CN101448949B

CN101448949B - 酶促制备2-羟基-2-甲基羧酸的方法

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Publication number: CN101448949B
Application number: CN200780018246XA
Authority: CN
Inventors: R·H·米勒; T·罗韦尔德尔
Original assignee: Evonik Roehm GmbH
Current assignee: Evonik Roehm GmbH
Priority date: 2006-03-24
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2027-03-23
Also published as: ZA200808373B; CN101448949A

Abstract

本发明涉及由3-羟基羧酸酶促制备2-羟基-2-甲基羧酸的方法，其中将3-羟基羧酸在含水反应溶液中制备和/或加入到该反应溶液中并温育。该含水反应溶液含有具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性的单元，其不但具有产生3-羟基羰基-CoA-酯的活性而且具有使3-羟基羰基-CoA-酯异构化的活性，并引起3-羟基羧酸转化生成相应的2-羟基-2-甲基羧酸(其作为酸或以其盐的形式获得)。在优选的实施方式中，具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性的单元是包含经分离的钴胺素依赖性变位酶和任选地产生3-羟基羰基-CoA-酯的酶或酶体系或包含它们的微生物的单元。本发明优选涉及一种生产2-羟基-2-甲基羧酸的生物技术方法，其中将具有所期望的活性的微生物在含水体系中借助简单的天然物质培养，并将细胞内产生的3-羟基羰基-CoA-酯转化生成相应的2-羟基-2-甲基羧酸。本发明同样包括不饱和2-甲基羧酸的制备，其中将所获得的2-羟基-2-甲基羧酸通过脱水转化生成相应的不饱和2-甲基羧酸(甲基丙烯酸和更高级的同系物)。

Description

酶促制备2-羟基-2-甲基羧酸的方法

技术领域

本发明涉及由3-羟基羧酸酶促制备2-羟基-2-甲基羧酸的方法，其中将3-羟基羧酸在含水反应溶液中制备和/或加入到该反应溶液中并温育。所述含水反应溶液含有具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性的单元，其不但具有产生3-羟基羰基-CoA-酯的活性而且具有使3-羟基羰基-CoA-酯异构化的活性并引起3-羟基羧酸转化生成相应的2-羟基-2-甲基羧酸，其作为酸或以其盐的形式获得。在优选的实施方式中，所述具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性的单元包含经分离的钴胺素依赖性变位酶和任选地包含产生3-羟基羰基-CoA-酯的酶或酶体系或者为含有它们的微生物。本发明优选涉及生产2-羟基-2-甲基羧酸的生物技术的方法，其中将具有所期望的变位酶-活性的微生物在含水体系中借助简单的天然物质培养，并将细胞内产生的3-羟基羰基-CoA-酯转化生成相应的2-羟基-2-甲基羧酸。本发明同样包括不饱和2-甲基羧酸的制备，其中将所获得的2-羟基-2-甲基羧酸通过脱水转化生成相应的不饱和2-甲基羧酸(甲基丙烯酸和更高级的同系物)。

在本发明的优选的实施方式中，作为产生3-羟基羰基-CoA-硫酯和使3-羟基羰基-CoA-硫酯异构化的微生物使用微生物株系HCM-10(DSM18028)。

背景技术

甲基丙烯酸以及同系的不饱和2-甲基羧酸广泛地用于制备丙烯酸玻璃板、压铸成型产品、涂层和许多其它的产品。

许多制备甲基丙烯酸及其同系物的方法是已知的。虽然世界范围内绝大部分的商购可得的产品基于甲基丙烯酸及其同系物(其由相应的2-羟基腈制得)的酰胺-硫酸盐水解的方法(W.Bauer，＂Methacrylic acid and derivatives＂，在Ullmann′s Encyclopediaof Industrial Chemistry，第5版中，编者：B.Elvers，S.Hawkins，G.Schulz，VCH，New York，1990，Bd.A16，441-452页；A.W.Gross，J.C.Dobson，＂Methacrylic acid and derivatives＂，在Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，第4版，编者：J.I.Kroschwitz，M.Howe-Grant，John Wiley&Sons，New York，1995，Bd.16，474-506页)。在该方法中，例如需要约1.6kg的硫酸用于生产1kg的甲基丙烯酸。出于这样的原因，甲基丙烯酸的商业性生产的可替代方法是有利的，其无需回收硫酸(和与其相关的高能量消耗)地进行。

2-羟基异丁酸生成甲基丙烯酸的化学转化通过专利US3,666,805和US5,225,594得到公开。在此2-羟基异丁酸通过使用金属氧化物、金属氢氧化物、离子交换树脂、矾土、二氧化硅、胺、磷化氢、碱金属醇化物和碱金属羧酸盐而脱水。常规的反应温度介于160℃和250℃之间。用该方法可达到直至96％的甲基丙烯酸-产率。

用于生产甲基丙烯酸及其同系物的可替代方法通过在腈-水解酶的使用下2-羟基腈水解生成相应的2-羟基-2-甲基羧酸而产生。在此涉及腈水解酶或由腈水合酶和酰胺酶组成的组合(A.Baner jee，R.Sharma，U.C.Baner jee，2002，＂The nitrile-degrading enzymes：current status and future prospects＂，Appl.Microbiol.Biotechnol.，60：33-44)。该方法是经多项专利保护的(US6582943B1)。该方法的一个严重的缺点是腈在对于有效的腈水解的酶活性必须的中性pH范围中的不稳定性。在反应混合物中腈的分解导致酮和氰化物的积聚，二者均抑制腈-水解酶活性。

这两种方法(即当今流行的基于酰胺-硫酸盐的方法和基于酶促的腈-水解的方法)的一般性的缺点是对2-羟基腈的需求。其必须首先由环境破坏性反应物，即酮和氰化物制备。

因此，基于简单的非环境破坏性反应物生产甲基丙烯酸及其同系物的方法是有利的。

因此，本发明的任务在于，寻找生产2-羟基-2-甲基羧酸的可替代的可能性并提供手段和方法，其尽可能地基于简单的、非环境破坏性反应物，消耗少量的能量和产生少量的废物。

所述任务通过由3-羟基羧酸制备2-羟基-2-甲基羧酸的酶促方法得到解决。根据本发明将3-羟基羧酸在含有具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性的单元的含水反应溶液中制备和/或加入到这样的反应溶液中。具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性的单元在本发明的意义中是指包含钴胺素依赖性变位酶和任选地包含产生3-羟基羰基-CoA-酯的酶或酶体系或者含有或产生它们的生物体系的单元，所述生物体系具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性，且不但显示产生3-羟基羰基-CoA-酯的活性而且显示使3-羟基羰基-CoA-酯异构化的活性。在温育后，随即作为酸或以其盐形式获得相应地转化的2-羟基-2-甲基羧酸。

优选本发明涉及在微生物的利用下用于生产2-羟基-2-甲基羧酸的生物技术的方法。所述微生物通常具有合成3-羟基羰基-CoA-酯的活性且能够产生这样的钴胺素依赖性变位酶或者含有这样的变位酶，并通过3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性能够，细胞内地将由简单的天然物质(由反应物，例如糖和/或醇和/或有机酸及其衍生物)形成的3-羟基羰基-CoA-酯转化生成相应的2-羟基-2-甲基羰基-CoA-酯。

本发明的方法的特征尤其在于，将微生物(其产生或者含有钴胺素依赖性变位酶，且具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性)在含水体系中用于从3-羟基羧酸生成相应的2-羟基-2-甲基羧酸的转化。

在优选的方法变化方案中，将微生物(其含有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性且不但具有产生3-羟基羰基-CoA-硫酯的活性而且具有使3-羟基羰基-CoA-硫酯异构化的活性)在含水体系中用再生性原材料或再生性原材料的利用产生的废物作为碳源和能量源进行培养。在此将细胞内形成的3-羟基羧酸-CoA-硫酯转化成相应的2-羟基-2-甲基羧酸。优选该反应在添加外源3-羟基羧酸的情况下进行。随即将相应的2-羟基-2-甲基羧酸作为酸或以其盐形式分离。

所述新颖的生物技术的方法，其利用由简单的原材料生产3-羟基羧酸并异构化生成2-羟基-2-甲基羧酸，能够解决上述问题。

在本发明优选的实施方式中，所述方法包括以下步骤：

a)在具有合成3-羟基羰基-CoA-酯的活性和变位酶活性的适宜的生物体系中由简单的天然物质生产3-羟基羧酸并随即转化生成2-羟基-2-甲基羧酸，和

b)作为游离酸或作为其相应的盐分离2-羟基-2-甲基羧酸。

如此获得的2-羟基-2-甲基羧酸可有利地用于制备C2-C3-不饱和的异烯烃酸(甲基丙烯酸及其同系物)，这可通过在(a)和(b)中所制备的酸或其相应的盐的脱水而进行。所述反应在下面说明：

