CN101448948A

CN101448948A - 微生物乙醇生产的增强

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Publication number: CN101448948A
Application number: CNA2007800185824A
Authority: CN
Inventors: ***·贾韦德; 纳姆达尔·巴格哈伊-亚兹迪
Original assignee: BIOCONVERSION TECHNOLOGIES Ltd
Current assignee: BIOCONVERSION TECHNOLOGIES Ltd
Priority date: 2006-03-24
Filing date: 2007-03-26
Publication date: 2009-06-03
Also published as: US20090226992A1; CA2681380A1; BRPI0709357A2; NZ571490A; AU2007231208B2; EP2007897A1; ES2396151T3; AP2458A; CU23771A3; JP2009529905A; ZA200808380B; EP2007897B1; MX2008012128A; AP2008004642A0; DK2007897T3; WO2007110606A1; GB0605890D0; AU2007231208A1; PL2007897T3; NO20084451L

Abstract

嗜热微生物缺乏乳酸脱氢酶活性，优选地包含有活性的丙酮酸甲酸裂合酶途径。所述嗜热微生物含有编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因。所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因优选地是所述耐热的NAD连接型甲酸脱氢酶编码基因的经密码子优化的形式。DNA构建体允许在所述嗜热微生物中稳定地表达所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因。这种DNA构建体基于使用实现稳定表达或重组的***序列，将编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因***到乳酸脱氢酶基因中，从而通过单一步骤实现基因敲除和获得新功能。这类微生物可用于糖发酵来生产乙醇。

Description

微生物乙醇生产的增强

技术领域

本发明涉及发酵过程和其中使用的微生物，特别是涉及微生物乙醇生产的增强。更具体地说，本发明涉及利用来源于生物质水解的混合糖由嗜热细菌(比如芽孢杆菌)生产乙醇的增强。特别地是，本发明设计了一种新的乙醇生产途径，这是通过将编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因克隆到微生物中，该微生物具有编码丙酮酸-甲酸裂合酶复合物但缺乏乳酸脱氢酶活性的功能基因。

背景技术

目前，生物乙醇从葡萄糖、麦芽糖或蔗糖来制取，这些糖来源于谷类淀粉、甘蔗或甜菜，它们都具有食用价值。纤维素和半纤维素形成了农业副产品的主要部分，原则上可以是低成本、可再生的生物乙醇的主要来源。然而，从纤维素来生成可发酵糖很困难而且昂贵。相比较而言，半纤维素几乎与纤维素一样丰富，而且易于水解，但是其产生的是以戊糖为主的混合物，而酵母菌无法发酵戊糖。

由于这个原因，Hartley(见国际公开号WO88/09379)提出在高达70℃的温度下由嗜热芽孢杆菌的突变体生产乙醇，这种嗜热细菌能够非常迅速地发酵来源于生物质的所有糖类。然而，只能在应激和濒死细胞中实现高乙醇产率。

许多微生物含有丙酮酸-甲酸裂合酶(pyruvate-formate lyase，PFL)途径，能够将丙酮酸转化为乙酰辅酶A和甲酸(图1A)。异乳酸发酵微生物是其中一类。这些微生物首先将输入糖转化为丙酮酸(通常通过糖酵解的EMP途径)，然后根据生长条件可通过多种途径产生不同比例的乳酸、甲酸、乙酸、乙醇和CO₂。

在完全需氧的细胞中，丙酮酸一般通过丙酮酸脱氢酶(PDH)途径、三羧酸循环和电子传递链被代谢为H₂O和CO₂。然而，在许多这类生物中，特别是嗜热芽孢杆菌中，糖摄入和糖酵解似乎不受调控，即使在有氧环境下，在高糖浓度时乳酸仍是主要产物。这说明，PDH流量已经饱和了，多出的丙酮酸被转到溢流的乳酸脱氢酶途径。这并不是用于生长，而是用于产热，结果导致环境温度升高并杀死嗜温(mesophilic)竞争者，正如新鲜草放在堆肥堆上时所见的情形。

如果ldh基因(编码乳酸脱氢酶)失活，例如WO 02/29030中所述，乳酸产生即停止，多出的丙酮酸主要被转入生长关联型PFL途径，(图1A)。但是，在糖浓度非常高和/或酸性PH值时，PFL途径流量下降，多出的丙酮酸溢出到厌氧PDH途径，该途径只产生乙醇和CO₂(图1B)。因此，获得高乙醇产量的优选条件是减少通过PFL途径的流量以及增加通过PDH途径的流量(Hartley，B.S.和Shama，G.Proc.Roy.Soc.Lond.321，555-568(1987))。不幸的是，在这种条件下，细胞将经受代谢应激，ATP产生随之减少，以及NAD/NADH和辅酶A/乙酰辅酶A比例的潜在失衡(图1C)。

