CN101460188B - 使用***的局部缺血疾病的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种血管再生的方法，包括以下步骤：(a)向受试者施用***；(b)从受试者收集外周血单核细胞；和(c)向受试者体内的目标位点施用收集的外周血单核细胞。当向受试者施用***时，外周血单核细胞(尤其是CD34阳性细胞)被动员进入受试者的外周血中。该方法对于治疗诸如外周血管障碍的局部缺血疾病是有用的。

Description

使用***的局部缺血疾病的治疗
技术领域
本发明涉及血管再生的方法、治疗局部缺血疾病的方法和用于这些方法的组合物。
背景技术
外周血管障碍是一种疾病，其中，外周组织由于外周动脉血流减少变成局部缺血状态，而外周动脉血流减少由例如血管内腔狭窄、血凝块形成、血管阻塞、血管炎、血管收缩或血粘度增加导致。近年来已经发现，当源自骨髓的单核细胞移植到缺血部位时，增强了血管新生，并且源自骨髓的单核细胞的移植被认为是治疗外周血管障碍的潜在的方法。但是，源自骨髓的单核细胞的移植需要从病人收集骨髓，这给病人增加了实质的负担。
为了减轻病人的负担，已经有人尝试使用源自外周血液的单核细胞代替源自骨髓的单核细胞；但是，由于外周血液中存在的单核细胞数目很少，该方法不能成功地提供有效的治疗。
***(也称为EPO)是一种酸性糖蛋白激素，其促进红系祖细胞的分化和增殖并主要在肾中产生。红细胞(血液中最大量的细胞)在一定时间段内发挥作用，然后主要在脾中被破坏(在人体内的平均寿命期限是约120天)。正常情况下，通过来自骨髓的连续供应，总的外周红细胞计数得以持续地保持恒定。EPO在体内红细胞的这一动态平衡中发挥了重要作用。在临床情况下，EPO用来治疗贫血和用于手术前后的处理。
另外，已有报导，EPO具有促进血管生成的活性，且作为治疗局部缺血疾病的治疗剂是有效的(Besarab A等人，The New England Journal ofMedicine，339(9)，584-590，(1998)，Heeschen C等人，Blood，102(4)，1340-1346，(2003)，Bahlmann F H等人，Blood，103(3)，921-926，(2004)，Smith K J等人，Cardiovascular Research，(59)，538-548，(2003)，BahlmannF H等人，Kidney International，64，1648-1652，(2003))。也有报导，EPO促进了血管内皮祖细胞进入外周血液的动员(Heeschen C等人，Blood，102(4)，1340-1346，(2003)，Bahlmann F H等人，Blood，103(3)，921-926，(2004))。
但是，还不清楚，由EPO动员进入外周血液的细胞对于诸如外周血管障碍的局部缺血疾病的治疗是否是有效的。
发明概述
本发明者已经发现，通过施用EPO促进了单核细胞进入外周血液的动员，和如此地由EPO动员的单核细胞对于治疗局部缺血疾病是特别有用的。
本发明提供了动员用于治疗局部缺血疾病或用于刺激血管再生的单核细胞进入外周血液的组合物，其中，该组合物包括作为活性成分的***。优选地，动员的单核细胞从受试者收集，然后施用给同一受试者。
优选在从受试者收集外周血液之前3-12天向受试者施用本发明的组合物。
本发明也提供了用于治疗局部缺血疾病的组合物和用于刺激血管再生的组合物，包括从预先施用了***的受试者的外周血液分离的作为活性成分的单核细胞。在这样的组合物中，优选在收集外周血液之前3-12天向受试者施用***。
本发明也提供了动员用于治疗局部缺血疾病或用于刺激血管再生的CD34阳性细胞进入外周血液的组合物，其包括作为活性成分的***。
另一方面，本发明提供了用于刺激血管再生和用于治疗局部缺血疾病的单核细胞的制备方法，包括从预先施用了***的受试者的外周血液分离单核细胞。
另一方面，本发明提供了治疗受试者的局部缺血疾病或刺激血管再生的方法，包括以下步骤：
(a)向受试者施用***；
(b)从受试者收集外周血单核细胞；和
(c)向受试者的目标位点施用收集的外周血单核细胞。
附图简要说明
图1显示了测量***动员造血干细胞的FACS分析的结果；
图2显示了由施用***动员的造血干细胞的集落数目的测量结果；和
