendimento máximo de etanol com base em celulose é de aproximadamente 90 %.

[005] As enzimas celulolíticas -sendo que a maioria das mesmas é produzida por espécies como Trichoderma, Humicola e Aspergillus- são comercialmente usadas para converter matéria-prima pré-tratada em uma massa que contém (hemi)celulose insolúvel, açúcares de redução feitas da mesma, e lignina. As enzimas celulolíticas termoestáveis derivadas a partir de Rasamsonia têm sido usadas para degradar matéria-prima lignocelulósica e essas enzimas são conhecidas por sua termoestabilidade, consulte o documento sob o n^o. WO2007091231. A massa produzida é usada em uma fermentação durante a qual os açúcares de redução são convertidos em biomassa de levedura (células), dióxido de carbono e etanol. O etanol produzido dessa forma é chamado de bioetanol.

[006] A produção comum de açúcares a partir de matériaprima lignocelulósica pré-tratada, a hidrólise também chamada de liquefação, pré-sacarificação ou sacarificação, tipicamente ocorre durante um processo que dura de 6 a 168 horas (Kumar, S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009) 517 a 526) sob temperaturas elevadas de 45 a 50 °C e condições não estéreis. Durante essa hidrólise, a celulose presente é parcialmente (tipicamente 30 a 95 %, dependendo da atividade enzimática e condições de hidrólise) convertida

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3/75 em açúcares de redução. No caso da inibição de enzimas por compostos presentes na matéria-prima pré-tratada e por açúcares liberados; e para minimizar a inativação térmica, esse período de temperatura elevada é minimizado na medida do possível.

[007] A fermentação após a hidrólise ocorre, de preferência, em uma etapa do processo anaeróbico separada, no mesmo vaso ou em um vaso diferente, no qual a temperatura é ajustada para 30 a 33 °C (processo mesofílico) para acomodar o crescimento e produção de etanol através de biomassa microbiana, comumente leveduras. Durante esse processo de fermentação, o material (hemi) celulósico restante é convertido em açúcares de redução pelas enzimas já presentes a partir da etapa de hidrólise, enquanto que a biomassa microbiana e etanol são produzidos. A fermentação é terminada uma vez que o material (hemi) celulósico é convertido em açúcares fermentáveis e todos os açúcares fermentáveis são convertidos em etanol, dióxido de carbono e células microbianas. Isso pode levar até 6 dias. Em geral, o tempo de processo total de hidrólise e fermentação pode atingir até 13 dias.

[008] A massa fermentada assim obtida consiste em açúcares não fermentáveis, material (hemi) celulósico não hidrolisável, lignina, células microbianas (mais comum, células de levedura), água, etanol, dióxido de carbono dissolvido. Durante as etapas sucessivas, o etanol é destilado a partir da massa e adicionalmente purificado. A suspensão de sólido restante é seca e usada como, por exemplo, combustível de queima, fertilizante ou alimento para gado.

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4/75 [009] O documento sob o n^o. WO2010080407 sugere tratar o material celulósico com uma composição de celulase sob condições anaeróbicas. A remoção ou exclusão de espécie de oxigênio reativa pode aperfeiçoar o desempenho de sistemas de enzima de hidrólise de celulose. A hidrólise de material celulósico, por exemplo, lignocelulose, através de uma composição de enzima, pode ser reduzida por dano oxidante a componentes da composição de enzima e/ou oxidação do material celulósico através, por exemplo, de oxigênio molecular.

[010] O documento sob o n^o. WO2009046538 revela um método para tratar materiais vegetais de matéria-prima lignocelulósica para liberar açúcares fermentáveis com o uso de um processo de hidrólise enzimática para tratar os materiais realizada sob vácuo e produzindo-se um fluxo de processo rico em açúcar que compreende quantidades reduzidas de compostos de inibição de fermentação/açúcar volátil, tais como furfural e ácido acético. Separadamente da remoção de componentes inibitórios voláteis, outros compostos e/ou moléculas que também são removidos incluem nitrogênio, oxigênio, argônio e dióxido de carbono.

[011] Com cada lote de matéria-prima, as enzimas são adicionadas para maximizar o rendimento e taxa de açúcares fermentáveis liberadas a partir da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada durante o determinado tempo de processo. Em geral, os custos para a produção de enzimas, rendimentos de matéria-prima a etanol e investimentos são os fatores de maior custo nos custos totais de produção (Kumar, S. Chem. Eng. Technol. 32 (2009) 517 a 526). Até esse momento, o custo de redução de uso de enzima é

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5/75 alcançado aplicando-se produtos de enzima a partir de uma única ou múltiplas fontes microbianas (documento sob o n^o. WO 2008/008793) com atividade hidrolítica (específica) mais ampla e/ou superior, tal uso se dirige a uma necessidade menor de enzima, taxas de conversão mais rápidas e/ou rendimentos de conversão maiores e, desse modo, a custos menores de produção de bioetanol total. Isso exige grandes investimentos em pesquisa e desenvolvimento desses produtos de enzima. No caso de um produto de enzima composto de enzimas a partir de múltiplas fontes microbianas, são necessários grandes investimentos de capital para a produção de cada composto de enzima individual.

[012] Portanto, é desejável aperfeiçoar o processo acima que envolve hidrólise e fermentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [013] Um objetivo da invenção é, portanto, fornecer um processo em que a etapa de hidrólise é conduzida em condições aperfeiçoadas. Outro objetivo da invenção consiste em fornecer um processo que envolve hidrólise que tem um tempo de processo reduzido. O objetivo adicional da invenção consiste em fornecer um processo, em que a dosagem de enzima pode ser reduzida e, ao mesmo tempo, a saída de produto de hidrólise útil é mantida no mesmo nível ou até aumentada. Outro objetivo consiste em fornecer um processo que envolve hidrólise, em que as condições do processo da hidrólise são otimizadas. Um outro objetivo adicional da invenção consiste em fornecer um processo que envolve hidrólise, em que a saída de produto de hidrólise útil é aumentada com o uso da mesma dosagem de enzima. Um ou mais desses objetivos são alcançados de acordo com a invenção.

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6/75 [014] A presente invenção fornece um processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, que compreende as seguintes etapas:

a) opcionalmente pré-tratamento do material lignocelulósico;

b) opcionalmente lavagem do material lignocelulósico opcionalmente pré-tratado;

c) hidrólise enzimática do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado com o uso de uma composição de enzima que compreende ao menos duas celulases e de modo que a composição de enzima ao menos compreenda GH61; e

d) opcionalmente recuperação de um produto de açúcar; em que, após o pré-tratamento e antes de e/ou durante a hidrólise enzimática, o oxigênio é adicionado ao material lignocelulósico.

[015] Adicionalmente, a presente invenção fornece um processo para a preparação de um produto de fermentação a partir de material lignocelulósico, que compreende as seguintes etapas:

a) opcionalmente pré-tratamento do material lignocelulósico;

b) opcionalmente lavagem do material lignocelulósico opcionalmente pré-tratado;

c) hidrólise enzimática do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado com o uso de uma composição de enzima que compreende ao menos duas celulases e de modo que a composição de enzima ao menos compreenda GH61;

d) fermentação do material lignocelulósico hidrolisado

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7/75 para produzir um produto de fermentação;

e) opcionalmente recuperação de um produto de fermentação;

em que, após o pré-tratamento e antes de e/ou durante a hidrólise enzimática, o oxigênio é adicionado ao material lignocelulósico.

[016] Preferencialmente, o oxigênio é adicionado durante a etapa de hidrólise enzimática.

[017] Em uma modalidade preferencial, o oxigênio é adicionado sob a forma de bolhas (gasosas).

[018] Surpreendentemente, de acordo com a invenção, através da adição de oxigênio, é possível alcançar muitas vantagens do processo, que incluem condições de temperatura ideais, tempo de processo reduzido, dosagem reduzida de enzima, reuso de enzimas, rendimentos superiores e outras otimizações do processo, que resultam em custos reduzidos.

[019] Em uma modalidade desse processo, o tempo de fermentação é de 5 a 120 horas. Em um modalidade, a composição de enzima estável usada retém atividade durante 30 horas ou mais. De acordo com uma modalidade adicional, a hidrólise é conduzida, de preferência, em uma temperatura de 45 °C ou mais, com mais preferência, em uma temperatura de 50 °C ou mais e, com mais preferência ainda, em uma temperatura de 55 °C ou mais. Em uma modalidade preferencial, a composição de enzima é derivada a partir de um fungo, de preferência, um micro-organismo do gênero Rasamsonia, ou a composição de enzima compreende enzima fúngica, de preferência, enzima de Rasamsonia. O processo da invenção será ilustrado em maiores detalhes abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

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8/75 [020] A Figura 1: O efeito de espargir nitrogênio ou ar através de uma matéria-prima aCS a 10 % antes da hidrólise, sobre a quantidade total de glicose (g/l) liberada pela mistura TEC-210 (1), mistura 4E-GH61 (2) e mistura 4E-EG (3) .

[021] A Figura 2: A hidrólise enzimática em um reator de 270 litros (escala de usina piloto), de modo que a conversão de glucano (%) seja mostrada em aCS a 20 % conforme uma função do tempo do processo (horas) para 3,75 mg de TEC210/g de matéria-prima DM para DO baixo (—□—) e DO alto (——).

[022] A Figura 3: O efeito da concentração de oxigênio dissolvido (DO) sobre a hidrólise de glucano em matériaprima lignocelulósica pré-tratada conforme uma função de tempo de hidrólise para 2,5 mg/g de enzima e DO=0,030 mol/m³ (—♦—) e 3,5 mg/g de enzima e DO=0,005 mol/m³ ( ) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [023] Por todo o presente relatório descritivo e nas reivindicações anexadas, as palavras compreender e incluir e variações, tais como compreende, compreendendo, inclui e incluindo, devem ser interpretadas de maneira inclusiva. Isto é, essas palavras são destinadas a transmitir a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não especificamente mencionados, onde o contexto permite. Os artigos um e uma, para uso na presente invenção, se referem a um ou mais que um (isto é, a um ou ao menos um) objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, um elemento pode se referir a um elemento ou mais que um elemento.

[024] No contexto da presente invenção, aperfeiçoado,

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9/75 aumentado, reduzido é usado para indicar que a presente invenção mostra uma vantagem em comparação com a mesma situação, processo ou condições de processo, exceto pelo fato de que nenhum oxigênio extra é adicionado. Dentro do contexto da presente invenção, medida sob as mesmas condições ou analisada sob as mesmas condições, etc., significa que o processo da invenção e o mesmo processo sem adição de oxigênio são realizados sob as mesmas condições (exceto a adição de oxigênio) e que os resultados do presente processo, se em comparação com o processo sem adição de oxigênio, são medidos com o uso das mesmas condições, de preferência, com o uso do mesmo ensaio e/ou metodologia, com mais preferência, dentro do mesmo exemplo ou exemplo paralelo. As condições da hidrólise são um exemplo de tais condições.

[025] Na técnica anterior é sugerido aperfeiçoar a hidrólise de material celulolítico com o uso de condições anaeróbicas (documento sob o n^o. WO2010/080407) ou de vácuo (documento sob o n^o. WO2009/046538) durante a hidrólise enzimática. Nos processos de ambos os documentos, o nível de oxigênio foi diminuído. Descobriu-se surpreendentemente agora que a hidrólise da presente invenção mostra resultados em um produto de reação aperfeiçoado que proporciona quantidades superiores de produtos de açúcar (reduzidos) e/ou produtos de fermentação desejados na fermentação após a hidrólise, conforme em comparação com um processo em que nenhum oxigênio é adicionado. Em geral, um aumento da conversão de glicose é observada de 5 a 15 % em peso.

[026] O oxigênio pode ser adicionado de diversas

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10/75 maneiras. Por exemplo, o oxigênio pode ser adicionado como gás de oxigênio, gás enriquecido com oxigênio, tal como ar enriquecido com oxigênio ou ar. O oxigênio pode ser adicionado de modo contínuo ou descontínuo. O termo oxigênio “é adicionado significa que o oxigênio é adicionado à fase líquida (que compreende o material lignocelulósico) no reator de hidrólise e não que o oxigênio está presente no espaço de cabeça no reator acima da fase líquida, de modo que o oxigênio tenha que difundir a partir do espaço de cabeça até a fase líquida. Então, de preferência, o oxigênio é adicionado como bolhas, com a máxima preferência, como bolhas pequenas.

[027] No caso em que a enzima pode ser danificada pela presença ou adição de oxigênio, suprimento de oxigênio moderado pode ser usado. Nesse caso, um equilíbrio pode ser encontrado entre a produção de glicose aperfeiçoada e o desempenho de enzima. A adição do oxigênio ao material celulolítico pode ser feita antes de e/ou durante a hidrólise enzimática. No caso em que o oxigênio é adicionado na forma gasosa, o gás contendo oxigênio pode ser introduzido, por exemplo, soprado, nos conteúdos líquidos do reator de hidrólise de material celulolítico. Em outra modalidade da invenção, o gás contendo oxigênio é introduzido no fluxo de material celulolítico líquido que irá entrar no reator de hidrólise. Em ainda outra modalidade da invenção, o gás contendo oxigênio é introduzido em conjunto com o material celulolítico que entra no reator de hidrólise ou com parte dos conteúdos líquidos de reator que passa um ciclo externo do reator. Na maioria dos casos, a adição de oxigênio antes de entrar no

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11/75 reator de hidrólise não é suficiente e a adição de oxigênio pode ser feita durante a hidrólise também. Em outra modalidade da invenção, a fase gasosa presente na parte superior do reator (espaço de cabeça) é renovada de maneira contínua ou descontínua com o gás contendo oxigênio. No último caso, a mistura ou agitação (vigorosa) é necessária para obter o oxigênio como bolhas e/ou através de difusão nos conteúdos líquidos do reator, de preferência, em combinação com a sobrepressão no reator. Em geral, a purga do espaço de cabeça com ar em combinação com a mistura ou agitação (vigorosa) pode introduzir oxigênio suficiente no material celulósico no reator de hidrólise para reatores até um tamanho de 100 litros a 1 m³. Em escala maior, por exemplo, em um reator de 50 m³ ou mais, por exemplo, 100 m³, determinada quantidade de energia é necessária para a agitação vigorosa de modo que, a partir do ponto de vista econômico, isso não será aplicado em um processo comercialmente operacional.