已经提出各种不同的发酵方案以试图避免或尽量减少此问题，比如Hartley，B.S.所讨论的那些(见国际公开号WO88/09379)。

有两种类型的甲酸脱氢酶。一类(由fdhF基因编码)将甲酸转化为CO₂+H₂，典型代表是肠杆菌，如大肠杆菌E.coli。另一类(由fdh1基因编码)将甲酸和NAD转化为CO₂+NADH₂，其存在于许多兼性厌氧生物中。Berrios-Rivera等人(Metabolic Engineering 4，217-219(2002))用酵母菌fdh1基因替换E.coli中的fdhF基因，结果发现，相对于氧化产物如乙酸，还原的厌氧产物如乙醇、乳酸和琥珀酸增加。基于该观察结果，San，K-Y.Berrios-Rivers，S.J.和Bennett，G.N.等人(见国际公开号WO 2003/040690)提出将引入NAD连接型甲酸脱氢酶基因作为一般方法来增加细胞中的还原能力，其涉及广泛的生物转化。接着，San，K-Y.Bennett，G.N.和Sanchez，A.等人(美国专利申请US2005/0042736A1)提出了将这种概念用于生产琥珀酸的具体应用。这些研究在大肠杆菌中进行，这是一种典型的嗜温细菌，它的糖摄入是受调节的。这些实验研究的目的是为了增加细胞内NADH水平，从而为各种生物转化提供增强的还原能力。

Sen等人(2004)推荐的酵母菌甲酸脱氢酶在60℃时无活性，而对于生物乙醇生产中可能采用的嗜热细菌，这个温度是最低生长温度。目前为止发现的最耐热的甲酸脱氢酶是假单胞菌属101(Pseudomonas sp.101)酶(A.Rojkova，A.Galkin，L.Kulakova，A.Serov，P.Savitsky，V.Fedorchuk，V.Tishkov FEBS Letters，445卷，第1期，第183-188页，1999)。

发明内容

本发明试图解决从生物质生产高产量乙醇的问题。具体来说，本文首次描述了一种新的代谢途径，可以使嗜热微生物尤其是细菌(如芽孢杆菌)产生最大的乙醇产量。

本发明依靠缺乏乳酸脱氢酶活性并因此需要替代途径来重新氧化由糖酵解产生之过量NADH的微生物。通过将编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因(如fdh1基因)导入所述微生物来提供这种途径。与嗜温细菌如大肠杆菌不同，在嗜热微生物中糖摄入不受调节，这导致在存在高水平糖时的NADH积聚。这将最终导致代谢崩溃和所谓的“氧化还原死亡”，如图1C所示。将编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因导入所述微生物中，可以通过导致NADH水平降低和NAD水平升高辅助防止在高浓度糖时的细胞死亡。该过程部分是通过恢复经丙酮酸脱氢酶(PDH)途径的流量，但更重要的是，导入编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因为乙醇生产创建了一个新的途径，即丙酮酸甲酸裂合酶(PFL)-NAD连接型甲酸脱氢酶(FDH)途径。图1D显示了这种PFL-FDH途径恢复氧化还原平衡的潜力，这是通过将高糖水平存在时经快速糖酵解产生的所有丙酮酸转化为乙醇和二氧化碳实现的，尤其是在中性pH条件下。重要的是，这种途径在适合细胞生长的条件下工作，导致快速的乙醇产生和高产量，因为PFL途径是嗜热微生物中主要的生长连接型厌氧途径。

因此，在本发明的第一个方面中提供了一种缺乏乳酸脱氢酶(ldh)活性的微生物，特别是嗜热微生物，其特征在于，这种微生物(优选地嗜热微生物)含有编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因(fdh)。

在一个实施方案中，所述微生物通过适当的基因缺失或去除乳酸脱氢酶活性的其它突变而缺乏乳酸脱氢酶活性。因此，优选地缺失所述ldh基因或者以其它方式使之无功能。基因敲除和缺失的方法是本领域众所周知的，在此详细描述优选的实例。另外，缺乏乳酸脱氢酶活性的已知细菌株可以适用于本发明(例如保藏号为NCIMB 41075的TN-T9和保藏号为NCIMB 41115的TN-TK)。