图3显示了接受***的病人(病例3)外周血单核细胞移植一个月后的血管造影照片。
本发明的优选实施方式
***对外周血单核细胞的动员
本发明的一个方面涉及动员用于治疗局部缺血疾病或用于刺激血管再生的单核细胞进入外周血液的组合物，其中，该组合物包括作为活性成分的***。术语“‘动员(mobilizing)’单核细胞”和“单核细胞‘的动员(mobilization of)’”表示刺激存在于各种器官中的多能干细胞的分化和增殖，和释放包含多能干细胞的单核细胞进入血液中。为了治疗局部缺血疾病或刺激血管再生，可以从受试者的外周血液收集以这种方式动员的单核细胞并施用于受试者。受试者优选为患有局部缺血疾病的病人或需要血管再生治疗的病人。
本发明对于在收集外周血单核细胞之前向受试者施用***的剂数没有特别的限制，但一般地为1-3剂。在施用3剂的情况中，例如，第一次***的施用在收集外周血单核细胞之前约2周对受试者全身性地(例如，皮下或静脉注射)给予。大约一周后，第二次***的施用在供血(取血)后全身性地给予。再一周后，第三次***的施用局部地给予，然后可以从受试者的外周血液中收集想要的外周单核细胞。在施用2剂的情况中，例如，第一次***的施用在收集外周血单核细胞之前约一周对受试者全身性地给予，和第二次***的施用在大约一周后局部地给予，然后可以从外周血液中收集想要的外周单核细胞。在单次施用的情况中，例如，向受试者全身性地施用***，并可以在大约一周后收集想要的外周单核细胞。
***的单位剂量一般地含有1000U/人体-100000U/人体，优选3000U/人体-12000U/人体(例如，6000U/人体)。个体受试者的剂量将由主治医师通过考虑例如受试者的年龄、体重和状态及施用途径的因素来确定。因此，在本发明中***的剂量不限于上述剂量。
一般地***通过肠胃外途径施用，例如，可以以注射剂(例如，皮下、静脉、肌肉内或腹膜内)施用或通过跨粘膜、经皮、鼻或肺途径施用。它也可以口服施用。
外周血单核细胞是存在于外周血液中的单核细胞。单核细胞(mononuclear cell)，也称为单核细胞(monocyte)，是主要存在于血液中并且驻留于分化为巨噬细胞型细胞的阶段中的细胞。造血干细胞在骨髓中分化为成单核细胞和幼单核细胞，然后分化为单核细胞，其被释放进入血液。在迁移进入组织时，单核细胞分化成为，例如，巨噬细胞、树突状细胞和组织细胞。
关于使用EPO动员单核细胞进入外周血液，据认为在施用EPO后需要两周时间以动员单核细胞进入外周血液(Bahlmann F H等人，Blood，103(3)，921-926，(2004))。但是，根据本发明发现，在施用EPO后大约一周时间，就动员了足够用于治疗局部缺血疾病或刺激血管再生的量的单核细胞进入外周血液。
因此，本发明涉及获得单核细胞的方法或制备用于移植的单核细胞的方法，包括以下步骤：
(a)向受试者施用***；和
(b)在施用***大约一周后，从受试者收集外周血单核细胞。
在本发明的上下文中，短语“大约一周”一般为3-12天，优选5-9天(例如，6-8天或7天)。
另一方面，本发明涉及动员用于治疗局部缺血疾病或刺激血管再生的CD34阳性细胞进入外周血液的组合物，包括作为活性成分的***。
CD34是血液干细胞(blood stem cell)抗原。它在血液干细胞上表达，也在例如血管内皮细胞、血管内皮祖细胞和基质细胞中表达。由于已知诸如血管内皮祖细胞的CD34阳性细胞参与血管生成，为了获得更好的局部缺血疾病的治疗效果或更好的血管再生效果，需要提高CD34阳性细胞在移植的单核细胞群中的比例。根据本发明的方法动员进入外周血液的单核细胞群一般具有足够获得局部缺血疾病的治疗效果或血管再生效应的CD34阳性细胞效价(titer)。在以治疗局部缺血疾病或刺激血管再生为目的的移植中，通过从由本发明的方法获得的单核细胞群分离或浓缩CD34阳性细胞来提高CD34阳性细胞的比例尤其有利。
在本发明中，在单核细胞中CD34阳性细胞的高比例意味着CD34阳性细胞计数占单核细胞的至少1％，优选至少2％，更优选至少3％。在单核细胞中CD34阳性细胞的比例上限可以是，例如，99.99％、99.9％或99％，且理论上为100％。
根据本发明获得的单核细胞中存在的CD34阳性细胞也可以是CD45阳性的。CD45是白细胞共同抗原，并且是造血类型细胞的关键的膜糖蛋白。