[028] De acordo com a presente invenção, o oxigênio pode ser adicionado antes da etapa de hidrólise, durante parte da etapa de hidrólise, durante toda a etapa de hidrólise ou uma combinação de antes ou durante a etapa de hidrólise. Vantajosamente, o oxigênio é adicionado durante a primeira metade da etapa de hidrólise. A adição de oxigênio durante somente parte da hidrólise pode ser feita, por exemplo, no caso em que ocorre dano de oxidação da(s) enzima(s). No caso em que o oxigênio presente nos conteúdos de reator de hidrólise ou no produto de açúcar ou no hidrolisado formado na etapa de hidrólise poderia influenciar ou perturbar a etapa de fermentação

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12/75 subsequente, a adição de oxigênio pode ser feita, exceto durante a última parte da hidrólise e, desse modo, (a maior parte de) o oxigênio é consumido antes de a biomassa hidrolisada entrar no reator de fermentação.

[029] Vários exemplos de aeração durante o processo de hidrólise enzimática são dados nos Exemplos para mostrar o efeito benéfico da presente invenção. Esse efeito benéfico é encontrado para vários substratos ou matérias-primas e, portanto, acredita-se que estejam presentes para a hidrólise de todos os tipos de substratos ou matériasprimas.

[030] Vários exemplos de composições de enzima para o processo de hidrólise enzimática são dados nos Exemplos para mostrar o efeito benéfico da presente invenção. Esse efeito benéfico é encontrado para várias composições de enzima e, portanto, acredita-se que estejam presentes para todos os tipos de composições de enzima de hidrólise.

[031] Para uma modalidade preferencial adicional da invenção, a concentração de oxigênio na fase líquida (DO), em que o material lignocelulósico está presente durante a hidrólise enzimática, é de ao menos 0,001 mol/m³, de preferência, ao menos 0,002 mol/m³, com mais preferência, ao menos 0,003 mol/m³ e com até mais preferência, é maior que 0,01 mol/m³, por exemplo, maior que 0,02 mol/m³ ou 0,03 mol/m³. Em reatores de menos que 1 m³, os valores de DO de abaixo de 0,01 mol/m³ ou 0,02 mol/m³ serão obtidos através de agitação lenta. A mistura ou agitação vigorosa em tal escala introduz parte da fase de gás do espaço de cabeça no líquido de reação. Por exemplo, a mistura ou agitação pode criar um redemoinho que atrai o oxigênio para o líquido. Em

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13/75 geral, a purga do espaço de cabeça com ar em combinação com mistura ou agitação (vigorosa) irá introduzir oxigênio suficiente no material celulósico no reator de hidrólise para reatores até um tamanho de 100 litros a 1 m³. Em escala maior, por exemplo, em um reator de 50 m³ ou mais, por exemplo, 100 m³, uma determinada quantidade de energia é necessária para a agitação vigorosa que, a partir do ponto de vista econômico, isso não será aplicado em um processo comercialmente operacional. Em geral, em reatores grandes, a agitação ou mistura sem introduzir ar ou oxigênio irá resultar em valores de DO de menos que 0,01 mol/m³.

[032] Para mais outra modalidade preferencial da invenção, durante a produção ou geração de oxigênio, a concentração de oxigênio na fase líquida (aeração ou adição de oxigênio), a concentração de oxigênio na fase líquida em que o material lignocelulósico está presente durante a hidrólise enzimática, de preferência, é de no máximo 80 % da concentração de saturação de oxigênio sob as condições de reação de hidrólise, com mais preferência, no máximo 0,12 mol/m³, com mais preferência ainda, no máximo 0,0 9 mol/m³, com até mais preferência, no máximo 0,06 mol/m³, com até mais preferência ainda, no máximo 0,045 mol/m³ e com a máxima preferência, no máximo 0,03 mol/m³. A temperatura e pressão irão influenciar o DO. Os valores de mol/m³ exemplificadores e preferenciais dados acima se referem à pressão atmosférica normal e uma temperatura de cerca de 62 °C. O elemento versado na técnica irá observar valores de DO favoráveis com base nas presentes instruções.

[033] A adição de oxigênio sob a forma de ar ou outro

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14/75 gás contendo oxigênio, de acordo com a invenção, também pode ser usada para agitar ou misturar ao menos parcialmente os conteúdos do reator de hidrólise. O presente processo da invenção mostra vantagens especialmente em usina piloto e escala industrial. Preferencialmente, o reator de hidrólise tem um volume de 1 m³ ou mais, de preferência, de mais que 10 m³ e com a máxima preferência, de 50 m³ ou mais. Em geral, o reator de hidrólise será menor que 3.000 m³ ou 5.000 m³. O inventor propõe a teoria que, especialmente em grande escala, oxigênio insuficiente está disponível para a hidrólise, o qual poderia ser devido às limitações de transferência de oxigênio no reator, por exemplo, na biomassa celulolítica. Em experimentos de escala de laboratório, essa insuficiência de oxigênio pode desempenhar um papel menos importante. A razão entre a área de superfície (ou área de contato de oxigênio do conteúdo do reator) e o volume do reator é mais favorável para experimentos de escala pequena que em experimentos de escala grande. Ademais, a mistura em experimentos de escala pequena é relativamente mais fácil que em grande escala. Durante aqueles experimentos de pequena escala, o transporte de oxigênio a partir do espaço de cabeça do reator de hidrólise também é mais rápido que em comparação com a situação em experimentos de grande escala. Essa teoria é somente dada como explicação possível do efeito notado pelos inventores, e a presente invenção não abrange ou possuir a exatidão dessa teoria. De acordo com uma modalidade adicional da invenção, a adição de oxigênio pode ser usada para controlar ao menos parcialmente o processo de hidrólise.

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15/75 [034] O processo da invenção é vantajosamente aplicado em combinação com o uso de enzimas termoestáveis.

[035] Uma enzima termoestável se refere à enzima que tem uma temperatura ideal de 60 °C ou maior, por exemplo, 70 °C ou maior, tal como 75 °C ou maior, por exemplo, 80 °C ou maior, tal como 85 °C ou maior. A mesma pode ser, por exemplo, isolada a partir de micro-organismos termofílicos, ou pode ser projetada pelo elemento versado na técnica e sintetizada artificialmente. Em uma modalidade, os polinucleotídeos podem ser isolados ou obtidos a partir de fungos filamentosos termofílicos ou termotolerantes ou isolados a partir de fungos não termofílicos ou não termotolerantes, mas descobriu-se que são termoestáveis.

[036] O termo fungo termofílico se refere a um fungo que cresce em uma temperatura de 50 °C ou acima. O termo fungo termotolerante se refere a um fungo que cresce em uma temperatura de 45 °C ou acima, que tem um máximo próximo a 50 °C.

[037] Os exemplos de cepas fúngicas termofílicas são Rasamsonia emersonii (anteriormente conhecido como Talaromyces emersoni; Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii e Rasamsonia emersonii são usados de maneira intercambiável no presente documento).

[038] As células fúngicas termofílicas ou termotolerantes adequadas podem ser uma célula de Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Rasamsonia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus ou Thielavia, de preferência, uma célula de Rasamsonia emersonii. Os fungos termofílicos ou termotolerantes preferenciais são Humicola grisea var. thermoidea, Humicola lanuginosa, Myceliophthora

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16/75 thermophila, Papulaspora thermophilia, Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Rasamsonia argillacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylindrospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacillisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Thermomyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus e Thielavia terrestris.

[039] Os fungos termofílicos não são limitados a uma ordem taxonômica específica e todos ocorrem sobre a árvore fúngica da vida. Os exemplos são Rhizomucor na espécie Mucorales, Myceliophthora em Sordariales e Talaromyces, Thermomyces e Thermoascus na espécie Eurotiales (Mouchacca, 1997). A maioria das espécies Talaromyces é mesófila, mas as exceções são as espécies dentro das seções Emersorii e Thermophila. A seção Emersonii inclui Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces bacillisporus e Talaromyces leycettanus, todos os quais crescem bem a 40 °C. Talaromyces bacillisporus é termotolerante, T. leycettanus é termotolerante a termofílico, e T. emersonii e T. byssochlamydoides são verdadeiramente termofílicos (Stolk e Samson, 1972) . O único membro de Talaromyces seção Thermophila, T. thermophilus, cresce rapidamente a 50 °C (Evans e Stolk, 1971; Evans, 1971; Stolk e Samson, 1972). A classificação atual dessas espécies Talaromyces termofílicas é principalmente baseada em caracteres fenotípicos e fisiológicos, tais como sua capacidade de crescer acima de 40 °C, cor de ascósporo, a estrutura de cobertura ascornatal e a formação de um determinado tipo de

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17/75 anamorfose. Stolk e Samson (1972) afirmaram que os membros da seção Emersonii têm anamorfoses de Paecilomyces (T byssochlamydoides e T leycettanus) ou Penicillium cylindrosporum series (T. emersonii e T. bacillisporus). Later, Pitt (1979) transferiu a espécie pertencente ao Penicillium cylindrosporum series para o gênero Geosmithia, com base em diversos caracteres, tais como a formação de conídios a partir de poros terminais em vez de em collula (pescoços), um caráter de Penicillium e Paecilomyces. Dentro do gênero Geosmithia, somente G. argillacea é termotolerante, e Stolk et al. (1969) e Evans (1971) propuseram uma conexão com os membros de Talaromyces sect. Emersonii. A relação filogenética da espécie Talaromyces termofílica dentro de Talaromyces e a Trichocomaceae é desconhecida. Consulte J. Houbraken, Antonie van Leeuwenhoek, fevereiro de 2012; 101 (2): 403 a 421.

[040] Rasamsonia é um novo gênero que compreende espécies Talaromyces e Geosmithia termotolerantes e termofílicas (J. Houbraken et al vida supra). Com base nos dados fenotípicos, fisiológicos e moleculares, Houbraken et al propuseram a transferência da espécie T. emersonii, T. byssochlamydoides, T. eburneus, G. argillacea e G. cylindrospora para Rasamsonia gen. nov. Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii e Rasamsonia emersonii são usados de maneira intercambiável no presente documento.

[041] Os fungos termofílicos preferenciais são Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Thermomyces lenuginosus, Talaromyces thermophilus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus e

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Thermoascus aurantiacus.

[042] Os “fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (conforme definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8^a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). Os fungos filamentosos são caracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose, glucano, quitosano, manano, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é através de alongamento de hifa e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. As cepas fúngicas filamentosas incluem, porém sem limitação, cepas de Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete,

Rasamsonia, Schizophyllum, Talaromyces,

Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium e Trichoderma.

[043] Várias cepas de fungos filamentosos estão prontamente acessíveis para o público em uma série de coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). Os exemplos de tais cepas incluem Aspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC 14488-14491, ATCC 11601, ATCC 12892, P. chrysogenum CBS 455.95,

Pleurotus,

Thermoascus,

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Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Talaromyces emersonii CBS 393.64, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 ou ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 2 6 921 ou ATCC 56765 ou ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC1 1906, Chrysosporium lucknowense C1, Garg 27K, VKM F3500-D, ATCC44006 e derivados dos mesmos.

[044] Uma vantagem da expressão e produção das enzimas (por exemplo, ao menos duas, três ou quatro celulases diferentes) em um micro-organismo adequado pode ser um alto rendimento de composição de enzima que pode ser usado no processo da presente invenção.

[045] De acordo com a invenção, através da adição de oxigênio, é possível alcançar muitas vantagens do processo, que incluem condições de temperatura ideais, tempo de processo reduzido, dosagem reduzida de enzima, reuso de enzimas e outras otimizações do processo, resultando em custos reduzidos. Vantajosamente, a invenção fornece um processo em que a etapa de hidrólise é conduzida em condições aperfeiçoadas. A invenção também fornece um processo que envolve a hidrólise com um tempo de processo reduzido. Adicionalmente, a invenção fornece um processo, em que a dosagem de enzima pode ser reduzida e ao mesmo tempo a saída de produto de hidrólise útil é mantida no mesmo nível. Outra vantagem da invenção é que o presente processo que envolve hidrólise pode resultar em condições do processo que são otimizados. Uma outra vantagem adicional da invenção é que a saída de produto de hidrólise útil do processo que envolve hidrólise é aumentada com o uso da mesma dosagem de enzima.

COMPOSIÇÃO DE ENZIMA ESTÁVEL

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20/75 [046] A composição de enzima estável, no presente documento, significa que a composição de enzima retém atividade após 30 horas de tempo de reação de hidrólise, de preferência, de ao menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de sua atividade inicial após 30 horas de tempo de reação de hidrólise. Preferencialmente, a composição de enzima retém atividade após 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 horas de tempo de reação de hidrólise.

[047] A composição de enzima pode ser preparada através da fermentação de um substrato adequado com um microorganismo adequado, por exemplo, Rasamsonia emersonii ou Aspergillus Níger, em que a composição de enzima é produzida pelo micro-organismo. O micro-organismo pode ser alterado para aperfeiçoar ou produzir a composição de celulase. Por exemplo, o micro-organismo pode ser mutante através de procedimentos de aperfeiçoamento de cepa clássicos ou através de técnicas de DNA recombinante. Portanto, os micro-organismos mencionados no presente documento podem ser usados como tais para produzir a composição de celulase ou podem ser alterados para aumentar a produção ou para produzir uma composição de celulase alterada que poderia incluir celulases heterólogas, desse modo, enzimas que não são originalmente produzidas por aquele micro-organismo. Preferencialmente, um fungo, com mais preferência, um fungo filamentoso é usado para produzir a composição de celulase. Vantajosamente, um micro-organismo termofílico ou termotolerante é usado. Opcionalmente, é usado um substrato que induz a expressão

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21/75 das enzimas na composição de enzima durante a produção da composição de enzima.

[048] A composição de enzima é usada para liberar açúcares a partir de lignocelulose, que compreende polissacarídeos. Os principais polissacarídeos são celulose (glucanos), hemiceluloses (xilanos, heteroxilanos e xiloglucanos). Além disso, alguma hemicelulose pode estar presente como glucomananos, por exemplo, em matérias-primas derivadas de madeira. A hidrólise enzimática desses polissacarídeos em açúcares solúveis, que incluem tanto monômeros como multímeros, por exemplo, glicose, celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturônico, ácido glucorônico e outras hexoses e pentoses, ocorre sob a ação de diferentes enzimas que agem em conjunto. O termo produto de açúcar se refere ao produto de hidrólise enzimática da matéria-prima ou material lignocelulósico. O produto de açúcar irá compreender açúcares solúveis, que incluem tanto monômeros como multímeros, de preferência, irá compreender glicose. Os exemplos de outros açúcares são celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturônico, ácido glucorônico e outras hexoses e pentoses. O produto de açúcar pode ser usado como tal ou pode ser adicionalmente processado, por exemplo, purificado.