本发明的微生物通常包含有活性的丙酮酸甲酸裂合酶途径。特别是，所述微生物优选含有编码丙酮酸甲酸裂合酶的基因，如pfl基因。本发明的微生物通常还包含有活性的丙酮酸脱氢酶(PDH)途径。

在一个优选的实施方案中，所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因被整合到嗜热微生物的基因组中。然而，无需整合例如通过导入合适的质粒也有可能实现稳定的表达。整合的一个优选方法是重组。编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因可以操作性连接到任何合适的调节元件，以指导NAD连接型甲酸脱氢酶的表达。“操作性连接”是指调节元件和编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因之间存在功能性连接。例如，编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因可以连接到合适的启动子上，例如所述启动子可以是组成型或诱导型启动子。“启动子”在本文中定义为包括参与RNA聚合酶结合以启动转录的DNA区域。通常，所述启动子是原核启动子，因此包含适当的-10和-35序列，其共有序列是本领域中明确定义的。该基因还可以操作性连接到其它合适的调节序列，如终止子。“终止子”定义为导致RNA聚合酶终止转录的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因从其自身启动子表达。在一个替代实施方案中，编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因从嗜热微生物的启动子表达(因为该基因整合到了基因组中的适当位置上)。还可以设想其它结构，其中由外来启动子驱动编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因表达。例如由此可以实现最大表达水平或诱导型表达。例如，可以利用噬菌体启动子如T7并联合合适的噬菌体聚合酶(它可以在分离的或同一DNA构建体中提供)。

在一个特别优选的实施方案中，所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因***作性连接到编码乳酸脱氢酶的基因的适当调节区，尤其是上游调节区。所述调节区优选地包含乳酸脱氢酶编码基因的启动子。该启动子可以定义为包含适当的-10和-35序列作为最小功能单元。因此，根据本发明的一个优选实施方案，所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因被***嗜热微生物的乳酸脱氢酶基因中，从而使嗜热微生物的乳酸脱氢酶活性失活。该实施方案是特别优选的，因为产生本发明嗜热微生物所需的两种修饰在同一步骤中完成。在此详细描述用于实现此目的的合适构建体。

通过嗜热细菌生产乙醇是有利的，因为它可以在高温下进行。尽管嗜热微生物比酵母菌对乙醇耐受力较低，但通过膜和/或轻度真空蒸发可将乙醇从高温发酵中连续且方便地移出。在适宜的厌氧生长条件下，芽孢杆菌LLD-R菌株在70℃时生长非常迅速，几乎完全通过PFL途径(Hartley和Shama，1982)。可以设想，通过新的PFL-FDH途径的生长可以同样旺盛，然而最大生长温度将受到导入嗜热微生物中NAD连接型甲酸脱氢酶耐热性的限制。由此，在一个优选的实施方案中，本发明的嗜热微生物并入了编码耐热的NAD连接型甲酸脱氢酶的基因和/或这种基因，其核苷酸序列已经密码子优化以促进由嗜热微生物表达。在此详细描述这种耐热的NAD连接型甲酸脱氢酶的生产。在一个具体实施方案中，所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因包含如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列、或者基本上由其组成或由其组成。在进一步的实施方案中，本发明的嗜热微生物并入了针对在芽孢杆菌中表达而优选了密码子的编码耐热的NAD连接型甲酸脱氢酶的基因，该基因包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列、或者基本上由其组成或由其组成。除了基本的耐热NAD连接型脱氢酶序列以外，该序列还包括启动子和终止子区以及Xba1位点，以便将该基因克隆到合适的DNA构建体中。

在更进一步的实施方案中，所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因是fdh1基因。所述fdh1基因可以来自任何合适的来源，优选地针对在相应的嗜热微生物中表达而进行了密码子优化。

可以通过用本文进一步详述的本发明的任何DNA构建体进行转化来产生本发明的嗜热微生物。由此，经适当修改，其中所作的讨论适用于本发明的该实施方案。

本发明的嗜热微生物可以是任何适于从生物质生产乙醇的微生物。所述嗜热微生物优选地是异乳酸发酵微生物。更优选地，所述嗜热微生物是嗜热细菌，更优选是芽孢杆菌属，甚至更优选是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。在一个实施方案中，本发明的嗜热微生物来自(嗜热脂肪芽孢杆菌的)已知菌株LLD-R或LLD-15。在另一个实施方案中，所述嗜热微生物是热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)。