可以通过常见的方法从受试者收集外周血单核细胞。例如，单核细胞可以通过直接回收由血液的血浆分离置换(blood apheresis)得到的血源单核细胞，采用捕捉外周血白细胞必要的离心除去大部分的红细胞、粒细胞和血小板，然后通过例如离心来洗涤获得的外周血白细胞而获得。
以这种方式获得的外周血单核细胞可以任选地通过添加、分离或纯化进行进一步的处理。例如，诸如CD34阳性细胞和/或血管内皮祖细胞的想要的细胞可以进一步由收集的外周血单核细胞浓缩或分离以用于施用。可以使用标准技术来制备基本上纯的CD34阳性细胞。例如，外周血单核细胞与抗CD34抗体反应，然后CD34阳性细胞附着在载有抗小鼠IgG抗体的磁性珠上。用片状磁体收集结合在磁性珠上的CD34阳性细胞反应，随后通过酶处理从磁性珠释放CD34阳性细胞。或者，CD34阳性细胞结合在用荧光染料标记的抗CD34抗体上，并使用荧光细胞分选器收集。
局部缺血疾病的治疗和血管再生
可以将根据本发明制备的外周血单核细胞施用给受试者用于治疗局部缺血疾病的目的。因此，本发明另一方面涉及治疗受试者的局部缺血疾病的方法，包括以下步骤：
(a)向受试者施用***；
(b)从受试者收集外周血单核细胞；和
(c)向受试者的目标位点施用收集的外周血单核细胞。
局部缺血疾病是一种疾病，其中，组织由于各种因素(如血管内腔狭窄、血凝块形成、血管阻塞、血管炎、血管收缩或血液粘度增加)导致的脉管***中血流减少而陷入局部缺血状态。局部缺血疾病包括外周血管障碍、缺血性心脏病(例如，缺血性心肌病、心肌梗塞、缺血性心力衰竭)、缺血性脑血管病、缺血性肾病、缺血性肺病和与传染病有关的局部缺血疾病。
外周血管障碍是一种疾病，其中，外周组织由于外周动脉血流减少而陷于局部缺血状态，而外周动脉血流减少由例如血管内腔狭窄、血凝块形成、血管阻塞、血管炎、血管收缩或血液粘度增加导致。与外周血管障碍相关的疾病包括诸如闭塞性动脉硬化和血栓闭塞性脉管炎(Buerger’s disease)的慢性动脉阻塞性疾病，及进行性***性硬化病、***性红斑狼疮(systemic erythematosus)、雷诺病(Raynaud’s disease)、振动综合症、动脉瘤和血管炎。外周血管障碍是本发明的治疗剂的优选目标疾病，闭塞性动脉硬化和血栓闭塞性脉管炎为尤其优选的目标。
另外，可以将根据本发明制备的外周血单核细胞施用于受试者来刺激血管再生。因此，本发明另一方面涉及刺激受试者的血管再生的方法，包括以下步骤：
(a)向受试者施用***；
(b)从受试者收集外周血单核细胞；和
(c)向受试者的目标位点施用收集的外周血单核细胞。
如本文中所用，血管再生表示刺激血管生成和/或血管的生长和发育。本发明的方法可用于刺激任何类型的血管，优选为动脉，尤其优选为外周动脉的新生、生长和发育。可以通过本领域的技术人员已知的技术监测血管再生，例如，使用碱性磷酸酶染料测量毛细血管密度。
如本文中所用，目标位点一般指局部缺血发生的位点和需要血管再生的位点。在外周血单核细胞移植到另一位点导致需要血管再生的位点发生血管再生的情况中，目标位点可以指这样的另一位点。局部施用的位点的特定的例子包括下肢骨骼肌、上肢骨骼肌和心脏(心肌)。
施用或移植到目标位点的所收集的单核细胞的数目没有特别限制，但是一般为1.0×107-1.0×1012个细胞，优选1×109-1×1011个细胞。
局部施用是一种能够将细胞有效施用于受影响的区域而不产生明显的***性影响的方法。局部施用可以通过使用例如普通注射器、针或定位针来进行。
在向目标位点施用收集的单核细胞时，单核细胞可以单独施用或与另一种物质组合施用。与单核细胞共同施用的物质没有特别的限制，但优选为能够提高血管再生活性的物质。
***
本发明可以采用任一类型的EPO，但优选高纯度的EPO，也优选具有与哺乳动物的EPO、尤其是人类EPO基本上相同的生物活性的EPO。
本发明中使用的EPO可以通过任一种方法来制备，例如，它可以是通过从人源的提取物进行纯化获得的天然的人类EPO(见，例如，审查过的日本专利申请公开平1-38800号)，或者它可以是在大肠杆菌、酵母、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、C127细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞或昆虫细胞中通过基因工程技术产生，然后通过各种方法中的任一种提取、分离和纯化的人类EPO。本发明中使用的EPO优选为通过基因工程技术产生的EPO，且优选为使用哺乳动物细胞(尤其是CHO细胞)产生的EPO(见，例如，审查过的日本专利申请公开平1-44317号，Kenneth Jacobs等人，Nature，313,806-810(1985))。