[049] Além disso, as pectinas e outras substâncias pécticas, tais como arabinanos, podem constituir consideravelmente uma proporção da massa seca de tipicamente paredes celulares a partir de tecidos de planta não lenhosa (cerca de um quarto a metade da massa seca pode

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22/75 ser pectinas).

[050] A celulose é um polissacarídeo linear composto de resíduos de glicose ligados por ligações de β-1,4. A natureza linear das fibras de celulose, assim como a estequiometria da glicose β-ligada (em relação à α) gera estruturas mais propensas à ligação de hidrogênio interfilamento que as estruturas α-ligadas altamente ramificadas de amido. Desse modo, os polímeros de celulose são geralmente menos solúveis e formam fibras mais estreitamente ligadas que as fibras encontradas no amido.

[051] As enzimas que podem ser incluídas na composição de enzima estável usada na invenção são agora descritas em maiores detalhes:

[052] GH61, Endoglucanases (EG) e exo-celobiohidrolases (CBH) catalisam a hidrólise de celulose insolúvel em produtos, tais como celo-oligossacarídeos (celobiose como um produto principal), enquanto que β-glucosidases (BG) convertem os oligossacarídeos, principalmente celobiose e celotriose em glicose.

[053] A hemicelulose é um polímero complexo e sua composição muitas vezes varia amplamente de organismo para organismo e de um tipo de tecido a outro. Em geral, um componente principal de hemicelulose é xilose e-1,4-ligada, um açúcar de cinco carbonos. Contudo, essa xilose é muitas vezes ramificada em 0 a 3 e/ou 0 a 2 átomos de xilose, e pode ser substituída por ligações a arabinose, galactose, manose, ácido glucorônico, ácido galacturônico Oe através de esterificação em ácido acético (e esterificação de ácido ferúlico em arabinose). A hemicelulose também pode conter glucano, o qual é um termo geral para açúcares de seis

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23/75 carbonos β-ligados (tais como os β-(1,3) (1,4) glucanos e heteroglucanos mencionados anteriormente) e adicionalmente glucomananos (nos quais tanto a glicose como manose estão presentes na cadeia principal linear, ligadas uma à outra por ligações β).

[054] As xilanases em conjunto com outras enzimas secundárias, por exemplo, α-L-arabinofuranosidases, feruloil e acetilxilano esterases, glucuronidases, e βxilosidases) catalisam a hidrólise de hemiceluloses.

[055] As substâncias pécticas incluem pectinas, arabinanos, galactanos e arabinogalactanos. As pectinas são os polissacarídeos mais complexos na parede celular de planta. São construídas em torno de uma cadeia de núcleo de unidades de ácido D-galacturônico α(1,4)-ligado intercaladas a algum grau com L-ramnose. Em qualquer parede celular, há uma série de unidades estruturais que se ajustam a essa descrição e tem sido considerado geralmente que, em uma única molécula péctica, as cadeias de núcleo de diferentes unidades estruturais são contínuas umas com as outras.

[056] Os tipos principais de unidade estrutural são: galacturonano (homogalacturonano), o qual pode ser substituído por metanol no grupo carboxila e acetato em O-2 e O-3; ramnogalacturonano I (RGI), no qual as unidades de ácido galacturônico se alternam com as unidades de ramnose que carregam cadeias laterais de galactano (1,4)-ligado e arabinano (1,5)-ligado. As cadeias laterais de arabinano podem ser fixadas diretamente a ramnose ou indiretamente através das cadeias de galactano; xilogalacturonano, com únicas unidades de xilosila em O-3 de ácido galacturônico

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24/75 (estritamente associado a RGI); e ramnogalacturonano II (RGII), uma unidade menor particularmente complexa que contém açúcares incomuns, por exemplo, apiose. Uma unidade de RGII pode conter dois resíduos de apiosil que, sob condições iônicas adequadas, podem formar de maneira reversível ésteres com borato.

[057] Uma composição para o uso em um método da invenção compreende, de preferência, ao menos duas atividades, embora tipicamente uma composição irá compreender mais que duas atividades, por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou mais. Tipicamente, uma composição da invenção pode compreender ao menos duas celulases diferentes ou uma celulase e ao menos uma hemicelulase. Uma composição da invenção pode compreender celulases, mas nenhuma xilanase. Além disso, uma composição da invenção pode compreender atividade de enzima auxiliar, isto é, atividade adicional que, de maneira direta ou indireta conduz à degradação de lignocelulose. Os exemplos de tais atividades auxiliares são mencionados no presente documento.

[058] Desse modo, uma composição para o uso na invenção pode compreender GH61, atividade de endoglucanase e/ou atividade de celobiohidrolase e/ou atividade de βglucosidase. Uma composição para o uso na invenção pode compreender mais que uma atividade de enzima em uma ou mais dentre aquelas classes. Por exemplo, uma composição para o uso na invenção pode compreender duas atividades de endoglucanase, por exemplo, atividade de endo-1,3(1,4)-β glucanase e atividade de endo-e-1,4-glucanase. Tal composição também pode compreender uma ou mais atividades

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25/75 de xilanase. Tal composição pode compreender uma atividade de enzima auxiliar.

[059] Uma composição para o uso na invenção pode ser derivada a partir de Rasamsonia emersonii. Na invenção, é previsto que um conjunto central de atividades de enzima (de degradação de lignocelulose) pode ser derivado a partir de Rasamsonia emersonii. Rasamsonia emersonii pode fornecer um conjunto altamente eficaz de atividades, conforme demonstrado no presente documento para a hidrólise de biomassa lignocelulósica. Essa atividade pode ser, então, suplementada com atividades de enzima adicionais a partir de outras fontes. Tais atividades adicionais podem ser derivadas a partir de fontes clássicas e/ou produzidas por um organismo geneticamente modificado.

[060] As atividades em uma composição para o uso na invenção podem ser termoestáveis. No presente documento, isso significa que a atividade tem uma temperatura ideal de cerca de 60 °C ou maior, por exemplo, cerca de 70 °C ou maior, tal como cerca de 75 °C ou maior, por exemplo, cerca de 80 °C ou maior, tal como 85 °C ou maior. As atividades em uma composição para o uso na invenção tipicamente não terão a mesma temperatura ideal, mas, de preferência, serão, no entanto, termoestáveis.

[061] Além disso, as atividades de enzima em uma composição para o uso na invenção podem ter capacidade para funcionar em baixo pH. Para os propósitos dessa invenção, baixo pH indica um pH de cerca de 5,5 ou menor, cerca de 5 ou menor, cerca de 4,9 ou menor, cerca de 4,8 ou menor, cerca de 4,7 ou menor, cerca de 4,6 ou menor, cerca de 4,5 ou menor, cerca de 4,4 ou menor, cerca de 4,3 ou menor,

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26/75 cerca de 4,2 ou menor, cerca de 4,1 ou menor, cerca de 4,0 ou menor cerca de 3,9 ou menor, cerca de 3,8 ou menor, cerca de 3,7 ou menor, cerca de 3,6 ou menor, ou cerca de 3,5 ou menor.

[062] As atividades em uma composição para o uso na invenção podem ser definidas por uma combinação de qualquer um dos valores de pH e temperatura ótima acima.

[063] A composição usada em um método da invenção pode compreender, adicionalmente às atividades derivadas a partir de Rasamsonia, uma celulase (por exemplo, uma derivada a partir de uma fonte diferente de Rasamsonia) e/ou uma hemicelulase (por exemplo, uma derivada a partir de uma fonte diferente de Rasamsonia) e/ou uma pectinase.

[064] Uma composição para o uso na invenção pode compreender uma, duas, três, quatro classes ou mais de celulase, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou todos dentre uma GH61, uma endoglucanase (EG), uma ou duas exocelobiohidrolase (CBH) e uma β- glucosidase (BG). Uma composição para o uso na invenção pode compreender duas ou mais dentre qualquer uma dessas classes de celulase.

[065] Uma composição da invenção pode compreender uma atividade que tem um tipo diferente de atividade de celulase e/ou atividade de hemicelulase e/ou atividade de pectinase daquela fornecida pela composição para o uso em um método da invenção. Por exemplo, uma composição da invenção pode compreender um tipo de atividade de celulase e/ou hemicelulase e/ou atividade de pectinase fornecida por uma composição, conforme descrito no presente documento e um segundo tipo de atividade de celulase e/ou hemicelulase e/ou atividade de pectinase fornecido por uma

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2Ί/Ί5 celulose/hemicelulase/pectinase adicional.

[066] No presente documento, uma celulase é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para degradar ou modificar celulose. Um polipeptídeo que tem capacidade para degradar celulose é aquele que tem capacidade para catalisar o processo de decomposição de celulose em unidades menores, parcialmente, por exemplo, em celodextrinas, ou completamente em monômeros de glicose. Uma celulase, de acordo com a invenção, pode dar origem a uma população mista de celodextrinas e monômeros de glicose, quando colocada em contato com a celulase. Tal degradação tipicamente irá ocorrer por meio de uma reação de hidrólise.

[067] As proteínas GH61 (família de glicosídeo hidrolase 61 ou às vezes mencionado como EGIV) são monooxigenases de polissacarídeo dependentes de oxigênio (PMO's) de acordo com a última literatura. Muitas vezes, na literatura, essas proteínas são mencionadas por intensificar a ação de celulases sobre substratos de lignocelulose. GH61 foi originalmente classificada como endogluconase com base na medição de atividade de endo-1,4β-d-glucanase muito fraca em um membro da família. O termo GH61, para uso no presente documento, deve ser compreendido como uma família de enzimas, as quais compartilham porções de sequência conservadas comuns e enovelamentos a serem classificados na família 61 do sistema de classificação CAZY GH bem estabelecido (http://www.cazy.org/GH61.html). A família de glicosídeo hidrolase 61 é um membro da família de glicosídeo hidrolases EC 3.2.1. GH61 é usado no presente documento

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28/75 como sendo parte das celulases.

[068] No presente documento, uma hemicelulase é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para degradar ou modificar hemicelulose. Isto é, uma hemicelulase pode ter capacidade para degradar ou modificar um ou mais dentre xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano e xiloglucano. Um polipeptídeo que tem capacidade para degradar uma hemicelulose é aquele que tem capacidade para catalisar o processo de decomposição da hemicelulose em polissacarídeos menores, parcialmente, por exemplo, em oligossacarídeos, ou completamente em monômeros de açúcar, por exemplo, monômeros de açúcar hexose ou pentose. Uma hemicelulase de acordo com a invenção pode dar origem a uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar quando colocada em contato com a hemicelulase. Tal degradação tipicamente irá ocorrer por meio de uma reação de hidrólise.

[069] No presente documento, uma pectinase é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para degradar ou modificar pectina. Um polipeptídeo que tem capacidade para degradar pectina é aquele que tem capacidade para catalisar o processo de decomposição de pectina em unidades menores, parcialmente, por exemplo, em oligossacarídeos, ou completamente em monômeros de açúcar. Uma pectinase de acordo com a invenção pode dar origem a uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar quando colocada em contato com a pectinase. Tal degradação tipicamente irá ocorrer por meio de uma reação de hidrólise.

[070] Consequentemente, uma composição da invenção pode compreender qualquer celulase, por exemplo, um GH61, uma

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29/75 mencionada como celobiohidrolase, celobiohidrolase, uma endo-β-1,4-glucanase, uma βglucosidase ou uma β-(1,3)(1,4)-glucanase.

[071] No presente documento, uma celobiohidrolase (EC 3.2.1.91) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosídicas em celulose ou celotetraose, liberar celobiose a partir das extremidades das cadeias. Essa enzima também pode ser celulase 1,4-β-celobiosidase, 1,4-β1,4^-D-glucano celobiohidrolase, avicelase, exo-1,4^-D-glucanase, exocelobiohidrolase ou exoglucanase.

[072] No presente documento, uma endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4^-Dglucosídicas em celulose, liquenina ou β-D-glucanos cereais. Tal polipeptídeo também pode ter capacidade para hidrolisar 1,4-ligações em β-D-glucanos que também contém

1,3-ligações. Essa enzima também pode ser mencionada como celulase, avicelase, β-1,4-endoglucano hidrolase, β-1,4glucanase, carboximetil celulase, celudextrinase, endo-1,4β-D-glucanase, endo-1,4-β-D-glucanohidrolase, βπάα-1,4-βglucanase ou endoglucanase.

[073] No presente documento, uma β-glucosidase (EC

3.2.1.21) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-glicose não redutores terminais com liberação de β-D-glicose. Tal polipeptídeo pode ter uma ampla especificidade para β-Dglucosídeos e também pode hidrolisar um ou mais dentre os seguintes: um β-D-galactosídeo, um α-L-arabinosídeo, um βD-xilosídeo ou um β-D-fucosídeo. Essa enzima também pode

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30/75 ser mencionada como amigdalase, β-D-glucosídeo glucohidrolase, celobiase ou gentobiase.

[074] No presente documento, uma e-(1,3)(1,4)-glucanase (EC 3.2.1.73) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de ligações 1,4-e-D-glucosídicas em β-D-glucanos que contêm 1,3- e 1,4-ligações. Tal polipeptídeo pode agir sobre liquenina e β-D-glucanos cereais, mas não sobre β-D-glucanos que contêm somente 1,3ou 1,4-ligações. Essa enzima também pode ser mencionada como liqueninase, 1,3-1,4-β-D-glucano 4-glucanoohidrolase, β-glucanase, βπάα-β-1,3-1,4 glucanase, liquenase ou βglucanase de ligação mista. Uma alternativa para esse tipo de enzima é EC 3.2.1.6, o qual é descrito como endo-1,3(4)beta-glucanase. Esse tipo de enzima hidrolisa 1,3- ou 1,4ligações em beta-D-glucanose, quando o resíduo de glicose, cujo grupo redutor está envolvido na ligação a ser hidrolisada, é por si mesmo substituído em C-3. Os nomes alternativos incluem endo-1,3-beta-glucanase, laminarinase,

1,3-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolase; os substratos incluem laminarina, liquenina e beta-D-glucanos cereais.

[075] Uma composição da invenção pode compreender qualquer hemicelulase, por exemplo, uma endoxilanase, uma β-xilosidase, uma α-L-arabionofuranosidase, uma α-Dglucuronidase, uma acetil xilano esterase, uma feruloil esterase, uma coumaroil esterase, uma α-galactosidase, uma β-galactosidase, uma β-mananase ou uma β-manosidase.