-简单的天然物质(例如再生性原材料或由再生性原材料的利用产生的废物，例如糖、有机酸或醇)→3-羟基羧酸→2-羟基-2-甲基羧酸(例如通过菌株HCM-10)

-2-羟基-2-甲基羧酸→甲基丙烯酸和同系物(例如在NaOH的存在下和185℃的温度下)

在此，当然地如此选择反应条件(pH-值、离子浓度、氧/二氧化碳需求、痕量元素、温度和类似的条件)以致于所述微生物能够最佳地使3-羟基羧酸反应生成2-羟基-2-甲基羧酸。在这样的反应条件下，所述钴胺素依赖性变位酶在天然微环境中(即细胞内)，具有比经分离的酶更高的稳定性和效率。此外，在适宜的条件下，细胞繁殖和由此变位酶浓度的提高是可能的。因此，借助微生物的酶促反应视情况意味着显著的优点，其关系到可靠性、自行性(Automatisierung)和简单性以及所述方法的最终产物的质量和产率。

对于本发明的3-羟基羧酸生成2-羟基-2-甲基羧酸的酶促反应还可能的是，将具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性的单元(即优选与合成CoA-酯的活性结合的钴胺素依赖性变位酶)以经纯化、经富集和/或经分离的形式引入到反应溶液中，其中所述酶可以是例如天然来源的。当然所述酶可以是由基因技术改变的有机体重组制备的酶。

在本发明的方法中于本发明的意义内，作为催化剂不但以完整的微生物细胞形式而且以渗透的微生物细胞的形式使用所述酶。其它的使用可能性以微生物细胞提取物的组分的形式(一种或多种)，但也以部分纯化或经纯化的形式存在。任选地根据本发明使用其它的合成CoA-酯的酶，例如CoA-转移酶或CoA-合成酶。所述酶促催化剂可固定化或附着到溶解的或未溶解的载体材料上。

在优选的实施变化方案中，将特定的细胞小室或其部分彼此分开或使其结合，即，可使碳水化合物结构、类脂或蛋白质和/或肽以及核酸(其能够积极地或消极地影响具有变位酶-活性的单元)结合或将其分开。为了有意识地利用这样的影响，由微生物例如根据该专业领域地制备粗提取物，将其任选地离心以便可以用沉淀物或上清液进行本发明的反应。

3-羟基羧酸(例如3-羟基丁酸)或更准确地说其细胞内的CoA-硫酯3-羟基羰基-CoA可容易地通过大量种类的细菌菌株由简单的天然物质制得。这些酸是用于广泛存在的细菌的碳和能量储存物质聚-3-羟基链烷酸酯的基础物质(Grundbausteine)/单体。在羧酸骨架内碳的移位在细菌中也在其它的生物体系中同样普遍存在。然而，至今没有生物体系可以被证实用于从3-羟基羰基-CoA-酯生成相应的2-羟基-2-甲基羧酸-CoA-酯的转化。本发明基于令人惊奇的认识，即具有钴胺素依赖性变位酶-活性的体系具有这两种性能。

含有钴胺素依赖性变位酶的微生物为例如MethylibiumpetroleiphilumPM1、Methylibiumsp.R8(Stammsammlung UFZ，莱比锡)、β-蛋白菌株HCM-10、自养黄色杆菌(Xanthobacterautotrophicus)Py2、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)(ATCC17029)或类诺卡氏菌属(Nocardioides sp.)JS614。

用菌株HCM-10找到优选适宜的生物体系。所述菌株根据关于用于专利方法目的的微生物保藏的布达佩斯条约保藏于DeutschenSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，德国，以保藏号DSM18028下于2006年3月13日。

在所述优选的微生物体系的使用下，可达到2-羟基-2-甲基羧酸(特别是2-羟基异丁酸)特别良好的产率。但是，所述通过微生物的酶促反应绝不仅限于所述的菌株。根据本发明，可使用所有能够将3-羟基羧酸转化生成2-羟基-2-甲基羧酸的有机体。

在此涉及微生物，其一方面具有相同的基因或者基因产物，或另一方面具有类似的基因，其导致具有相似或类似活性的基因产物)。即通过本发明同样揭示了其它来源的3-羟基羰基-CoA-变位酶-活性。同样本发明也包括经转化的体系，其具有如菌株HCM-10或其它来源的一种或一种相似的3-羟基羰基-CoA-变位酶-活性。

属于突变体(基因技术改变的以及分离的微生物的变异体)的可以是例如有机体，其由于引入变位酶-编码性核苷酸序列而具有所期望的钴胺素依赖性变位酶-活性。

优选使用的生物体系(菌株HCM-10-DSM18028)由简单的天然物质(如糖和/或有机酸和/或醇及其衍生物)制备作为硫酯的3-羟基羰基-CoA-酯。在这里所使用的优选的体系中，将3-羟基羰基-CoA-酯通过钴胺素依赖性碳骨架-改造性变位酶转化成2-羟基-2-甲基羰基-CoA-酯，如在等式1中示例性地对于(R)-3-羟基丁酰基-CoA的情况所示的那样。所述CoA-硫酯在所述体系中水解并将酸排出到培养介质中。

(R)-3-羟基丁酰基-CoA 2-羟基异丁酰基-CoA

对于本发明的方法，作为优选的酶-催化剂使用含有钴胺素依赖性变位酶的微生物株系HCM-10(DSM18028)、自养黄色杆菌Py2、类球红细菌(ATCC17029)或类诺卡氏菌属JS614、它们的粗提取物或部分。本发明所使用的菌株产生优选具有序列SEQ ID NO：2和/或SEQ IDNO：4的蛋白质或者包含核酸序列SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3(HCM-10)、具有序列SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6的蛋白质或者包含核酸序列SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8(自养黄色杆菌Py2)、具有序列SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的蛋白质或者包含核酸序列SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：12(类球红细菌ATCC

17029)或具有序列SEQ ID NO：13和/或SEQ ID NO：14的蛋白质或者包含核酸序列SEQ ID NO：15和/或SEQ ID NO：16(类诺卡氏菌属JS614)。在本发明的意义中，可将所述蛋白质以富集的、分离的或合成的制备形式使用。

在进一步优选的本发明的实施变化方案中，将所述酶-催化剂(特别是微生物、其粗提取物、其部分和/或经富集的或经分离的酶)固定化地使用。通过固定化将酶、细胞器和细胞置于到不溶的和反应空间受限的状态中。如此可将所述酶例如在聚合物基质中固定化(例如海藻酸盐-、聚乙烯醇-或聚丙烯酰胺-凝胶)。固定化还可在溶解或未溶解的载体材料上(例如硅藻土)进行以简化催化剂-回收和-再使用。用于在聚合物-基质中或在溶解或未溶解的载体上的细胞-固定化的方法是本领域技术人员已知的并已经有详细地描述。同样可将所述酶活性由微生物细胞分离。随后可直接作为催化剂或在聚合物-基质中或在溶解或未溶解的载体上固定化地使用所述酶活性。对此必要的方法是本领域技术人员已知的并描述于例如Methods in Biotechnology，卷1：Immobilization of enzymes and cells，编者：G.F.Bickerstaff，Humana出版社，Totowa，New Jersey，1997。

3-羟基羧酸生成2-羟基-2-甲基羧酸的转化优选在连续的方法的范围中进行，其可在贯流的反应器中进行，在所述反应器中微生物进行生长并由此产物形成。但是，连续的方法还可理解为生长的细胞和催化性酶的任何体系，一方面输送营养溶液到其中和另一方面从其中将培养溶液(包括酶促形成的2-羟基-2-甲基羧酸)采出。根据本发明所述方法还可以半连续的方法或间歇-方法进行。