通过基因重组技术获得的EPO可以具有与天然来源的EPO相同的氨基酸序列，或可以具有与天然来源的EPO相同的生物活性而氨基酸序列具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加。氨基酸的缺失、取代或添加可以通过本领域内已知的方法引入。例如，本领域的技术人员可以通过使用定点诱变在EPO的氨基酸序列上引入合适的突变来制备与EPO功能相当的多肽(Gotoh，T.等人(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.等人(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.和Fritz，H.J.(1987)Methods Enzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)。氨基酸突变也可能自然地产生。一般地，氨基酸残基优选使用具有类似的氨基酸侧链性质的另一氨基酸残基取代。氨基酸侧链的性质包括，例如，疏水氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有羟基功能侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸或含酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱基侧链的氨基酸(R、K、H)和具有芳香侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号中给出氨基酸的单字母代号)。已知具有由一个或多个氨基酸残基的缺失、添加或取代导致的经修饰氨基酸序列的多肽保留其生物活性(Mark，D.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.& Smith，M.Nucleic AcidsResearch(1982)10，6487-6500；Wang，A.等人，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
也可以使用EPO与另一种蛋白质的融合蛋白质。例如，融合蛋白质可以通过在框架中将编码EPO的DNA编码另一种蛋白质的DNA连接，将DNA***表达载体，表达载体随之在宿主中表达而构建。对与本发明的EPO融合的另一种蛋白质没有特别限制。
本发明也可以使用化学修饰的EPO。化学修饰的EPO包括连接到例如聚乙二醇或维生素B12的无机或有机化合物上的EPO。本发明中使用的EPO也可以是EPO衍生物。
如本文中所用，EPO衍生物指在EPO分子中具有氨基酸修饰的EPO，或在EPO分子中具有糖链修饰的EPO。EPO分子中的糖链修饰包括糖链的添加、取代或缺失。本发明中优选的糖链修饰是从EPO分子中除去唾液酸。
所获得的由重组动物细胞产生的EPO或源自尿的EPO一般是包含具有不同糖链结构的各种类型EPO的EPO组合物。连接于EPO组合物中EPO分子上的唾液酸的数目将随EPO分子发生变化，但一般地，11-15个唾液酸连接在各单个EPO分子上。可以通过除去唾液酸制备非唾液酸化(asialylated)的EPO(asialo-EPO)。对非唾液酸化过程中除去的唾液酸的数目没有特别限制；可以除去所有的唾液酸，或者可以除去1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个唾液酸。优选用于本发明的asialo-EPO含有不超过10个连接在EPO分子上的唾液酸，更优选不超过5个，和尤其优选不超过2个。这里提到的唾液酸的数目指包含在EPO组合物中的EPO分子上的唾液酸的平均数目。每分子的平均唾液酸可以通过本领域的技术人员已知的方法来测量(见，例如，EP0428267)。