[076] No presente documento, uma endoxilanase (EC

3.2.1.8) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-β-D-xilosídicas

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31/75 em xilanos. Essa enzima também pode ser mencionada como endo-1,4-β-xilanase ou 1,4-β-D-xilano xilanohidrolase. Uma alternativa é EC 3.2.1.136, uma glucuronoarabinoxilano endoxilanase, uma enzima que tem capacidade para hidrolisar ligações 1,4 xilosídicas em glucuronoarabinoxilanos.

[077] No presente documento, uma β-xilosidase (EC 3.2.1.37) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de 1,4-e-D-xilanos, para remover resíduos de D-xilose sucessivos a partir das terminações não redutoras. Tais enzimas também podem hidrolisar xilobiose. Essa enzima também pode ser mencionada como xilano 1,4-β-xilosidase, 1,4-β-D-xilano xilohidrolase, exo1,4-e-xilosidase ou xilobiase.

[078] No presente documento, uma α-Larabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para agir sobre α-L-arabinofuranosídeos, α-L-arabinanos contendo (1,2) e/ou (1,3)-e/ou (1,5)ligações, arabinoxilanos e arabinogalactanos. Essa enzima também pode ser mencionada como α-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.

[079] No presente documento, uma α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.139) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar uma reação da forma a seguir: alfa-Dglucuronosídeo + H(2)O = um álcool + D-glucuronato. Essa enzima também pode ser mencionada como alfa-glucuronidase ou alfa-glucosiduronase. Essas enzimas também podem hidrolisar ácido glucorônico 4-O-metilado, o qual também pode estar presente como um substituinte em xilanos. A alternativa é EC 3.2.1.131: xilano alfa-1,2glucuronosidase, o qual catalisa a hidrólise de ligações de

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32/75 alfa-1,2-(4-O-metil)glucuronosil.

[080] No presente documento, um acetil xilano esterase (EC 3.1.1.72) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a desacetilação de xilanos e xilooligossacarídeos. Tal polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de grupos acetila a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, alfa-naftil acetato ou p-nitrofenil acetato, mas, tipicamente, não a partir de triacetilglicerol. Tal polipeptídeo tipicamente não age sobre pectina ou manano acetilado.

[081] No presente documento, um feruloil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar uma reação da forma: feruloil-sacarídeo + H(2)O = ferulato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Pode tipicamente catalisar a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir de um açúcar esterificado, o qual é usualmente arabinose em substratos 'naturais', p-nitrofenol acetato e metil ferulato são tipicamente substratos mais insatisfatórios. Essa enzima também pode ser mencionada como cinamoil éster hidrolase, ácido ferúlico esterase ou hidroxicinamoil esterase. Também pode ser mencionada como uma enzima secundária hemicelulase, uma vez que a mesma ajuda xilanases e pectinases a decompor hemicelulose e pectina de parede celular de planta.

[082] No presente documento, uma coumaroil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar uma reação da forma: coumaroil-sacarídeo + H(2)O = coumarato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Essa enzima também

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33/75 pode ser mencionada como trans-4-coumaroil esterase, transp-coumaroil esterase, p-coumaroil esterase ou ácido pcoumárico esterase. Essa enzima também se inclui em EC 3.1.1.73, assim, também pode ser mencionada como uma feruloil esterase.

[083] No presente documento, uma α-galactosidase (EC

3.2.1.22) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de resíduos de α-D-galactose não redutores terminais em α-D-galactosídeos, que incluem oligossacarídeos de galactose, galactomananos, galactanos e arabinogalactanos. Tal polipeptídeo também pode ter capacidade para hidrolisar α-D-fucosídeos. Essa enzima também pode ser mencionada como melibiase.

[084] No presente documento, uma β-galactosidase (EC

3.2.1.23) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-galactose não redutores terminais em β-D-galactosídeos. Tal polipeptídeo também pode ter capacidade para hidrolisar α-Larabinosídeos. Essa enzima também pode ser mencionada como exo-(1->4)-e-D-galactanase ou lactase.

[085] No presente documento, uma β-mananase (EC 3.2.1.78) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-β-Όmanosídicas em mananos, galactomananos e glucomananos. Essa enzima também pode ser mencionada como manano endo-1,4-emanosidase ou endo-1,4-mananase.

[086] No presente documento, uma β-manosidase (EC 3.2.1.25) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-manose não redutores terminais em β-D-manosídeos. Essa enzima também

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34/75 pode ser mencionada como mananase ou manase.

[087] Uma composição da invenção pode compreender qualquer pectinase, por exemplo, uma endo poligalacturonase, uma pectina metil esterase, uma endogalactanase, uma beta galactosidase, uma pectina acetil esterase, uma endo-pectina liase, pectato liase, alfa ramnosidase, uma exo-galacturonase, uma expoligalacturonato liase, uma ramnogalacturonano hidrolase, uma ramnogalacturonano liase, uma ramnogalacturonano acetil esterase, uma ramnogalacturonano galacturonohidrolase, uma xilogalacturonase.

[088] No presente documento, uma endo-poligalacturonase (EC 3.2.1.15) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-a-Dgalactosidurônicas em pectato e outros galacturonanos. Essa enzima também pode ser mencionada como poligalacturonase pectina depolimerase, pectinase, endopoligalacturonase, pectolase, pectina hidrolase, pectina poligalacturonase, poli-a-1,4-galacturonídeo glicanohidrolase, endogalacturonase; endo-D-galacturonase ou poli(1,4-a-Dgalacturonídeo) glicanohidrolase.

[089] No presente documento, uma pectina metil esterase (EC 3.1.1.11) é qualquer enzima que tem capacidade para catalisar a reação: pectina + n H2O = n metanol + pectato. A enzima também pode ser conhecida como pectinesterase, pectina demetoxilase, pectina metoxilase, pectina metilesterase, pectase, pectinoesterase ou pectina pectilhidrolase.

[090] No presente documento, uma endo-galactanase (EC

3.2.1.89) é qualquer enzima com capacidade para catalisar a

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35/75 endo-hidrólise de ligações 1,4-β-D-galactosídicas em arabinogalactanos. A enzima também pode ser conhecida como arabinogalactano endo-1,4-p-galactosidase, endo-1,4-pgalactanase, galactanase, arabinogalactanase ou arabinogalactano 4- β-D-galactanohidrolase.

[091] No presente documento, uma pectina acetil esterase é definida no presente documento como qualquer enzima que tem uma atividade de acetil esterase que catalisa a desacetilação dos grupos acetila nos grupos hidroxila de resíduos GaIUA de pectina.

[092] No presente documento, uma endo-pectina liase (EC 4.2.2.10) é qualquer enzima com capacidade para catalisar a clivagem eliminadora de metil éster (1^4)-α-D-galacturonano para proporcionar oligossacarídeos com grupos 4-desoxi-6-Ometil-a-D-galact-4-enuronosila em suas extremidades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida como pectina liase, pectina trans-eliminase; endo-pectina liase, transeliminase polimetilgalacturônica, pectina metiltranseliminase, pectoliase, PL, PNL ou PMGL ou (1^4)6-O-metil-α-D-galacturonano liase.

[093] No presente documento, uma pectato liase (EC 4.2.2.2) é qualquer enzima com capacidade para catalisar a clivagem eliminadora de (1^4)-α-D-galacturonano para proporcionar oligossacarídeos com grupos 4-desoxi-a-Dgalact-4-enuronosila em suas extremidades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida como transeliminase poligalacturônica, ácido péctico transeliminase, poligalacturonato liase, endopectina metiltranseliminase, pectato transeliminase, endogalacturonato transeliminase, ácido péctico liase, liase péctica, ácido a-1,4-DPetição 870160072633, de 05/12/2016, pág. 42/85

36/75 endopoligalacturônico liase, PGA liase, PPase-N, ácido endo-a-1,4-poligalacturônico liase, ácido poligalacturônico liase, pectina trans-eliminase, ácido poligalacturônico trans-eliminase ou (1 ·4) - α-D-galacturonano liase.

[094] No presente documento, uma alfa ramnosidase (EC 3.2.1.40) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de resíduos de α-L-ramnose não redutores terminais em α-L-ramnosídeos ou alternativamente em ramnogalacturonano. Essa enzima também pode ser conhecida como α-L-ramnosidase T, α-L-ramnosidase N ou a-Lramnosídeo ramnohidrolase.

[095] No presente documento, exo-galacturonase (EC 3.2.1.82) é qualquer polipeptídeo com capacidade para hidrólise de ácido péctico a partir da extremidade não redutora, liberando-se digalacturonato. A enzima também pode ser conhecida como exo-poli-a-galacturonosidase, exopoligalacturonosidase ou exopoligalacturanosidase.

[096] No presente documento, exo-galacturonase (EC 3.2.1.67) é qualquer polipeptídeo com capacidade para catalisar: (1,4-a-D-galacturonídeo)_n + H₂O = (1,4-a-Dgalacturonídeo)n-1 + D-galacturonato. A enzima também pode ser conhecida como galacturano 1,4-a-galacturonidase, exopoligalacturonase, poli(galacturonato) hidrolase, exo-Dgalacturonase, exo-D-galacturonanase, exopoli-Dgalacturonase ou poli(1,4-a-D-galacturonídeo) galacturonohidrolase.

[097] No presente documento, exopoligalacturonato liase (EC 4.2.2.9) é qualquer polipeptídeo com capacidade para catalisar a clivagem eliminadora de 4-(4-desoxi-a-D-galact4-enuronosil)-D-galacturonato a partir da extremidade

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37/75 redutora de pectato, isto é, pectina desesterificada. Essa enzima pode ser conhecida como pectato dissacarídeo-liase, pectato exo-liase, transeliminase de ácido exopéctico, exopectato liase, exopoligalacturônico, PATE, extremidade redutora de dissacarídeo-liase.

[098] No presente ácido-trans-eliminase exo-PATE, exo-PGL ou (1^4) -α-D-galacturonanodocumento, ramnogalacturonano hidrolase é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para hidrolisar a ligação entre ácido galactosilurônico e ramnopiranosila de um modo endo em estruturas de ramnogalacturonano estritamente alternadas, que consistem no dissacarídeo [ácido (1,2-alfa-L-ramnoil-(1,4)-alfagalactosilurônico].

[099] No presente documento, ramnogalacturonano liase é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para clivar ligações de α-L-Rhap- (1^4) -α-D-GalpA em um modo endo em ramnogalacturonano através de eliminação beta.

[100] No presente documento, ramnogalacturonano acetil esterase é qualquer polipeptídeo que catalisa a desacetilação da cadeia principal de resíduos de ácido galacturônico e ramnose alternados em ramnogalacturonano.

[101] No presente documento, ramnogalacturonano galacturonohidrolase é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para hidrolisar ácido galacturônico a partir da extremidade não redutora de estruturas de ramnogalacturonano estritamente alternadas de um modo exo.

[102] No presente documento, xilogalacturonase é qualquer polipeptídeo que age sobre xilogalacturonano através da clivagem da cadeia principal de ácido

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38/75 galacturônico β-xilose substituída de uma maneira endo. Essa enzima também pode ser conhecida como xilogalacturonano hidrolase.

[103] No presente documento, um α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para agir sobre α-L-arabinofuranosídeos, α-L-arabinanos contendo (1,2) e/ou (1,3) e/ou (1,5)-ligações, arabinoxilanos e arabinogalactanos. Essa enzima também pode ser mencionada como α-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.

[104] No presente documento, endo-arabinanase (EC 3.2.1.99) é qualquer polipeptídeo que tem capacidade para catalisar endo-hidrólise de ligações 1,5-αarabinofuranosídicas em 1,5-arabinanos. A enzima também pode ser conhecida como endo-arabinase, arabinano endo-1,5α-L-arabinosidase, endo-1,5-a-L-arabinanase, endo-a-1,5arabanase; endo-arabanase ou 1,5-a-L-arabinano 1,5-a-Larabinano hidrolase.

[105] A composição da invenção tipicamente irá compreender ao menos uma celulase e/ou ao menos uma hemicelulase e/ou ao menos uma pectinase (das quais uma é um polipeptídeo de acordo com a invenção). Uma composição da invenção pode compreender um GH61, um celobiohidrolase, uma endoglucanase e/ou a β-glucosidase. Tal composição também pode compreender uma ou mais hemicelulases e/ou uma ou mais pectinases.

[106] Além disso, um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro ou todos) dentre uma amilase, uma protease, uma lipase, uma ligninase, uma hexosiltransferase, uma glucuronidase ou uma expansina ou uma proteína induzida por

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39/75 celulose ou uma proteína de integração de celulose ou proteína similar podem estar presentes em uma composição da invenção (esses são mencionados como atividades auxiliares acima).

[107] Protease inclui enzimas que hidrolisam ligações de peptídeo (peptidases), assim como enzimas que hidrolisam ligações entre peptídeos e outras porções químicas, tais como açúcares (glicopeptidases). Muitas proteases são caracterizadas sob EC 3.4, e são adequadas para o uso na invenção incorporadas no presente documento a título de referência. Alguns tipos específicos de proteases incluem, cisteína proteases que incluem pepsina, papaína e serina proteases que incluem quimotripsinas, carboxipeptidases e metaloendopeptidases.

[108] Lipase inclui enzimas que hidrolisam lipídios, ácidos graxos e acilglicerídeos, que incluem fosfoglicerídeos, lipoproteínas, diacilgliceróis, e similares. Em plantas, os lipídios são usados como componentes estruturais para limitar a perda de água e infecção de patógeno. Esses lipídios incluem ceras derivadas de ácidos graxos, assim como cutina e suberina.

[109] Ligninase inclui enzimas que podem hidrolisar ou decompor a estrutura de polímeros de lignina. As enzimas que podem decompor lignina incluem lignina peroxidases, manganês peroxidases, laccases e feruloil esterases, e outras enzimas descritas na técnica, conhecidas por despolimerizar ou de outra forma decompor polímeros de lignina. Também são incluídas as enzimas com capacidade para hidrolisar ligações formadas entre açúcares hemicelulósicos (notavelmente arabinose) e lignina. As

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40/75 ligninases incluem, porém sem limitação, o seguinte grupo de enzimas: lignina peroxidases (EC 1.11.1.14), manganês peroxidases (EC 1.11.1.13), laccases (EC 1.10.3.2) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73).

[110] Hexosiltransferase (2.4.1-) inclui enzimas que têm capacidade para catalisar uma reação de transferase, mas que também podem catalisar uma reação de hidrólise, por exemplo, de celulose e/ou produtos de degradação de celulose. Um exemplo de uma hexosiltransferase que pode ser usada na invenção é uma β-glucanosiltransferase. Tal enzima

pode ser	capaz de	catalisar a	degradação	de
(1,3) (1,4)glucano e/ou	celulose e/ou	um produto	de
degradação [111]	de celulose. Glucuronidase	inclui enzimas	que catalisam	a

hidrólise de um glucoronosídeo, por exemplo, βglucuronosídeo para render um álcool. Muitas glucuronidases têm sido caracterizadas e podem ser adequadas para o uso na invenção, por exemplo, β-glucuronidase (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidase (EC 3.2.1.36), glucuronosildisulfoglucosamina glucuronidase (3.2.1.56), glicirrizinato β-glucuronidase (3.2.1.128) ou α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.139).

