CN101454015A - 包含绿茶种的提取物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用超临界CO₂萃取方法制备的绿茶种植物原料提取物。

Description

包含绿茶种的提取物和方法

相关申请

本申请要求2006年3月23日提交的美国临时专利申请编号60/785,178的优先权权益，其在此全部引作参考。

发明领域

本发明涉及绿茶种提取物，使用连续的提取步骤制备提取物的方法，及其治疗方法。

发明背景

约4000年前茶发源于中国南部，超过世界人口的三分之二都饮用茶。茶气味诱人，口感极好，有利于健康，使其成为仅此于水的世界上最受欢迎的饮品。早在公元前3000年，中国人已将茶作为药饮用。明朝(16世纪)所著的古代中国药典“本草纲目”就有茶作为药用的记载。茶来源于植物Camellia sinensis。现在数以百计的茶实际上是从C.Sinensis的叶片制得的，一般分为三个主要的类：未发酵绿茶、部分发酵的乌龙茶以及完全发酵的红茶。

Camellia sinesis是山茶科家族的成员，为常绿灌木或乔木，可长到30英尺高。但是在栽培中为获取茶叶叶片通常将其剪枝为1-5英尺高度。此植物分支旺盛，栽培长有深绿、长毛、长卵形叶片，优选幼芽时采摘。老些的叶片一般认为质量差。

虽然绿茶和红茶都来自于植物Camellia sinensis，但叶片的处理过程使这两种茶有所不同。就红茶而言，采下叶片后使其萎蔫，而后卷曲。这些叶片进行发酵，将茶多酚(儿茶素类)转化为鞣酐并形成芳香环。叶片酶包括多酚氧化物与茶多酚，特别是儿茶素类反应从而发酵[1]。就绿茶制备而言，嫩叶不氧化。相反地蒸青叶片使所述氧化酶失活，从而保留茶叶儿茶素类。

绿茶叶片的化学成分包括多酚、甲基黄嘌呤、氨基酸、有机酸、糖、蛋白、木质素、脂质、叶绿素以及其他色素、灰分和精油，参见表1[2，3]。从商业和生物学角度看，传统上已认为多酚和儿茶素比其他成分更重要。但是近期已证实其他化学成分如茶氨酸、精油以及水溶性-乙醇不溶性的多糖具有重要的生物学有益作用(参见下列概要)。

表1.绿茶叶片的主要化学成分

化学成分干重

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精油组分(主要挥发油)                        0.1

多酚                                        39.0

     儿茶素类                               25.0

           儿茶素(C)                        (0.2)

           表儿茶素(EC)                     (2.2)

           表儿茶素没食子酸酯(ECG)          (1.9)

           没食子儿茶素(GC)                 (8.7)

           表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)   (10.9)

           表没食子儿茶素(EGC)              (9.7)

     咖啡酸衍生物                            微量

           咖啡酸

           绿原酸

     黄酮醇&黄酮醇苷                         3.0

           槲皮素                            (0.4)

           芦丁                              (1.5)

           山奈酚                            (0.5)

     其他酚酸类物质(鞣质)                    12.0

甲基黄嘌呤                                   3.5

咖啡因^*                                      3.3

      可可碱                0.1

氨基酸                      4.0

      茶氨酸                0.6

草酸^*                       0.6

多糖                        13.0

单糖                        4.0

纤维素                      7.0

蛋白质                      15.0

有机酸                      0.5

木质素                      6.0

脂质                        3.0

叶绿素&其他色素             0.5

灰分                        5.0

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^*毒性

绿茶含有以％物质干重计30-42％的多酚。也已被报道具有最强生物学有益活性的这些多酚的大部分是被称作“儿茶素类”的黄酮醇。所述主要的儿茶素类包括下述物质：(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、(-)-表没食子儿茶素(EGC)、(-)-儿茶酚没食子酸酯(CG)和表儿茶素(EC)，浓度最高的是EGCG，随后EGC、ECG和EC递减。包括(+)-没食子儿茶素(GC)、(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、(-)-儿茶素没食子酸酯(CG)和(+)-儿茶素(C)的其它儿茶素量少。已研究了所述儿茶素类的许多有益生物学效应，它们包括抗氧化活性，抗突变作用，抗致癌作用，抑制亚硝化作用，以及抑制肿瘤和无限增殖细胞生长，但对正常细胞无作用。但是其他化学成分基团也抑制生物学的有益作用。例如精油(EO)化学成分具有抗氧化剂活性、抗哮喘活性、抗菌活性、抗病毒活性、抗癌活性、免疫增强活性、降血糖活性、降血脂活性、抗炎活性、抗皮炎活性、抗痤疮活性和抗动脉粥样硬化活性。茶氨酸(T)具有减少焦虑和改善情绪的活性，提高认知的活性，抗癌活性，抗脑缺血和中风的神经元保护，以及降低体重的活性。此外，绿茶多糖(P)具有抗氧化剂和清除氧自由基的活性，抗糖尿病活性和免疫增强活性。

为简要总结绿茶化学成分的治疗价值，最近的科学研究和临床研究已表明，绿茶的各种化合物、化学组分和粗提物的治疗作用包括如下：很强的抗氧化剂作用，清除氧自由基，以及抑制亚硝化作用(EO，儿茶素类-主要是ECGC &ECG，P，提取物)[4-7]；抗突变活性(EO、儿茶素类、提取物)[7-12]；抗致癌活性但不影响正常细胞(EO、儿茶素类、T、提取物)[7-13]；皮肤保护(EO、儿茶素类、P、提取物)[8、10、11、14、15]；抗心血管疾病(EO、儿茶素类、提取物)[4-7、16、17]；抗高脂血症(提取物)[16]；抗中风和保护脑(EO、儿茶素类、T、P、提取物)[18、19]；抗牙周疾病(提取物)[20]；抗骨质疏松(提取物)[21]；增强免疫(提取物)[22]；抗病毒，抗HIV，抗细菌(EO、儿茶素类、提取物)[23]；减轻体重和产热作用(儿茶素类、咖啡因、T、提取物)[23、24]；抗衰老(儿茶素类-ECGC、提取物)[23]；减少焦虑，改善情绪，以及增强认知(T、提取物)[25、26]；及抗糖尿病(P、提取物)[27]。

虽然非常高剂量的绿茶普遍是安全无毒的，但饮用绿茶饮料和使用绿茶药品的一个可能后果是与咖啡因相关疾病的发展，如心律失常，胃肠道疾病，及表现为颤动、广泛性焦虑症和失眠的咖啡因毒性。此外过量使用咖啡因增加压力和压力有关的激素释放。使用过量咖啡因时血压可能升高，心脏病发作和中风的风险增加。

鉴于现有提取工艺缺乏广泛的选择性，就其化学组成而言目前可用的绿茶产品有待考察。因此需要的是新颖的可重现的绿茶提取物组合物，由纯化精油，高ECGC的儿茶素类，茶氨酸和多糖化学成分组分组合而成，且咖啡因浓度低，这可用标准化且可靠量的这些协同[14、28]作用的生理和医学上有益的绿茶化学成分制备。

发明概述

一方面，本发明涉及绿茶种提取物，其包含具有图6至25中任一的实时直接分析(DART)质谱分析色谱图的组分。

在另一实施方案中，所述提取物包含选自精油、多酚、多糖的化合物及其组合。在另一实施方案中，所述精油选自n-棕榈酸、十四酸、9-十六醇、1-十一醇、1-十六醇、油醇、9-十八烯-1-醇、十九醇及其组合。在另一实施方案中，所述多酚选自儿茶素类、黄烷醇、黄酮醇苷及其组合。在另一实施方案中，所述儿茶素选自儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)及其组合。在另一实施方案中，所述黄烷醇选自槲皮素和芦丁。在另一实施方案中，所述黄酮醇苷是山奈酚。在另一实施方案中，所述多糖选自葡萄糖、***糖、半乳糖、鼠李糖、木糖糖醛酸及其组合。在另一实施方案中，本发明的所述绿茶种基本上没有咖啡因、草酸或单宁酸。

在另一实施方案中，以重量计所述精油的量大于2％。在另一实施方案中，以重量计所述精油的量为25％-90％。在另一实施方案中，以重量计所述精油的量为50％-90％。在另一实施方案中，以重量计精油的量为75％-90％。

在另一实施方案中，以重量计多酚的量大于40％。在另一实施方案中，以重量计多酚的量为50％-90％。在另一实施方案中，以重量计多酚的量为75％-90％。

在另一实施方案中，以重量计多糖的量大于15％。在另一实施方案中，以重量计多糖的量为25％-90％。在另一实施方案中，以重量计多糖的量为50％-90％。在另一实施方案中，以重量计多糖的量为75％-90％。

在另一实施方案中，所述绿茶种提取物包含以重量计2％-97％的精油，以重量计15％-98％的儿茶素，以重量计4％-90％的茶氨酸，以及以重量计9％-98％的多糖。

另一方面，本发明涉及包含本发明所述绿茶种提取物的食品或药物。

另一方面，本发明涉及制备具有至少一种预定特性的绿茶提取物的方法，该方法包括通过a)超临界二氧化碳萃取提取绿茶种植物原料，制得精油组分和第第一残留；b)醇提或者绿茶种植物原料或者步骤a)的第第一残留，制得所述多酚组分和第第二残留；以及c)水提步骤b)的第第二残留，并醇沉多糖，制得所述多糖组分，从而顺序地提取绿茶种植物原料，制得精油组分、多酚组分和多糖组分。

在另一实施方案中，通过二氧化碳超临界萃取对步骤a)的第第一残留进一步去除咖啡因。在另一实施方案中，通过亲和吸附色谱进一步纯化所述多酚组分。

在另一实施方案中，步骤a)包括：1)将碾碎的绿茶中植物原料放入提取容器中；2)在超临界条件下加入二氧化碳；3)使绿茶种植物原料与二氧化碳接触一段时间；以及4)在收集容器中收集精油组分。在进一步实施方案中，步骤a)进一步包括通过超临界二氧化碳组分分离***分级分离所述精油组分，从而改变精油化合物的比例。在另一实施方案中，超临界条件包括35℃至90℃下60-800巴。在另一实施方案中，超临界条件包括40℃至80℃下60巴至500巴压力。在另一实施方案中，时间为30分钟至2.5小时。在另一实施方案中，时间为1小时。

在另一实施方案中，步骤b)包括：1)使碾碎的绿茶种植物原料或步骤a)的第第一残留与醇类溶剂接触足够长的时间，以提取多酚化学成分；2)使步骤1)提取的多酚化学成分的水溶液通过亲和吸附树脂柱，其中多酚类组分被吸附；3)用酸性洗脱溶剂从亲和吸附剂洗脱咖啡因化合物；以及4)用水-醇洗脱溶剂从亲和吸附树脂洗脱多酚化学成分。在另一实施方案中，所述水-醇溶液包含乙醇和水，其中以重量计乙醇浓度是10-95％。在另一实施方案中，水-醇溶液包含乙醇和水，其中以重量计乙醇浓度是25％。在另一实施方案中，步骤1)在30℃到100°进行。在另一实施方案中，步骤1)在60℃到100°进行。在另一实施方案中，时间是1-10小时。在另一实施方案中，时间是1-5小时。在另一实施方案中，时间是2个小时。

在另一实施方案中，步骤c)包含：1)使步骤b)的第第二残留与水接触足够长的时间，提取多糖；和2)醇沉水溶液中的多糖。在另一实施方案中，水温为70℃到90℃。在另一实施方案中，水温为80℃到90℃。在另一实施方案中，时间是1-5小时。在另一实施方案中，时间是2-4小时。在另一实施方案中，时间是2小时。在另一实施方案中，所述醇为乙醇。

另一方面，本发明涉及用本发明的方法制备的绿茶种提取物。

另一方面，本发明涉及绿茶种提取物，其包含连苯三酚，以连苯三酚重量计25至35％的茶碱/可可碱，以连苯三酚重量计0.1至5％的莽草酸，以连苯三酚重量计0.1至5％的香豆酸，和以连苯三酚重量计0.1至5％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

另一方面，本发明涉及绿茶种提取物，其包含茶氨酸，以茶氨酸重量计20至30％的茶碱/可可碱，以茶氨酸重量计1至10％的儿茶素/表儿茶素，以茶氨酸重量计1至10％的没食子酸，以茶氨酸重量计0.1至5％的儿茶素醌(catechin quinone)，以茶氨酸重量计0.1至5％的肉桂醛，以及以茶氨酸重量计1-10％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

另一方面，本发明涉及到绿茶种提取物，其包含茶氨酸，以茶氨酸重量计45至55％的茶碱/可可碱，以茶氨酸重量计1-10％的儿茶素/表儿茶素，以茶氨酸重量计0.1至5％的鼠尾草酸，以茶氨酸重量计1至10％的没食子酸，以茶氨酸重量计0.5至5％的儿茶素醌，以茶氨酸重量计1至10％的肉桂醛，以茶氨酸重量计0.1-5％的甲基肉桂酸，以茶氨酸重量计1至10％的肉桂酰胺，以及以茶氨酸重量计1-10％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

另一方面，本发明涉及绿茶种提取物，其包含连苯三酚，以连苯三酚重量计1至10％的茶碱/可可碱，以连苯三酚重量计0.1至5％的茶氨酸，以连苯三酚重量计1至10％的儿茶素/表儿茶素，以连苯三酚按重量计5至15％的山奈酚，以连苯三酚重量计0.1至5％的杨梅苷，以连苯三酚重量计0.1至5％的没食子儿茶素醌(gallocatechin quinone)，以连苯三酚重量计65至75％的没食子酸，以连苯三酚重量计0.5至5％的儿茶素醌，以连苯三酚重量计1至10％的香草酸，以及以连苯三酚重量计1-5％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

另一方面，本发明涉及绿茶种提取物，其包含山奈酚，以山奈酚重量计1至10％的茶氨酸，以山奈酚重量计95至105％的儿茶素/表儿茶素，以山奈酚重量计20至30％的槲皮素，以山奈酚重量计5至15％的杨梅苷，以山奈酚重量计5至10％的没食子儿茶素醌，以山奈酚重量计55至65％的没食子酸，以山奈酚重量计1至10％的儿茶素醌，以山奈酚重量计10％至20％的香豆酸，以山奈酚重量计1至10％的香草酸，以及以山奈酚重量计15-25％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

另一方面，本发明涉及绿茶种提取物，其包含连苯三酚，以连苯三酚重量计0.5至5％的茶碱/可可碱，以连苯三酚重量计95至105％的儿茶素/表儿茶素，以连苯三酚重量计55至65％的山奈酚，以连苯三酚重量计20至30％的槲皮素，以连苯三酚重量计10％至20％的杨梅苷，以连苯三酚重量计20至30％的没食子儿茶素醌，以连苯三酚重量计50至60％的没食子酸，以连苯三酚重量计15至25％的儿茶素醌，以连苯三酚重量计15至25％的香豆酸，以连苯三酚重量计1至10％的香草酸，以及以连苯三酚重量计0.5-5％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