如已经详述的那样，优选通过碳水化合物和/或有机酸和/或醇或其衍生物的酶促反应制备3-羟基羧酸，其为2-羟基-2-甲基羧酸的原材料。在与本发明的关联中除了钴胺素依赖性变位酶之外任选地还使用合成CoA-酯的酶，其在微生物中存在或将其添加。在此，烃和/或碳水化合物和/或有机酸和/或醇或其衍生物生成3-羟基羧酸和由3-羟基羧酸生成2-羟基-2-甲基羧酸的转化在单一的方法步骤中进行，即初始底物直至3-羟基羧酸的转化和3-羟基羧酸生成相应的2-羟基-2-甲基羧酸的酶促转化反应同时或稍微时间延迟地在一个且同一个反应溶液中运行。

在尤其特别的本发明的实施方式中，用于培养使用具有叔丁基残基的底物作为碳源和能量源，优选叔丁醇在基础培养基中用作为唯一的碳源和能量源。

本发明的方法优选可用于制备2-羟基-2-甲基丙酸(2-羟基异丁酸)。优选的2-羟基异丁酸的制备的特征还在于，添加外源3-羟基丁酸。

所述方法可需氧地，优选在使用全细胞的情况下实施，或者还可厌氧地例如在氮气充气下，优选当使用提取物或经纯化的酶时实施。

本发明还涉及核酸分子，其编码具有钴胺素依赖性变位酶活性的酶，选自

a)核酸分子，其编码蛋白质，所述蛋白质包含在Seq.No.2和/或Seq.No.4下所示的氨基酸序列；

b)核酸分子，其包含在Seq.No.1和/或Seq.No.3下所示的核苷酸序列。

已经显示，本发明的酶优选为异源二聚体蛋白质，其包含在Seq.No.2和Seq.No.4下描述的亚基和由此具有突出的酶活性。

核酸分子可以是DNA分子，优选cDNA分子或基因组DNA和/或RNA分子。核酸和蛋白质均可由天然源分离(优选由DSM18028，但是例如，也由Methylibium petroleiphilum PM1，Methylibium sp.R8(Stammsammlung UFZ莱比锡)，自养黄色杆菌Py2，类球红细菌(ATCC17029)或类诺卡氏菌属JS614)或根据已知的方法合成。

在本发明所使用的核酸分子中可借助本身已知的分子生物学技术产生突变，这使得可以合成其它的具有类似或相似的性能的酶，所述酶同样用于本发明的方法中。突变可以是缺失性突变，其导致截短的酶。通过其它的分子机制例如***、复制、转位、基因融合、核苷酸交换或还有各种微生物株系之间的基因转化，可同样产生具有相似的或类似的性能的经修饰的酶。

这种核酸分子的识别和分离可在使用核酸分子或其部分的情况下进行。与核酸分子杂交的分子还包括片段、衍生物和上述核酸分子的等位基因变体，其编码根据本发明可使用的酶。在此，片段是指核酸分子的部分，其足够地长，以便编码所述的酶。衍生物是指分子的序列，其在一个或多个位置上区别于上述核酸分子的序列，但是针对该序列具有高度同源性。在此，同源性意指着至少40％、特别是至少60％的、优选超过80％和特别优选超过90％、95％、97％或99％的在核酸水平上的序列一致性。在此，所编码的酶具有针对所给出的氨基酸序列至少60％、优选至少80％、特别优选至少95％、尤其特别优选至少99％的在氨基酸水平上的序列一致性。在此，偏差可通过缺失、置换、***或重组而产生。在此可涉及自然出现的变异，例如涉及来自其它有机体的序列，或涉及突变，其中所述突变可以自然的方式或通过有针对性的诱变(UV-射线、X射线、化学制剂或其它)出现。此外，所述变体可以涉及合成制备的序列。所述变异体具有特定的共同特征，例如酶活性、活性的酶浓度、亚基、功能性基团、免疫反应性、构象和/或物理性能，如在凝胶电泳中的迁移行为、色谱行为、溶解性、沉淀系数、最适pH值、最适温度、光谱特性、稳定性和/或其它。

此外，本发明的主题也为具有序列No.2和4的新的蛋白质以及异源二聚体的蛋白质，其包含Seq.No.2和Seq.No.4及其至少99％的同系物。

SEQ ID NO：1展示编码源自DSM18028的钴胺素依赖性变位酶的大亚基的包含1644bp的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2展示源自DSM18028的钴胺素依赖性变位酶的大亚基的包含548AS的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3展示编码源自DSM18028的钴胺素依赖性变位酶的小亚基的369bp的部分核苷酸序列。

SEQ ID NO：4展示源自DSM18028的钴胺素依赖性变位酶亚基的包含123AS的部分序列。

SEQ ID NO：5和6展示源自自养黄色杆菌Py2的钴胺素依赖性变位酶的包含562或者135AS的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7和8展示编码源自自养黄色杆菌Py2的钴胺素依赖性变位酶的1689或者408bp的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9和10展示源自类球红细菌ATCC17029的钴胺素依赖性变位酶的包含563或者135AS的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11和12展示编码源自类球红细菌ATCC17029的钴胺素依赖性变位酶的1692或者408bp的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13和14展示源自类诺卡氏菌属JS614的钴胺素依赖性变位酶的包含569或者164AS的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15和16展示编码源自类诺卡氏菌属JS614的钴胺素依赖性变位酶的1710或者495bp的核苷酸序列。

通过培养介质的处理(在除去未溶解的成分如微生物的细胞之后)可将根据本发明所制备的2-羟基-2-甲基羧酸用已知的方法分离。这样的方法尤其例如为浓缩、离子交换、蒸馏、电透析、提取和结晶。可将所述产物作为盐或(在酸化后)作为质子化的2-羟基-2-甲基羧酸分离。

可将2-羟基-2-甲基羧酸(或其相应的盐)通过许多方法脱水生成相应的不饱和的2-甲基羧酸。为了制备C2-C3不饱和的异链烯酸，将制得的2-羟基-2-甲基羧酸根据现有技术已知的方法脱水。所述2-羟基-2-甲基羧酸的脱水可通过使用金属氧化物、金属氢氧化物、离子交换树脂、矾土、二氧化硅、胺、磷化氢、碱金属醇化物和碱金属羧酸盐进行。常规的反应温度介于160℃和250℃之间。如此例如通过2-羟基异丁酸在NaOH的存在下的脱水，在约185℃的温度进行甲基丙烯酸的制备。

通过该过程制得的甲基丙烯酸及其同系物适于应用于一系列工业分支，例如作为添加剂和在涂层中。与至今已知的方法相反，所述方法使低温过程、非环境破坏性反应物的使用和少量的废物产生的优点结合起来。

随后在实施例中更详尽地描述本发明，但不应将本发明限制于此。

具体实施方式

材料和方法

微生物酶催化剂

源自菌株HCM-10(DSM18028)的微生物细胞或由其分离的具有序列No.2和No.4的蛋白质亚基，所述细胞的特征在于具有产生3-羟基羰基-CoA-酯的活性和使3-羟基羰基-CoA-酯异构化的活性。

微生物酶-催化剂的增长

将用于制备2-羟基-2-甲基羧酸所使用的微生物株系如下所述地分离。将在20％的甘油-溶液中的菌株培养物储存于液氮中。

源自地下水的菌株HCM-10在基础培养基(表1)上用叔丁醇作为唯一的碳源和能量源富集。

所述菌株***发生于红长命菌属-纤发菌属(Rubrivivax-Leptothrix)类。

表1

需氧地在下列条件下(表2)培育菌株HCM-10用于测试3-羟基羰基-CoA-变位酶活性。

表2

将细胞直接在采集后使用。全细胞可在无进一步的预处理(例如透化处理)的情况下使用。此外，可经透化地使用所述细胞(例如通过用甲苯、清洗剂或通过冻融循环的处理)，以便改善物质进入到细胞中和从细胞中出来的扩散速率。

在培养液中或者在反应配料(Reaktionsansatz)中的2-羟基异丁酸和3-羟基丁酸的浓度通过气相色谱法在酸性甲醇的醇解后在FFAP柱和FID探测器的使用下测定。

实施例1：

通过菌株HCM-10由3-羟基丁酸转化成2-羟基异丁酸。

将菌株HCM-10的1g(干重)细胞于100mL基础培养基中的悬浮液填充到120mL血清瓶中。将50mg的3-羟基丁酸加入到该悬浮液中并将该悬浮液在旋转的摇动器(Schüttler)上于30℃温育。在0.3小时的需氧温育后，将该悬浮液用氮气充气并在摇动下于30℃进一步温育4.4h。在不同的时间点采集试样并测定在悬浮液的离心后的无细胞的上清液中的2-羟基异丁酸和3-羟基丁酸的含量。经确定，2-羟基异丁酸为厌氧相中释放的唯一产物。与此相反，在需氧的初始相中，3-羟基丁酸明显地完全地被分解(图1)。2-羟基异丁酸的产率在这种情况下为5.1％，约80％的3-羟基丁酸残留在反应液中。