本发明促进的发酵过程优选利用合成的NAD连接型甲酸脱氢酶，通过使用适当嗜热微生物如芽孢杆菌LLD-R菌株的密码子偏好，该脱氢酶被设计为表达耐热的氨基酸序列。所述合成基因优选地包含工程化的限制性位点，以帮助***乳酸脱氢酶基因中。从而通过单一操作实现缺失LDH途径并创建PFL-FDH途径。由此，在第二方面，本发明提供了耐热的NAD连接型甲酸脱氢酶。优选地，所述耐热NAD连接型甲酸脱氢酶在60℃或以上温度时仍然保留功能。优选地，所述耐热酶通过已针对在嗜热微生物中表达而优化了密码子的核苷酸序列来表达。在一个实施方案中，所述甲酸脱氢酶可以包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列、或者基本上由其组成或由其组成。

根据假单胞菌属物种101(Pseudomonassp 101)甲酸脱氢酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，并通过使用针对热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)优化了的密码子(下文将更详细讨论)，已经设计了一种特定的耐热的NAD连接型甲酸脱氢酶。技术人员将会理解，这种基本序列的衍生物将保持其功能性。例如，保守性和半保守性替换可以得到耐热的NAD连接型甲酸脱氢酶，这些衍生物也落入本发明的范围内，只要它们保留了有效的催化活性和耐热性，使得它们可以用于使用嗜热微生物的乙醇生产中。与之相似，较小的氨基酸缺失和/或添加可以产生保留适当功能的衍生物。

第三方面，本发明涉及编码耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的合成基因。该基因优选包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或者基本上由其组成或由其组成。该序列代表一个新的fdh基因序列，其中密码子针对产生耐热NAD连接型甲酸脱氢酶进行了优化。在一个更具体的实施方案中，所述编码耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的基因包含如SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列，或者基本上由其组成或由其组成。该序列引入了耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的编码区以及合适的芽孢杆菌启动子和rho-非依赖性终止子。该序列还引入了合适的限制性位点以帮助克隆，特别是Xba1位点。技术人员很容易理解，对所述核苷酸序列进行较小的修饰不会改变所得酶的功能或耐热性，例如，通过将优化密码子替换为在适当嗜热微生物的翻译***中优选的其它密码子。

本发明还涉及DNA构建体，其包含编码NAD连接型甲酸脱氢酶(特别是耐热的NAD连接型甲酸脱氢酶)的基因，其中该基因侧翼有限制性位点，以辅助将该基因克隆到合适的DNA构建体比如表达载体或质粒中。

在一个相关的方面，本发明还提供了一种DNA构建体，其包含操作性连接到编码耐热NAD连接型甲酸脱氢酶之基因上的调节序列。因此该DNA构建体促进嗜热微生物的转化，特别是那些缺乏乳酸脱氢酶活性的嗜热微生物的转化，以产生能够有效发酵而得到最大乙醇产量的嗜热微生物。如前所述，本文所用的术语“操作性连接”是指调节序列和编码NAD连接型甲酸脱氢酶基因之间的功能性连接，使得所述调节序列能够影响基因表达。例如，一种优选的调节序列是启动子。如前所述，所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因优选地包含如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列，或者基本上由其组成或由其组成。一种优选的调节序列是启动子，尽管该DNA构建体可以额外地引入合适的终止子序列。在一个具体实施方案中，所述启动子包含如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。如上所述，其它启动子可以用于高水平和/或诱导型表达。

在本发明的另一个方面，提供了一种包含编码NAD连接型甲酸脱氢酶之基因和***序列的DNA构建体，其中所述***序列有助于所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因整合到用该DNA构建体转化的嗜热微生物的基因组中。“***序列”是指可转位的DNA片段，它能够整合到适当嗜热微生物的基因组中。***序列还可以表示为***序列元件(IE)，并可以是天然存在的。在本发明的一个具体实施方案中，所述***序列来源于嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-R或LLD-15菌株。

在一个更具体的实施方案中，所述***序列包含如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，或者基本上由其组成或由其组成(图3)。所述优选的***序列可以通过用引物扩增产生，所述引物包含如SEQ ID NO：6和7所示的核苷酸序列，或者基本上由其组成或由其组成。在此情况下，来自已知嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-15菌株的基因组DNA可以作为模板使用。一个特别优选的DNA构建体是质粒pUB-ISF1(如下文试验部分及图5所述)。