[112] Uma composição para o uso na invenção pode compreender uma expansina ou proteína semelhante à expansina, tal como uma swolenina (consulte Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202 a 4211, 2002) ou uma proteína semelhante à swolenina.

[113] As expansinas estão envolvidas no relaxamento da estrutura de parede celular durante o crescimento de célula de planta. As expansinas têm sido propostas para

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41/75 interromper a ligação de hidrogênio entre celulose e outros polissacarídeos de parede celular sem que tenha atividade hidrolítica. Dessa forma, acredita-se que as mesmas permitam o deslizamento de fibras de celulose e alargamento da parede celular. A swolenina, uma proteína semelhante à expansina, contém um domínio de módulo de ligação a carboidrato (CBD) de família 1 N-terminal e um domínio semelhante à expansina C-terminal. Para os propósitos dessa invenção, uma proteína semelhante à expansina ou proteína semelhante à swolenina pode compreender um ou ambos tais domínios e/ou pode interromper a estrutura de paredes celulares (tal como interromper estrutura de celulose), opcionalmente sem produzir quantidades detectáveis de açúcares de redução.

[114] Uma composição para o uso na invenção pode ser uma proteína induzida por celulose, por exemplo, o produto de polipeptídeo do gene cip1 ou cip2 ou genes similares (consulte Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31988 a 31997, 2003), uma proteína de integração de celulose/celulosoma, por exemplo, o produto de polipeptídeo do gene cipA ou cipC, ou uma escafoldina ou uma proteína semelhante à escafoldina. As escafoldinas e proteínas de integração de celulose são subunidades de integração multifuncionais que podem organizar subunidades celulolíticas em um complexo de multienzima. Isso é realizado pela interação de duas classes complementares de domínio, isto é, um domínio de coesão na escafoldina e um domínio de dockerina em cada unidade enzimática. A subunidade de escafoldina também suporta um módulo de ligação à celulose (CBM) que media a fixação do celulosoma

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42/75 a seu substrato. Uma escafoldina ou proteína de integração de celulose, para os propósitos dessa invenção, pode compreender um ou ambos tais domínios.

[115] Uma composição para o uso em um método da invenção pode ser composta de um membro de cada uma das classes de enzimas mencionadas acima, vários membros de uma classe de enzima, ou qualquer combinação dessas classes de enzimas ou proteínas auxiliares (isto é, aquelas proteínas mencionadas no presente documento que não têm atividade enzimática por si mesmas, mas mesmo assim auxiliam na degradação lignocelulósica).

[116] Uma composição para o uso em um método da invenção pode ser composta de enzimas a partir de (1) fornecedores comerciais; (2) genes clonados que expressam enzimas; (3) caldo complexo (tal como aquele que resulta a partir do crescimento de uma cepa microbiana no meio, em que as cepas secretam proteínas e enzimas no meio; (4) lisatos de célula de cepas desenvolvidas conforme em (3); e/ou (5) material de planta que expressa enzimas. Diferentes enzimas em uma composição da invenção podem ser obtidas a partir de diferentes fontes.

[117] As enzimas podem ser produzidas de maneira exógena em micro-organismos, leveduras, fungos, bactérias ou plantas, então, isoladas e adicionadas, por exemplo, à matéria-prima lignocelulósica. Alternativamente, as enzimas são produzidas, mas não isoladas, e o caldo de fermentação de massa celular bruta, ou material de planta (tal como restos culturais do milho ou palha de trigo), e similares, pode ser adicionado, por exemplo, à matéria-prima. Alternativamente, a massa celular bruta, meio de produção

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43/75 de enzima ou material de planta pode ser tratado para evitar crescimento microbiano adicional (por exemplo, através do aquecimento ou adição de agentes antimicrobianos), então, adicionado, por exemplo, a uma matéria-prima. Essas misturas de enzima bruta podem incluir o organismo que produz a enzima. Alternativamente, a enzima pode ser produzida em uma fermentação que usa matéria-prima (pré-tratada) (tal como, restos culturais do milho ou palha de trigo) para fornecer nutrição para um organismo que produz uma(s) enzima(s). Dessa maneira, as plantas que produzem as enzimas podem por si mesmas servirem como uma matéria-prima lignocelulósica e serem adicionadas na matéria-prima lignocelulósica.

[118] Nos usos e métodos descritos no presente documento, os componentes das composições descritas acima podem ser fornecidas de maneira concomitante (isto é, como uma única composição por si mesmo), separada ou sequencial.

[119] A invenção, desse modo, se refere a métodos em que a composição descrita acima é usada e a usos da composição em processos industriais.

MATERIAL LIGNOCELULÓSICO [120] O material lignocelulósico no presente documento inclui qualquer material lignocelulósico e/ou hemicelulósico. O material lignocelulósico adequado para o uso como matéria-prima na invenção inclui biomassa, por exemplo, biomassa virgem e/ou biomassa não virgem, tal como biomassa agrícola, produtos orgânicos comerciais, detritos de construção e demolição, resíduos sólidos da rede pública, papel usado e restos culturais. As formas comuns de biomassa incluem árvores, arbustos e gramíneas, trigo,

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44/75 palha de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, painço, miscanthus, milho, restos culturais do milho, cascas de milho, espigas de milho, caules de canola, caules de soja, sorgo sacarino, grãos de milho que incluem fibra a partir de grãos, produtos e subprodutos a partir da moagem de grãos, tais como milho, trigo e cevada (que incluem moagem úmida e moagem seca) muitas vezes chamados de “farelo ou fibra”, assim como resíduos sólidos da rede pública, papel usado e restos culturais. A biomassa também pode ser, porém sem limitação, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos da rede pública, papel usado, e polpa e resíduos de moagem de papel. “Biomassa agrícola” inclui ramos, arbustos, canas, milho e cascas de milho, cultivos para a produção de energia, florestas, frutas, flores, grãos, gramíneas, culturas herbáceas, folhas, cortiça, acículas, lenhas, raízes, renovos, culturas de madeira de rotação curta, moitas, painços, árvores, vegetais, cascas de fruta, videiras, polpa de beterraba, trigo moído, cascas de aveia, e madeiras duras e moles (que não inclui madeiras com materiais deletérios). Além disso, a biomassa agrícola inclui materiais residuais orgânicos gerados a partir processos agrícolas que incluem atividades florestais e rurais, especificamente que incluem resíduo de madeira florestal. A biomassa agrícola pode ser qualquer um dos mencionados anteriormente de forma singular ou em qualquer combinação ou mistura dos mesmos.

PRE-TRATAMENTO [121] A matéria-prima pode ser opcionalmente prétratada com modificação térmica, mecânica e/ou química ou

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45/75 qualquer combinação de tais métodos, a fim de aprimorar a acessibilidade do substrato à hidrólise enzimática e/ou hidrolisar a hemicelulose e/ou solubilizar a hemicelulose e/ou celulose e/ou lignina, de qualquer maneira conhecida na técnica. Em uma modalidade, o pré-tratamento é conduzido tratando-se a lignocelulose com explosão de vapor, tratamento de água quente ou tratamento com ácido diluído ou base diluída.

ETAPA DE LAVAGEM [122] Opcionalmente, o processo de acordo com a invenção compreende uma etapa de lavagem. A etapa de lavagem opcional pode ser usada para remover compostos solúveis em água que podem agir como inibidores para a etapa de fermentação. A etapa de lavagem pode ser conduzida de maneira conhecida.

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA [123] A composição de enzima usada no processo da invenção pode hidrolisar de maneira extremamente eficaz material lignocelulolítico, por exemplo, restos culturais do milho ou palha de trigo, os quais podem ser, então, adicionalmente convertidos em um produto útil, tal como etanol, biogás, butanol, ácido láctico, um plástico, um ácido orgânico, um solvente, um suplemento alimentar para animal, um produto farmacêutico, uma vitamina, um aminoácido, uma enzima ou uma matéria-prima química. Adicionalmente, os produtos intermediários a partir de um processo após a hidrólise, por exemplo, ácido láctico como intermediário na produção de biogás, podem ser usados como elemento fundamental para outros materiais. A presente invenção é exemplificada com a produção de etanol, mas isso

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46/75 é feito como exemplificação somente em vez de como limitação, os outros produtos úteis mencionados podem ser produzidos igualmente bem.

[124] O processo de acordo com a invenção compreende uma etapa de hidrólise enzimática. A hidrólise enzimática inclui, porém sem limitação, hidrólise para o propósito de liquificação da matéria-prima e hidrólise para os propósitos de liberar açúcar a partir da matéria-prima ou ambos. Nessa etapa, o material lignocelulósico opcionalmente pré-tratado e opcionalmente lavado é colocado em contato com a composição de enzima, de acordo com a invenção. Dependendo do material lignocelulósico e do prétratamento, as diferentes condições de reação, por exemplo, temperatura, dosagem de enzima, tempo de reação de hidrólise e concentração de matéria seca, podem ser adaptadas pelo elemento versado na técnica, a fim de alcançar uma conversão desejada de lignocelulose em açúcar. Algumas indicações são dadas doravante.

[125] Em um aspecto da invenção, a hidrólise é conduzida em uma temperatura de 45 °C ou mais, de 50 °C ou mais, 55 °C ou mais, 60 °C ou mais, 65 °C ou mais ou 70 °C ou mais. A alta temperatura durante a hidrólise tem muitas vantagens, as quais incluem trabalho na temperatura ideal da composição de enzima, a redução de risco de contaminação (bacteriana), viscosidade reduzida, menor quantidade de água de resfriamento exigida, uso de água de resfriamento com uma temperatura superior, reuso das enzimas e muito mais.

[126] Em um aspecto adicional da invenção, a quantidade de composição de enzima adicionada (no presente documento

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47/75 também chamada de dosagem de enzima ou carga de enzima) é baixa. Em uma modalidade, a quantidade de enzima é de 6 mg de proteína/ g de peso de matéria seca ou menor, 5 mg de proteína/ g de matéria seca ou menor, 4 mg de proteína/ g de matéria seca ou menor, 3 mg de proteína/ g de matéria seca ou menor, 2 mg de proteína/ g de matéria seca ou menor, ou 1 mg de proteína/ g de matéria seca ou menor (expressado como proteína em mg de proteína/ g de matéria seca) . Em uma modalidade, a quantidade de enzima é de 0,5

mg de	enzima /	g de peso	de	matéria seca	ou menor,	0,4	mg
de composição	de enzima	/	g de peso de	matéria	seca	ou
menor,	0,3 mg	de enzima	/	g de peso de	matéria	seca	ou
menor,	0,25 mg	de enzima	/	g de peso de	matéria	seca	ou
menor,	0,20 mg	de enzima	/	g de peso de	matéria	seca	ou
menor,	0,18 mg	de enzima	/	g de peso de	matéria	seca	ou
menor,	0,15 mg	de enzima	/	g de peso de	matéria	seca	ou

menor ou 0,10 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menor (expressado como total de enzimas de celulase em mg de enzima / g de matéria seca). A dosagem baixa de enzima é possível, uma vez que devido à atividade e estabilidade das enzimas, é possível aumentar o tempo de reação de hidrólise.

[127] Em um aspecto adicional da invenção, o tempo de reação de hidrólise é de 5 horas ou mais, 10 horas ou mais, 20 horas ou mais, 40 horas ou mais, 50 horas ou mais, 60 horas ou mais, 70 horas ou mais, 80 horas ou mais, 90 horas ou mais, 100 horas ou mais, 120 horas ou mais, 130 h ou mais. Em outro aspecto, o tempo de reação de hidrólise é de 5 a 150 horas, 40 a 130 horas, 50 a 120 horas, 60 a 120 horas, 60 a 110 horas, 60 a 100 horas, 70 a 100 horas, 70 a

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48/75 horas ou 70 a 80 horas. Devido à estabilidade da composição de enzima, tempos de reação de hidrólise mais longos são possíveis com rendimentos de açúcar superiores correspondentes.

[128] O pH durante a hidrólise pode ser escolhido pelo elemento versado na técnica. Em um aspecto adicional da invenção, o pH durante a hidrólise pode ser de 3,0 a 6,4. As enzimas estáveis da invenção podem ter uma ampla faixa de pH de até 2 unidades de pH, até 3 unidades de pH, até 5 unidades de pH. O pH ideal pode se situar dentro dos limites de pH 2,0 a 8,0, 3,0 a 8,0, 3,5 a 7,0, 3,5 a 6,0, 3,5 a 5,0, 3,5 a 4,5, 4,0 a 4,5 ou é de cerca de 4,2.

[129] Em um aspecto adicional da invenção, a etapa de hidrólise é conduzida até que 70 % ou mais, 80 % ou mais, 85 % ou mais, 90 % ou mais, 92 % ou mais, 95 % ou mais de açúcar disponível em material lignocelulósico sejam liberados.

[130] Significantemente, um processo da invenção pode ser realizado com o uso de altos níveis de matéria seca (do material lignocelulósico) na reação de hidrólise. Desse modo, a invenção pode ser realizada com um teor de matéria seca de cerca de 5 % em peso ou maior, cerca de 8 % em peso ou maior, cerca de 10 % em peso ou maior, cerca de 11 % em peso ou maior, cerca de 12 % em peso ou maior, cerca de 13 % em peso ou maior, cerca de 14 % em peso ou maior, cerca de 15 % em peso ou maior, cerca de 20 % em peso ou maior, cerca de 25 % em peso ou maior, cerca de 30 % em peso ou maior, cerca de 35 % em peso ou maior ou cerca de 40 % em peso ou maior. Em uma modalidade adicional, o teor de matéria seca na etapa de hidrólise é de 14 % em peso, 15 %

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em peso,

16

o, %

em peso,

17

% em peso

, 18 %

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19

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ou

14 a

33

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peso.