另一方面，本发明涉及绿茶种提取物，其包含连苯三酚，以连苯三酚重量计0.5至5％的茶碱/可可碱，以连苯三酚重量计95至105％的儿茶素/表儿茶素，以连苯三酚重量计55至65％的山奈酚，以连苯三酚重量计20-30％的槲皮素，以连苯三酚重量计10％至20％的杨梅苷，以连苯三酚重量计20至30％的没食子儿茶素醌，以连苯三酚重量计50至60％的没食子酸，以连苯三酚重量计15至25％的儿茶素醌，以连苯三酚重量计15至25％的香豆酸，以连苯三酚重量计1至10％的香草酸，以及以连苯三酚重量计0.5-5％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

另一方面，本发明涉及绿茶种提取物，其包含连苯三酚，以连苯三酚重量计的茶氨酸，以连苯三酚重量计90至100％的儿茶素/表儿茶素，以连苯三酚重量计65至75％的山奈酚，以连苯三酚重量计15至25％的槲皮素，以连苯三酚重量计5至15％的杨梅苷，以连苯三酚重量计5至15％的没食子儿茶素醌，以连苯三酚重量计65至75％的没食子酸，以连苯三酚重量计5至15％的儿茶素醌，以连苯三酚重量计10％至20％的香豆酸，以连苯三酚重量计1至10％的香草酸，以及以连苯三酚重量计1-10％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

本发明的提取用于提供生理和医疗效果，包括但不限于抗氧化活性，清除氧自由基，抑制亚硝化作用，抗致突变活性(预防癌症)，抗致癌活性(癌症治疗)，皮肤保护，抗衰老，抗心血管疾病，抗中风及治疗，保护脑，抗高脂血症，抗牙周疾病，抗骨质疏松，增强免疫，抗病毒，抗HIV和细菌活性，抗真菌活性，抗病毒活性，控制体重和产热作用，抗糖尿病，减少焦虑，改善情绪和提高认知水平。

通过下述说明、附图和权利要求，所述公开的这些实施方案，其他实施方案及其特征和特点是显而易见的。

附图简述

图1描绘了根据本发明的精油超临界二氧化碳萃取(步骤1)和绿茶脱咖啡因(步骤2)的典型示意图。

图2描绘了根据本发明的天然绿茶儿茶素化学成分组分的乙醇提取典型示意图。

图3描绘了根据本发明的亲和吸附提取方法的典型示意图。

图4描绘了根据本发明的水浸提取L-茶氨酸和多糖的典型示意图。

图5描绘了根据本发明的纯化L-茶氨酸和多糖组分的典型示意图。

图6描绘了本方法步骤6的绿茶多糖组分的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图7描绘了本方法步骤6的绿茶多糖组分的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图8描绘了本方法步骤6的绿茶多糖组分的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图9描绘了本方法步骤6的绿茶多糖组分的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图10描绘了本方法步骤6的绿茶多糖组分的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图11描绘了本方法步骤6的绿茶多糖组分的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图12描绘了市售绿茶(Kai Hua Long Ding)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图13描绘了本方法步骤3的95％乙醇浸出的绿茶粗提物的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图14描绘了使用XAD7HP解吸填料柱色谱的本方法步骤4绿茶酚酸料液(feed)的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图15描绘了使用XAD 7HP解吸填料柱色谱的本方法步骤4绿茶纯化F2组分的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图16描绘了使用XAD 7HP解吸填料柱色谱的本方法步骤4绿茶纯化F3组分的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图17描绘了使用XAD 7HP解吸填料柱色谱的本方法步骤4绿茶纯化F4组分的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图18描绘了使用XAD 7HP解吸填料柱色谱的本方法步骤4绿茶纯化F5组分的AccuTOF-DART质谱(正离子模式)。

图19描绘了市售绿茶(Kai Hua Long Ding)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图20描绘了本方法步骤3的95％乙醇浸出的绿茶粗提物的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图21描绘了使用XAD 7HP解吸填料柱色谱的本方法步骤4绿茶酚酸料液(feed)的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图22描绘了使用XAD 7HP解吸填料柱色谱的本方法步骤4绿茶纯化F2组分的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图23描绘了使用XAD 7HP解吸填料柱色谱的本方法步骤4绿茶纯化F3组分的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图24描绘了使用XAD 7HP解吸填料柱色谱的本方法步骤4的绿茶纯化F4组分的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

图25描绘了使用XAD 7HP解吸填料柱色谱的本方法步骤4绿茶纯化F5组分的AccuTOF-DART质谱(负离子模式)。

发明详述

定义

本文所用的冠词“一”指所述冠词的一个/种或大于一个/种(即至少一个/种)的语法对象。例如“一成分”意思是一种成分或大于一种成分。

本文所用的“地上部分”指C.Sinensis的组成部分，包含叶和茎。

本文所用的“儿茶素组分”包含从绿茶获得或来源于绿茶的水溶性和醇溶性儿茶素化合物，进一步包含但不限于如ECGC、EGC、ECG、EC、GC、GCC、GC和C的化合物。

术语“包含”用作包括、开放之意，指可以包括另外的成分。

除通常与其相关的杂质外，术语“组成”用于将成分限定在那些指定的物质。

术语“基本上由......组成”用于将成分限定在指定的那些以及实质上不影响所述物质或步骤的基本和新特征的那些。

本文所用的术语“脱/去除咖啡因的”包含绿茶提取组合物，其咖啡因浓度低于绿茶叶片植物原料中咖啡因的浓度。

本文所用的术语“有效量”指得到所需生物学效应的必需量。本领域普通技术人员会理解，合成物或生物活性物质的有效量可能会随以下因素而变化：所需生物终点、待使用的生物活性物质、封装基质的组成、靶组织等。

本文所用的术语“精油组分”包含从绿茶获得或来源于绿茶的脂溶性，水不溶性化合物，包括但不限于分类为n-棕榈酸、十四酸、9-十六醇、E、油醇、1-辛醇、叶绿醇和二氢猕猴桃(醇酸)内酯的化合物。

本文所用的“原料”一般指植物原料，包含单独整个植物，或与包含叶、根的植物的一种或多种组成部分的组合，包含但不仅限于主根、尾根、须根、茎、叶、种子和花，其中植物或组成部分可包含生的、干燥的、蒸的，加热的或以其他方式受到物理处理以方便处理的物料，可进一步包含完整的、切的、剁碎的、切块的、磨细的、磨碎的或以其他方式处理从而影响植物原料大小和物质完整性的物料。偶尔地，术语“原料”可用于表征用作其它提取方法原料来源的提取物。

本文所用的术语“组分”指所述提取组合物，其包含由某些物理-化学性质或物理或化学性质表征的化合物的特定组。

本文所用的术语“绿茶”指来源于Camellia sinensis种植物的叶片或气生植物原料。术语绿茶也与茶C.Sinensis种互换使用，指这些植物、克隆、变体和芽变等。绿茶是经处理生产绿茶叶片的C.sinensis种植物原料常规提取物的药物名称。

本文所用的术语“绿茶成分”应指在绿茶种中发现的化合物，并应包括以上指明的所有这些化合物以及在绿茶种中发现的其他化合物，包括但不限于所述精油化学成分、儿茶素、茶氨酸和多糖。

本文所用的“一种或多种化合物”是指至少一种化合物，如n-棕榈酸(绿茶的脂溶性精油化学成分)，或ECGC(绿茶的水和水-乙醇可溶性儿茶素)，或茶氨酸(绿茶的水溶性氨基酸)或绿茶的水溶性-乙醇不溶性多糖分子，或指超过一种化合物如n-棕榈酸和ECGC。正如本领域所知，术语“化合物”并不是指单个分子，而是指多个或多摩尔的一种或多种化合物。正如本领域所知，术语“化合物(compound)”是指具有独特的化学和物理性质的特定化学成分，而“化合物(compounds)”是指一种或多种化学成分。

本文所用的术语“多糖组分”包括从绿茶获得或来源于绿茶的水溶性-乙醇不溶性多糖化合物。多糖的非限定性例子包括葡萄糖、***糖、半乳糖、鼠李糖、木糖糖醛酸及其组合。

绿茶的其他化学成分也可能出现在这些提取组分中。

本文所用的术语“分布(profile)”是指提取组分中所述化合物的物质重量百分比比率，或最终绿茶提取组合物中所述四种绿茶组分化学成分每种的物质重量百分比的比率。

本文使用的术语“纯化”组分或组合物指包含由某些物理-化学性质或物理或化学性质表征的特定组化合物的组分或组合物，这些化合物的浓度大于所述组分或组合物化学成分的50％。换而言之，纯化的组分或组合物包含少于50％化学组成的化合物，这些化合物不由定义所述组分或组合物的某些所需物理-化学性质或物理或化学性质所表征。

术语”协同的”是本领域承认的，指两种或多种成分共同作用，从而使总的效果大于所述成分的总和。

本文所用的术语“茶氨酸组分”包括从绿茶获得或来源于绿茶的水溶性茶氨酸(氨基酸)。

术语“治疗”是本领域承认的，指治愈以及改善任何疾病的至少一种症状。

提取物

本发明包括来自一种或多种绿茶原料的精油、儿茶素、茶氨酸和多糖的分离或纯化组分的提取物。这些单个的组分可以以特定比率(分布)组合以提供有益的组合物，并可提供目前所知的提取物产物中没有的提取产物。举例来说，来自一个种的精油组分可以和相同或不同种的儿茶素组分组合，该组合物可以与或不与相同或不同绿茶原料的茶氨酸组分或多糖组分组合。这种提取物包括具有既定量的精油、儿茶素、茶氨酸或多糖组分的至少一种的组分。实施方案包含不含草酸的绿茶提取物。实施方案包含脱咖啡因的绿茶提取物。

另外的实施方案包含提取物，该提取物包含与天然植物原料或现有的绿茶提取物产品中发现的绿茶化学成分有关的分布(比例分配)改变的绿茶化学成分。举例来说，与儿茶素和/或茶氨酸和/或多糖的浓度有关的精油组分浓度可能增加或减少。类似地，与其他提取物组分有关的儿茶素或茶氨酸或多糖可能增加或减少，从而出现新的组分化学分布的组合物，以产生特定的生物效应。

在一个实施方案中，本发明的提取物可包含以物质重量计超过2％的精油化学成分。这样提取物的另一个实施方案包含预定的儿茶素浓度，其中所述儿茶素浓度大于在天然植物原料或常规绿茶种提取物中发现的浓度。举例来说，提取物可包括以物质重量计浓度大于提取物30％的新型绿茶儿茶素。这样提取物的另一实施方案可包括以物质重量计浓度超过2％的L-茶氨酸，比在天然植物原料或现有提取物中的天然绿茶L-茶氨酸的浓度大。

单个绿茶种有益化学成分浓度关系(化学分布)的改变使为特定人类疾病或食物设计的独特或新的绿茶种提取物制剂成为可能。举例来说，具有抗氧化剂、清除氧自由基以及抑制亚硝化作用活性的新颖且功效很强的绿茶组合物以％物质重量计可以有比在绿茶天然植物原料或常规已知提取物中更多的纯化精油、儿茶素和多糖组合物，以及L-茶氨酸减少的组合物。相反地，预防癌症的新型绿茶提取物以％物质重量计，可以有比在绿茶天然植物原料或常规已知提取物中更多的纯化精油和儿茶素组分，以及减少的L-茶氨酸和多糖组分。抗中风和保护脑的新型绿茶提取物分布的另一个例子可以是以％物质重量计比天然绿茶植物原料或已知常规绿茶提取物中发现的更多的纯化精油、儿茶素、L-茶氨酸和多糖组合物的提取物分布。对于抗衰老活性，以％物质重量计比天然绿茶植物原料或常规提取物中发现的更高的儿茶素以及减少的精油、茶氨酸和多糖组分可能是需要的。相比较而言，对于减少焦虑，改善情绪和认知提高，以％物质重量计比天然绿茶植物原料或常规提取物中发现的更高的纯化茶氨酸组分，以及减少的精油、儿茶素和多糖组分可能是最理想的组合产物。

本发明另一实施方案为包含新的儿茶素化学成分的亚组分的提取物，其中总儿茶素是高纯度的(例如以物质重量计>95％)，特定的高生物活性儿茶素化合物如ECGC相对于其他儿茶素类化合物(分布的亚组分)浓度增加。这种新型的纯化儿茶素亚组分提取物可用单独或与其他绿茶纯化组分、其他植物化学成分或药学化学化合物组合使用。举例来说，这样的新型儿茶素亚组分对于预防癌症和老化可能有相当大的益处。

本发明的方法包括提供新型绿茶提取物治疗和预防人类疾病。例如与绿茶天然植物原料或常规已知提取物中发现的相比，抗氧化活性和保护心血管的新型绿茶提取物以％重量计，可能有增加的儿茶素组分浓度，增加的精油组分浓度，降低的茶氨酸浓度以及增加的多糖组分浓度。与绿茶天然植物原料或常规已知提取物中发现的相比，预防和治疗中风的新型绿茶种提取物以％重量计，可能有增加的儿茶素组分、精油组分、茶氨酸组分以及多糖组分浓度。治疗焦虑和抑郁的新型绿茶提取物的另一个例子包含具有与绿茶天然植物原料或已知常规提取物中发现的相比，浓度增加的茶氨酸组分、降低的精油组分，降低的儿茶素浓度以及降低的多糖组分的组合物。

与天然绿茶相对的提取物

实施方案包含绿茶提取物，其有与天然绿茶植物原料和现有绿茶提取物中发现的相比量更大的精油、儿茶素、茶氨酸或多糖中的至少一种。实施方案还包含组合物，其中发现一种或多种组分，包括精油、儿茶素、茶氨酸或多糖的浓度比天然绿茶植物原料中的高。实施方案还包含提取物，其中发现一种或多种组分，包括精油、儿茶素、茶氨酸或多糖的浓度比天然绿茶植物原料中的低。绿茶已知量的生物活性化学成分组分(表1)用作本发明的例子。例如本发明的提取物包括其中精油浓度是天然绿茶植物原料浓度0.001至200倍的组分，和/或其中儿茶素浓度是天然绿茶植物原料浓度0.001至4倍的成分，和/或其中茶氨酸浓度是绿茶植物原料浓度0.001至200倍的提取物，和/或其中多糖浓度是绿茶植物原料浓度0.001到40倍提取物，和/或其中咖啡因浓度是绿茶植物原料浓度0.001至0.99倍浓度的提取物。本发明提取物包含其中精油浓度是天然绿茶浓度0.01至200倍的组分，和/或其中儿茶素浓度是天然绿茶浓度0.01至4倍的提取物，和/或其中茶氨酸浓度是天然绿茶浓度0.01至200倍的提取物，和/或其中多糖浓度是天然绿茶植物原料浓度0.01至40倍的提取物。此外，本发明的提取物包含儿茶素化学成分的亚组分，该儿茶素化学成分具有至少一种或多种天然植物原料儿茶素化学成分中出现的化合物，其量比天然绿茶植物原料儿茶素化学成分中发现的更多或更少。例如化合物ECGC的浓度可能从以天然绿茶植物原料中总儿茶素化学成分％物质重量计的50％，增加至儿茶素亚组分中以亚组分％物质重量计的60％。相比之下，C可能从以天然植物原料中总儿茶素化学成分％物质重量计的2.2％，减少至儿茶素亚组分中以亚组分％物质重量计的<0.1％。本发明的提取物包含提取物，其中这样的新儿茶素亚组分中的特定化合物的浓度比天然绿茶儿茶素组分中发现的或者增加了约1.1至约2倍，或者减少了约0.1至100倍。