已经除去唾液酸的EPO(asialo-EPO)可以通过本领域的技术人员已知的方法产生。例如，可以通过使用诸如唾液酸酶的酶对EPO进行处理来制备。可商购得到的唾液酸酶可用于此目的(见，例如，翻译版本2005-507426号的国家公布；Nobuo Imai等人，Eur.J.Biochem.194，457-462(1990))。
在EPO分子中的氨基酸修饰的例子包括氨基甲酰化、生物素化、脒基化(amidination)、乙酰化和胍基化(guanidination)。氨基甲酰化是本发明优选的氨基酸修饰方式。
对进行修饰的氨基酸残基没有特别的限制，且可以包括赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和色氨酸。赖氨酸是本发明优选的修饰氨基酸。
因此，含有氨基甲酰化的赖氨酸的EPO是本发明中氨基酸修饰的EPO的特别优选的实施方式(见，例如，Marcel L.等人，Derivatives ofErythropoietin that are tissue protective but not erythropoietic.Science，2004；305：239；Fiordaliso E.等人，A nonerythropoietic derivative oferythropoietin protects the myocardium from ischemia-reperfusion injury.PNAS，2005；102：2046)。EPO氨基甲酰化的方法包括，例如，通过与氰酸盐离子反应的氨基甲酰化、通过与烷基异氰酸酯反应的烷基氨基甲酰化和通过与芳香基异氰酸酯反应的芳香基氨基甲酰化。
药物制剂
可以根据本领域内已知的技术通过适当地加入，例如，悬浮剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂(isotonizer)、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、安抚剂、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧化剂等将EPO制成制剂。
悬浮剂包括甲基纤维素、聚山梨酯80、羟乙基纤维素、***胶、黄蓍胶粉末、羧甲基纤维素钠和聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯。
增溶剂包括聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨酯80、烟酰胺、聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯、聚乙二醇和蓖麻油脂肪酸的乙基酯。
稳定剂包括右旋糖酐40、甲基纤维素、明胶、亚硫酸钠和焦亚硫酸钠。
也可以加入特定的氨基酸作为稳定剂(见，例如，日本专利申请公开平10-182481)。加入作为稳定剂的氨基酸包括，例如，游离氨基酸及其盐(如钠盐、钾盐和盐酸盐)。可以加入单一的氨基酸或者两种或多种氨基酸的组合。对作为稳定剂添加的氨基酸没有特别的限制，但这方面的优选氨基酸为，例如，亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸。
等渗剂包括D-甘露醇和山梨醇。
防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚和氯甲酚。
吸附抑制剂包括人血清白蛋白、卵磷脂、右旋糖酐、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、羧丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚乙二醇。
表面活性剂的代表性的例子为非离子表面活性剂，例如，具有6-18的HLB的非离子表面活性剂，例如，诸如山梨聚糖单辛酸酯、山梨聚糖单月桂酸酯和山梨聚糖单棕榈酸酯的山梨聚糖脂肪酸酯，诸如甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯和甘油单硬脂酸酯的甘油脂肪酸酯，诸如十甘油单硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸酯和十甘油单亚油酸酯的聚甘油脂肪酸酯，诸如聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖三油酸酯和聚氧乙烯山梨聚糖三硬脂酸酯的聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，诸如聚氧乙烯山梨聚糖四硬脂酸酯和聚氧乙烯山梨聚糖四油酸酯的聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，诸如聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯的聚氧乙烯甘油脂肪酸酯，诸如聚乙二醇二硬脂酸酯的聚乙二醇脂肪酸酯，诸如聚氧乙烯月桂基醚的聚氧乙烯烷基醚，诸如聚氧乙烯-聚氧丙烯乙二醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯丙醚和聚氧乙烯-聚氧丙烯十六烷基醚的聚氧乙烯-聚氧丙烯烷基醚，诸如聚氧乙烯壬基苯基醚的聚氧乙烯烷基苯基醚，聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氢化蓖麻油)，诸如聚氧乙烯山梨醇蜂蜡的聚氧乙烯/蜂蜡衍生物，诸如聚氧乙烯羊毛脂的聚氧乙烯/羊毛脂衍生物，和诸如聚氧乙烯硬脂酰胺的聚氧乙烯脂肪酸酰胺。另外的表面活性剂的代表性的例子为阴离子表面活性剂，例如，诸如十六烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠和油烯基硫酸钠的具有C10-18烷基的烷基硫酸盐，诸如聚氧乙烯月桂基硫酸钠的具有平均2-4摩尔的环氧乙烷加入和具有C10-18烷基的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐，和诸如月桂基磺基丁二酸钠的具有C8-18烷基的烷基磺基丁二酸盐。另外的表面活性剂的代表性的例子为天然的表面活性剂，例如，卵磷脂、甘油磷脂、诸如神经鞘磷脂的鞘磷脂和与C12-18脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯。这些表面活性剂中的单个表面活性剂或这些表面活性剂中的两种或多种的组合可以添加到本发明的制剂中。诸如聚山梨酯20、40、60和80的聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯是优选的表面活性剂，尤其优选聚山梨酯20和80。诸如泊洛沙姆(例如，Pluronic F-68(注册商标))的聚氧乙烯-聚氧丙烯乙二醇也是优选的。
含硫还原剂包括诸如N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫代乳酸、硫代二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、硫代乙醇酸(thioglycol acid)和其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽和C1-7硫代链烷酸的含巯基的还原剂。
抗氧化剂包括异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、α-生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯和没食子酸丙酯，及诸如乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠和偏磷酸钠的螯合剂。
可以适当地加入的组分还包括诸如氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾和碳酸氢钠的无机盐，和诸如柠檬酸钠、柠檬酸钾和醋酸钠的有机盐。
在本申请的说明书中清楚地引用的所有专利和参考文献的内容将完整引入本文作为参考。另外，作为本申请的优先权要求的基础的日本专利申请2006-158998的说明书和附图的内容完整引入本文作为参考。
通过下面的实施例详细描述本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1
EPO对造血细胞的动员