FERMENTAÇÃO [131] O processo de acordo com a invenção compreende uma etapa de fermentação. Em um aspecto adicional, a invenção inclui, desse modo, na etapa, processos de fermentação em que um micro-organismo é usado para a fermentação de uma fonte de carbono que compreende açúcar(es), por exemplo, glicose, L-arabinose e/ou xilose. A fonte de carbono pode incluir qualquer oligo- ou polímero de carboidrato que compreende unidades de L-arabinose, xilose ou glicose, tais como, por exemplo, lignocelulose, xilanos, celulose, amido, arabinano, e similares. Para a liberação de unidades de xilose ou glicose a partir de tais carboidratos, carboidrases adequadas (tais como xilanases, glucanases, amilases, e similares) podem ser adicionadas ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pela célula hospedeira modificada. No último caso, a célula hospedeira modificada pode ser geneticamente modificada para produzir e excretar tais carboidrases. Uma vantagem adicional do uso de fontes oligo- ou poliméricas de glicose é que o mesmo possibilita manter uma baixa (menor) concentração de glicose livre durante a fermentação, por exemplo, com o uso de quantidades limitadoras de taxa das carboidrases. Isso, por sua vez, irá evitar a repressão de sistemas exigidos para o metabolismo e transporte de açúcares diferentes de

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50/75 glicose, tais como xilose. Em um processo preferencial, a célula hospedeira modificada fermenta tanto a L-arabinose (opcionalmente xilose) como a glicose, de preferência, simultaneamente, em tal caso, de preferência, é usada uma célula hospedeira modificada que é insensível à repressão de glicose para evitar o crescimento diauxico. Adicionalmente a uma fonte de L-arabinose, opcionalmente xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação irá compreender, adicionalmente, o ingrediente adequado exigido para o crescimento da célula hospedeira modificada. As composições de meios de fermentação para o crescimento de micro-organismos, tais como leveduras ou fungos filamentosos, são bem conhecidas na técnica.

[132] O tempo de fermentação pode ser mais curto que na fermentação convencional nas mesmas condições, em que parte da hidrólise enzimática ainda tem que participar durante a fermentação. Em uma modalidade, o tempo de fermentação é de 100 horas ou menos, 90 horas ou menos, 80 horas ou menos, 70 horas ou menos, ou 60 horas ou menos, para uma composição de açúcar de 50 g/l de glicose e outros açúcares correspondentes a partir da matéria-prima lignocelulósica (por exemplo, 50 g/l de xilose, 35 g/l de L-arabinose e 10 g/l de galactose. Para composições de açúcar mais diluídas, o tempo de fermentação pode ser correspondentemente reduzido.

[133] O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbico ou anaeróbico. Um processo de fermentação anaeróbico é definido no presente documento como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é

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51/75 consumido, de preferência, menos que 5, 2,5 ou 1 mmol/l/h, com mais preferência, 0 mmol/l/h é consumido (isto é, o consumo de oxigênio não é detectável), e em que as moléculas orgânicas servem tanto como doador de elétrons como aceitador de elétrons. Na ausência de oxigênio, NADH produzido em glicólise e formação de biomassa, não pode ser oxidado por fosforilação oxidante. Para resolver esse problema, muitos micro-organismos usam piruvato ou um de seus derivados como aceitador hidrogênio e elétron, regenerando, assim, NAD+. Desse modo, em um processo de fermentação anaeróbico preferencial, o piruvato é usado como um elétron (e aceitador de hidrogênio) e é reduzido a produtos de fermentação, tais como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico β-lactâmico e uma cefalosporina. Em uma modalidade preferencial, o processo de fermentação é anaeróbico. Um processo anaeróbico é vantajoso, uma vez que é mais econômico que os processos aeróbicos: menos equipamento especial é necessário. Adicionalmente, espera-se que os processos anaeróbicos proporcionem um rendimento de produto maior que os processos aeróbicos. Sob condições aeróbicas, usualmente o rendimento de biomassa é maior que sob condições anaeróbicas. Como consequência, usualmente sob condições aeróbicas, o rendimento de produto esperado é menor que sob condições anaeróbicas.

[134] Em outra modalidade, o processo de fermentação é sob condições de oxigênio limitado. Com mais preferência, o

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52/75 processo de fermentação é aeróbico e sob condições de oxigênio limitado. Um processo de fermentação de oxigênio limitado é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio a partir do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás de entrada, assim como as propriedades de transferência de mistura/massa real do equipamento de fermentação usado. Preferencialmente, em um processo sob condições de oxigênio limitado, a taxa de consumo de oxigênio é de ao menos 5,5, com mais preferência, ao menos 6 e com até mais preferência, ao menos 7 mmol/l/h.

[135] O processo de fermentação é executado, de preferência, em uma temperatura que é ideal para a célula modificada. Desse modo, para a maioria das leveduras ou células fúngicas, o processo de fermentação é realizado em uma temperatura que é menor que 42 °C, de preferência, menor que 38 °C. Para células hospedeiras fúngicas filamentosas ou de levedura, o processo de fermentação é, de preferência, realizado em uma temperatura que é menor que 35, 33, 30 ou 28 °C e uma temperatura que é maior que 20, 22 ou 25 °C.

[136] Em uma modalidade da invenção, na etapa, a fermentação é conduzida com um micro-organismo que é capaz de fermentar ao menos um açúcar C5. Em uma modalidade, o processo é um processo para a produção de etanol de modo que o processo compreenda a etapa que compreende fermentar um meio contendo açúcar(es) com um micro-organismo que é capaz de fermentar ao menos um açúcar C5, de modo que a célula hospedeira tenha capacidade para fermentar glicose,

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L-arabinose e xilose em etanol. Em uma modalidade do mesmo, o micro-organismo que é capaz de fermentar ao menos um açúcar C5 é uma levedura. Em uma modalidade, a levedura pertence ao gênero Saccharomyces, de preferência, é da espécie Saccharomyces cerevisiae, em que modificações genéticas têm sido feitas. Um exemplo de tal microorganismo e sua preparação é descrito em maiores detalhes no documento sob o n^o. WO 2 008/041840 e no pedido de patente europeu n^o. EP10160622.6, depositado no dia 21 de abril de 2010. Em uma modalidade, o processo de fermentação para a produção de etanol é anaeróbico. Anaeróbico já tem sido definido anteriormente no presente documento. Em outra modalidade preferencial, o processo de fermentação para a produção de etanol é aeróbico. Em outra modalidade preferencial, o processo de fermentação para a produção de etanol é sob condições de oxigênio limitado, com mais preferência, aeróbico e sob condições de oxigênio limitado. As condições de oxigênio limitado já têm sido definidas anteriormente no presente documento.

[137] Em tal processo, a produtividade de etanol volumétrica é, de preferência, de ao menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 ou 10,0 g de etanol por litro por hora. O rendimento de etanol em L-arabinose e opcionalmente xilose e/ou glicose no processo de preferência, é de ao menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 98%. O rendimento de etanol é definido no presente documento como uma porcentagem do rendimento máximo teórico, a qual, para glicose e L-arabinose e opcionalmente xilose, é de 0,51 g de etanol por g de glicose ou xilose.

[138] Em um aspecto, o processo de fermentação que

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54/75 conduz à produção de etanol, tem várias vantagens em comparação com os processos de fermentação de etanol conhecidos:

- processos anaeróbicos são possíveis;

- condições de oxigênio limitado também são possíveis;

- rendimentos de etanol e taxas de produção de etanol maiores podem ser obtidos;

- a cepa usada pode ter capacidade para usar Larabinose e opcionalmente xilose.

[139] Alternativamente aos processos de fermentação descritos acima, ao menos duas células distintas podem ser usadas, isso significa que esse processo é um processo de cofermentação. Todas as modalidades preferenciais dos processos de fermentação, conforme descrito acima, também são modalidades preferenciais desse processo de cofermentação: identidade do produto de fermentação, identidade da fonte de L-arabinose e fonte de xilose, condições de fermentação (condições aeróbicas ou anaeróbicas, condições de oxigênio limitado, temperatura na qual o processo está sendo realizado, produtividade de etanol, rendimento de etanol).

[140] O processo de fermentação pode ser realizado sem qualquer exigência para ajustar o pH durante o processo. Isto é, o processo é aquele que pode ser realizado sem a adição de qualquer ácido ou base. Contudo, isso exclui uma etapa de pré-tratamento, em que o ácido pode ser adicionado. O ponto é que a composição da invenção tem capacidade para agir em baixo pH e, portanto, não há necessidade de ajustar o pH de ácido de uma matéria-prima pré-tratada com ácido para que a sacarificação ou hidrólise

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55/75 possa ocorrer. Consequentemente, um método da invenção pode ser um método de desperdício zero com o uso de somente produtos orgânicos com nenhuma exigência para entrada de produto químico inorgânico.

TEMPO DE REAÇÃO TOTAL [141] De acordo com a invenção, o tempo de reação total (ou tempo de reação da etapa de hidrólise e etapa de fermentação em conjunto) pode ser reduzido. Em uma modalidade, o tempo de reação total é de 300 horas ou

menos,	200	horas	ou menos,	150	horas	ou	menos, 140	horas	ou
menos,	130	ou menos, 120	horas ou	menos, 110	horas	ou
menos,	100	horas	ou menos,	90	horas	ou	menos, 80	horas	ou
menos,	75	horas	ou menos,	ou cerca	de 72	horas	em

rendimento de glicose de 90 %. Correspondentemente, tempos totais menores podem ser alcançados em rendimento de glicose menor.

PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO [142] Os produtos de fermentação que podem ser produzidos de acordo com a invenção incluem aminoácidos, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos alimentares para animal, produtos químicos especializados, matériasprimas químicas, plásticos, solventes, combustíveis, ou outros polímeros orgânicos, ácido láctico, e etanol, que incluem etanol combustível (sendo que o termo etanol é compreendido como incluindo álcool etílico ou misturas de álcool etílico e água).

[143] Os produtos de valor adicionado específicos que

podem	ser	produzidos	pelos	métodos	da invenção	incluem,
porém	sem	limitação,	biocombustíveis	(que incluem	biogás,
etanol	e	butanol);	ácido	láctico	; ácido 3-	hidróxi-

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56/75 propiônico; ácido acrílico; ácido acético; 1,3-propanodiol; etileno; glicerol; um plástico; um produto químico especializado; um ácido orgânico, que inclui ácido cítrico, ácido succínico e ácido maléico; um solvente; um suplemento alimentar para animal; um produto farmacêutico, tal como um antibiótico β-lactâmico ou uma cefalosporina; uma vitamina; um aminoácido, tal como lisina, metionina, triptofano, treonina, e ácido aspártico; uma enzima, tal como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glucanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidoredutase, uma transferase ou uma xilanase; uma matéria-prima química; ou um suplemento alimentar para animal.

SEPARAÇÃO DE PRODUTO DE FERMENTAÇÃO [144] O processo de acordo com a invenção opcionalmente compreende a recuperação de produto de fermentação. Um produto de fermentação pode ser separado do caldo de fermentação de qualquer maneira conhecida. Para cada produto de fermentação, o elemento versado na técnica será, desse modo, capaz de selecionar uma técnica de separação adequada. Por exemplo, o etanol pode ser separado de um caldo de fermentação de levedura através de destilação, por exemplo, destilação a vapor/destilação a vácuo em maneira convencional.

[145] Determinadas modalidades da invenção serão descritas abaixo em maiores detalhes, mas não limitam de forma algum o escopo da presente invenção.

USO DE ENZIMAS TERMOESTÁVEIS SOB CONDIÇÕES DE TEMPERATURA IDEAIS [146] Em uma modalidade, a invenção se refere ao uso de enzimas termoestáveis, tais como enzimas celulolíticas de

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Rasamsonia para a produção de açúcares de redução a partir de matéria-prima lignocelulósica pré-tratada em, porém sem limitação, produção de etanol.

[147] As enzimas celulolíticas de Rasamsonia aplicadas sob matéria-prima lignocelulósica pré-tratada mostraram taxas de conversão máximas em temperatura dentro da faixa de 50 a 70 °C. A enzima permanece ativa sob essas circunstâncias durante 14 dias e mais sem a cessação completa de atividade.

[148] Com o uso de condições de temperatura ideais, a quantidade máxima de açúcares de redução pode ser liberada a partir da matéria-prima (hidrólise total) dentro do tempo de hidrólise mais curto possível. Dessa maneira, 100 % de conversão de celulose em glicose é alcançada em menos que 5 dias.

[14 9] O rendimento máximo teórico (Yps max em g de produto por grama de glicose) de um produto de fermentação pode ser derivado da bioquímica de manual. Para etanol, 1 mol de glicose (180 g) rende, de acordo com a via de fermentação de glicólise normal em levedura, 2 moles de etanol (=2x46 = 92 g de etanol. O rendimento máximo teórico de etanol em glicose é, portanto, 92/180 = 0,511 g de etanol/g de glicose.

[150] Para butanol (MW 74 g/mol) ou isobutanol, o rendimento máximo teórico é de 1 mol de butanol por mol de glicose. Assim, Yps max para (iso-)butanol = 74/180 = 0,411 g de (iso-)butanol/g de glicose.

[151] Para ácido láctico, o rendimento de fermentação para fermentação homoláctica é de 2 moles de ácido láctico (MW = 90 g/mol) por mol de glicose. De acordo com essa

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58/75 estequiometria, o Yps max = 1 g de ácido láctico/g de glicose.

[152] Para outros produtos de fermentação, um cálculo similar pode ser feito.

[153] A redução de custo alcançada com a aplicação de enzimas celulolíticas de Rasamsonia será o resultado de uma redução de tempo de processo total.

COMPENSAÇÃO DE DOSAGEM DE ENZIMA MENOR COM TEMPO DE HIDRÓLISE PROLONGADO COM O USO DE ENZIMAS RASAMSONIA [154] Devido à alta estabilidade das enzimas estáveis, as atividades não cessam com o tempo, embora menos açúcares de redução são liberados no curso da hidrólise. É possível diminuir a dosagem de enzima e estender o uso da enzima prolongando-se os tempos de hidrólise para se obter níveis similares de açúcares de redução liberados. Por exemplo, 0,175 ml de enzima/ g de matéria seca de matéria-prima resultou na liberação de aproximadamente 90 % do máximo teórico de açúcares de redução a partir da matéria-prima pré-tratada dentro de 72 h. Sob o uso de 0,075 ml de enzima/ g de matéria seca de matéria-prima, aproximadamente 90 % de conversão do máximo teórico é alcançada dentro de 120 h. Os resultados mostram que, devido à estabilidade da atividade enzimática, a redução da dosagem de enzima pode ser compensada através do prolongamento do tempo de hidrólise para se obter a mesma quantidade de açúcares de redução. O mesmo se aplica para a hidrólise de matériaprima pré-tratada em teores de matéria seca maiores que 10 %, que mostra o efeito de compensação de tempo hidrólise prolongado em 15 % de matéria seca de matéria-prima.