这样的提取物的另一实施方案包含比天然绿茶种干植物原料或常规绿茶种提取物中发现的浓度大幅增加的预定的多糖。例如提取物可能包括超过提取物物质重量3％的水溶性乙醇不溶性多糖组分。实施方案还包含提取物，其中一种或多种组分，包括精油化合物、儿茶素类、L-茶氨酸或多糖，浓度比天然绿茶植物原料中发现的低。例如本发明的提取物包含的精油是天然绿茶植物原料浓度的0.001至100倍，和/或提取物儿茶素类浓度是天然绿茶植物原料浓度的0.001至14倍，和/或L-茶氨酸浓度是天然绿茶植物原料的0.001至100倍，和/或多糖浓度是天然绿茶植物原料浓度的0.001至80倍。制备组合提取物时，可以使用约0.001mg至约200mg的精油组分。另外可使用约0.001mg至约500mg的纯化儿茶素组分。此外可使用约0.001mg至500mg的纯化L-茶氨酸组分。最后可用约0.001mg至约500mg水溶性，乙醇不溶性的多糖组分。

提取物纯度

本发明以下教导的方法允许精油组分、儿茶素组分、儿茶素亚组分、L-茶氨酸组分和多糖组分的纯化(浓度)，以及儿茶素、L-茶氨酸和多糖组分脱咖啡因。以所需化学成分物质重量计，高达89％的精油组分纯度，可以以咖啡因作为纯化组分中主要的非精油成分而实现。SCCO2已被证明是绿茶原料去除咖啡因的极好的方法，去除以原料中咖啡因物质重量计的约85％。将儿茶素组分层析纯化过程的所有儿茶素亚组分组合，可以得到以组合提取物物质重量计63-68％的总儿茶素类纯度，和以总儿茶素类物质重量计57-69％的ECGC浓度(分布)。将选定的亲和吸附层析洗脱的亚组分，包含以亚组分物质重量计的91-99％总儿茶素纯度的高度纯化的儿茶素亚组分，与以总儿茶素物质重量计的浓度62-70％的ECGC组合，很容易实现并有相当高的得率。如果不考虑得率，可以得到包含甚至更高水平的总儿茶素纯度和ECGC浓度的亚组分。使用本发明教导的方法还可以得到高得率的，包含以组分物质重量计浓度90％的L-茶氨酸的纯化L-茶氨酸组分，和包含以组分物质重量计浓度大于90％的纯化多糖组分。特定提取环境，提取率，溶剂和使用的提取技术取决于来源原料起始化学成分分布和最终提取物中所需的纯化水平。本发明教导的特定方法由本领域技术人员仅通过常规实验就能容易地确定，所述常规实验典型地能调整方法以适应经处理得到具有特定性质产品的起始原料的属性改变。例如在特定的许多绿茶种植物材料中，使用正如本发明所教导的本领域技术人员已知的方法来确定精油化学成分、咖啡因、儿茶素、L-茶氨酸和多糖的初始浓度。对于使用所述提取方法的最终提取产物而言，本领域技术人员可确定变化量，例如从儿茶素组分初始浓度到儿茶素化学成分预定量的变化量，如本文所述以达到最终绿茶种组合物产物的理想浓度。同样地，对于去除咖啡因的水平，精油化合物、L-茶氨酸和多糖组分组合物而言，也可确定这样的变化。

总而言之，本发明的方法和组合物包含制备具有预定特性的经提取绿茶种组合物的方法。这样经提取绿茶种组合物可取决于给定产物所需的有益生物效应包含所述四种浓提取组分的任意一种、两种、三种或全部四种。典型地，含有所有四种纯化绿茶种提取物组分的组合物通常是所需的，因为这样的新型组合物是含有天然植物原料中发现的所有四种主要生物学有益化学成分的一级高纯度绿茶种提取物。本发明的实施方案包含方法，其中所述预定特性包含单独提取组分中预定选择性浓度增加的绿茶种精油化合物、儿茶素、L-茶氨酸和多糖。最终组合物中有所有四种生物学有益化学成分组的重要性与这些化合物增强的协同相互作用相关，与相关化合物高纯度单个化合物或组所发现的相比，所需生理和药物作用增强。

提取方法

提取的起始原料为来自一种或多种C.sinensis种的植物原料。虽然优选植物的气生部分，包括叶片、茎或其它部分，但该植物原料可以是所述植物的任何部分，叶片是最优选的起始原料。

可对C.sinensis种植物原料进行预提取步骤，使该原料形成任何特定形式，可用于提取的任何形式都在本发明考虑范围内。对于绿茶制备，C.sinensis叶片原料优选蒸青的以灭活将儿茶素转化为鞣红的酶。这种预提取步骤包括但不仅限于其中的原料被切，剁、切碎、撕碎、碾碎、磨碎、切或撕扯，以及在预提取步骤前，起始原料是干燥的或新鲜植物原料。首选的预提取步骤包括将C.Sinensis种叶片原料碾碎和/或磨碎成细粉。起始原料或预提取步骤后的原料可以是干燥的或添加水分的。一旦绿茶植物原料为提取形式，提取方法在本发明的考虑范围内。

通常本发明的方法部分包含其中绿茶植物原料用超临界流体萃取(SFE)，也称作超临界二氧化碳(SCCO₂)提取，随后为一个或多个溶剂提取步骤，例如但不限于水、含水乙醇和亲和聚合物吸附提取工艺的方法。本发明考虑的另外的其他方法包含用其它化学溶剂、制冷剂化学品、压缩气体、超声处理、压力下液体萃取(pressure liquid extraction)、高速逆流色谱、分子印迹聚合物和其它已知提取方法对绿茶植物原料进行提取。这样的技术本领域技术人员是已知的。一方面，本发明的组合物可通过包含图1-5中示意图描绘步骤的方法制备。

本发明包括用SCCO2技术从绿茶植物原料浓缩(纯化)和分布(profiling)精油和其它脂溶性化合物。本发明包括用SCCO2方法使绿茶植物原料脱咖啡因。本发明教导的用SCCO2提取精油化学成分和去除绿茶植物原料的咖啡因，不考虑使用毒性有机溶剂。二氧化碳是天然安全的生物学产品和许多食品饮料中的成分。

精油是广泛用于香料产业、医药行业以及食品和人类营养的芳香物质。它们是超过200种化合物的混合物，可基本分为两部分：挥发性部分和非挥发性残留物，挥发性部分构成精油整体的90-95％，含有单萜和倍半萜烃类及其含氧衍生物，以及脂肪醛、醇和酯，非挥发性残留物构成精油整体的5-10％，含有烃、脂肪酸、甾醇、类胡萝卜素、蜡、香豆素、咖啡因和黄酮类。

这些化合物的广泛使用使得多年来精油的分离、浓缩和纯化已成为重要工艺。迄今普遍的方法主要是根据溶剂萃取法和水蒸气蒸馏法。使用这些传统技术有重大的不利之处(不耐热化合物损失的风险)，还有两个重要缺点(无法自动化且提取所需时间长)。浓缩的工业方法为分级真空蒸馏和选择性溶剂萃取及色谱分离。所有这些方法都有重要的缺点，如产量低，副产物的形成(归因于接触高温的时间)和提取物存在有毒有机残留物。

最近超临界流体萃取(SFE)已用于从中植物中提取精油，尝试避免常规技术相关的缺点。SFE用于提取是由于结合了类似气体的传质性能和类似液体的溶解特性以及高于液体溶剂的扩散系数。SFE也是提高通过分级分离的常规提取方法所得到精油的质量的合适技术。

咖啡因是世界上消耗最多的生物碱，在某些天然产物发现其浓度高，如可可豆(0.2％)，咖啡豆(0.9-2.4％)和茶叶(1.5-2.5％)。咖啡因通常通过使用有机溶剂提取获得，如二氯甲烷和正己烷，这些溶剂被认为对人类健康和环境是有害的。对咖啡因而言，水是极好的但非选择性的溶剂。用水提取导致溶解和随后如绿茶茶多酚(儿茶素类)的其它有价值成分的损失。

在本发明中，超临界二氧化碳已被选作提取咖啡因(绿茶脱咖啡因)的主要方法。该方法涉及高温下使用压缩气体作为去除咖啡因的溶剂。在工业规模上，用二氧化碳从咖啡豆提取咖啡因。超临界CO2与传统所用有机溶剂相比无污染和无毒性。一些专利已发表用CO2从咖啡豆提取咖啡因并已在此前进行了讨论。Zosel(美国专利4,247,570)详细描述了大规模脱咖啡因的操作。咖啡豆中咖啡因含量从0.7-3％降至约0.02％。提取方法在70-90℃和160-200巴(CO2密度为0.4-0.65g/cc)下进行。

对于咖啡因超临界二氧化碳是非常有选择性的，但咖啡因溶解度低于在有机溶剂中的溶解度，从而导致使用大量二氧化碳，并因此大量增加固定和运营成本。用咖啡豆观察到，水可以作为有价值的共溶剂从而大大提高提取率。

绿茶植物原料的生物活性化学成分的提取方法示意图如图1-5所示。提取方法一般是但不仅限于6个步骤。为本文参照起见，本文中出现黑体数字X时，该数字指的是图1-5中的数字。提取方法中使用的分析方法在范例部分出现。

步骤1：绿茶精油的超临界流体二氧化碳萃取

由于精油的疏水性，非极性溶剂包括但不限于SCCO2、正己烷、石油醚和乙酸乙酯可用于此提取方法。由于精油某些成分是挥发性的，所以也可用水蒸汽蒸馏作为提取方法。

用SCCO2从绿茶叶片提取精油化学成分的通用说明在图1-步骤1中有图解。原料[10]是干的经切剪的绿茶叶片(尺寸超过105μm)。提取溶剂[210]是纯二氧化碳。水可作为共溶剂。原料装入SFE萃取容器[20]中。清洗和检漏后，该方法包括液化的二氧化碳从存储容器流经冷却器到达二氧化碳泵。二氧化碳被压缩到所需压力，流经压力和温度都保持在所需水平的容器中的原料。提取压力范围从约60巴到800巴，温度范围从约35℃至约90℃。本文教导的所述SCCO2提取优选在压力至少100巴和温度至少35℃下进行，更优选压力约60巴到300巴，温度约40℃到60℃。单阶段提取的提取时间范围从约30分钟至约2.5小时，至约1小时。每次SCCO2提取的溶剂与原料比例通常是约20-60比1。工业提取处理时回收二氧化碳。经提取、纯化并分布(profiled)的精油化学成分[30]经收集器或分离器收集，保存在避光玻璃瓶中，并储存在4℃冰箱暗处。绿茶原料[10]可在一个步骤方法中提取(图1，步骤1A)，其中所产生的经提取和纯化的绿茶精油组分[30]收集在一个SFE收集器或SCCO2***[20]中。或者如在分级SFE***中，SCCO2萃取的绿茶原料可分凝到收集器(分离器)中，这样在每个收集器中，收集的每种纯化精油亚组分中有不同相对百分比的精油化学成分组合物(分布)。收集残留(剩余物)[40]，保存并用于包括但不限于脱咖啡因的进一步处理，以及得到纯化的绿茶组分儿茶素、茶氨酸和多糖的处理。本发明的实施方案包括使用压力为60巴至800巴和温度为35℃-90℃下的多级SCCO2萃取提取绿茶原料，并在每个阶段后收集被提取的绿茶原料。本发明的第二个实施方案使用压力为60-800巴和温度为35℃-90℃下的分级分离SCCO2萃取提取绿茶种原料，并在预定的条件(压力、温度和密度)以及预定的间隔(时间)下，用不同的收集器容器收集提取的绿茶物质。来自每次多级提取器或不同收集器容器(分级分离***)中所产生的提取的绿茶纯化精油亚组分的组合物可回收单独使用，或可组合成包含比天然植物原料中发现的浓度高或低的预定精油化学成分的一种或多种绿茶精油组合物。通常使用单个步骤SCCO2萃取的绿茶植物原料精油组分的总收率以％重量计为约0.4％(>精油化学成分的95％)，含有的精油化学成分纯度大于提取物物质重量的85％。这种提取过程的结果见下表2-4。实施例1中可看到该方法过程。

表2 第一阶段40℃、200巴下处理的结果

 

试验	原料1	S/F	得率(％)	咖啡因纯度(％)	原料提取的咖啡因(％)2
						2	F1干叶片	24	0.17	15.6	2.1
3	F1干叶片	24	0.13	18.3	1.9
						4	F1干叶片	36	0.40	12.2	2.8
5	含水40％的F1湿叶片	24	0.26	21.6	4.6
						6	含水100％的F1湿叶片	60	0.45	79.8	17.5
7	含水100％的F4湿叶片	60	0.66	11.0	2.2
						8	含水100％的JPGT湿叶片	60	0.88	16.8	2.1

1.F1＝中国绿茶；F4＝中国绿茶；JPGT＝日本绿茶。

2.原料提取的咖啡因＝提取物中咖啡因/原料中咖啡因×100。

表3.绿茶精油提取物的组合物

 

峰ID	保留时间(分钟)	名称	CAS#	分子式	Mw
						CGTF2-P1	7.8	4-戊烯醛	2100-17-6	C5H8O	84
CGTF2-P2	11.5	(Z)-2-辛烯	7642-04-8	C8H16	112
						CGTF2-P3	12.1	4-亚甲基庚烷	15918-08-8	C8H17	113
1	13.5	庚醛	111-71-7	C7H14O	114
						2	16.0	壬醛	124-19-6	C9H18O	142
CGTF2-P4	18.3	2-丙烯酸-2-甲基丙酯	106-63-8	C7H12O2	128
						3	20.0	2-甲基-1，3，4-噁二唑	3451-51-2	C3H4N2O	139
4	20.4	1，3-二(1，1-二甲基乙基)苯	1014-60-4	C14H22	190
						5	20.6	3-甲基-1-庚醇	1070-32-2	C8H18O	130
6	22.8	丙烯酸叔丁基酯	1663-39-4	C7H12O2	128
						7	23.2	1-丁氧基戊烷	18636-66-3	C9H20O	144
8	23.6	4-乙基-5-甲基壬烷	1632-71-9	C12H26	170
						9	23.9	未知1		C10H18O	154
JPGT-P1	24.9	2-甲氧基-1-(1-丙烯基)苯酚	97-54-1	C10H12O2	164
						10	25.3	5-甲基-1-庚醇	7212-53-5	C8H18O	130
11	26.1	3-丁基环己酮	39178-69-3	C10H18O	154

 