实施例2：

通过菌株HCM-10的粗提取物由3-羟基丁酸转化成2-羟基异丁酸。

在球磨中通过细胞的解聚制备菌株HCM-10的无细胞的粗提取物，随后通过离心将细胞碎片分离出去。将在5mL的50-mM-磷酸钾缓冲液(在pH7.2下含有1mM MgCl₂)中的浓度为10mg蛋白质的无细胞的粗提取物加入到可封闭的10mL-玻璃容器中。随后将0.01mM的辅酶B12、1mM的辅酶A、1mM的ATP和4.25mg的3-羟基丁酸加入到所述提取物中。将所述反应液用氮气充气，将所述反应容器紧密地封闭并在摇动下于30℃温育2h。如上所示的那样分析反应产物。2-羟基异丁酸的产率在这种情况下为9％，约88％的3-羟基丁酸残留在反应液中(图2)。

实施例3：

将2-羟基异丁酸脱水生成甲基丙烯酸酯。

将2-羟基异丁酸的溶液(1mg/5mL)(相应于实施例2实施的步骤制备的)在搅拌下掺入NaOH(0.06mg)。将该溶液在搅拌和回流冷却下于185-195℃在真空(300托)中温育。经过5h期间每小时进一步加入每5ml0.5mg的2-羟基异丁酸的等分试样，该等分试样额外地含有0.4重量％的对甲氧基苯酚，以便避免甲基丙烯酸酯的聚合。温育24h后结束反应。2-羟基异丁酸生成甲基丙烯酸酯的转化率共计为97％。甲基丙烯酸通过蒸馏从反应物料中分离出去。

序列表

<110>UFZ

<120>酶促制备2-羟基-2-甲基羧酸的方法

<130>P396906PC

<140>

<141>

<150>DE10 2006 017 760.6

<151>2006-04-12

<150>DE 10 2006 014 1679

<151>2006-03-21

<160>16

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1644

<212>DNA

<213>β-蛋白菌株HCM-10(DSM18028)

<400>1

aagtcccaac tccaatcgga gcgcaaggac tgggaagcga acgaagtcgg cgccttcttg 60

aagaaggccc ccgagcgcaa ggagcagttc cacacgatcg gggacttccc ggtccagcgc 120

acctacaccg ctgccgacat cgccgacacg ccgctggagg acatcggtct tccggggcgc 180

tacccgttca cgcgcgggcc ctacccgacg atgtaccgca gccgcacctg gacgatgcgc 240

cagatcgccg gcttcggcac cggcgaggac accaacaagc gcttcaagta tctgatcgcg 300

cagggccaga ccggcatctc caccgacttc gacatgccca cgctgatggg ctacgactcc 360

gaccacccga tgagcgacgg cgaggtcggc cgcgagggcg tggcgatcga cacgctggcc 420

gacatggagg cgctgctggc cgacatcgac ctcgagaaga tctcggtctc gttcacgatc 480

aacccgagcg cctggatcct gctcgcgatg tacgtggcgc tcggcgagaa gcgcggctac 540

gacctgaaca agctgtcggg cacggtgcag gccgacatcc tgaaggagta catggcgcag 600

aaggagtaca tctacccgat cgcgccgtcg gtgcgcatcg tgcgcgacat catcacctac 660

agcgcgaaga acctgaagcg ctacaacccg atcaacatct cgggctacca catcagcgag 720

gccggctcct cgccgctcca ggaggcggcc ttcacgctgg ccaacctgat cacctacgtg 780

aacgaggtga cgaagaccgg tatgcacgtc gacgaattcg cgccgcggtt ggccttcttc 840

ttcgtgtcgc aaggtgactt cttcgaggag gtcgcgaagt tccgcgccct gcgccgctgc 900

tacgcgaaga tcatgaagga gcgcttcggt gcaagaaatc cggaatcgat gcggttgcgc 960

ttccactgtc agaccgcggc ggcgacgctg accaagccgc agtacatggt caacgtcgtg 1020

cgtacgtcgc tgcaggcgct gtcggccgtg ctcggcggcg cgcagtcgct gcacaccaac 1080

ggctacgacg aagccttcgc gatcccgacc gaggatgcga tgaagatggc gctgcgcacg 1140

cagcagatca ttgccgagga gagtggtgtc gccgacgtga tcgacccgct gggtggcagc 1200

tactacgtcg aggcgctgac caccgagtac gagaagaaga tcttcgagat cctcgaggaa 1260

gtcgagaagc gcggtggcac catcaagctg atcgagcagg gctggttcca gaagcagatt 1320

gcggacttcg cttacgagac cgcgctgcgc aagcagtccg gccagaagcc ggtgatcggg 1380

gtgaaccgct tcgtcgagaa cgaagaggac gtcaagatcg agatccaccc gtacgacaac 1440

acgacggccg aacgccagat ttcccgcacg cgccgcgttc gcgccgagcg cgacgaggcc 1500

aaggtgcaag cgatgctcga ccaactggtg gctgtcgcca aggacgagtc ccagaacctg 1560

atgccgctga ccatcgaact ggtgaaggcc ggcgcaacga tgggggacat cgtcgagaag 1620

ctgaagggga tctggggtac ctac 1644

<210>2

<211>548

<212>PRT

<213>β-蛋白菌株HCM-10(DSM18028)

<400>2

Lys Ser Gln Leu Gln Ser Glu Arg Lys Asp Trp Glu Ala Asn Glu Val

1 5 10 15

Gly Ala Phe Leu Lys Lys Ala Pro Glu Arg Lys Glu Gln Phe His Thr

20 25 30

Ile Gly Asp Phe Pro Val Gln Arg Thr Tyr Thr Ala Ala Asp Ile Ala

35 40 45

Asp Thr Pro Leu Glu Asp Ile Gly Leu Pro Gly Arg Tyr Pro Phe Thr

50 55 60

Arg Gly Pro Tyr Pro Thr Met Tyr Arg Ser Arg Thr Trp Thr Met Arg

65 70 75 80

Gln Ile Ala Gly Phe Gly Thr Gly Glu Asp Thr Asn Lys Arg Phe Lys

85 90 95

Tyr Leu Ile Ala Gln Gly Gln Thr Gly Ile Ser Thr Asp Phe Asp Met

100 105 110

Pro Thr Leu Met Gly Tyr Asp Ser AspHi s Pro Met Ser Asp Gly Glu

115 120 125

Val Gly Arg Glu Gly Val Ala Ile Asp Thr Leu Ala Asp Met Glu Ala

130 135 140

Leu Leu Ala Asp Ile Asp Leu Glu Lys Ile Ser Val Ser Phe Thr Ile

145 150 155 160

Asn Pro Ser Ala Trp Ile Leu Leu Ala Met Tyr Val Ala Leu Gly Glu

165 170 175

Lys Arg Gly Tyr Asp Leu Asn Lys Leu Ser Gly Thr Val Gln Ala Asp

180 185 190

Ile Leu Lys Glu Tyr Met Ala Gln Lys Glu Tyr Ile Tyr Pro Ile Ala

195 200 205

Pro Ser Val Arg Ile Val Arg Asp Ile Ile Thr Tyr Ser Ala Lys Asn

210 215 220

Leu Lys Arg Tyr Asn Pro Ile Asn Ile Ser Gly Tyr His Ile Ser Glu

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ser Pro Leu Gln Glu Ala Ala Phe Thr Leu Ala Asn Leu