在另一个方面，本发明涉及包含编码NAD连接型甲酸脱氢酶的(fdh)基因的DNA构建体，该基因操作性连接到编码乳酸脱氢酶基因的适当的调节区，特别是上游调节区。所述调节区优选地包含编码乳酸脱氢酶基因(ldh)的启动子。该启动子可以定义为包括适当的-10和-35序列作为最小功能单元，以使RNA聚合酶有效结合。所述乳酸脱氢酶基因启动子适于在嗜热微生物如芽孢杆菌中驱动高水平的表达，还可以有利地将其用作克隆策略的一部分，以在同一步骤中实现既缺失乳酸脱氢酶活性又导入NAD连接型甲酸脱氢酶活性。因此，该DNA构建体也可以定义为包含操作性连接到一种核酸分子的编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因，所述核酸分子包含编码乳酸脱氢酶(ldh)基因的启动子。

所述DNA构建体优选地还包含宿主乳酸脱氢酶基因之编码序列的一部分，其在编码NAD连接型甲酸脱氢酶基因的下游。这有利于在用该DNA构建体转化的微生物中进行基因整合。“至少一部分”意思是指该基因的一部分，其长度足以容许基因通过重组(优选经双交换(doublecross-over))整合到包含所述乳酸脱氢酶基因的微生物的基因组中。所述编码序列部分优选地引入所述乳酸脱氢酶基因的末端。在一个实施方案中，所述乳酸脱氢酶基因的至少100、200、300、400、500、600、700或750个核苷酸被引入到编码NAD连接型甲酸脱氢酶基因的下游。这样，在本发明的一个实施方案中，所述DNA构建体包含编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因，其中编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因的侧翼有来自编码乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列(来源于目标嗜热微生物)。所述侧翼序列具有足够的长度，足以容许将编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因整合到编码乳酸脱氢酶的宿主基因中，从而在单一克隆步骤中导入NAD连接型甲酸脱氢酶活性并敲除乳酸脱氢酶活性。优选地，编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因在上游侧翼至少有编码乳酸脱氢酶基因的启动子区，使得在经重组而整合之后所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因操作性连接所述启动子。在一个特别优选的实施方案中，所述乳酸脱氢酶基因的下游部分可以通过用引物扩增ldh基因而获得，其中所述引物包含如SEQ ID NO：8和9所示的核苷酸序列、或者基本上由其组成或由其组成，并使用LLD-R菌株作为模板。上游侧翼区优选引入了ldh启动子，其优选地包含适当ldh上游区域的至少100、200、300、400、500、600、700或750个核苷酸，以使通过与宿主基因组重组进行整合的效率最大化。该上游区域可以依赖于感兴趣的具体嗜热微生物中ldh基因的序列环境，技术人员很容易确定这种序列环境。由此，具有ldh基因序列知识的技术人员容易确定合适的侧翼区以允许经重组进行整合。例如，可以研究公开的基因组序列，进行测序反应，或使用来自ldh基因序列的引物通过PCR扩增侧翼区。这样，所述fdh基因便***到源自所述ldh基因的两个核苷酸序列之间，使得所述fdh基因读框一致地(in frame)替换了所述ldh基因的至少一部分。

这样一来，所述DNA构建体通常包含基因整合盒(gene integrationcassette)，其中目标基因(编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因)被***到整合期间待敲除基因(在此是乳酸脱氢酶基因)的编码序列(ORF)中。通过重组发生整合时，在被敲除基因的控制下实现了目标基因的表达。在为表达异源基因而需要敲除一个基因的情况下，这种构建体可能具有普遍适用性。在一个优选的实施方案中，所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因编码耐热的NAD连接型甲酸脱氢酶。因此，在此提供的关于耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的讨论经适当变动也可应用于本发明的这个方面。具体来说，在一个实施方案中，所述编码耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的基因包含如SEQ ID NO：1或2所示的核苷酸序列，或者基本上由其组成或由其组成。一种特别优选的DNA构建体是质粒pUCK-LF1(如下文试验部分和图8所述)。

对于本发明的所有DNA构建体，一种优选的形式是表达载体。这样，所述DNA构建体可以容许所述编码耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的基因在用该构建体转化的微生物中稳定表达。在一个特别优选的实施方案中，该DNA构建体是质粒。优选地，该DNA构建体只有在与宿主嗜热微生物基因组发生重组后才能在宿主嗜热微生物中进行复制。

本发明的DNA构建体优选地还并入合适的报告基因作为成功转化的指示。在一个实施方案中，报告基因是抗生素抗性基因，如卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。其它报告基因，如绿色荧光蛋白(GFP)和β-半乳糖苷酶(lacZ)可以被适当利用。如果适当，该DNA构建体可以整合多个报告基因。在随后的传代中，报告基因功能丧失指示了编码耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的基因与适当侧翼区的整合。