峰ID	保留时间(分钟)	名称	CAS#	分子式	Mw
12	28.2	2-甲基-2-壬烷	10297-57-1	C10H22O	158
						JPGT-P2	29.7	3-溴甲基庚烷	18908-66-2	C8H17Br	192
13	29.7	2，3，7-三甲基辛烷	62106-34-6	C11H24	156
						14	30.1	1-癸醇	112-30-1	C10H22O	158
15	31.5	未知2			154
						JPGT-P3	31.3	3-甲基-十一烷	1002-43-3	C12H26	170
16	31.7	3，5-二(1，1-二甲基乙基)苯酚	1138-52-9	C14H22O	206
						17	32.4	凝血酸乙烯基酯	4840-76-0	C9H14O2	154
18	32.7	水杨酸甲基酯	119-36-8	C8H8O3	152
						19	33.0	十二烷	112-40-3	C12H26	170
CGTF2-P5	33.1	二环(3，1，1)-庚-3-醇	27779-29-9	C10H18O	154
						20	33.4	苯并噻唑	95-16-9	C7H5NS	135
21	34.9	2，2-二甲基-十一烷	17312-64-0	C13H28	184
						22	35.3	3-甲基-十一烷	1001-43-3	C12H26	170
CGTF2-P6	35.8	2，2-二甲基-十一烷	17312-64-0	C13H28	185
						23	36.6	2，6-二甲基-2-辛醇	18479-57-7	C10H22O	158
CGTF2-P7	36.6	2-甲基-2-癸醇	2/9/3396	C11H24O	172
						24	37.9	吲哚	120-72-9	C8H7N	117
25	38.3	十三烷	629-50-5	C13H28	184
						26	38.9	1-十一醇	112-42-5	C11H24O	172
27	39.3	3，7-二甲基壬烷	17302-32-8	C11H24	156
						28	39.7	丁酸-3-己烯酯	53998-84-8	C10H18O2	170
29	40.4	未知3
						30	41.5	4-十二烷醇	10203-32-4	C12H26O	186
31	42.2	5-(2-甲基丙基)-壬烷	62185-53-9	C13H28	184
						32	43.2	十二烷醇	112-54-9	C12H24O	184
33	43.8	3-(3，3-二甲基丁基)环己醇	40564-98-5	C12H24O	184

 

峰ID	保留时间(分钟)	名称	CAS#	分子式	Mw
						34	44.6	2-甲基-2-癸醇	3396-09-2	C11H24O	172
35	45.1	咖啡因	58-08-2	C8H10N4O2	194
						36	46.3	肉豆蔻酸-n-丁基酯	110-36-1	C18H36O2	284
37	47.0	1-十六醇	36653-82-4	C16H34O	242
						38	48.2	橙花叔醇		C15H26O	222
39	49.4	1-十七醇	1454-85-9	C17H36O	256
						40	49.8	十六酸甲酯	112-39-0	C17H34O2	270
41	50.4	未知4
						42	50.7	未知5
43	51.2	未知6
						44	52.6	n-十六酸	57-10-3	C16H32O2	256
45	53.6	未知7
						46	54.7	2-十五基-1，3-二氧戊环	4360-57-0	C18H36O2	284
47	55.3	未知8
						48	56.1	未知9
49	56.2	5-环己基十二烷	13151-85-4	C18H36	252
						50	56.9	未知10
51	58.3	未知11
						52	60.5	油醇	143-28-2	C18H36O	268
53	61.2	(E)-9-十八烯-1-醇	506-42-3	C18H36O	268
						54	62.6	未知12
55	63.3	十九醇	1454-84-8	C19H40O	284
						56	64.5	十九烷		C19H42	268
57	65.2	未知13
						58	65.5	未知14
59	66.8	叶绿醇	150-86-7	C20H40O	296
						60	70.4	油酸	112-80-1	C18H34O2	282
61	71.0	未知15
						62	71.4	2-甲基十八烷	1560-88-9	C19H40O	268
63	74.3	硬脂酸	57-11-4	C18H36O2	284

表4 不同绿茶原料的绿茶精油化合物分布(GC-MS的峰面积％)

 

峰ID	CGT F1	CGT F2	CGT F3	CGT F4	JPGT
						CGTF2-P1		0.18
CGTF2-P2		0.11
						CGTF2-P3		0.17
1		0.28	0.19	0.22	0.16

 

峰ID	CGT F1	CGT F2	CGT F3	CGT F4	JPGT
						2		0.05	0.13	0.1
CGTF2-P4		0.1
						3			0.08
4	0.1	0.14	0.24	0.21	0.13
						5	0.23	0.8	0.1	0.05
6	0.05	0.05	0.07	0.04	0.03
						7	0.11	0.13	0.21	0.04	0.07
8	0.05		0.1	0.06	0.05
						9	0.12	0.21	0.29	0.24	0.05
JPGT-P1					0.1
						10		0.05		0.05
11		0.16	0.18	0.15	0.06
						12			0.03	0.04	0.01
JPGT-P2					0.04
						13	0.04	0.07	0.07
14	0.12	0.23	0.34	0.15	0.19
						15	0.06	0.21	0.27	0.21
JPGT-P3					0.04
						16			0.08	0.06	0.08
17	0.47	0.06	0.14	0.07	0.11
						18				0.02
19				0.04	0.1
						CGTF2-P5		0.13
20				0.04
						21				0.03
22		0.04	0.06	0.05	0.05
						CGTF2-P6		0.04
23	0.06		0.06	0.05	0.06
						CGTF2-P7		0.09
24				0.03
						25	0.01	0.48	0.48	0.57	0.28
26	2.28	1.76	0.92	0.42	0.26
						27	0.08	0.09	0.08	0.05	0.04
28		0.03		0.04	0.02
						29			0.01		0.04
30	0.59	0.04		0.07	0.1
						31		0.12	0.51	0.08	0.17
32			0.06	0.06	0.1
						33		0.12		0.18	0.08
34				0.1	0.03
						35	92.68	35.6	32.53	20.51	57.18
36		0.36	0.84	0.21	0.35
						37	0.2	19.03	15.46	21.56	10.95
38		0.06	0.1	0.12
						39	0.27	0.18	1.15	0.04
40			0.64	0.07

 

峰ID	CGTF1	CGTF2	CGTF3	CGTF4	JPGT
						41		0.11		0.07
42				0.06
						43				0.04
44	0.59	5.87	4.15	5.06	1.89
						45		0.11		0.06
46		0.1	0.08	0.23	0.14
						47	0.31	0.07	0.1	0.08	0.09
48				0.05
						49			0.19
50				0.11
						51				0.1	1.65
52	0.12	9.44	13.76	22.56	10.29
						53		1.65	3.06	2.93	1.99
54		0.06	0.53	0.1
						55	0.28	16.78	14.28	17.99	8.83
56			0.45
						57			0.57
58	0.2	0.46	0.46	0.52	0.21
						59	0.58	0.58	4.97	1.99	1.25
60		0.36	0.73	0.66	0.23
						61				0.2
62	0.11	1.98	0.22		1.56
						63		0.98	0.87	0.92	0.53

使用40℃和100-200巴下SCCO2提取绿茶叶片精油组分的总共73个化合物。用干的还是湿的绿茶叶片完成SCCO2萃取似乎并不重要，咖啡因是在此方法中提取的。这些精油组分中的咖啡因浓度不同，以精油组分的％物质重量计为约11-80％。除了咖啡因，精油组分中发现的其他主要化合物包括饱和脂肪醇如1-十一醇、1-十六醇、油醇和十九醇，以及不饱和脂肪酸如棕榈酸。有趣的是，中国绿茶F1中极少发现精油化合物。相比之下，发现中国绿茶F2、F3和F4皆含有包含SCCO2精油提取组分的以物质重量计大于50％的脂肪醇和脂肪酸。在日本绿茶原料的SCCO2精油组分中，以物质重量计少于40％的脂肪醇和脂肪酸包含所述提取组分。

步骤2 绿茶超临界二氧化碳脱咖啡因

使用SCCO2去除绿茶叶片化学成分咖啡因的通用说明在图1-步骤2中有图解。原料[10或40]为干的切碎的绿茶叶片(大小超过105μm)或步骤1精油组分提取后的残留，浸泡在一个床体积的蒸馏水中。萃取溶剂[210]是纯的二氧化碳。水可用作为共溶剂。原料装入SFE萃取容器[50]。清洗和检漏后，这个过程包括液化二氧化碳从存储容器通过冷凝器进入二氧化碳泵。二氧化碳被压缩到所需的压力，并流经压力和温度维持在所需水平的提取容器中的原料。提取压力的范围从约60巴至800巴，温度范围从约35℃至约90℃。本文教导的SCCO2提取优选压力至少200巴和温度至少35℃时进行，更优选压力约30巴至700巴，温度约60℃至约80℃。单阶段提取的提取时间范围从约2至约6小时，至约4小时。每次SCCO2提取，溶剂与原料比通常是约240比1。二氧化碳回收进行工业提取处理。然后收集提取的咖啡因化学成分[70]，测定咖啡因含量并丢弃。收集残留(剩余物)或脱咖啡因的绿茶提取物[60]，保存并用于进一步处理，包括但不限于处理得到绿茶儿茶素类、茶氨酸和多糖的纯化组分。通常使用单个步骤SCCO2提取的绿茶植物原料的咖啡因总得率以％重量计为约4.5％(原料中咖啡因化学成分的约85％)，具有的咖啡因化学成分纯度以咖啡因提取物物质重量计为约29％。以原料中咖啡因含量的物质重量计，这样的脱咖啡因过程使脱咖啡因绿茶原料中的咖啡因含量降低了约55-85％。咖啡因含量低的绿茶原料中，可去除83-85％物质重量的咖啡因。为减少含咖啡因高的绿茶原料的咖啡因含量，需要更高的溶剂/原料比，以去除原料的以物质重量计超过80％的咖啡因。这样的提取方法的结果见下表5和6。实施例2中可见所述过程。

表5 不同共溶剂和原料的总的以及咖啡因提取物得率的结果

1.原料提取的咖啡因＝提取物中咖啡因/原料中咖啡因×100。

2.结果为三次重复试验的平均值(标准偏差+/-5％)。

表6 脱咖啡因F1、F4和JPGT绿茶残留与生(天然)绿茶原料中化学成分的HPLC分析测定的分别比较

^*L-茶氨酸得率在水中测定

咖啡因提取得率随着共溶剂的添加而增加。咖啡因在超临界流体二氧化碳/共溶剂混合物中的溶解度比仅在纯二氧化碳中高3-5倍(Kopcak 2005)。从咖啡因提取的角度看，75％乙醇/水是非常有效的。但是除了以物质重量计脱咖啡因提取物中9.3％的咖啡因外，还从原料提取了有价值的酚酸化合物，如以脱咖啡因提取物物质重量计4％的EGCG、2.6％的EGC和0.9％的ECG。对于绿茶叶片原料脱咖啡因而言，水是比乙醇更好的共溶剂。使用湿绿茶叶片，以水为共溶剂，且S/F比为240，则可以去除F1原料和日本绿茶(JPGC)原料中超过80％的咖啡因(脱咖啡因)，但不会去除原料中任何有价值的酚酸或茶氨酸。这相当于使咖啡因含量从F1原料中1.3％物质重量减少到F1脱咖啡因绿茶原料中的0.18％，或咖啡因含量从JPGT原料中以物质重量计的2.2％减少到脱咖啡因绿茶原料的0.36％，咖啡因含量减少了6-7倍。就F4绿茶叶片原料以物质重量计3.3％的高咖啡因含量而言，总咖啡因减少较少。F4脱咖啡因原料1.46％的物质重量。但是脱咖啡因残留原料中有价值的儿茶素类和茶氨酸得以保留。因此保留了有价值的儿茶素类和茶氨酸的脱咖啡因残留可用作进一步处理以得到纯的儿茶素、茶氨酸和多糖组分。

有趣的是，在同样的SFE脱咖啡因条件下高咖啡因含量的F4原料观察到仅约55％脱咖啡因。所述差异似乎由更高的咖啡因含量或F4绿茶叶片不同的胞间质结构或两者所造成。根据观察，水浸泡使F4原料叶片变湿的较少。换句话说，水往往停留在叶片表面，而不是渗透到F4叶片内部的胞间质中。因此F4绿茶叶片将需要更多的水和/或更长时间浸泡从而实现超过80％的脱咖啡因，以及可能更大的溶剂/原料比。

步骤3、粗绿茶儿茶素化学成分组分的乙醇提取

一方面，本发明包括生物活性的儿茶素化学成分的提取和浓缩。此步骤的通用说明在图2-步骤3中有图解。此步骤3提取过程是溶剂浸出过程。此提取的原料为切碎的绿茶叶片原料绿茶[10]，或者步骤1 SCCO2提取精油组分[30]或步骤2绿茶叶片原料[60]的SCCO2脱咖啡因的残留。提取溶剂[220]是95％乙醇。提取溶剂可以是10-95％含水的醇，优选95％含水乙醇。在此方法中，绿茶原料和提取溶剂装入被加热搅拌的提取容器100中。可加热至90℃，至约80℃，至约70℃或至约60-90℃。提取进行约1-10小时，约1-4小时，约2小时。产生的液体提取物离心[110]并过滤[120]。收集滤液(上清)[300，310]作为产物，测量体积，溶剂蒸发后测量固体内容物干重。保留并保存提取的残留物质[130或140]供进一步处理(见步骤4)。如果必要或需要，则提取可能会重复多次。可能重复两次或更多次，3次或更多次，4次或更多次等。当用于提取的超过(more that)一个阶段时，可将粗儿茶素组分组合[320]作产物，或将之保留以进一步纯化儿茶素组分(见步骤4)。例如，图2-步骤3显示的是两个阶段的处理，其中第二阶段使用同样的方法和条件。结果见下面的表7和8。实施例3中可见所述方法。

表7F1绿茶脱咖啡因残留的95％乙醇两阶段(2stage)浸提结果

^*PA(酚酸)＝EGC+C+EGCG+ECG

表8 天然(生)绿茶原料以及中国绿茶F1、中国绿茶F4和日本绿茶(JPGT)的SFE脱咖啡因残留的95％乙醇两阶段(twostage)浸提产物的化学成分含量比较

^*PA＝总儿茶素(EGC+C+EGCG+ECG).