245 250 255

Ile Thr Tyr Val Asn Glu Val Thr Lys Thr Gly Met His Val Asp Glu

260 265 270

Phe Ala Pro Arg Leu Ala Phe Phe Phe Val Ser Gln Gly Asp Phe Phe

275 280 285

Glu Glu Val Ala Lys Phe Arg Ala Leu Arg Arg Cys Tyr Ala Lys Ile

290 295 300

Met Lys Glu Arg Phe Gly Ala Arg Asn Pro Glu Ser Met Arg Leu Arg

305 310 315 320

Phe His Cys Gln Thr Ala Ala Ala Thr Leu Thr Lys Pro Gln Tyr Met

325 330 335

Val Asn Val Val Arg Thr Ser Leu Gln Ala Leu Ser Ala Val Leu Gly

340 345 350

Gly Ala Gln Ser Leu His Thr Asn Gly Tyr Asp Glu Ala Phe Ala Ile

355 360 365

Pro Thr Glu Asp Ala Met Lys Met Ala Leu Arg Thr Gln Gln Ile Ile

370 375 380

Ala Glu Glu Ser Gly Val Ala Asp Val Ile Asp Pro Leu Gly Gly Ser

385 390 395 400

Tyr Tyr Val Glu Ala Leu Thr Thr Glu Tyr Glu Lys Lys Ile Phe Glu

405 410 415

Ile Leu Glu Glu Val Glu Lys Arg Gly Gly Thr Ile Lys Leu Ile Glu

420 425 430

Gln Gly Trp Phe Gln Lys Gln Ile Ala Asp Phe Ala Tyr Glu Thr Ala

435 440 445

Leu Arg Lys Gln Ser Gly Gln Lys Pro Val Ile GlyVal Asn Arg Phe

450 455 460

Val Glu Asn Glu Glu Asp Val Lys Ile Glu Ile His Pro Tyr Asp Asn

465 470 475 480

Thr Thr Ala Glu Arg Gln Ile Ser Arg Thr Arg Arg Val Arg Ala Glu

485 490 495

Arg Asp Glu Ala Lys Val Gln Ala Met Leu Asp Gln Leu Val Ala Val

500 505 510

Ala Lys Asp Glu Ser Gln Asn Leu Met Pro Leu Thr Ile Glu Leu Val

515 520 525

Lys Ala Gly Ala Thr Met Gly Asp Ile Val Glu Lys Leu Lys Gly Ile

530 535 540

Trp Gly Thr Tyr

545

<210>3

<211>370

<212>DNA

<213>β-蛋白菌株 HCM-10(DSM18028)

<400>3

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gcgctgcgcg acgccggcat ggacgtcatc tactccggcc ttcatcgcac gcccgaagag 120

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tccttggtcg 370

<210>4

<211>123

<212>PRT

<213>β-蛋白菌株 HCM-10(DSM18028)

<400>4

Val Leu Leu Ala Lys Val Gly Leu Asp Gly His Asp Arg Gly Val Lys

1 5 10 15

Val Val Ala Arg Ala Leu Arg Asp Ala Gly Met Asp Val Ile Tyr Ser

20 25 30

Gly Leu Ars Arg Thr Pro Glu Glu Val Val Asn Thr Ala Ile Gln Glu

35 40 45

Asp Val Asp Val Leu Gly Val Ser Leu Leu Ser Gly Val Gln Leu Thr

50 55 60

Val Phe Pro Lys Ile Phe Lys Leu Leu Asp Glu Arg Gly Ala Gly Asp

65 70 75 80

Leu Ile Val Ile Ala Gly Gly Val Met Pro Asp Glu Asp Ala Ala Ala

85 90 95

Ile Arg Lys Leu Gly Val Arg Glu Val Leu Leu Gln Asp Thr Pro Pro

100 105 110

Gln Ala Ile Ile Asp Ser Ile Arg Ser Leu Val

115 120

<210>5

<211>562

<212>PRT

<213>自养黄色杆菌Py2

<400>5

Met Ser Met Ser Glu Ile Met Thr Leu Ala Asn Leu Asp Asp Asp Val

1 5 10 15

Arg His Trp Glu Glu Thr Glu Val Ala Ala Phe Leu Lys Lys Gln Lys

20 25 30

Glu Arg Lys Glu Gln Phe Phe Thr Leu Gly Asp Phe Pro Val Lys Arg

35 40 45

Val Tyr Thr Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr Pro Ile Glu Asp Ile Gly

50 55 60

Leu Pro Gly Arg Tyr Pro Phe Thr Arg Gly Pro Tyr Pro Thr Met Tyr

65 70 75 80

Arg Ser Arg Asn Trp Thr Met Arg Gln Ile Ala Gly Phe Gly Thr Gly

85 90 95

Glu Asp Thr Asn Lys Arg Phe Lys Tyr Leu Ile Glu Gln Gly Gln Thr

100 105 110

Gly Ile Ser Thr Asp Phe Asp Met Pro Thr Leu Met Gly Tyr Asp Ser

115 120 125

Asp His Pro Met Ser Asp Gly Glu Val Gly Arg Glu Gly Val Ala Ile

130 135 140

Asp Thr Leu Ala Asp Met Glu Ala Leu Phe Asp Gly Ile Asp Leu Glu

145 150 155 160

Lys Ile Ser Val Ser Met Thr Ile Asn Pro Ser Ala Trp Ile Leu Leu

165 170 175

Ala Met Tyr Ile Val Leu Ala Gln Lys Arg Gly Tyr Asp Leu Asp Lys

180 185 190

Leu Ser Gly Thr Val Gln Ala Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Met Ala Gln

195 200 205

Lys Glu Tyr Ile Tyr Pro Ile Ala Pro Ser Val Arg Ile Val Arg Asp

210 215 220

Cys Ile Thr Tyr Cys Ala Lys Asn Met Lys Arg Tyr Asn Pro Ile Asn

225 230 235 240

Ile Ser Gly Tyr His Ile Ser Glu Ala Gly Ser Ser Pro Val Asp Glu

245 250 255

Val Ala Phe Thr Leu Ala Asn Leu Ile Val Tyr Val Glu Glu Val Leu

260 265 270

Lys Thr Gly Met Lys Val Asp Asp Phe Ala Pro Arg Leu Ala Phe Phe

275 280 285

Phe Val Cys Gln Ala Asp Phe Phe Glu Glu Ile Ala Lys Phe Arg Ala

290 295 300

Val Arg Arg Cys Tyr Ala Lys Ile Met Lys Glu Arg Phe Gly Ala Arg

305 310 315 320

Asn Pro Glu Ser Met Arg Leu Arg Phe His Cys Gln Thr Ala Ala Ala

325 330 335

Ser Leu Thr Lys Pro Gln Phe Met Val Asn Val Val Arg Thr Thr Leu

340 345 350

Gln Ala Leu Ala Ala Val Leu Gly Gly Cys Gln Ser Leu His Thr Asn

355 360 365

Gly Phe Asp Glu Ala Phe Ala Ile Pro Thr Glu Glu Ala Met Arg Leu

370 375 380

Ala Leu Arg Thr Gln Gln Val Ile Ala Glu Glu Ser Asn Val Thr Gln

385 390 395 400

Val Ile Asp Pro Val Gly Gly Ser Tyr Tyr Val Glu Thr Leu Thr Thr

405 410 415

Glu Tyr Glu Lys Arg Ile Met Asp Ile Ile Ser Glu Val Asp Ala Arg

420 425 430

Gly Gly Thr Ile Lys Leu Ile Gln Glu Gly Trp Phe Gln Lys Ser Val

435 440 445

Ala Asp Phe Ala Tyr Glu Thr Ala Leu Arg Lys Gln Ser Gly Glu Lys

450 455 460

Pro Val Ile Gly Val Asn Thr Met Val Asp Glu Ser Glu Val His Glu

465 470 475 480

Ile Glu Leu His Pro Tyr Asp His Thr Thr Ala Asp Arg Gln Ile Ala

485 490 495

Arg Thr Gln Arg Val Arg Arg Glu Arg Asp Asn Val Lys Val Ser Ala

500 505 510

Leu Leu Asp Arg Leu Val Glu Val Ala Lys Asp Glu Thr Gln Asn Ile

515 520 525

Met Pro Val Thr Ile Glu Leu Val Arg Glu Gly Ala Thr Met Gly Asp

530 535 540

Ile Val Glu Arg Leu Lys Thr Val Trp Gly Val Tyr Arg Glu Thr Pro

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Val Phe

<210>6

<211>135

<212>PRT

<213>自养黄色杆菌Py2

<400>6

Met Ala Gln Pro Ile Arg Val Leu Leu Ala Lys Val Gly Leu Asp Gly

1 5 10 15

His Asp Arg Gly Val Lys Val Val Ala Arg Thr Leu Arg Asp Ala Gly

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Met Asp Val Ile Tyr Ser Gly Leu His Arg Thr Pro Glu Glu Val Val

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Thr Ala Ala Val Gln Glu Asp Val Asp Ile Leu Gly Val Ser Leu Leu

50 55 60

Ser Gly Val Gln Leu Thr Val Phe Pro Lys Ile Phe Lys Leu Leu Ala

65 70 75 80

Glu Arg Gly Ala Asp Asp Leu Ile Val Ile Ala Gly Gly Val Met Pro

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Asp Glu Asp Val Val Ala Leu Lys Glu Leu Gly Val Lys Glu Val Met