[155] A redução de custo alcançada com o uso de enzimas

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59/75 celulolíticas estáveis, tais como de Rasamsonia, resulta a partir da exigência de dosagem de enzima menor, resultando em rendimentos de conversão de hidrólise similar.

REDUÇÃO DO RISCO EM CONTAMINAÇÃO COM ENZIMAS ESTÁVEIS [156] Em um processo comum para converter material lignocelulósico em etanol, as etapas do processo são feitas, de preferência, sob condições sépticas para reduzir os custos operacionais. A contaminação e crescimento de micro-organismos contaminantes podem, portanto, ocorrer e resultar em efeitos colaterais indesejáveis, tais como produção de ácido láctico, ácido fórmico e ácido acético, perdas de rendimento de etanol em substrato, produção de toxinas e polissacarídeos extracelulares, os quais podem afetar os custos de produção de maneira significante. Uma alta temperatura de processo e/ou um tempo de processo curto irá limitar o risco em contaminação durante a hidrólise e a fermentação. As enzimas termoestáveis, como aquelas de Rasamsonia, têm capacidade para hidrolisar matéria-prima lignocelulósica em temperaturas maiores que 60 °C. Nessas temperaturas, o risco que um micro-organismo contaminante irá causar efeitos colaterais indesejáveis será pequeno a quase zero.

[157] Durante a etapa de fermentação, na qual etanol é produzido, as temperaturas são tipicamente entre 30 a 37 °C e não serão, de preferência, elevadas devido às perdas de produção. Mediante a aplicação de tempos de processo de fermentação tão curtos quanto possível, os riscos e efeitos de contaminação e/ou crescimento de contaminantes serão reduzidos tanto quanto possível. Com enzimas estáveis, como aquelas de Rasamsonia, tempos de fermentação tão curtos

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60/75 quanto possível podem ser aplicados (consulte a descrição acima) e, desse modo, os riscos em contaminação e/ou crescimento de contaminantes serão reduzidos tanto quanto possível. A redução de custo alcançada com a aplicação de enzimas termoestáveis celulolíticas de Rasamsonia, dessa maneira, será o resultado do risco menor de falhas do processo devido à contaminação.

ENZIMAS ESTÁVEIS REDUZEM CUSTOS DE RESFRIAMENTO E

AUMENTAM A PRODUTIVIDADE DE USINAS DE ETANOL [158] A primeira etapa após o pré-tratamento térmico será para resfriar a matéria-prima pré-tratada a temperaturas em que as enzimas são ativas de forma ideal. Em grande escala, isso é tipicamente feito mediante a adição de água (resfriada), a qual irá, além de diminuir a temperatura, reduzir o teor de matéria seca. Com o uso de enzimas termoestáveis, como aquelas de Rasamsonia, a redução de custo pode ser alcançada pelo fato de que (i) menos resfriamento da matéria-prima pré-tratada é exigido, uma vez que temperaturas maiores são permitidas durante a hidrólise, e (ii) menos água será adicionada, o qual irá aumentar o teor de matéria seca durante a hidrólise e fermentação e, desse modo, aumentar a capacidade de produção de etanol (quantidade produzida por unidade de tempo por volume) de uma usina de etanol. Além disso, com o uso de enzimas termoestáveis de acordo com a invenção, como aquelas de Rasamsonia, a redução de custo também pode ser alcançada com o uso de água de resfriamento que tem temperatura maior que a água que é usada em um processo com enzima não termoestável.

RECICLAGEM DE ENZIMA APÓS HIDRÓLISE COM ENZIMAS

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ESTÁVEIS [159] No final da hidrólise, as atividades enzimáticas parecem ser baixas, uma vez que poucos açúcares de redução são liberados logo que quase toda a celulose é convertida. A quantidade de atividade enzimática presente, contudo, tem diminuído somente um pouco, supostamente devido à absorção das enzimas ao substrato. Mediante a aplicação de separação de sólido-líquido após a hidrólise, tal como centrifugação, filtração, decantação, etc., 60 % ou mais, por exemplo, 70 % da atividade enzimática em solução podem ser recuperados e reusados para a hidrólise de uma nova matéria-prima lignocelulósica pré-tratada durante a hidrólise seguinte.

[160] Ademais, após a separação de sólido-líquido, a enzima em solução pode ser separada da solução que contém açúcares de redução e outros produtos de hidrólise a partir das ações enzimáticas. Essa separação pode ser feita através de, porém sem limitação, (ultra e micro)filtração, centrifugação, decantação, sedimentação, com ou sem primeira adsorção da enzima em um veículo de qualquer tipo.

[161] Por exemplo, após a hidrólise de matéria-prima pré-tratada com 0,175 ml/g de carga de enzima de matéria seca de matéria-prima durante 20 h, 50 % da quantidade máxima teórica de açúcares de redução são liberados e, após a mesma hidrólise durante 72 h, 90 % da quantidade máxima teórica de açúcares de redução são liberados. Através da centrifugação e ultrafiltração, 60 a 70 % da atividade de enzima foram recuperadas no retentado, enquanto que o filtrado continha mais que 80 % dos açúcares de redução liberados. Com o reuso do retentado, tal como é ou após a purificação e/ou concentração adicional, a dosagem de

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62/75 enzima durante a próxima etapa de hidrólise pode ser reduzida com 60 a 70 %. A redução de custo alcançada com o uso de enzimas celulolíticas estáveis, tais como de Rasamsonia, dessa maneira, é o resultado da exigência de dosagem de enzima menor.

RECICLAGEM DE ENZIMA APÓS HIDRÓLISE EM COMBINAÇÃO COM PRODUÇÃO DE ENZIMA E RECICLAGEM DE CÉLULA DE LEVEDURA COM ENZIMAS ESTÁVEIS [162] O processo que inclui a reciclagem de enzima após a hidrólise, conforme descrito acima, pode ser combinado com a reciclagem do micro-organismo de produção de etanol após a fermentação e com o uso do filtrado contendo açúcares de redução como um substrato (purificado e/ou concentrado ou diluído) em fermentação de produção de enzima e como substrato para o cultivo do micro-organismo de produção de etanol.

RECICLAGEM DE ENZIMA APÓS DESTILAÇÃO A VÁCUO COM ENZIMAS ESTÁVEIS [163] A termoestabilidade de enzimas, como aquelas de Rasamsonia, causa atividade celulolítica restante após a hidrólise, fermentação e destilação a vácuo na destilação na vinhaça fina. A atividade total da enzima é reduzida durante as três etapas sucessivas do processo. A vinhaça fina obtida após a destilação a vácuo pode ser, desse modo, reusada como uma fonte de enzima para um ciclo do processo de hidrólise-fermentação-destilação recém iniciado da conversão de palha de trigo pré-tratada em etanol. A vinhaça fina pode ser usada na forma concentrada ou (não)diluída e/ou purificada e com ou sem suplementação de enzima adicional.

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RECICLAGEM DE ENZIMA EM COMBINAÇÃO COM SUPLEMENTAÇÃO DE ENZIMA APÓS DESTILAÇÃO A VÁCUO COM ENZIMAS TERMOESTÁVEIS [164] Em um processo ideal, uma quantidade de enzima é suplementada na vinhaça fina, antes de seu reuso em um novo ciclo do processo, igual à quantidade de atividade perdida durante as três etapas sucessivas do processo do ciclo do processo anterior. Dessa maneira, a sobredosagem de enzima é impedida e, desse modo, o uso mais eficaz de enzima é obtido.

[165] Ademais, fornecendo-se alta dosagem de enzima no primeiro ciclo do processo, e suplementando-se enzima igual à quantidade de atividade perdida durante as três etapas sucessivas do processo nos ciclos seguintes do processo, taxas de hidrólise maiores possíveis podem ser obtidas em cada ciclo do processo, resultando em tempos de hidrólise curtos de menos que 48 h em combinação com o uso mais eficaz de enzimas.

USO DE ENZIMAS ESTÁVEIS EM SISTEMAS MISTOS [166] Aplicando-se mistura durante a hidrólise, as enzimas entram mais frequentemente em contato com substratos, o qual resulta em um uso mais eficaz da atividade catalítica. Isso irá resultar em uma dosagem de enzima menor e, desse modo, em custos menores, exceto o fato de que a mistura tem um efeito negativo sobre as enzimas. As enzimas estáveis, como as enzimas termoestáveis a partir de Rasamsonia, são robustas e podem resistir a circunstâncias de cisalhamento e temperaturas (localmente) altas, o qual é o caso durante a mistura intensiva de pastas fluidas. O uso das mesmas em sistemas mistos é, portanto, benéfico e irá conduzir à redução de dosagem e,

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64/75 desse modo, redução de custos.

[167] A invenção é adicionalmente descrita pelos exemplos a seguir, os quais não deveriam ser interpretados como limitadores do escopo da invenção.

EXEMPLOS

INFORMAÇÕES EXPERIMENTAIS

CEPAS [168] A cepa Rasamsonia (Talaromyces) emersonii foi depositada em CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES, Uppsalalaan 8, P.O. Box 85167, NL-3508 AD Utrecht, Países baixos, em dezembro de 1964, com o número de registro CBS

393.64.

[169] Outras cepas adequadas podem ser igualmente usadas nos presentes exemplos para mostrar o efeito e vantagens da invenção. Por exemplo, TEC-101, TEC-147, TEC192, TEC-201 ou TEC-210 são cepas Rasamsonia adequadas que são descritas no documento sob o n^o. WO2011/000949.

PREPARAÇÃO DE SUBSTRATO DE RESTOS CULTURAIS DO MILHO PRÉ-TRATADOS COM ÁCIDO.

[170] Os restos culturais do milho (aCS) pré-tratados com ácido foram obtidos conforme descrito em Schell, D.J., Applied Biochemistry and Biotechnology (2003), vol. 105 a 108, páginas 69 a 85. Um reator de pré-tratamento de escala piloto foi usado operando em condições de estado estacionário de 190 °C, tempo de permanência de 1 min. e uma concentração de ácido H2SO4 eficaz de 1,45% (em peso) na fase líquida.

ENSAIOS DE MEDIÇÃO DE PROTEÍNA

1. PROTEÍNA TOTAL

TCA BIURETO

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65/75 [171] O método foi uma combinação de precipitação de proteína com o uso de ácido tricloro acético (TCA) para remover substâncias perturbadoras e permitir a determinação da concentração de proteína com a reação de Biureto colorimétrica. Na reação de Biureto, um íon de cobre (II) é reduzido a cobre (I), o qual forma um complexo com os nitrogênios e carbonos das ligações de peptídeo em uma solução alcalina. Uma cor violeta indica a presença de proteínas. A intensidade da cor e, por conseguinte, a absorção a 546 nm, é diretamente proporcional à concentração de proteína, de acordo com a lei de BeerLambert. A padronização foi realizada com o uso de BSA (albumina sérica bovina) e o teor de proteína foi expressado em g de proteína como equivalente de BSA/l ou mg de proteína como equivalente de BSA/ml. O teor de proteína foi calculado com o uso de protocolos de cálculo padrão conhecidos na técnica, mediante a plotagem do OD546 versus a concentração de amostras com concentração conhecida, seguida pelo cálculo da concentração das amostras desconhecidas com o uso da equação gerada a partir da linha de calibração.

2. PROTEÍNAS INDIVIDUAIS COM O USO DE PAGE

PRÉ-TRATAMENTO DE AMOSTRA SDS-PAGE [172] Com base na concentração de proteína estimada das amostras, a preparação de amostras a seguir foi realizada. A 10 pl de amostra, 40 pl de água MilliQ e 50 pl de TCA (20 %) foram adicionados para diluir a amostra cinco vezes (~ 1 mg/ml) e precipitar as proteínas. Após 1 hora no gelo, a amostra foi centrifugada (10 minutos, 14.000 rpm). O pélete foi lavado com 500 pl de acetona e centrifugado (10

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66/75 minutos, 14.000 rpm). O pélete foi tratado conforme descrito abaixo.

SDS-PAGE [173] O pélete foi dissolvido em 65 pl da água MilliQ, 25 pl de tampão de amostra NuPAGE™ LDS (4x) Invitrogen e 10 pl de agente redutor de amostra NuPAGE™ (10x) Invitrogen. Antes da etapa de desnaturação, a amostra foi diluída 5 vezes com o uso de uma mistura de MilliQ; tampão de amostra NuPAGE™ LDS e 10 pl de redutor de amostra NuPAGE™ na razão de 65:25:10. Após a mistura, as amostras foram incubadas em um termomisturador durante 10 minutos a 70 °C. As soluções de amostra foram aplicadas em um gel de Bis-Tris a 4 a 12 % (NuPAGE™ BisTris, Invitrogen). Uma amostra (10 pl) de marcador M12 (Invitrogen) também foi aplicada no gel. O gel foi manejado em 200 V durante 50 minutos, com o uso do XCELL Surelock, com 600 ml de tampão SDS diluído 20 x na câmara de tampão externa e 200 ml de tampão SDS diluído 20 x, contendo 0,5 ml de antioxidante (NuPAGE™ Invitrogen) na câmara de tampão interna. Após o procedimento, o gel foi enxaguado duas vezes com água desmineralizada, os géis foram fixados com solução de metanol a 50 %/ácido acético a 7 % durante uma hora e tingidos com Sypro Ruby (50 ml por gel) de um dia para o outro. Uma imagem foi feita com o uso do Typhoon 9200 (610 BP 30, Green (532 nm), PMT 600V, 100 mícrons) após a lavagem do gel com água MilliQ.

ANÁLISE QUANTITATIVA DA PROTEÍNA [174] Com o uso do digitalizador Typhoon, a razão entre bandas de proteína dentro de uma via foi determinada com o uso de métodos padrão conhecidos na técnica. A amostra foi aplicada em triplicado e os valores de cinza foram

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67/75 determinados com o uso do programa Image quant. Os valores são expressados como % relativa de proteína em relação à proteína total, calculados com o uso do valor de cinza da banda de proteína selecionada em relação ao valor de cinza total de todas as bandas de proteína.

CÁLCULO DE CONVERSÃO DE GLUCANO:

% de conversão de glucano (%) = (glicose (g/l) x 100%) / (glucano (fração em DM) x dm (g/kg) x 1,1 ) em que:

glicose (g/l) = concentração de glicose em sobrenadante após hidrólise.

glucano (fração em dm) = teor de glucano do substrato antes do pré-tratamento.

dm (g/kg) = matéria seca de hidrólise (f.i. 20 % dm = 200 g/kg).

1,1 = aumento de peso devido à incorporação de água durante a hidrólise.