这些结果表明，SFE脱咖啡因方法去除了绿茶原料的咖啡因，而不影响残留中其他有价值的化合物。此外使用95％乙醇提取残留物，保存残留中的L-茶氨酸和水溶性-乙醇不溶性多糖，可用于进一步处理得到纯化的茶氨酸和多糖组分。最后这两个阶段浸出方法提高了四种主要儿茶素(PA，表8)的浓度，从天然绿茶叶片中以物质重量计的约7-12％提高到提取物中以物质重量计的约26-39％，纯度增加约3.5倍。提取率为以初始绿茶原料物质重量计的19至36％。使用亲和吸附层析过程可得到儿茶素化学成分组分更高的纯度(见下文)。

步骤4 亲和吸附提取方法

正如本文所教导的，绿茶的高度纯化的儿茶素组分提取物可通过使绿茶原料的水醇提取物(步骤3)与固态的亲和聚合物吸附树脂接触，从而使水醇提取物中含有的活性儿茶素类吸附到亲和吸附剂上。结合的化学成分随后用本文教导的方法洗脱。儿茶素组分化学成分洗脱前，可用任何方便的方式使其上吸附有所需化学成分的亲和吸附剂与剩余提取物分离，优选地与吸附剂接触和分离过程是受将水提取物流经吸附剂材料的提取柱或床的影响。此外将儿茶素组分化学成分洗脱前，任何吸附在亲和吸附剂上的咖啡因化合物可用特定溶剂从儿茶素类中分离，该特定溶剂会洗脱咖啡因化合物，但不会洗脱所述儿茶素化合物(纯化儿茶素组分的脱咖啡因)。

各种亲和吸附剂可用于纯化绿茶植物原料的儿茶素化学成分，例如但不仅限于“Amberlite XAD-2”(Rohm & Hass)，“Duolite S-30”(Diamond Alkai Co.)，“SP207”(Mitsubishi Chemical)，ADS-5(南开大学，天津，中国)，ADS-17(南开大学，天津，中国)，Dialon HP20(Mitsubishi，日本)和Amberlite XAD7 HP(Rohm & Hass)。由于对绿茶儿茶素化学成分的高亲和力，优选使用Amaberlite XAD 7HP。它是一种粒径560-710μm(μn)的非离子型脂肪族丙烯酸[酯]类聚合物，其吸附性能源自其大孔结构(含有连续聚合物相和连续孔隙相)，高表面积以及其表面的脂肪族性质。有了具有聚合酯基团的此大孔结构，XAD 7HP可以吸附极性化合物，对酚酸类(儿茶素类)有高亲和力。

虽然可采用各种洗脱剂从吸附剂回收所述儿茶素化学成分，但在本发明的一方面，所述洗脱剂包括低分子量的醇，包括但不限于甲醇、乙醇或丙醇。第二方面所述洗脱剂包括低分子量的醇与水的混合物。第三方面所述洗脱剂包括低分子量的醇，第二有机溶剂和水。另一方面用于使吸附到吸附剂上的儿茶素脱咖啡因的洗脱剂包括酸性溶剂，例如但不仅限于含5％硫酸的10％乙醇。因此，两阶段洗脱过程已计划用于绿茶的儿茶素化学成分组分的纯化。第一阶段是利用咖啡因的碱性性质和儿茶素的酸性性质，用酸性溶液使吸附在柱子上的化学成分脱咖啡因。第二阶段是使用乙醇/水洗脱剂，以洗脱脱咖啡因的儿茶素。

所述绿茶原料可能或可能不经历一个或多个初步纯化过程，例如但不仅限于使含提取物的含水儿茶素化学成分与亲和吸附剂材料接触前的步骤1、2和3中描述的方法。

使用本发明教导的亲和吸附方法得到高纯度、分布的(profiled)和脱咖啡因的，明显没有在天然植物原料或现有工业提取产物中通常存在的其它化学成分的绿茶儿茶素化学成分组分。例如在本发明教导的方法可得到含有以干物质重量计超过95％的总儿茶素化学成分的纯化儿茶素提取物。

用聚合物亲和吸附树脂颗粒从绿茶叶片提取和纯化儿茶素类的通用说明在图3-步骤4中有图示。该提取方法的原料可以是或者天然绿茶原料[10]或者含有步骤3的95％乙醇浸提的儿茶素的水溶液[320]。适当重量的吸附剂树脂颗粒(12mg儿茶素/毫克吸附树脂)装入柱410、420之前和之后，用4-5BV乙醇[220]和4-5BV蒸馏水[230]洗涤。洗涤过的吸附剂树脂颗粒填入柱子[430]。含儿茶素的水溶液[320]随后以2至4个床体积(BV/小时)的流速上样到柱[440]。一旦柱子满载，用蒸馏水[230]洗涤柱子[450]，流速为2-3BV/小时，去除被吸附的儿茶素类的任何杂质。收集流出的残留[500]并洗涤残留[510]，测量物质含量，儿茶素含量，咖啡因含量，并丢弃。被吸附的咖啡因化合物[460]的洗脱是以含5％  H2SO4的10％乙醇[240]为洗脱液，流速2-4BV/小时，以等度洗脱方式实现的。收集洗脱液[520]，测量物质含量，儿茶素含量，咖啡因含量，并丢弃。此脱咖啡因阶段后，用8BV的蒸馏水[230]，流速为10BV/小时洗涤柱子[470]。用pH试纸检测洗涤[530]直至中性，收集并丢弃。被吸附的儿茶素[480]的洗脱是用80％乙醇/水溶液为洗脱液[250]，流速2-4BV/小时，以等度洗脱方式实现的，记录洗脱提取物[540]的洗脱曲线。大约每15-30分钟收集洗脱体积480，用HPLC分析这些样品，测定固体含量和纯度。结果列于表9-11。实施例4中可见所述方法。

表9 F1 SFE脱咖啡因的95％乙醇的绿茶浸提物XAD-7HP柱处理层析的分析结果

 

样品

得率(％)

总固体(mg)

总TPs(mg)

EGCG(mg)

EGC(mg)

ECG(mg)

C(mg)

TheoB(mg)

Caff(mg)

CA(mg)

 

上样	23.3	480	181.16	91.50	66.42	20.06	3.19	0.68	6.20	1.85
											流出物		170							1.22
F2	3.89	38.2	51.63	29.58	16.35	5.08	0.62		0.16	0.69
											F3	1.84	55	26.15	14.11	8.50	2.91	0.63		0.08	0.59
F4	2.65	35.3	37.39	21.35	11.08	4.36	0.59		0.15	0.42
											F5	1.70	10.5	31.56	19.58	7.32	4.32	0.34		0.08	0.41
F6	0.51	0.9	10.22	6.46	1.83	1.93	0.00		0.00	0.00
											总量	10.6	390	157.0	91.1	45.1	18.6	2.2		0.5	2.1
回收率(％)		81.5	86.6	99.5	67.9	92.7	68.4		7.6	114.2

 

样品	收集	得率(％)	总TPs(％)	EGCG(％)	EGC(％)	ECG(％)	C(％)	TheoB(％)	Caff(％)	CA(％)
											上样		23.3	37.4	18.9	13.7	3.9	4.1	0.14	1.3	0.38
F2	0.8-1BV	3.89	64.0	36.7	20.3	6.3	0.8		0.20	0.86
											F3	1-1.1BV	1.84	68.5	37.0	22.3	7.6	1.6		0.21	1.55
F4	1.1-1.3BV	2.65	68.0	38.8	20.1	7.9	1.1		0.3	0.8
											F5	1.3-1.6BV	1.70	89.5	55.6	20.8	12.2	1.0		0.2	1.15
F6	1.6-3BV	0.51	97.2	61.4	17.4	18.3
											F2—F4	0.8-1.3V	8.38	66.2	37.41	20.67	7.10	0.98		0.22	0.98
F5—F6	1.3-3V	2.21	91.3	56.90	20.00	13.64	0.89		0.17	0.89

表10 F4 SFE脱咖啡因的95％乙醇的绿茶浸提物XAD-7HP柱处理层析的分析结果

 

样品	得率(％)	总固体(mg)	总TPs(mg)	EGCG(mg)	EGC(mg)	ECG(mg)	C(mg)	TheoB(mg)	Caff(mg)	CA(mg)
											上样	26.6	2250	1096.7	521.28	339.5	136.0	100	40	100	37
流出物		540
											F2	0.4	35	21.3	13.8	4.4	1.8	1.3		1.4	1.1

 

F3	9.2	779	0.0	377.4	67.6	89.7	15.8		26.7	15.4
											F4	4.1	347	213.7	152.0	16.3	39.8	5.5		8.9	5.1
F5	1.0	85	57.6	39.8	2.7	13.8	1.4		1.3	1.5
											F6	0.2	14	292.6	583.1	91.1	145.1	23.9		38.3	23.2
总量	14.9	1261	585.2	1166.2	182.2	290.1	47.9		76.7	46.3
											回收率(％)		56.1	53.4	-	53.7	-	47.9		76.1	-

 

样品	收集	得率(％)	总TPs(％)	EGCG(％)	EGC(％)	ECG(％)	C(％)	TheoB(％)	Caff(％)	CA(％)
											上样		26.6	48.8	23.2	15.1	6.1	4.4	1.8	4.5	1.7
F2	0.8-1BV	0.4	60.7	39.4	12.6	5.0	3.6	0.25	4.0	3.3
											F3	1-1.6BV	9.2	70.7	48.4	8.7	11.5	2.0		3.4	2.0
F4	1.6-2.3BV	4.1	61.5	43.8	4.7	11.5	1.6		2.6	1.5
											F5	2.3-2.9BV	1.0	67.9	46.9	3.2	16.2	1.6		1.5	1.7
F6	2.9-3.7BV	0.2	98.9	66.6	3.2	29.1	0.0		2.5	0.0
											F2-F5	0.8-2.9V	14.8	67.7	46.8	7.3	11.6	1.9		3.1	1.9

表11 JPGT SFE脱咖啡因的95％乙醇的绿茶浸提物XAD-7HP柱处理层析的分析结果

 

样品	得率(％)	总固体(mg)	总TPs(mg)	(mg)	EGC(mg)	ECG(mg)	C(mg)	TheoB(mg)	Caff(mg)	CA(mg)
											上样	24.2	1910	542	285.85	174.30	59.48	22.46	4.35	33.22	10，54
流出物		800							1.22
											F2	5.3	420	273.1	177.4	49.3	38.4	8.0		3.7	3.9
F3	2.3	182	112.2	78.2	13.1	18.0	2.9		1.0	1.4
											F4	0.3	23.5	19.6	14.1	1.4	3.5	0.6		0.1	0.2
F5	0.1	6.5	3.0	2.7		1.1
											总量	8.0	631.5	407.9	272.1	63.8	60.5	11.5		4.8	5.5

 

回收率(％)

33

75.2

95.2

36.6

101.8

51.2

14.4

51.9

 

样品	收集	得率(％)	总TPs(％)	EGCG(％)	EGC(％)	ECG(％)	C(％)	TheoB(％)	Caff(％)	CA(％)
											上样		24.2	28.4	15.0	9.2	3.1	1.2	0.23	1.7	0.6
F2	0.7-1.2BV	5.3	65.1	42.3	11.7	9.1	1.9		0.9	0.9
											F3	1.2-2.0BV	2.3	61.7	43.0	7.2	9.9	1.6		0.6	0.8
F4	2.0-2.7BV	0.3	83.5	60.0	6.0	15.0	2.4		0.4	0.9
											F5	2.7-3.6BV	0.1	98.0	69.1		28.9

酸性洗脱溶剂已被证明是儿茶素进一步脱咖啡因的极好方法，使终产物中咖啡因浓度降低到以提取物物质重量计的少于1％至低至0.2％。得到的儿茶素纯化的组分纯度>90％，总收率为以初始绿茶原料％物质重量计的1.9％。此外还可获得亚组分，其中不论使用的初始绿茶原料，EGCG的浓度提高到>60％，儿茶素纯度>95％。F1、F4和JPGT的组合处理层析洗脱物中儿茶素纯度和ECGC分布的概略见表12。

表12 三种不同SFE脱咖啡因绿茶原料的两阶段95％乙醇浸提得到的合并(F2-F5或F6)处理层析洗脱物中儿茶素纯度和EGCG分布^*的比较

^*分布＝四种主要儿茶素类的％物质重量

在其他典型试验中，工作液是步骤395％乙醇浸提的生的或初始绿茶叶片原料后得到的透明水溶液。对于这些实验，25gm生绿茶残留用250ml 95％乙醇70℃两个阶段，每阶段2小时进行提取(溶剂/料液比为20/1)。将从这两个阶段得到的两种上清溶液组合，用旋转蒸发仪去除乙醇提取溶剂。去除乙醇(蒸馏)后，如步骤3所述，离心过滤去除一些固体沉淀。收集上清，然后将蒸馏水加到浓缩的上清中，得到最终浓度为16-30mg/ml。这种含有儿茶素类的透明水溶液随后使用步骤4的亲和吸附色谱法进行进一步纯化。此步骤3浸提结果见表13，其中生的或初始绿茶叶片的浸出与步骤2SFE脱咖啡因残留的浸出进行比较。应该指出的是，就生绿茶植物原料而言，乙醇蒸馏过程中出现沉淀，这在SFE脱咖啡因残留没有观察到。因此该沉淀的离心、过滤使总收率从以初始原料％物质重量计的32.8％减少到26.9％。虽然浸提生绿茶原料的总收率较高，但儿茶素化学成分的纯度相似。此外，在生绿茶浸提产物中，咖啡因浓度非常高。这样的两阶段95％乙醇浸出的结果制成表13和14。

表13 F1天然绿茶叶片(生)的步骤395％乙醇浸提物与步骤2F1SFE脱咖啡因绿茶残留(残留)的得率与纯度比较

^*纯度由浓度定义(提取物中所述化合物的％干物质重量)。

^**TheoB-可可碱；CA-绿原酸；Caff-咖啡因；Cat-儿茶素类.

表14.F1、F4和JPGT生绿茶叶片原料两阶段95％乙醇浸提物的得率和纯度

典型吸附试验是室温下在开放的批***中进行。用乙醇洗涤～30g PA XAD7HP，去除单体和杂质，接着浸泡在蒸馏水中16小时后填充。然后洗涤过的PA树脂颗粒被填充入10mm(ID)×350mm(L)的玻璃柱中。100ml浓度为16-30mg/ml的水溶液(去乙醇浸出液)上样到填充柱上，流速为1.8ml/min，2BV/hr。上样后，用150毫升蒸馏水，流速10BV/hr洗涤柱子。随后用200ml含5％硫酸的10％乙醇洗脱(脱咖啡因)柱子，流速2.2BV/hr。此洗脱后，用250ml蒸馏水，流速10BV/hr洗涤柱子，直到柱子的洗涤液达到pH7。然后用100ml 80％乙醇洗脱(解吸附)柱子，流速为2BV/hr。总处理时间为300分钟。收集连续的洗脱液组分。每个洗脱组分用HPLC分析，结果见表15-17。

表15 F1绿茶生叶片作为原料进行步骤3的浸提，随后进行步骤4处理层析的得率和纯度

 

样品	得率(％)	总固体(mg)	总TPs(mg)	EGCG(mg)	EGC(mg)	ECG(mg)	C(mg)	TheoB(mg)	Caff(mg)	CA(mg)
											上样	26.9	1630	707.57	369.19	255.25	68.61	14.51	2.74	120.85	10.64
流出物		340							0.56
											F2	1.1	66.08	48.79	34.38	9.25	4.36	0.80		0.12	1.61
F3	4.7	285.25	235.70	160.82	42.62	26.59	5.67		1.61	2.83
											F4	3.7	226.48	165.45	125.36	11.70	26.19	2.19		0.28	2.16
F5	1.7	105.36	67.39	49.85	2.45	14.54	0.55		0.13	0.99
											F2-F5		683.2	517.33	370.41	66.02	71.68	9.22		2.14	7.59
回收率(％)*		41.9	73.1	100	25.8	100	63.5		1.8	71.3

^*回收率的计算：(F2-F5)的重量/上样×100

 

样品	收集	得率(％)	总TPs(％)	EGCG(％)	EGC(％)	ECG(％)	C(％)	TheoB(％)	Caff(％)	CA(％)
											上样			43.3	22.7	15.7	4.2	0.9	0.2	7.41	0.65
F1	-0.5BV
											F2	0.5-1.0BV	1.1	73.8	52.0	14.0	6.6	1.2		0.19	2.43
F3	1.0-1.5BV	4.7	82.6	56.4	14.9	9.3	2.0		0.56	0.99
											F4	1.5-2.0BV	3.7	73.1	55.4	5.2	11.6	1.0		0.12	0.95
F5	2.0-3BV	1.7	64.0	47.3	2.3	13.8	0.5		0.13	0.94
											F2-F5	0.5-3BV	11.3	75.7	54.2	9.7	10.5	1.3		0.31	1.1