100 105 110

Leu Gln Asp Thr Pro Pro Lys Ala Ile Val Glu Thr Leu Glu Arg Leu

115 120 125

Val Ala Glu Arg Gly Pro Arg

130 135

<210>7

<211>1689

<212>DNA

<213>自养黄色杆菌Py2

<400>7

tcagaacacc ggtgtttcgc gatacacgcc ccacaccgtc ttcagccgct ccacgatgtc 60

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caattcgatc tcatgcacct cgctttcgtc caccatggtg tttacgccga tcaccggctt 300

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ccagccttct tgaatcagct tgatggtgcc accgcgcgcg tccacctcgg agatgatgtc 420

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ttccgggttc ctggccccga agcgctcctt catgatcttg gcgtagcagc gccgcacggc 780

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cggggcgaag tcatccactt tcatgccggt cttcaacacc tcctccacat agacgatgag 900

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gcgcacgatg cgcacggaag gcgcgatggg atagatatat tccttctgcg ccatgtactc 1080

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cgccagcacg atatacatgg cgagcaggat ccacgcggac ggattgatgg tcatcgagac 1200

cgagatcttc tcgagatcga tcccgtcgaa cagcgcctcc atgtcggcga gcgtgtcgat 1260

ggccacgccc tcgcggccca cctcgccgtc gctcatcgga tggtcgctgt cgtaacccat 1320

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catgctcat 1689

<210>8

<211>408

<212>DNA

<213>自养黄色杆菌Py2

<400>8

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cggcatcacg ccgccggcga tcacgatgag gtcgtccgcg ccccgctcgg cgagcagctt 180

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<210>9

<211>563

<212>PRT

<213>类球红细菌 ATCC 17029

<400>9

Met Ser Asp Thr Phe Ser His Ala Arg Thr Asp Glu Ile Ala Gln Ala

1 5 10 15

Val Glu Asp Trp Glu Arg Thr Glu Val Ala Asp Phe Ile Ala Arg Ala

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Pro Glu Arg Lys Glu Gln Phe Tyr Thr Leu Gly Asp Phe Pro Val Lys

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Arg Thr Tyr Thr Ala Ala Asp Ile Ala Asp Thr Pro Leu Glu Asp Ile

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Gly Leu Pro Gly Lys Tyr Pro Phe Thr Arg Gly Pro Tyr Pro Thr Met

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Tyr Arg Gly Arg Asn Trp Thr Met Arg Gln Ile Ala Gly Phe Gly Thr

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Gly Glu Asp Thr Asn Lys Arg Phe Lys Phe Leu Ile Glu Gln Gly Gln

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Thr Gly Ile Ser Thr Asp Phe Asp Met Pro Thr Leu Met Gly Tyr Asp

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Ser Asp His Pro Met Ser Asp Gly Glu Val Gly Arg Glu Gly Val Ala

130 135 140

Ile Asp Thr Leu Ala Asp Met Arg Ala Leu Leu Asp Gly Ile Asp Leu

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Glu Lys Ile Ser Val Ser Leu Thr Ile Asn Pro Thr Ala Trp Ile Leu

165 170 175

Leu Ala Met Tyr Ile Ala Leu Cys Glu Glu Arg Gly Tyr Asp Leu Asn

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Lys Val Ser Gly Thr Val Gln Ala Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Met Ala

195 200 205

Gln Lys Glu Tyr Ile Phe Pro Ile Ala Pro Ser Val Arg Ile Val Arg

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Asp Ile Ile Ser His Ser Thr Arg Thr Met Lys Arg Tyr Asn Pro Ile

225 230 235 240

Asn Ile Ser Gly Tyr His Ile Ser Glu Ala Gly Ser Ser Pro Leu His

245 250 255

Glu Ala Ala Phe Thr Leu Ala Asn Leu Ile Val Tyr Val Glu Glu Val

260 265 270

Leu Lys Thr Gly Val Glu Val Asp Asp Phe Ala Pro Arg Leu Ala Phe

275 280 285

Phe Phe Val Cys Gln Ala Asp Phe Phe Glu Glu Ile Ala Lys Phe Arg

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Ala Leu Arg Arg Cys Tyr Ala Lys Ile Met Lys Glu Arg Phe Gly Ala

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Lys Lys Pro Glu Ser Met Arg Leu Arg Phe His Cys Gln Thr Ala Ala

325 330 335

Ala Ser Leu Thr Lys Pro Gln Tyr Met Val Asn Val Met Arg Thr Thr

340 345 350

Thr Gln Ala Leu Ala Ala Val Leu Gly Gly Ala Gln Ser Leu His Thr

355 360 365

Asn Gly Tyr Asp Glu Ala Phe Ala Ile Pro Thr Glu His Ala Met Gln

370 375 380

Leu Ala Leu Arg Thr Gln Gln Val Ile Ala Asp Glu Thr Gly Val Thr

385 390 395 400

Gln Val Val Asp Pro Leu Gly Gly Ser Tyr Phe Val Glu Ser Leu Thr

405 410 415

Asn Asp Tyr Glu Lys Lys Ile Phe Glu Ile Leu Asp Glu Val Glu Glu

420 425 430

Arg Gly Gly Ala Ile Lys Leu Ile Glu Glu Gly Trp Phe Gln Lys His

435 440 445

Ilc Ala Asp Phe Ala Tyr Glu Thr Ala Leu Arg Lys Gln Ser Gly Glu

450 455 460

Lys Pro Val Ile Gly Val Asn Arg Tyr Val Met Asp Glu Ser His Val

465 470 475 480

Lys Ile Glu Val His Pro Tyr Asp Glu Thr Thr Ala Lys Arg Gln Ile

485 490 495

Asp Arg Thr Arg Ser Val Arg Ala Gly Arg Asp Glu Ala Lys Val Gln

500 505 510

Ala Leu Leu Asp Glu Leu Val Ala Val Ala Arg Asp Glu Ser Ala Asn

515 520 525

Val Met Pro Val Thr Ile Gln Leu Val Lys Glu Gly Ala Thr Met Gly

530 535 540

Asp Ile Val Glu Lys Leu Lys Thr Ile Trp Gly Val Tyr Arg Glu Thr

545 550 555 560

Pro Val Phe

<210>10

<211>135

<212>PRT

<213>类球红细菌ATCC 17029

<400>10

Met Ser Thr Gln Ile Arg Val Leu Leu Ala Lys Val Gly Leu Asp Gly

1 5 10 15

His Asp Arg Gly Val Lys Val Val Ala Arg Thr Leu Arg Asp Ala Gly

20 25 30

Met Asp Val Val Tyr Ser Gly Leu His Arg Thr Pro Glu Glu Val Val

35 40 45

Thr Ala Ala Val Gln Glu Asp Val Asp Ile Leu Gly Val Ser Leu Leu

50 55 60

Ser Gly Val Gln Met Thr Val Phe Pro Lys Ile Phe Ala Leu Leu Lys

65 70 75 80

Glu His Lys Val Glu Asp Met Ile Val Val Ala Gly Gly Val Met Pro

85 90 95

Asp Glu Asp Val Ile Glu Leu Lys Lys Met Gly Val Ala Glu Val Leu

100 105 110

Leu Gln Asp Thr Pro Pro Gln His Ile Ile Asp Thr Leu Thr Gly Leu

115 120 125

Val Lys Ala Arg Gly Asp Arg

130 135

<210>11

<211>1692

<212>DNA

<213>类球红细菌ATCC 17029

<400>11

tcagaacacc ggcgtttcgc ggtagacgcc ccagatcgtc ttcagcttct cgacgatgtc 60

gcccatggtc gccccctcct tcacgagctg gatggtcacg ggcatcacgt tggcgctctc 120

gtccctggcg accgcaacga gttcgtcgag gagcgcctga accttggcct cgtcgcggcc 180

cgcgcgcacc gagcgcgtgc ggtcgatctg ccgcttggcg gtcgtctcgt cgtagggatg 240

gacctcgatc ttcacatggc tctcgtccat cacatagcgg ttcacgccga tcaccggctt 300

ctcgcccgac tgcttgcgca gcgccgtctc gtaggcgaag tcggcgatgt gcttctggaa 360

ccagccttcc tcgatcagct tgatcgcccc gccacgctct tccacctcgt cgaggatctc 420

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ctgcatcgca tgttcggtcg ggatggcgaa ggcctcgtca tagccgttcg tatggagcga 600