CÁLCULO DE EXEMPLO:

glicose = 60 g/l fração de glucano = 0,40 (é 40% em matéria seca) dm = 200 g/kg exemplo de conversão de glucano = (60*100) / (0,4 x 200 x 1,1 ) = 68 % de conversão

EXEMPLO 1

AVALIAÇÃO DO EFEITO DA AUSÊNCIA DE OXIGÊNIO DURANTE A HIDRÓLISE SOBRE A ATIVIDADE CELULOLÍTICA DE COQUETÉIS DE ENZIMA CELULASE [175] O efeito da ausência de oxigênio durante a hidrólise sobre a atividade celulolítica de três coquetéis de enzima diferentes foi avaliado de acordo com os

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68/75 procedimentos descritos abaixo. A reações de hidrólise foram realizadas com matéria-prima de restos culturais do milho (aCS) pré-tratada com ácido em uma concentração final de 10 % em peso de DM. Essa solução de matéria-prima foi preparada através da diluição de uma solução de matériaprima concentrada com água. Subsequentemente, o pH foi ajustado para pH 4,5 com uma solução 4 M de NaOH. A eliminação de oxigênio a partir da matéria-prima foi realizada em duas etapas. Primeiramente, a solução de matéria-prima foi desgaseificada através de sonicação sob vácuo em um banho de sonicação (Bransonic 5510E-DTH, ajuste; Degas) durante 15 minutos. Na segunda etapa, o oxigênio foi adicionalmente removido espargindo-se de maneira contínua um fluxo de nitrogênio através de uma solução de 500 ml da matéria-prima a 10 % de DM por um período de 3 horas. Antes de ser espargido através da solução de matéria-prima, o fluxo de nitrogênio foi espargido através da água a fim de saturar a mesma com vapor d'água e evitar a evaporação da água a partir da solução de matéria-prima. Em paralelo, 500 ml do mesmo lote de aCS a 10 % em peso de DM foram espargidos com ar como uma amostra de controle contendo oxigênio em uma configuração similar e de acordo com o mesmo protocolo.

[176] A hidrólise das soluções de matéria-prima de aCS a 10 % em peso com depleção de oxigênio (espargida com nitrogênio) e com saturação de oxigênio (espargido com ar) foi conduzida em garrafas de centrífuga de 30 ml herméticas (Nalgene Oakridge) em um volume de reação total de 10 ml. As garrafas, já contendo a solução de celulase, usadas para o experimento com depleção de oxigênio foram espargidas com

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69/75 nitrogênio antes e durante o enchimento das mesmas com matéria-prima. Cada hidrólise foi realizada em duplicata com 7,5 mg/g de coquetel de enzima celulase DM adicionados em um volume total não maior que 375 pl. Os três coquetéis de enzima celulase testados incluíram: uma mistura TEC-210 (mistura de celulases), uma mistura 4E-GH61 (que consiste em 9 % em peso de proteína total BG, 30 % em peso de proteína total CBHI, 25 % em peso de proteína total CBHII e 36 % em peso de proteína total GH61) e uma mistura 4E-EG (que consiste em 9 % em peso de proteína total BG, 30 % em peso de proteína total CBHI, 25 % em peso de proteína total CBHII e 36 % em peso de proteína total EG) . TEC-210 foi fermentada de acordo com os procedimentos de inoculação e fermentação descritos no documento sob o n^o. WO2011/000949. A mistura 4E (conforme descrito no documento sob o n^o. WO2011/098577) foi usada.

[177] As garrafas de centrífuga que contém a solução de enzima e matéria-prima foram colocadas em um forno incubador (forno de hibridização Techne HB-1D) e incubadas durante 72 horas a 65 °C, sob a rotação em ponto de ajuste 3 (12 rpm por minuto). Após a hidrólise, as amostras foram resfriadas em gelo e imediatamente 50 pl de cada sobrenadante foram diluídos em 1.450 pl de água de grau I. O sobrenadante diluído foi subsequentemente filtrado (filtro de 0,45 pm, Pall PN 454) e os filtrados foram analisados acerca do teor de açúcar, conforme descrito abaixo.

[178] As concentrações de açúcar das amostras diluídas foram medidas com o uso de uma HPLC equipada com uma coluna Aminex HPX-87P (Biorad n^o. 1250098) através da eluição com

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70/75 água a 85 °C em uma taxa de fluxo de 0,6 ml por minuto e quantificadas através da integração dos sinais de glicose a partir da detecção de índice de refração (R.I.) calibrada com soluções padrão de glicose.

[179] Os dados apresentados na Tabela 1/Figura 1 mostram que a glicose liberada a partir das matérias-primas espargidas com nitrogênio é menor que a glicose liberada a partir das matérias-primas espargidas com ar tanto para as incubações de mistura TEC-210 como da mistura 4E-GH61. Não há diferença em liberação de glicose detectável entre as matérias-primas espargidas com nitrogênio e com ar para amostras hidrolisadas pela mistura 4E-EG.

[180] Com base nesses resultados, conclui-se que a presença de oxigênio aperfeiçoa o desempenho celulolítico de misturas de celulase que contêm enzimas GH61.

Coquetel de celulase	Espargido com ar Glicose média (g/l)	Desvio padrão (stdev)	Espargido com N2 Glicose média (g/l)	Desvio padrão (stdev)
TEC-210	34,5	0,8	31,9	1,1
mistura 4E-GH61	31,7	1,4	27,4	0,1
mistura 4E-EG	22,7	0,1	23,3	1,7

Tabela 1: O efeito de espargir nitrogênio ou ar através de uma matéria-prima de aCS a 10 % antes da hidrólise, sobre a quantidade total de glicose liberada por três misturas de celulase diferentes.

EXEMPLO 2

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O EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE OXIGÊNIO DISSOLVIDO SOBRE A ATIVIDADE CELULOLÍTICA DE COMPOSIÇÕES DE ENZIMA CELULASE DURANTE HIDRÓLISE DE MATÉRIA-PRIMA LIGNOCELULÓSICA EM ESCALA PILOTO (270 LITROS) [181] O efeito da concentração de oxigênio dissolvido sobre a atividade celulolítica da composição de enzima ou coquetel de enzima durante a hidrólise de matéria-prima lignocelulósica em escala piloto (270 litros) é mostrado nesse exemplo. As reações de hidrólise foram realizadas com matéria-prima de restos culturais do milho (aCS) prétratada com ácido em uma concentração (final) de 20 % em peso de DM. A solução de matéria-prima foi preparada por meio da diluição de pasta fluida de matéria-prima concentrada com água. O pH foi ajustado para pH 4,5 com uma solução de NH4OH a 25 % (em peso).

[182] A hidrólise enzimática foi feita em um reator piloto de 270 litros que foi controlado por pH e temperatura com um volume de trabalho de 150 litros. O oxigênio dissolvido durante o processo foi controlado ajustando-se a velocidade do impulsor em um determinado fluxo de ar e sobrepressão. A hidrólise enzimática foi realizada em uma dosagem de 3,75 mg de TCA proteína/g de DM de composição de enzima celulase TEC-210. TEC-210 foi produzido de acordo com os procedimentos de inoculação e fermentação descritos no documento sob o n^o. WO2011/000949.

OS SEGUINTES EXPERIMENTOS SÃO FEITOS:

[183] 1. 150 l de aCS a 20 %, pH 4,5, temperatura 62 °C, nenhuma sobrepressão, nenhum fluxo de ar, 3,75 mg de TCA/g de dm de composição de celulase TEC-210, tempo de incubação 120 horas em um reator piloto de 270 litros. A

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72/75 concentração de oxigênio dissolvido reação foi medida constantemente com de DO. O DO foi controlado em um ajustando-se a velocidade do impulsor (DO) da mistura de o uso de um eletrodo nível de 0,01 mol/m³ [184] 2. 150 l de aCS a 20 %, pH 4,5, temperatura 62 °C, sobrepressão de 0,1 MPa (1 bar), fluxo de ar de 10 kg/h no espaço de cabeça do reator, 3,Ί5 mg de TCA/g de dm de composição de celulase TEC-210 dm, tempo de incubação 120 0 litros. A concentração de stura de reação foi medida eletrodo de DO. O DO foi

horas em um reator	piloto	de
oxigênio dissolvido	(DO)	da
constantemente com	o uso	de
controlado em um	nível	de
velocidade do impulsor. [185] Durante a hidrólise

tomadas diariamente para a análise de carboidrato (glicose, celobiose) por RMN e medição de viscosidade e pH.

[186] A análise da composição dos restos culturais do milho (aCS) pré-tratados com ácido foi feita através de hidrólise química da amostra e determinação dos monossacarídeos por RMN.

[18Ί] As amostras tomadas durante a hidrólise enzimática foram analisadas acerca de (oligo)açúcares, ácidos orgânicos e inibidores por RMN de fluxo.

[188] A conversão foi calculada com concentração de glucano medida (g/kg) hidrólise enzimática e a glicose (g/l) que foi medida durante a hidrólise enzimática.

[189] Os resultados são apresentados na Figura 2.

[190] Esse exemplo mostra que em volumes de reator maiores , por exemplo, 100 litros ou mais, a adição de base na no início da

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73/75 oxigênio (sob a forma de ar) aperfeiçoa fortemente a hidrólise de material lignocelulósico pré-tratado. Em escalas de 1 m³ ou mais, 10 m³ ou mais ou 50 m³ ou mais de conteúdo de reator, será encontrado aperfeiçoamento similar em conversão durante a hidrólise.

EXEMPLO 3

O EFEITO DE OXIGÊNIO SOBRE A ATIVIDADE CELULOLÍTICA DE COMPOSIÇÕES DE ENZIMA CELULASE DURANTE A HIDRÓLISE DE MATÉRIA-PRIMA LIGNOCELULÓSICA COM O USO DE UMA BAIXA DOSAGEM DE ENZIMA [191] O efeito de oxigênio sobre a atividade celulolítica da composição de enzima com o uso de uma baixa dosagem de enzima durante a hidrólise de matéria-prima lignocelulósica é mostrado nesse exemplo. As reações de hidrólise são realizadas com matéria-prima de restos culturais do milho (aCS) pré-tratada com ácido em uma concentração final de 20 % em peso de DM. Essa solução de matéria-prima é preparada através da diluição de uma solução de matéria-prima concentrada com água. Subsequentemente, o pH é ajustado para pH 4,5 com uma solução de NH4OH a 10 % (em peso). O teor de glucano dos restos culturais do milho aplicados foi de 37% em matéria seca.

[192] A hidrólise é feita em um reator agitado de pH controlado e temperatura controlada com um volume de trabalho de 1 l. Cada hidrólise é realizada em duplicata com 2,5 mg/g de DM de composição (ou coquetel) de enzima celulase TEC-210. TEC-210 foi produzido de acordo com os procedimentos de inoculação e fermentação descritos no documento sob o n^o. WO2011/000949.

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OS SEGUINTES EXPERIMENTOS SÃO FEITOS:

[193] 1. 1 l de aCS a 20 %, pH 4,5, temperatura 62 °C, velocidade de agitador 60 rpm, 3,5 mg de composição de celulase TEC-210 por grama de matéria-prima (em matéria seca), tempo de incubação 120 horas (experimento de referência) em um reator fechado. O nível de oxigênio dissolvido da mistura de reação foi medido constantemente com o uso de um eletrodo de DO. Essa agitação lenta resultou em um nível de oxigênio dissolvido de 0,005 mol/m³.

[194] 2. Conforme o experimento 1, mas com o uso de uma dosagem de enzima de 2,5 mg de TEC-210 por grama de matéria-prima (em matéria seca) e uma velocidade de agitador de 250 rpm, um espaço de cabeça sobre a mistura de reação que é constantemente renovado com ar fresco. A velocidade de agitação maior em combinação com a renovação do espaço de cabeça com ar fresco resultou em um nível de oxigênio dissolvido de 0,030 mol/m³ na mistura de reação.

[195] Durante a hidrólise, as amostras foram tomadas para análise. As amostras foram resfriadas em gelo e imediatamente 50 pl de cada sobrenadante são diluídos em 1.450 pl de água de grau I. O sobrenadante diluído é subsequentemente filtrado (filtro de 0,45 pm, Pall PN 454) e os filtrados são analisados acerca do teor de açúcar, conforme descrito abaixo.

[196] As concentrações de açúcar das amostras diluídas são medidas com o uso de uma HPLC equipada com uma coluna Aminex HPX-87P (Biorad n^o. 1250098) através da eluição com água a 85 °C em uma taxa de fluxo de 0,6 ml por minuto e quantificadas através da integração dos sinais de glicose a

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75/75 partir da detecção de índice de refração (R.I.) calibrada com soluções padrão de glicose.

[197] Os resultados são apresentados na Figura 3.

[198] As conversões de glucano são listadas na Tabela .

Tabela 2: níveis de conversão de glucano.

Experimento	Dosagem de enzima	Nível de DO mol/m3	Conversão de glucano (%)
(mg/g de	dm)
1	2,5	0,030	75
2	3,5	0,005	70

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Claims (2)

REIVINDICAÇÕES

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12 3

Fig,1

1. Processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte etapa:

hidrólise enzimática do material lignocelulósico com o uso de uma composição de enzima que compreende ao menos duas celulases, em que a enzima compreende uma endoglucanase, uma ou duas exo-celobiohidrolases e um betaglucosidase e de modo que a composição de enzima ao menos compreende GH61; e em que durante a etapa de hidrólise enzimática oxigênio é soprado no material lignocelulósico, a concentração de oxigênio na fase líquida na qual o material lignocelulósico está presente durante a hidrólise enzimática é maior que 0,02 mol/m^{3 4 5} e de no máximo 0,12 mol/m³ em pressão atmosférica normal e a uma temperatura de 62°C, o reator para a hidrólise enzimática possuindo um volume de 50 m³ ou mais e o teor de matéria seca na etapa de hidrólise sendo de 10% em peso ou mais.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende o pré-tratamento do material lignocelulósico.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende a lavagem do material lignocelulósico.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende a recuperação de um produto de açúcar.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que

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2/2 compreende a seguinte etapa:

fermentação do material lignocelulósico hidrolisado para produzir um produto de fermentação.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de recuperação do produto de fermentação.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o oxigênio é adicionado sob a forma de bolhas. 8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a hidrólise é conduzida em uma temperatura de 45 °C ou mais. 9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição de enzima é derivada de um fungo. 10. Processo, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o teor de matéria seca na etapa de hidrólise é de 14 % em peso ou mais.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o teor de matéria seca na etapa de hidrólise é de 14 a 33 % em peso.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a hidrólise enzimática ocorre em um reator de batelada, batelada alimentada e/ou de cultura contínua.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o oxigênio é introduzido como um gás contendo oxigênio.

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Conversão de