表16 F4绿茶生叶片作为原料进行步骤3的浸提，随后进行步骤4处理层析的得率和纯度

 

样品	得率(％)	总固体(mg)	总TPs(mg)	EGCG(mg)	EGC(mg)	ECG(mg)	C(mg)	TheoB(mg)	Caff(mg)	CA(mg)
											上样	37.7	3040	1543.9	984.7	254.3	237.3	67.6	38.69	380.7	35.6
流出		420							0.56

 

物
											F2	6.0	487.3	391.5	266.4	39.9	74.8	10.3		13.2	9.3
F3	4.1	333.0	310.6	204.3	39.8	58.0	8.5		11.2	6.9
											F4	1.0	77.1	68.0	45.8	4.3	15.6	2.2		1.7	1.4
总量	11.2	899	771.2	517.4	84.1	148.8	21.0		26.1	17.6
											回收率(％)*		29.5	50.0	52.5	33.0	62.7	31.0		6.9	49.5

^*回收率的计算：(F2-F4)的重量/上样×100

 

样品	收集	得率(％)	总TPs(％)	EGCG(％)	EGC(％)	ECG(％)	C(％)	TheoB(％)	Caff(％)	CA(％)
											上样			50.8	32.4	8.36	7.8	2.2	1.3	12.5	1.2
F1	-0.8BV
											F2	0.8-1.1BV	6.0	80.4	54.7	8.2	15.4	2.1		2.7	1.9
F3	1.1-1.8BV	4.1	93.3	61.3	11.9	17.4	2.5		3.4	2.1
											F4	1.8-3.0BV	1.0	88.1	59.5	5.6	20.2	2.8		2.2	1.8
F2-F4	0.8-3.0BV	11.2	85.8	57.6	9.4	16.5	2.9		2.9	2.0

表17 日本绿茶生叶片作为原料进行步骤3的浸提，随后进行步骤4处理层析的得率和纯度

 

样品	得率(％)	总固体(mg)	总TPs(mg)	EGCG(mg)	EGC(mg)	ECG(mg)	C(mg)	TheoB(mg)	Caff(mg)	CA(mg)
											上样	29.1	2460	884.3	526.6	232.7	98.9	26.1	6.70	319.4	10.7
流出物		940
											F2	5.5	465.1	333.72	209.8	71.0	43.4	9.56		5.07	2.66
F3	2.2	186	115.74	83.2	13.1	17.4	2.01		1.83	1.47
											F4	0.5	45.4	25.25	19.1	1.9	4.2	0.00		0.18	0.66
总量	8.3	899	474.7	312.1	86.1	65.0	11.6		7.1	4.8
											回收率(％)*		28.3	53.7	59.3	37.0	65.7	44.3		2.2	44.9

^*回收率的计算：(F2-F4)的重量/上样×100

 

样品	收集	得率(％)	总TPs(％)	EGCG(％)	EGC(％)	ECG(％)	C(％)	TheoB(％)	Caff(％)	CA(％)
											上样			36.0	21.4	9.46	4.0	1.0	0.3	13.0	0.4

 

F1	-0.6BV
											F2	0.6-1.2BV	6.0	71.8	45.1	15.3	9.3	2.1		1.09	0.6
F3	1.2-2.1BV	4.1	62.2	44.8	7.0	9.4	1.1		0.98	0.8
											F4	2.1-3.0BV	1.0	55.6	42.1	4.3	9.3			0.41	1.5
F2-F4	0.6-3.0BV	11.2	68.2	44.8	12.4	9.3	1.7		1.0	0.7

在步骤4儿茶素类的亲和吸附纯化中，从生的(未脱咖啡因的)绿茶植物原料开始，使用酸性洗脱溶剂可去除95％的咖啡因，同时保持儿茶素结合在吸附剂上。例如使含有以％物质重量计约12％咖啡因的粗浸提物脱咖啡因至处理层析提取组分中的0.3％是可能的。原料的咖啡因浓度越高，就需要更大体积的酸性洗脱液来去除提取组分的咖啡因。

有趣的是，用80％乙醇洗脱儿茶素使得提取物组分中以％物质重量计EGCG、ECG和C的得率大于EGC。在0.6至2BV的组分中发现了最高得率和纯度。高度纯化组分的总儿茶素纯度是粗浸提物的1.7倍。儿茶素纯度的水平与SFE脱咖啡因残留的步骤4处理层析得到的不一样高。但是以初始绿茶原料物质重量计超过11％的总提取物组分得率，是以绿茶原料计71％-93％的总儿茶素纯度得到的。四种主要儿茶素类的最后化学分布分布图随ECGC、ECG和C的％物质重量的优选增加，以及EGC的减少而变化。例如在组合的提取物组分中以总儿茶素物质重量计EGCG通常超过65％，在提取物亚组分中以物质重量计可能高达75％。

通过分析纯化的儿茶素组分和亚组分中的草酸，尽管在95％乙醇浸出原料中出现了草酸，但在任何这些组分或亚组分中没有检测到草酸。事实上在原料溶液中，发现以物质重量计草酸高达6％。但是草酸化合物并没有吸附到吸附剂上，并在流出物中被发现。

步骤5 茶氨酸和多糖的水浸出

绿茶化学成分的多糖提取组分在科学文献中已被定义为“水溶性，乙醇不溶性的提取组分”。L-茶氨酸和多糖都溶于水。用水溶剂从绿茶植物原料提取物中浸提茶氨酸和多糖的通用说明在图4-步骤5(附录1)中有图解。原料140是来自步骤3的95％乙醇浸提方法的固体残留。此原料在两个阶段浸提。溶剂是蒸馏水260。在此方法中，绿茶提取物残留140和提取溶剂260加入提取容器600，并加热搅拌。可加热到100℃，到约80℃，或到约60-80℃。提取进行约1-小时，约2-4小时，或约2个小时。上清提取溶液700离心610，过滤620并收集。保留残留630以备进一步处理。如果必要或需要可对残留进行多次提取。可以是两次或更多次，3次或更多次，4次或更多次等。例如图4-步骤5显示了两个阶段的方法，第二阶段使用相同的方法和条件。丢弃最后的残留[650]。此提取步骤的例子在实施例5中可见，L-茶氨酸含量的质量测定和HPLC分析的最终结果见表18。

表18 不同绿茶原料的水浸出、多糖纯化和茶氨酸纯化结果

水浸出方法的总得率以初始绿茶原料物质重量计为3.6-12.5％。L-茶氨酸浓度以浸提物物质重量计为13.2-18.2％。可通过两个阶段浸出的方法提取以初始绿茶叶片原料中茶氨酸物质重量计超过85％的得率。与科学文献(29)相一致的是其他化学成分应主要是多糖。可用另外的步骤6从多糖化学成分分离茶氨酸。

步骤6 L-茶氨酸和多糖组分的纯化

使用水溶剂方法从绿茶提取物提取和纯化多糖和茶氨酸组分的通用说明在图5-步骤6中有图解。原料是步骤5水浸提的水浸出上清溶液[700+710]。组合的溶液蒸发[800]除去60％的水。然后往浓缩的溶液中加入溶剂无水乙醇[280]，得到最终乙醇浓度为75％。溶液放置，观察到大量沉淀[810]。溶液离心[820]，倾析[830]，收集上清[910]作进一步处理并纯化茶氨酸组分。该沉淀产物[900]为纯化的多糖组分，可对其采用比色法方法，使用5,000-410,000分子量的葡聚糖作为参考标准分析多糖。提取的多糖组分的纯度以不同分子量葡聚糖计，约为23-50％，总得率以初始天然绿茶叶片原料％物质重量计为1.15％(表18)。将不同葡聚糖当量的纯度结合，与以纯化的多糖组分的物质重量计超过90％的总多糖纯度一致。

上清液中茶氨酸纯度为约31-42％。为得到更高水平的茶氨酸纯度，需进行另外的处理。将上清溶液[910]干燥。干燥产物溶解于足够量的蒸馏水[260]中，得到10％的溶液[850]。4个体积的无水乙醇[270]添加到此溶液中，并混合。此含水醇溶液放置约1小时，然后离心[860]，丢弃任何沉淀[910]。使用真空旋转蒸发仪[870]在约60℃浓缩上清[920]，得到80％的溶液。此80％的溶液冷却至室温，然后溶液加入4个体积的无水乙醇[280]，0℃冷藏[880]24小时。收集形成的结晶，并于60℃真空干燥[890]，得到纯化的茶氨酸组分[930]。纯化的茶氨酸组分得率以初始绿茶原料％物质重量计约为0.51-1.95％，纯度约为90-92％(表18)。实际的方法可见实施例6。

绿茶多糖的得率以初始绿茶叶片原料物质重量计为1.2-8.5％。多糖组分的纯度以不同分子量葡聚糖计为23-50％，表明组分中大于90％绿茶多糖化学成分的总纯度。基于大量和不同的实验方法，以物质重量计1.2-8.5％的得率大于天然绿茶种原料中水溶性，醇不溶性多糖的90％，得出这样的结论是相当合理的。

绿茶 L-茶氨酸得率以初始绿茶原料物质重量计为0.5-2.0％，为初始原料中茶氨酸的约70％。使用这些方法可实现90％的茶氨酸纯度。

对于从溶液中除去醇，许多方法在本领域是已知的。如果想留下醇回收，则提取后可在常压或减压下蒸馏从溶液中除去醇。醇可重复使用。此外，对于其中已除去醇的水溶液或溶液，从溶液中除去水本领域也已知有许多方法。这种方法包括但不仅限于将水溶液喷雾干燥到合适的载体例如但不限于碳酸镁或麦芽糊精上，或者液体可通过冷冻干燥或折射窗干燥进行干燥。

在实施之前所述的提取方法中，发现在精油SCCO2提取物组分中可提取得到以精油化学成分物质重量计超过90％的得率，所述精油化学成分在绿茶初始干叶片原料和相关种中有超过80％纯度(步骤1)。使用步骤2教导的方法(SCCO2脱咖啡因方法)，绿茶植物原料咖啡因的总得率以物质重量计为约4.5％(初始绿茶原料中出现的咖啡因化合物的约85％)，具有的咖啡因化学纯度以咖啡因提取物物质重量计为约29％。这样的脱咖啡因方法使脱咖啡因绿茶原料中的咖啡因含量降低到以脱咖啡因绿茶原料％物质重量计低于0.2％。此外使用本发明教导的方法，可使绿茶原料80％脱咖啡因，同时保留了原料中有价值的儿茶素、茶氨酸和多糖化学成分，可用于进一步的处理，从而得到纯化的儿茶素，茶氨酸和多糖组分。

使用本发明步骤3教导的方法，乙醇浸出组分的得率以初始绿茶种原料物质重量计为19-31％。儿茶素化学成分的得率以初始绿茶原料中儿茶素物质重量计超过90％(见表8和A1-附录1)。此外，乙醇浸出方法使所述四种主要儿茶素的浓度(纯度)从以所研究的天然绿茶叶片原料物质重量计的7-12％，增加到以所述儿茶素提取物组分中物质重量计的约25-39％，儿茶素浓度增加了3.5倍(ECGC、ECG、EGC和C的总和)。最后乙醇浸提保留了固体残留中的茶氨酸和多糖化合物，可用于进一步处理得到纯化的茶氨酸和多糖组分(步骤5和6)。

使用本发明步骤4中教导的方法(亲和吸附提取方法)，可得到纯度以提取组分％干重计超过90％的儿茶素组分。从95％乙醇浸提原料提取56-86％的儿茶素是可能的。这相当于用ECGC、ECG、EGC和C作儿茶素化学成分参比，在天然绿茶中植物原料中发现的儿茶素化学成分50-70％的得率。基于用这些为参比的此酚酸组分的HPLC分析，酚酸化学成分的纯度为酚酸组分提取产物的约40％。此外，酸性洗脱溶剂已证明对于进一步去除纯化的儿茶素组分的咖啡因而言是极好的方法，使最终儿茶素组分产物中的咖啡因减少到以提取物组分物质重量计少于1％到低至0.2％。此外，可能得到亚组分，其中EGCG浓度提高到以物质重量计的65-75％，儿茶素纯度以提取物亚组分物质重量计大于95％。数据支持亲和吸附处理层析通过优选增加提取物组分中EGCG、ECG和C的％物质重量并降低EGC，分布(profile)儿茶素提取物组分的能力。

使用步骤5教导的方法(水浸出方法)，可得到以初始绿茶叶片原料物质重量计约3.6％的水溶性化学成分的高得率。此粗提取中L-茶氨酸的浓度为以物质重量计约17％。其余的水溶性化合物主要是多糖，这与其它研究(29)的结果相一致，其中报道了用60％乙醇沉淀，绿茶叶片中多糖浓度以物质重量计为约2.42％，纯度为86.8％。

使用本发明步骤6教导的方法(L-茶氨酸和多糖的提取和纯化方法)，以初始原料物质重量计，水溶性乙醇不溶性多糖的得率为约1.2％。基于使用不同分子量的葡聚糖为参比标准的比色法，多糖提取物组分的纯度为约56-76％。这些数据与总多糖纯度超过95％一致。

此外，使用步骤6中教导的方法，L-茶氨酸得率以初始绿茶叶片原料物质重量计为约0.8％，大于初始原料中L-茶氨酸的55％。使用这些方法可实现以纯化的茶氨酸提取物组分物质重量计90％的茶氨酸纯度。

食品与药品

作为本发明食品的形式，可制成任选的形式，例如颗粒态，粒子态，糊剂态，凝胶态，固体态或液体态。在这些形式中，可任选地含有本领域技术人员常规已知的，允许加入食品的各种物质，例如粘结剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、重吸收促进剂，味觉剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂、防腐剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂或pH控制剂等。加入食品的接骨木提取物的量没有明确限制，例如体重约60kg的成人每天摄入量可能是约10mg至5g，优选50mg至2g。

特别是当用作保健食品、功能性食品等，优选含有充分显示本发明预期效果量的本发明有效成分。

本发明的药品可任选依据常规已知的方法制备，例如作为固体药物，如片剂、颗粒剂、粉末剂、胶囊等，或作为液体药物，如注射剂等。这些药物可用任何普遍使用的物质配制，例如粘合剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、重吸收促进剂、味觉剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂、防腐剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂或pH控制剂。

药物中有效成分(绿茶提取物)的给药剂量可能随种类、药物形式、年龄、体重或症状变化，从而施用于患者等等，例如口服给药时，体重约60kg的成人每天给药一次或几次，给药量为约10mg至5g，优选每天约50mg至2g。有效成分可能是绿茶提取物的一种或几种成分。

方法还包含施用这样的提取物每天超过1次，每天超过2次，每天超过3次，并在每天1到15次的范围内，这样的给药可以是持续的，如每天给药给几天，几周，几个月，几年或给药特定次数以治疗或预防特定疾病。例如人可施用绿茶种提取物每天至少一次，施用几年以增强注意力，认知和记忆，或预防和治疗2型糖尿病，防止心血管疾病中风，或治疗胃肠道疾病，或治疗炎症性疾病和关节炎包括痛风，或治疗普通感冒，细菌和真菌感染。