ctgcgcgccc cccagcaccg ccgccagcgc ctgggtcgtc gtgcgcatga cattgaccat 660

gtactgcggc ttggtgagcg aggccgccgc ggtctggcag tgaaagcgca ggcgcatcga 720

ctcgggtttc ttcgcgccga accgctcctt catgatcttg gcatagcagc ggcggagcgc 780

ccggaacttc gcgatctcct cgaagaagtc ggcctgacag acgaagaaga aggcgagccg 840

cggggcgaag tcgtcgacct cgacgccggt cttcagcacc tcctcgacat agacgatcag 900

gttggccagc gtgaaggcgg cctcgtgtag cggcgacgag cccgcttccg agatgtggta 960

gcccgagatg ttgatcgggt tgtagcgctt catcgtccgg gtcgagtggg agatgatgtc 1020

gcgcacgatg cggaccgagg gcgcgatcgg gaagatatat tccttctgcg ccatatattc 1080

cttgaggatg tcggcctgca ccgtgccgga caccttgttc aggtcgtagc cccgctcctc 1140

gcagagcgcg atatacatcg cgagcaggat ccaggcggtg ggattgatgg tcagcgagac 1200

cgagatcttc tcgagatcga tcccgtcgag cagcgcgcgc atgtcggcca gcgtgtcgat 1260

ggccacgccc tcgcggccca cctcgccgtc cgacatcgga tggtcgctgt cgtagcccat 1320

cagcgtcggc atgtcgaaat cggtcgagat gccggtctgg ccctgctcga tcaggaactt 1380

gaaccgcttg ttggtgtcct cgccggtgcc gaagcccgcg atctggcgca tggtccagtt 1440

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gatatcctcg agcggcgtgt cggcgatgtc ggcggccgtg taggtccgct tcaccgggaa 1560

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ctcggtgcgt tcccagtcct cgaccgcttg tgcgatctcg tcggtgcggg cgtgcgagaa 1680

ggtgtcagac at 1692

<210>12

<211>408

<212>DNA

<213>类球红细菌 ATCC 17029

<400>12

tcagcggtct ccccgcgcct tcaccagacc cgtgagggtg tcgatgatgt gctggggcgg 60

cgtgtcctgc agcagcacct cggccacgcc catcttcttc agctcgatca catcctcgtc 120

gggcatgacg ccccccgcga ccacgatcat gtcctcgacc ttgtgctcct tcagcagcgc 180

gaagatcttc ggaaagaccg tcatctgcac gcccgacagg aggctgacgc cgaggatgtc 240

cacatcctcc tgcaccgcgg ccgtcaccac ctcctccggg gtgcggtgga gaccggaata 300

gacgacatcc atcccggcat cgcgcagggt gcgggccacc accttcacac cgcggtcgtg 360

gccatcgagg ccaaccttcg cgagcagcac acggatctgg gtcgacat 408

<210>13

<211>569

<212>PRT

<213>类诺卡氏菌属物种JS614

<400>13

Met Ser Thr His Glu Ala Asp Ala Ile Lys Ile Thr Asn Glu Ala Ala

1 5 10 15

Val Lys Ala Ile Glu Glu Arg Leu Ala Gly Trp Glu Ser His Glu Leu

20 25 30

Glu Ala Phe Leu Gln Arg Thr Pro Glu Ser Lys Gly Val Phe Arg Thr

35 40 45

Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Arg Val Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Pro

50 55 60

Glu Asp Trp Asn Asp Ile Gly Leu Pro Gly Gln Phe Pro Phe Thr Arg

65 70 75 80

Gly Pro Tyr Pro Thr Met Tyr Arg Gly Arg His Trp Thr Met Arg Gln

85 90 95

Ile Ala Gly Phe Gly Gln Ala Glu Glu Thr Asn Lys Arg Phe Gln Tyr

100 105 110

Leu Ile Asn Gln Gly Gln Thr Gly Leu Ser Val Asp Phe Asp Met Pro

115 120 125

Thr Leu Met Gly Leu Asp Ser Asp Asp Pro Met Ser Leu Gly Glu Val

130 135 140

Gly Arg Glu Gly Val Ala Val Asp Val Leu Ser Asp Met Glu Ala Leu

145 150 155 160

Phe Asp Gly Ile Asp Leu Glu Asn Ile Ser Val Ser Met Thr Ile Asn

165 170 175

Pro Ser Ala Trp Ile Leu Leu Ala Met Tyr Ile Ala Val Ala Glu Asp

180 185 190

Lys Gly Tyr Asp Leu Asn Arg Leu Ser Gly Thr Ile Gln Asn Asp Ile

195 200 205

Leu Lys Glu Tyr Val Ala Gln Lys Glu Trp Ile Phe Pro Val Arg Pro

2l0 215 220

Ser Met Arg Ile Val Arg Asp Cys Ile Ala Tyr Cys Ala Glu Asn Met

225 230 235 240

Ala Arg Tyr Asn Pro Val Asn Ile Ser Gly Tyr Hi sIle Ser Glu Ala

245 250 255

Gly Ala Asn Ala Val Gln Glu Val Ala Phe Thr Met Ala Ile Thr Arg

260 265 270

Ala Tyr Val Ser Asp Val Ile Ala Ala Gly Val Asp Val Asp Thr Phe

275 280 285

Ala Pro Arg Leu Ser Phe Phe Phe Val Ser Gln Ala Asp Phe Phe Glu

290 295 300

Glu Ala Ala Lys Phe Arg Ala Val Arg Arg Phe Tyr Ala Lys Met Met

305 310 315 320

Arg Asp Glu Phe Gly Ala Glu Asn Glu Gln Ser Met Arg Leu Arg Phe

325 330 335

His Ala Gln Thr Ala Ala Ala Thr Leu Thr Lys Pro Gln Pro Met Asn

340 345 350

Asn Ile Ile Arg Thr Thr Leu Gln Ala Leu Ser Ala Ile Leu Gly Gly

355 360 365

Ala Gln Ser Leu His Thr Asn Gly Leu Asp Glu Ala Tyr Thr Ile Pro

370 375 380

Ser Glu Thr Ala Met Lys Ile Ala Leu Arg Thr Gln Gln Val Ile Ala

385 390 395 400

His Glu Thr Gly Val Pro Ser Ile Val Asp Pro Leu Gly Gly Ser Tyr

405 410 415

Tyr Val Glu Ala Leu Thr Asp Glu Ile Glu Thr Gly Ile His Asp Tyr

420 425 430

Leu Ala Lys Ile Glu Ser Leu Gl y GlyVal Val Ala Ala Ile Glu Asn

435 440 445

Gly Phe Met Gln Arg Glu Ile Ser Asp Thr Ala Tyr Gln Tyr Ala Leu

450 455 460

Arg Lys Glu Ser Gly Asp Arg Pro Val Leu Gly Val Asn Met Tyr Ile

465 470 475 480

Asp Glu Asn Ser Thr Glu Glu Ile Glu Thr His Gln Leu Asp Pro Glu

485 490 495

Ser Glu Gln Arg Gln Ile Arg Arg Val Gln Gln Val Arg Ala Glu Arg

500 505 510

Asn Ala Glu Thr Ala Gln Ala Ala Leu Ala Thr Leu Val Glu Thr Ala

515 520 525

Arg Asp Asn Asp Ala Asn Leu Met Pro Ala Thr Ile Ala Ala Val Arg

530 535 540

Ala Gly Leu Ser Met Gly Glu Ile Thr Gly Ala Leu Arg Asp Val Phe

545 550 555 560

GLy Thr Tyr Val Glu Thr Pro Val Tyr

565

<210>14

<211>164

<212>PRT

<213>类诺卡氏菌属物种JS614

<400>14

Met Trp His Thr Pro Gln Ala Asn Leu Gly Ala Pro Met Pro Leu Ser

1 5 10 15

Ala His Ser Asp Ile Asp Ala Gly Asp Thr Ala Pro Ile Arg Ile Met

20 25 30

Leu Ala Lys Ile Gly Leu Asp Gly His Asp Arg Gly Val Lys Val Val

35 40 45

Ala Arg Thr Leu Arg Asp Ala Gly Met Glu Val Val Tyr Thr Gly Leu

50 55 60

His Arg Ser Pro Glu Gln Val Leu Glu Ala Ala Val Gln Glu Asp Val

65 70 75 80

Asp Val Leu Gly Ile Ser Leu Leu Ser Gly Ala His Leu Thr Ile Phe

85 90 95

Gly Arg Leu Phe Thr Leu Ile Ala Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Arg Phe