向小鼠(C57BL/6，鼠龄：9周)皮下施用重组人EPO(Epogin(注册商标))，一天一次，以100μg/kg/天的剂量施用4天。向对照小鼠类似地皮下施用单独的载体。第5天，处死小鼠，收集外周血细胞(0.6-1mL)。加入0.01M的Tris-HCl缓冲液(pH7.5±0.2)中的含有8.3g/L的氯化铵的红细胞溶解缓冲液(SIGMA)作为溶血剂，并在室温下静置5-10分钟，然后用2％ BSF+PBS(-)洗涤。以1μg/106细胞的量加入CD16/CD32(Fcγ III/II受体)非特异性的反应抑制抗体(reaction blocking antibody)(BD-Pharmingen，San Diego，CA)，并在冰上保持30分钟。FITC-偶联的抗-mSca-1抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA)、PE-偶联的抗-mCD34抗体、APC-偶联的抗-mc-Kit抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA)和APC-Cy7-偶联的抗-mCD3、CD4、CD8a、CD45R/B220、Ly6G(Gr-1)、CD11b(Mac-1α链)和Ter119抗体的混合物用作谱系标志物(lineage marker)。抗体染色后，通过FACSvantage SE(Becton Dickinson，Mountain View，CA)分析细胞。
图1显示了分析结果。如图1的R3所示，通过施用EPO，c-Kit+Sca-1+Lin-细胞的数目增加大约13倍。c-Kit+Sca-1+Lin-细胞是小鼠中的CFU-S-样细胞的标志物(见，例如，Blood，1992 Dec.15；80(12)：3044-50)。以上报告的结果表明通过施用EPO将CFU-S-样细胞动员进入外周血液。
CFU-S集落分析
来自已经皮下施用EPO5天的C57/b6小鼠的外周血细胞用作供体细胞。104-105细胞/100-200μL的供体细胞通过受体C57/b6小鼠的尾静脉进行移植，受体C57/b6小鼠已经使用放射性照射装置(Hitachi Medico)接受了致死剂量的γ-辐射(来自137Cs的950cGy)。在移植后8-12天切除脾，并通过Bouin’s染色分析脾的集落(在脾中形成的集落的数目)。
图2显示了与FACS分析的结果一致的分析结果，观察到了CFU-S-样细胞进入外周血液的动员。
实施例2
通过外周血液单核细胞移植的血管生成治疗
本研究设计为调查是否能够通过施用***制剂在5个患有严重肢缺血疾病的病人中动员造血干细胞进入外周血液中。还进行了通过外周单核细胞的自身移植进行血管生成治疗的临床研究。临床研究的总体设计采用开放性的研究方案。
在计划的细胞移植之前两周，病人通过皮下注射接受6000U的EPO(第一次施用)。在细胞移植前一周，为了自体供血的目的而取血(约400mL)，并皮下注射接受6000U的EPO(第二次施用)。在手术日的早上，注射6000U的EPO(第三次施用)，然后通过血液的血浆分离置换法从外周血液中分离大约109的外周单核细胞。在施用EPO之前、在第二次施用之后和正好在血浆分离置换之前收集外周血液样本，并进行血液检测(WBC、CRP、CK)和CD34阳性细胞计数。
在50-100个位点将分离的外周单核细胞注射到病人的局部缺血的一个或多个肢体的肌肉中。在细胞移植前、施用后的一天、一周后、两周后、1月后、2月后和6月后，基于观察和对于下面项目的测量来评价血管生成治疗的效果：
QOL：以视觉模拟评分法(VAS)评价疼痛，0为不痛，10为最强疼痛
血样采集
血液检测
血管造影术
踏板试验：以2.4千米/小时、水平条件测量绝对行走距离或疼痛出现距离
皮肤和溃疡损伤的客观评价：踝肱指数(ABPI)、指(趾)容积描记法、踏板试验(走动能力)、温度记录法、激光多普勒血流灌注成像仪(LDPI)和透皮氧分压(TdPO2)测量
CD34阳性细胞的改变
下面的表1给出了病例、移植细胞计数和CD34阳性细胞计数的总结。在施用***之前的值标准化为100％，则在第一次施用***一周之后抽取血液时，外周血液中的CD34阳性细胞的比例显示出82-245％(平均为158％)的增长。在再一周后正好在血浆分离置换之前，增长率为88-175％(平均为139％)。这些结果表明在第一次施用***后一周，CD34阳性细胞计数(在放血过程中)与两周后(正好在血浆分离置换之前)的细胞计数一样或更大。
CD34阳性细胞占通过血液的血浆分离置换回收的单核细胞的0.02-0.1％(平均为0.06％)。
表1.