上述说明书包括实施本发明的目前考虑到的最佳的方式。本说明书的目的在于说明本发明的一般原理，并且不应以限制之意理解。本发明通过下列实施例进一步阐述，不以对其范围加以限制的任何方式进行解释。相反应清楚地理解，可以有各种其它的实施方案，其修改和等价方式，这些在阅读完本文的说明后可呈现于本领域技术人员，但不偏离本发明的精神。

本文所用的所有术语被认为是以其为本领域技术人员能接受的用法进行解释。本文引用的专利、专利申请或参考文献其全部引作参考。

范例

材料

植物：本发明使用了四种中国绿茶和一种日本绿茶。

F1：中国绿茶叶片购自Nam Wan Tea Co Pte Ltd，新加坡。

F2：高级中国绿茶“百福茶(BaifuTea)”由中国江苏省生产。

F3：高级中国绿茶“开花龙顶(Kai Hua Long Ding)”由ZhejingKai Hua Co.生产，并在春季采收。

F4：高级中国绿茶“开花龙顶(Kai Hua Long Ding)”由ZhejingKai Hua Co.生产，并在秋季采收。

JPGT：高级日本绿茶。

表19 绿茶的活性成分^*

^*精油通过在己烷中超声提取1克原料2小时进行估计；儿茶素、咖啡因、咖啡因、可可碱和氯原酸通过在甲醇中超声提取1克原料2小时进行估计；L-茶氨酸和草酸通过在水中超声提取1克原料2个小时进行估计。

有机溶剂

乙腈(75-05-8)，HPLC用，梯度级≥99.9％(GC)(000687)；己烷(110-54-3)，95+％，分光光度级(248878)，乙醇，用4.8％异丙醇(02853)变性；乙醇(64-17-5)，无水，(02883)；甲醇(67-56-1)，99.93％，ACS HPLC级，(4391993)；和水(7732-18-5)，HPLC级(95304)；均购自Sigma-Aldrich Co.。

酸和碱：

甲酸(64-18-6)，50％溶液(09676)；苯酚(108-95-2)(P3653)；硫酸(7664-93-9)，ACS试剂，95-97％(44719)；三氟乙酸(76-05-1)，99.8％分光光度级(302031)，磷酸(7664-38-2)，85％水溶液(438081)；均购自Sigma-Aldrich Co.。磷酸二氢钾(7778-77-0)，>99％纯度(205925000，批号：A019842601)购自Acros Organics Co.。

化学参比标准：

(+)-儿茶素(154-23-4)，纯度95％(03310)；(-)-表儿茶素(490-46-0)，纯度93.6％(05125)；(-)-表儿茶素没食子酸酯(1257-08-5)，纯度99％(05135)；(-)-表没食子儿茶素(970-74-1)，纯度98.3％(05145)；(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(989-51-5)，纯度94％(05151)；L-茶氨酸(3086-61-6)，纯度99.0％(20250-001)；均购自Chromadex(www.chromadex.com)。咖啡因(58-0802)，purum，无水，>99％(27600)；可可碱(83-67-0)，纯度>99％，(T4500)；以及氯原酸(327-97-9)，最低95％滴定法(C3878)，均购自Sigma-Aldrich Co.。葡聚糖标准5000(00269)、50,000(00891)和410,000(00895)按照DIN认证，均购自Fluka Co.。草酸(144-62-7)，98％纯度(194131)，购自Sigma-Aldrich Co.。标准的结构见表20。

表20 绿茶化学参考标准的物理性质

方法

HPLC方法

儿茶素和生物碱分析

色谱***：Shimadzu高效液相色谱LC-10AVP***，配备LC10ADVP泵、SPD-M10AVP光电二极管阵列探测器。得到的提取产物在反相Jupiter C18柱(250×4.6mm I.D.，5μ，300)(Phenomenex，部件号：00G-4053-E0，序列号：2217520-3，批号：5243-17)上测量。流动相由A(0.5％(V/V)甲酸水溶液)和B(乙腈)组成。梯度程序如下：第一个6分钟，A保持在100％，6-10分钟，溶剂B从0％线性增加到12％，10-35分钟，B从12％线性增加到21％，然后35-40分钟，B从21％线性增加至25％，然后40-50分钟，B线性增加至100％。注射体积为10μl，流动相流速为1ml/min。柱温为50℃。

C(儿茶素)，EGC(表没食子儿茶素)，ECG(表儿茶素没食子酸酯)，EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)，咖啡因，可可碱，绿原酸的甲醇原液制备为浓度1mg/ml。1毫升等分的标准溶液转入10毫升容量瓶，得到混合的标准溶液。然后逐步稀释混合的参考标准溶液，得到最终浓度分别为0.5、0.2、0.1、0.05和0.01mg/ml的系列溶液。用这五个浓度制备标准曲线，用线性回归，峰面积对相应浓度作图，生成标准曲线。结果总结于表21。

表21 甲醇中浓度0.1mg/ml绿茶参比标准的HPLC分析结果

¹理论塔板数的计算：N＝16×(t_R/w)²。t_R是保留时间，w是峰宽，https://www.mn-net.com/web％5CMN-WEB- HPLCKatalog.nsf/WebE/GRUNDLAGEN

茶氨酸分析

茶氨酸的分析在反相Jupiter C18柱(250×4.6mm I.D.，5μ，300)(Phenomenex，部件号：00G-4053-E0，序列号：2217520-3，批号：5243-17)上进行。流动相为三氟乙酸调节的水，浓度为0.1％。流动相流速为1ml/min。检测器设定在波长203nm。

草酸分析

对草酸的分析在反相JupiterC18柱(250×4.6mm I.D.，5μ，300)(Phenomenex，部件号：00G-4053-E0，序列号：2217520-3，批号5243-17)上进行。流动相由A(0.5％KH2PO4(w/v)水溶液)和B(乙腈)组成。0.5％ KH2PO4(w/v)水溶液的流动相通过将固体KH2PO4溶解在蒸馏水中制备。然后用1.0mol/L H3PO4调节PH至2.80。梯度程序如下：溶剂B15分钟内从10％线性增加至40％，随后在另5分钟内从40％减少到10％。注射体积为10μl，流动相流速为1ml/min。柱温为25℃。检测波长为262nm。检测水中草酸从0.1mg/ml至10mg/ml的不同浓度。以这些浓度作标准曲线，用线性回归，峰面积对相应浓度作图，产生标准曲线。通过比较样品溶液和已知标准的峰面积，定量样品溶液中的草酸含量。

GC-MS方法

使用Shimadzu GCMS-QP2010***进行了GC-MS分析。该***包括高效气相色谱仪，直接连接的GC/MS接口，独立温度控制的电子轰击(EI)离子源，四极质滤器等。该***由GCMS solutionVer.2软件控制数据采集和运行后分析。在Agilent J&W DB-5熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm i.d.，0.25μm膜厚度)(目录：1225032，序列号：US5285774H)上使用下列温度程序进行分离。初始温度60℃，维持1分钟，然后以3℃/min的速度增加至180℃，维持35分钟，总运行时间为76分钟。样品注射液温度为220℃，自动进样器1分钟内以不分流方式进样1μl样品。载体为氦，流速通过40.1KPa的压力控制。在这种压力下，流速为0.79ml/min，线速度为32.5cm/min。质谱离子源温度为230℃，GC/MS接口温度为230℃。质谱检测器在50至500m/z间扫描，扫描速度AMU/秒。溶剂截断温度(Solvent cut off temperature)为3.5分钟。

多糖分析

分光光度计***：Shimadzu UV-1700紫外可见分光光度计(190-1100nm，1mm分辨率)已用于这项研究。比色法(Dubois，M.，Gilles，K.A.，Hamilton，J.K.，Rebers，P.A.and Smith，F.，Colorimetric Method for Determination of Sugars and related substances，Analytical chemistry，1956，28(3)，350-356)已用于多糖的分析。制备0.1mg/ml葡聚糖(Mw＝5000、50,000和410,000)原液。取0.08、0.16、0.24、0.32、0.40ml原液，用蒸馏水将体积补充至0.4ml。然后添加0.2ml5％苯酚溶液和1ml浓硫酸。紫外扫描前，该混合物放置10分钟。发现最大吸收在488nm。然后将波长设定在488nm，测定每个样品的吸光度。结果见表22。得到的每个葡聚糖溶液的标准校正曲线如下：葡聚糖5000，吸光度＝0.01919+0.027782C(μg)，R²＝0.97(N＝5)；葡聚糖50,000，吸光度＝0.0075714+0.032196C(μg)，R²＝0.96(N＝5)；以及葡聚糖410,000，吸光度＝0.03481+0.036293C(μg)，R²＝0.98(N＝5)。

表22 葡聚糖标准的比色分析

 

试管	葡聚糖溶液(ml)	蒸馏水(ml)	5％苯酚(ml)	硫酸(ml)	吸光度(Mw＝5K)	吸光度(Mw＝50K)	吸光度(Mw＝410K)
								空白	0	0.40	0.2	1	0	0	0
1	0.08	0.32	0.2	1	0.238	0.301	0.335
								2	0.16	0.24	0.2	1	0.462	0.504	0.678
3	0.24	0.16	0.2	1	0.744	0.752	0.854
								4	0.32	0.08	0.2	1	0.907	1.045	1.247
5	0.40	0.00	0.2	1	1.098	1.307	1.450

绿茶提取物的DART-MS分析

JEOL AccuTOF-DART质谱仪(Jeol USA，Peabody，MA)用于绿茶提取物的质谱分析。此飞行时间(TOF)质谱仪技术不要求(或最小)样品制备，产生的物质精确度达0.00001质量单位。对于正离子模式(DART+)，探针电压为3500V，成分加热至300℃，电极1至150V，电极2至250V，氦气流至3.69升每分钟(LPM)。质谱仪如下设置：孔1设为20V，环形透镜电压设为5V，孔2设为5V。峰电压设为1000V，以使分辨率从约100m/z开始。在微通道板检测器(MCP)电压设为2550V。10％PEG600溶液加入每个样品内进行校正，PEG600在整个100-1000质量单位的所需质量范围提供质量标记。

用硅硼玻璃熔点毛细管的封闭端将绿茶样品粉末引入DART氦等离子体。收集样品在毛细管上成薄膜，形成暴露在He等离子束下的均匀表面，从而最大量地进入TOF。每次分析，毛细管在离子束中放置约3-5秒。分析过程中未见样品热分解。

对于负离子模式(DART-)，DART和AccuTOF-MS转化为负离子模式。探针电压为3500V，成分加热至300℃，电极1-150V，电极2-250V，氦气流3.69LPM。质谱仪如下设置：孔1设为-20V，环型透镜电压设为-5V，孔2设为-5V。峰电压设为600V，以实现负离子模式中更低m/z范围的合适分辨率。MCP电压设为2600V。样品引入DART的方式与正离子模式中的完全相同。全氟羧酸溶液加入每个样品内进行校正。

分子式由JEOL AccuTOF DART-MS提供的元素组成和同位素匹配程序确认。基于文献发展了绿茶成分的可检索数据库。质谱中所有化学鉴定(确认的和未确认的)的置信度大于90％。

实施例1

步骤1的实施例：绿茶精油的单步骤SFE提取和纯化

所有SFE提取在压力和温度分别设计为最高达690巴和200℃的SFT250(Supercritical Fluid Technologies，Inc.，Newark，Delaware，USA)进行。此仪器在超临界条件下进行简便和有效的提取，在动态或静态的模式下灵活操作。该装置由三个组件构成：烘箱、泵，以及控制和收集组件。所述烘箱有一个预热柱和一个100ml的提取容器。所述泵组件配备有压缩空气驱动的泵，恒定流量为300ml/min。收集组件是40ml的玻璃小瓶，以隔膜和瓶盖封口，以回收提取产物。进一步提供了微米阀和流量计。监测提取容器的压力和温度并控制在+/-3巴和+/-1℃。

在典型的实验性例子中，每次试验把25克被切碎的，大于105μm，过140目筛的绿茶叶片放入100ml提取容器中。烘箱预热至所需温度，然后装入已填充的容器(the packed vessel)。所述容器连接到烘箱后，提取***用CO₂(850psig)加压检漏，并排气。密闭***，用空气驱动液体泵加压至所需提取压力。然后***平衡～3min。样品瓶(40ml)称重，连接到采样口。计量阀控制CO₂流速为5SLPM(9.8g/min)开始提取。计算溶剂/原料比，其定义为使用的总CO₂和装入的粗原料的重量比。提取过程中，被提取的样品每5分钟称重。当两次称重测量间样品重量变化不超过5％时，推断提取完毕。得率的定义是总提取物与粗原料料液的重量比。

在此实施例中，设定的提取条件其中温度设为40℃，压力设为200巴。CO2流速为9.8g/min。

实施例2

步骤2的实施例：绿茶植物原料的单步骤SFE脱咖啡因

所有SFE提取在SFT250(Supercritical Fluid Technologies，Inc.，Newark，Delaware，USA)进行。在典型的实验性例子中，每次试验将25g蒸馏水共溶剂浸湿的25g提取精油的切碎绿茶叶片残留放入100ml提取容器中。烘箱预热至所需温度，然后装入已填充的容器(the packed vessel)。所述容器连接到烘箱后，提取***用CO₂(850psig)加压检漏，并排气。密闭***，用空气驱动液体泵加压至所需提取压力。然后***平衡～3min。样品瓶(40ml)称重，连接到采样口。计量阀控制CO₂流速为5SLPM(9.8g/min)开始提取。每次分钟(every time minutes)将3ml共溶剂加入***中。提取时间4小时。计算溶剂/原料比，其定义为使用的总CO₂和装入的粗原料的重量比。得率定义为总提取物与粗原料料液的重量比。提取条件设为70℃和500巴。

实施例3

步骤3的实施例：95％乙醇浸提

绿茶叶片原料的儿茶素化学成分2阶段溶剂提取的典型实施例如下：原料为25g步骤2SCCO2脱咖啡因的切碎的绿茶叶片SFE残留或粗绿茶叶片原料。溶剂是250ml95％乙醇。在此方法中，原料和250ml95％乙醇分别装入500ml提取容器，并在加热水浴70℃混合2小时。使用截留粒子大小为4-8μm的Fisherbrand的P4滤纸过滤提取溶液，3000rpm离心20分钟，颗粒残留用于进一步提取。收集滤液(上清)，计算得率并进行HPLC分析。阶段1的残留用前述的方法提取2小时(阶段2)。混合上清提取物，用旋转蒸发仪除去乙醇。如需进一步纯化儿茶素组分，则将无醇的粗儿茶素提取产物溶解在250ml蒸馏水中，进行步骤4处理。对于茶氨酸和多糖组分，阶段2提取的残留同样做进一步处理(见步骤5)。

实施例4

步骤4的实施例儿茶素组分的亲和吸附提取

在典型试验中，工作液是步骤3中绿茶两阶段95％乙醇浸提物的透明水溶液。对于这些实施例，如步骤3所述25g绿茶SFE脱咖啡因残留用250ml95％乙醇在70℃(溶剂料液比20/1)被两阶段浸提。所述两阶段提取物混合，旋转蒸发除去乙醇。随后加入蒸馏水，重新配制成初始浓度的溶液(500ml体积)。