100 105 110

Ala Val Val Ala Gly Gly Val Met Pro Asp Glu Asp Glu Arg Thr Leu

115 120 125

Ile Glu Leu Gly Val Ala Ala Val Leu Gly Gln Asp Thr Ala Pro Arg

130 135 140

His Ile Val Glu Val Val Thr Asp Ala Ala Asn Gln Ala Arg Asn Gln

145 150 155 160

Val Glu Ala Ser

<210>15

<211>1710

<212>DNA

<213>类诺卡氏菌属物种JS614

<400>15

tcagtacaca ggtgtctcga cgtaggttcc gaacacgtcg cgtagtgcac cggtgatctc 60

gcccatcgac agaccggctc ggacagcggc gatggttgcc ggcatgagat tggcgtcgtt 120

gtcgcgagct gtttcgacca gggttgcgag agctgcctgt gcggtctcgg cgttgcgctc 180

cgcacgtacc tgctgcacgc ggcggatctg gcgctgctcg gactcggggt cgagctggtg 240

tgtctcgatc tcttccgtcg agttctcatc gatgtacata ttgaccccaa gcacagggcg 300

gtcgccgctc tccttgcgga gcgcgtactg gtaggccgtg tctgagatct cgcgctgcat 360

aaagccgttc tcgatcgctg ctacgactcc accaaggctt tcgatcttgg ctagatagtc 420

gtgaattccc gtttcgatct catcggtaag tgcctcgacg tagtacgagc cgccgagggg 480

gtcgacaatg ctaggaacgc cagtctcatg tgcgatgacc tgctgggtgc gaagcgcgat 540

cttcatggcg gtttcgctcg ggatcgtgta cgcctcgtcg agaccgttgg tgtggagcga 600

ctgtgccccg cccaggattg ctgagagggc ttggagcgtc gtgcggatga tgttgttcat 660

gggttgtggc ttggtcagcg ttgccgctgc agtctgagcg tggaaccgga gccgcatgga 720

ctgttcgttc tcggctccga actcgtcgcg catcatcttg gcgtagaagc gccggacagc 780

cctgaacttt gcggcttcct cgaagaagtc agcctggctc acgaagaaga acgacagtcg 840

cggagcgaac gtgtcgacgt cgacgccggc cgcaatgacg tcactcacgt aggcgcgcgt 900

gatcgccatg gtgaaggcga cctcctgcac ggcgttcgcg ccggcttcgc tgatgtggta 960

cccgctgatg ttgaccgggt tataacgggc catattctca gcgcaataag cgatgcagtc 1020

tcggacaatg cgcatactcg gacgaaccgg gaagatccat tccttttggg cgacgtactc 1080

cttgaggatg tcgttctgaa tcgttccgct cagtcggttc aggtcgtagc ccttgtcttc 1140

ggctacagcg atgtacatgg ccagcaggat ccaggcagac gggttgatgg tcatcgacac 1200

ggagatgttc tccaggtcga ttccgtcgaa gagtgcctcc atgtcggaga gcacgtcgac 1260

ggcgactcct tcgcggccga cctctcccag actcatgggg tcgtcgctgt cgagacccat 1320

cagtgtgggc atgtcgaagt cgacggagag gcccgtctgt ccctggttga tgaggtactg 1380

gaagcgcttg ttggtctctt cggcttgacc gaatccggcg atctggcgca tcgtccagtg 1440

gcggccccgg tacatggtcg ggtaaggccc tcgcgtgaac gggaattgac ccggaagtcc 1500

gatatcgttc cagtcctcgg gaaggtcagc cggcgtgtag accctcttga cgggggcgcc 1560

gctgccagtg cggaacactc ccttcgactc tggcgtccgt tgcaagaatg cctcgagctc 1620

gtggctctcc caccctgcga gtcgttcctc gatggccttg acggcggcct cgttggtgat 1680

cttgatggcg tcggcctcgt gggtgctcat 1710

<210>16

<211>495

<212>DNA

<213>类诺卡氏菌属物种JS614

<400>16

tcacgaggcc tctacctggt tccgggcctg gttcgcggcg tcggtgacga cctcgacgat 60

gtggcgcggc gcggtgtcct ggccgaggac agcggcgaca cccagttcga tcagggtcct 120

ctcgtcctcg tcgggcatga cgccgccagc gacgacggca aatcgtggcg tgtagggaag 180

atctgcgatg agcgtgaaga gtcgaccgaa aatggtcagg tgtgctccgg agagcaggct 240

gatgccgagc acgtcgacgt cttcttgcac ggcggcttcg aggacctgct ctgggctgcg 300

gtgaaggccg gtgtagacga cctccatgcc ggcgtcacgc agtgtgcggg cgacgacctt 360

gacgcctcga tcgtgcccgt cgagaccgat cttagcgagc atgatgcgga tcggagcggt 420

gtcgcctgcg tcgatgtcgg agtgtgcgga cagcggcatg ggggctccta ggttggcctg 480

tggcgtgtgc cacat 495

Claims

1.由3-羟基羧酸酶促制备2-羟基-2-甲基羧酸的方法，其特征在于，将3-羟基羧酸在含水反应溶液中制备和/或加入到该反应溶液中，温育并作为酸或以其盐形式获得相应转化的2-羟基-2-甲基羧酸，所述反应溶液含有具有3-羟基-羧酸-CoA-变位酶-活性的单元，所述单元不但具有产生3-羟基羰基-CoA-酯的活性而且具有使3-羟基羰基-CoA-酯异构化的活性，所述具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性的单元为微生物或其粗提取物，所述微生物是保藏号为DSM18028的细菌菌株HCM-10。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性的单元包含经分离的钴胺素依赖性变位酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性的单元包括产生3-羟基羰基-CoA-酯的酶或酶体系。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用保藏号为DSM18028的细菌菌株HCM-10微生物，其产生或者包含钴胺素依赖性变位酶、具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性且不但具有产生3-羟基羰基-CoA-酯的活性而且具有使3-羟基羰基-CoA-酯异构化的活性，该微生物在含水体系中用于从3-羟基羧酸生成相应的2-羟基-2-甲基羧酸的转化。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

a)将具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶-活性的所述微生物在含水体系中用再生性原材料或由再生性原材料的利用产生的废物作为碳源和能量源进行培养，经此细胞内地合成3-羟基羧酸-CoA-硫酯并转化生成相应的2-羟基-2-甲基羧酸，所述微生物不但具有产生3-羟基羰基-CoA-硫酯的活性而且具有使3-羟基羰基-CoA-硫酯异构化的活性，和

b)使相应的2-羟基-2-甲基羧酸作为酸或以其盐形式分离。

6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述反应在添加外源3-羟基羧酸的情况下进行。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述微生物的全细胞不变地、渗透地或载体固定地使用。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，部分或完全地从微生物分离细胞提取物，并任选地以纯化的形式使用。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞提取物包含钴胺素依赖性变位酶和/或合成CoA-酯的酶。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，使用所述微生物的无细胞的粗提取物。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，为了在所述微生物的培养期间进行酶促反应，使用糖和/或醇和/或有机酸和/或烃或其衍生物作为碳源和能量源。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，使用具有叔丁基残基的底物作为碳源和能量源以用于培养。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，使用叔丁醇作为基础培养基中的唯一的碳源和能量源以用于培养。

14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，由糖和/或醇和/或有机酸和/或烃或其衍生物生成3-羟基羧酸和从3-羟基羧酸生成2-羟基-2-甲基羧酸的酶促反应以单一的方法步骤进行。

15.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在添加外源3-羟基丁酸的情况下进行2-羟基异丁酸的制备。

16.制备C2-C3-不饱和的异烯烃酸的方法，其特征在于，(a)通过权利要求1-15任一项所述的方法制备2-羟基-2-甲基羧酸；和(b)使根据步骤(a)制备的2-羟基-2-甲基羧酸脱水。

17.制备甲基丙烯酸的方法，其特征在于，(a)通过根据权利要求1-15任一项的方法制备2-羟基-2-甲基羧酸，其中所述2-羟基-2-甲基羧酸是2-羟基异丁酸；和(b)使2-羟基异丁酸脱水。

18.微生物株系HCM-10，其保藏号为DSM18028。