 
病例 性别 年龄 病因 移植位点 移植细胞总数 CD34阳性细胞
1 男 77 闭塞性动脉硬化 右下肢 0.5×109 0.1×106(0.2×104细胞/kg)
2 男 66 闭塞性动脉硬化 左下肢 16.7×109 5.0×106(8×104细胞/kg)
3 男 48 血栓闭塞性脉管炎 双上肢 9.2×109 9.2×106(14×104细胞/kg)
4 男 48 血栓闭塞性脉管炎 右上肢 6.9×109 5.5×106(9×104细胞/kg)
细胞移植的临床评价
主观症状和血管造影术的评价
表2.
 
病例 观察期 情况 VAS Fontatine分级 血管造影
1 11月 麻木、静息痛 7→7 III→II 没有改变
 
2 3月 麻木、静息痛 2→0 III→II 没有改变
3 3月 溃疡 6→3 不可分级 —
4 1周 溃疡 3→1 不可分级 没有进行
从主观角度，4个病例中的3个观察到疼痛的改善。
另外，移植1个月后，在病例3的血管造影中观察到血管再生(图3)。
客观评价
表3.
 
病例 观察期 ABPI 指(趾)容积描记 温谱图 LDPI TdPO2
1 11月 0.24→0.4 改善 中度改善 没有改变 没有改变
2 3月 0.49→0.66 改善 没有改变 没有改变 没有改变
3 3月 没有进行 改善 中度改善 中度改善 改善
4 1周 没有进行 改善 没有进行 没有进行 没有进行
在某些病例中注意到了ABPI和TdPO2的改善。病例2中看到在踏板试验中行走距离从160m到915m的明显改善。
上述结果表明可以通过施用***动员造血干细胞进入外周血液，和通过将外周单核细胞移植到局部缺血的骨骼肌中的血管生成疗法来治疗外周闭塞性动脉疾病。
而且，在第一次施用EPO一周后回收的外周血单核细胞中CD34阳性细胞的含量等于或高于两周后回收的单核细胞中的CD34阳性细胞含量，这表明在施用EPO一周后回收的单核细胞能够提供等于或大于两周后回收的单核细胞的血管生成的治疗效果。
工业实用性
本发明的方法和组合物对于治疗诸如外周血管障碍的局部缺血疾病是有用的。

Claims (6)

1.***与单核细胞联合用于制备治疗局部缺血疾病的药物的用途，其中所述***用于动员单核细胞进入外周血液，且其中所述单核细胞从施用***后3-12天的受试者的外周血液收集。
2.***与单核细胞联合用于制备刺激血管再生的药物的用途，其中所述***用于动员单核细胞进入外周血液，且其中所述单核细胞从施用***后3-12天的受试者的外周血液收集。
3.从预先施用了***的受试者的外周血液分离的单核细胞用于制备用于移植以治疗局部缺血疾病的药物的用途，其中红细胞生成素在从受试者收集外周血液之前3-12天施用。
4.从预先施用了***的受试者的外周血液分离的单核细胞用于制备用于移植以刺激血管再生的药物的用途，，其中红细胞生成素在从受试者收集外周血液之前3-12天施用。
5.***用于制备用于移植以治疗局部缺血疾病的药物的用途，其中***在从受试者收集外周血液之前3-12天向受试者施用，其中外周血单核细胞从受试者收集，和其中收集的外周血单核细胞向受试者的目标位点施用。
6.***用于制备用于移植以刺激受试者血管再生的药物的用途，其中***在从受试者收集外周血液之前3-12天向受试者施用，其中外周血单核细胞从受试者收集，和其中收集的外周血单核细胞向受试者的目标位点施用。
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