亲和吸附剂聚合物树脂为XAD7HP(见附录1)。在装填入ID为10mm，长为350mm的玻璃柱之前和之后，用95％乙醇(4-5BV)和蒸馏水(4-5BV)预洗涤30gm的亲和吸附剂。吸附剂的BV(床体积)为35ml。溶液浓度＝4.8-9.6mg/ml的100ml水溶液(除去乙醇的步骤3浸出液)上样到填充柱上，流速为1.2ml/min(2BV/hr)。上样时间85分钟。上样的柱子用150ml蒸馏水洗涤，流速10BV/hr，洗涤时间为25分钟。为除去上样柱的咖啡因，用100ml含5％硫酸的10％乙醇洗脱咖啡因化合物，流速为2.2ml/min(2BV/hr)。丢弃洗脱液。然后用250ml蒸馏水洗柱子，流速6ml/min(12BV/小时)，或直到洗出液pH值为中性。用100ml80％乙醇从上样柱上洗脱儿茶素类，流速1.2ml/min(2BV/hr)，洗脱时间85分钟。洗脱过程中，在0-0.7(F1)，0.8-1.0(F2)，1.0-1.1(F3)，1.1-1.3(F4)，1.3-1.6(F5)和1.6-3(F6)BV，分别收集6个组分(F1-F6)。然后，用3BV的无水乙醇清除柱子上的剩余化学物质，流速为3.6BV/hr，随后用3BV蒸馏水3.8BV/hr洗涤。收集上样、流出物、洗涤物和咖啡因洗脱液，测定物质含量，用HPLC分析测定儿茶素类(EGCG、EGC、ECG、C)，咖啡因，可可碱和绿原酸。收集每个洗脱组分，用HPLC分析。

实施例5

步骤5的实施例多糖和茶氨酸提取的水浸出方法

在水浸出方法的典型实施例中，20gm步骤3的95％乙醇浸出方法的残留和400ml蒸馏水分别装入500ml提取容器中，70℃水浴混合2小时。慢慢倒出最上面澄清层，固体残留的第二阶段提取用400ml蒸馏水使用相同方法提取。两阶段提取溶液2000rpm离心10分钟，用Fisherbrand的P4滤纸(截留颗粒大小为4-8μm)过滤。收集两阶段倾析的上清溶液并混合，计算得率，并用HPLC分析茶氨酸含量。

实施例6

步骤6的实施例多糖组分和茶氨酸的提取和纯化

绿茶的水溶性，乙醇不溶性的纯化多糖组分化学成分和茶氨酸化学成分的溶剂提取和沉淀的典型例子如下：如步骤5中上述的，20gm步骤3的两阶段95％乙醇浸提的固态残留，用两阶段蒸馏水浸提。合并步骤5两阶段提取物溶液。真空旋转蒸发浓缩澄清的上清提取物溶液，去除60％水溶剂。然后加入无水乙醇，补配成最终乙醇浓度为75％。该溶液放置1小时，观察到沉淀。提取溶液2000rpm离心10分钟，慢慢倒出上清，冻干，保存作进一步处理。收集多糖沉淀，冻干。干燥的多糖组分称重，溶解在水中，用比色法以葡聚糖为参考标准分析多糖纯度。此外用AccuTOF-DART质谱进一步测定包含多糖组分的化合物分子量分布。结果见图6-11。

含有L-茶氨酸的干燥上清产物溶解于蒸馏水，配制成10％的溶液。4个体积的无水乙醇加入此溶液，混合，放置1个小时。然后溶液6000rpm离心10分钟，慢慢倒出。丢弃沉淀。收集上清溶液，用真空旋转蒸发60℃浓缩为80％的乙醇溶液。此80％乙醇溶液冷却至室温。溶液中加入4个体积乙醇。此溶液放置于0℃冰箱24小时，使茶氨酸化合物结晶。溶液2000rpm离心10分钟，然后收集晶体，60℃真空干燥。

实施例7

下列成分被混合为制剂

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绿茶提取物                            150.0mg

      精油组分(10mg，7％干重)

      儿茶素组分(90mg，60％干重)

      茶氨酸组分(20，13％干重)

      多糖(30mg，20％干重)

蛇菊苷(甜菊提取物)                    12.5mg

羧甲基纤维素                          35.5mg

乳糖                                  77.0mg

------------------------------------------------------------------------------------

总量                                  275.0mg

绿茶的所述新型提取物包括以％物质重量计，比天然根茎原料或常规提取产物中发现的更高的纯化精油组分、儿茶素组分、茶氨酸组分和多糖组分。该配方可制成任何口服剂型，依所需生理、心理和医疗效果的需要(抗氧化剂，清除氧自由基和抑制亚硝化的活性，增强免疫，抗骨质疏松症，心血管疾病的预防和治疗，脑血管疾病的预防和治疗，降胆固醇的活性，预防和治疗癌症，治疗HIV和病毒病，减轻体重和产热，防止衰老，糖尿病管理，增强记忆和认知，减少焦虑，改善情绪)，每天给药一次或至每天给药15次。

实施例8

下列成分被混合为制剂

------------------------------------------------------------------------------------------

绿茶提取物                      150.0mg

      精油组分(5mg，3％干重)

      酚酸组分(90.0mg，60％干重)

      茶氨酸(10.0mg，7％干重)

      多糖(45.0mg，30％干重)

维生素C                         15.0mg

三氯半乳蔗糖                    35.0mg

绿豆粉10:1                      50.0mg

摩卡香料                        40.0mg

巧克力香料                      10.0mg

----------------------------------------------------------------------------------------------

总量                            300.0mg

绿茶的所述新型提取物的组合物包括以％物质重量计，比天然植物原料或常规提取产物中发现的更高的纯化精油、儿茶素、茶氨酸和多糖化学成分组分。所述配方可制成任何口服剂型，依所需生理、心理和医疗效果需要的最高达每天15次的给药是安全的。

引用的参考文献

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Claims (55)

1.绿茶种提取物，其包含具有图6-25中任一幅的实时直接分析(DART)质谱分析色谱图的组分。

2.权利要求1所述的绿茶种提取物，其中所述提取物包含选自精油、多酚、多糖的化合物及其组合。

3.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中所述精油选自正十六酸、十四酸、9-十六醇、1-十一醇、1-十六醇、油醇、9-十八烯-1-醇、十九醇及其组合。

4.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中所述多酚选自儿茶素类、黄烷醇、黄酮醇苷及其组合。

5.权利要求4所述的绿茶种提取物，其中所述儿茶素选自儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)及其组合。

6.权利要求4所述的绿茶种，其中所述黄烷醇选自槲皮素和芦丁。

7.权利要求4所述的绿茶种，其中所述黄酮醇苷为山奈酚。

8.权利要求2所述的绿茶种，其中所述多糖选自葡萄糖、***糖、半乳糖、鼠李糖、木糖糖醛酸及其组合。

9.权利要求1所述的绿茶种，其基本上不含咖啡因、草酸或单宁。

10.权利要求2所述的绿茶种，其中精油的量以重量计超过2％。

11.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中精油的量以重量计为25％至90％。

12.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中精油的量以重量计为50％-90％。

13.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中精油的量以重量计为75％-90％。

14.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中多酚的量以重量计超过40％。

15.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中多酚的量以重量计为50％至90％。

16.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中多酚的量以重量计为75％至90％。

17.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中多糖的量以重量计超过15％。

18.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中多糖的量以重量计为25％至90％。

19.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中多糖的量以重量计为50％至90％。

20.权利要求2所述的绿茶种提取物，其中多糖的量以重量计为75％至90％。

21.权利要求1所述的绿茶种提取物，其中所述提取物包含以重量计2％至97％的精油，以重量计15％至98％的儿茶素，以重量计4％至90％的茶氨酸，以及以重量计9％至98％的多糖。

22.食品或药物，其包含权利要求1所述的绿茶种提取物。

23.制备具有至少一种预定特征的绿茶种提取物的方法，其包含通过以下步骤顺序地提取绿茶种植物原料，产得精油组分、多酚组分和多糖组分：

a)通过超临界二氧化碳萃取提取绿茶种植物原料，产得精油组分和第一残留；

b)通过醇提法提取绿茶种植物原料或步骤a)的第一残留，产得多酚组分和第二残留；

c)通过水提法提取步骤b)的第二残留并醇沉多糖，产得多糖组分。

24.权利要求23所述的方法，其中步骤a)的第一残留通过超临界二氧化碳萃取进一步脱咖啡因。

25.权利要求23所述的方法，其中所述多酚组分通过亲和吸附层析进一步纯化。

26.权利要求23所述的方法，其中步骤a)包含：

1)将碾碎的绿茶种植物原料放入提取容器；

2)在超临界条件下加入二氧化碳；

3)使所述绿茶种植物原料与二氧化碳接触一段时间；以及

4)将精油组分收集到收集容器中。

27.权利要求23所述的方法，其进一步包含用超临界二氧化碳分级分离***分级分离所述精油组分，改变所述精油化合物比率的步骤。

28.权利要求26所述的方法，其中超临界条件包含60巴至800巴压力，35℃至90℃。

29.权利要求26所述的方法，其中超临界条件包含60巴至500巴压力，40℃至80℃。

30.权利要求26所述的方法，其中所述时间为30分钟至2.5小时。

31.权利要求26所述的方法，其中所述时间是1小时。

32.权利要求23所述的方法，其中步骤b)包含：

1)将碾碎的绿茶种植物原料或步骤a)的第一残留与醇溶剂接触足够长的时间，以提取多酚化学成分；

2)将步骤1)提取的多酚化学成分的水溶液流经亲和吸附树脂柱，其中所述多酚成分被吸附；

3)用酸性洗脱溶剂从所述亲和吸附剂洗脱所述咖啡因化合物；以及

4)用水醇洗脱溶剂从亲和吸附树脂洗脱所述多酚化学成分。

33.权利要求32所述的方法，其中所述水醇溶液包含乙醇和水，其中所述乙醇浓度以重量计为10-95％。

34.权利要求32所述的方法，其中所述水醇溶液包含乙醇和水，其中所述乙醇浓度以重量计为25％。

35.权利要求32所述的方法，其中步骤1)在30℃至100℃进行。

36.权利要求32所述的方法，其中步骤1)在60℃至100℃进行。

37.权利要求32所述的方法，其中所述时间为1-10小时。

38.权利要求32所述的方法，其中所述时间为1-5小时。

39.权利要求32所述的方法，其中所述时间为2小时。

40.权利要求23所述的方法，其中步骤c)包括：

1)将步骤b)的第二残留与水接触足够长的时间，以提取多糖；以及

2)用醇沉法沉淀水溶液中的多糖。

41.权利要求40所述的方法，其中所述水温为70℃至90℃。

42.权利要求40所述的方法，其中所述水温为80℃至90℃。

43.权利要求40所述的方法，其中所述时间为1-5小时。

44.权利要求40所述的方法，其中所述时间为2-4小时。

45.权利要求40所述的方法，其中所述时间为2小时。

46.权利要求40所述的方法，其中所述醇为乙醇。

47.绿茶种提取物，其通过权利要求23所述的方法制备。

48.绿茶种提取物，其包含连苯三酚，以连苯三酚重量计25至35％的茶碱/可可碱，以连苯三酚重量计0.1至5％的莽草酸，以连苯三酚重量计0.1至5％的香豆酸，以及以连苯三酚重量计0.1至5％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

49.绿茶种提取物，其包含茶氨酸，以茶氨酸重量计20至30％的茶碱/可可碱，以茶氨酸重量计1至10％的儿茶素/表儿茶素，以茶氨酸重量计1至10％的没食子酸，以茶氨酸重量计0.1至5％的儿茶素醌，以茶氨酸重量计0.1至5％的肉桂醛，以及以茶氨酸重量计1至10％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

50.绿茶种提取物，其包含茶氨酸，以茶氨酸重量计45至55％的茶碱/可可碱，以茶氨酸重量计1至10％的儿茶素/表儿茶素，以茶氨酸重量计0.1至5％的鼠尾草酸，以茶氨酸重量计1至10％的没食子酸，以茶氨酸重量计0.5至5％的儿茶素醌，以茶氨酸重量计1至10％的肉桂醛，以茶氨酸重量计0.1至5％的甲基肉桂酸，以茶氨酸重量计1至10％的肉桂酰胺，以及以茶氨酸重量计1至10％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

51.绿茶种提取物，其包含连苯三酚，以连苯三酚重量计1至10％的茶碱/可可碱，以连苯三酚重量计0.1至5％的茶氨酸，以连苯三酚重量计1至10％的儿茶素/表儿茶素，以连苯三酚重量计5至15％的山奈酚，以连苯三酚重量计0.1至5％的杨梅苷，以连苯三酚重量计0.1至5％的没食子儿茶素醌，以连苯三酚重量计65至75％的没食子酸，以连苯三酚重量计0.5至5％的儿茶素醌，以连苯三酚重量计1至10％的香草酸，以及以连苯三酚重量计1至5％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

52.绿茶种提取物，其包含山奈酚，以山奈酚重量计1至10％的茶氨酸，以山萘酚重量计95至105％的儿茶素/表儿茶素，以山萘酚重量计20至30％的槲皮素，以山萘酚重量计5至15％的杨梅苷，以山萘酚重量计5至10％的没食子儿茶素醌，以山萘酚重量计55至65％的没食子酸，以山萘酚重量计1至10％的儿茶素醌，以山萘酚重量计10至20％的香豆酸，以山奈酚重量计1至10％的香草酸，以及以山萘酚重量计15至25％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

53.绿茶种提取物，其包含连苯三酚，以连苯三酚重量计0.5至5％的茶碱/可可碱，以连苯三酚重量计95至105％的儿茶素/表儿茶素，以连苯三酚重量计55至65％的山奈酚，以连苯三酚重量计20至30％的槲皮素，以连苯三酚重量计10至20％的杨梅苷，以连苯三酚重量计20至30％的没食子儿茶素醌，以连苯三酚重量计50至60％的没食子酸，以连苯三酚重量计15至25％的儿茶素醌，以邻苯三酚重量计15至25％的香豆酸，以连苯三酚重量计1至10％的香草酸，以连苯三酚重量计0.5至5％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

54.绿茶种提取物，其包含连苯三酚，以连苯三酚重量计0.5至5％的茶碱/可可碱，以连苯三酚重量计95至105％的儿茶素/表儿茶素，以连苯三酚重量计55至65％的山奈酚，以连苯三酚重量计20至30％的槲皮素，以连苯三酚重量计10至20％的杨梅苷，以连苯三酚重量计20至30％的没食子儿茶素醌，以连苯三酚重量计50至60％的没食子酸，以连苯三酚重量计15至25％的儿茶素醌，以连苯三酚重量计15至25％的香豆酸，以连苯三酚重量计1至10％的香草酸，以连苯三酚重量计0.5至5％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

55.绿茶种提取物，其包含连苯三酚，以连苯三酚重量计的茶氨酸，以连苯三酚重量计90至100％儿茶素/表儿茶素，以连苯三酚重量计65至75％的山奈酚，以连苯三酚重量计15至25％的槲皮素，以连苯三酚重量计5至15％的杨梅苷，以连苯三酚重量计5至15％的没食子儿茶素醌，以连苯三酚重量计65至75％的没食子酸，以连苯三酚重量计5至15％的儿茶素醌，以连苯三酚重量计10至20％的香豆酸，以连苯三酚重量计1至10％的香草酸，以连苯三酚重量计1至10％的3-甲氧基-1-酪氨酸。

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