在另一个方面，本发明涉及包含本发明之DNA构建体的微生物。优选的受体微生物为异乳酸发酵微生物。特别的是，本发明优选涉及嗜热细菌，如芽孢杆菌属的细菌，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌。例如，所述细菌可以来自LLD-R或LLD-15菌株。在一个进一步的实施方案中，嗜热微生物是热葡糖苷地芽孢杆菌(Geobacilus thermoglucosidasius)。

在另一个方面，本发明涉及本发明的微生物或本发明的嗜热微生物在发酵中的应用，特别是在乙醇生产中的应用。

与之相似，本发明涉及用于乙醇生产的发酵方法，其包括为本发明的嗜热微生物或本发明的微生物供应糖。根据本发明构建的微生物尤其适合在适宜生长条件下的高乙醇产量和体积生产率(volumetricproductivity)。由此，本发明的任何微生物可以用于任何发酵罐类型中，诸如分批、补料(fed-batch)或连续发酵工艺。在一个优选的实施方案中，发酵工艺是补料型工艺。

使用诸如嗜热细菌的微生物生产生物乙醇的主要益处之一是，与酵母菌不同，它们能够发酵来源于农业废弃物的广泛的糖，如半纤维素。因此，在一个实施方案中，用于本发明发酵方法的糖来源于生物质。在另一个实施方案中，发酵是混合糖发酵。在一个具体实施方案中，所述混合糖包括戊糖，优选主要是戊糖。

在另一个实施方案中，所述发酵方法保持氧化还原平衡。这一点对于嗜热生物特别重要，因为与嗜温生物不同，这些微生物中糖摄入似乎是不受调控的。优选地，通过使用反馈传感器实现此点。

尽管嗜热细菌的乙醇耐受性低，但是在本发明的发酵方法中，通过定时或连续地移出乙醇可以方便地克服这个问题。这样确保发酵过程中保持乙醇浓度低于本发明的嗜热微生物或微生物的乙醇耐受浓度。通过蒸发或蒸馏，诸如膜和/或轻度真空蒸发，可以连续和方便地从高温发酵中移出乙醇。

接下来将参考下面非限制性说明和附图来描述本发明。

附图说明

图1显示了不同条件对嗜热微生物中代谢途径的影响，其中乳酸脱氢酶途径已经被失活。箭头的暗度和粗度指示各个代谢途径的相对优势。

A.在中性pH和低糖存在下活跃的代谢途径。此时，丙酮酸甲酸裂合酶途径占优。

B.在低pH和低糖存在下活跃的代谢途径。此时，厌氧的丙酮酸盐脱氢酶途径占优。

C.在低pH和高糖存在下活跃的代谢途径。此时，细胞遭受代谢应激并失去氧化还原平衡，导致所谓的“氧化还原死亡”。

D.在中性pH和高糖存在下在本发明嗜热微生物中活跃的代谢途径。此时，新的PFL-FDH途径占优，乙醇和二氧化碳是仅有的厌氧产物。

图2列出合成fdh基因的核苷酸序列，该基因已经过密码子优化以最大化其耐热性。fdh开放读码框的DNA序列的侧翼有启动子和终止子(斜体)区。启动子的-35和-10盒用下划线标出。为了在合适的载体中克隆该构建体，在该序列的两侧都引入了Xba1位点。

图3显示嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-15菌株的***序列(IS)的核苷酸序列。9bp的反向重复末端用粗体显示。

图4是pCR-Blunt衍生质粒pCR-F1的图示。该质粒包含在ldh启动子控制下的经密码子优化的fdh1基因，该基因在独有Xba1位点克隆到pCR-Blunt中。

图5是pUB110衍生质粒pUB-ISF1的图示。该质粒包含来源于pCR-F1质粒的在ldh启动子控制下的经密码子优化的fdh1基因，还包含来源于已知芽孢杆菌LLD-15菌株的***序列(IS)。

图6是pUC18衍生质粒pUCK的图示。该质粒包括卡那霉素抗性基因，它从质粒pUB110克隆到pUC18中的独有Zra1限制性位点。

图7是pUCK衍生质粒pUCK-LC的图示。该质粒携带一个ldh基因，该基因在ORF中间缺失363bp。

图8是pUCK衍生质粒pUCK-IdhB的图示。该质粒包含ldh基因的750bp，包括该基因的下游区域。

图9是pUCK-LF1质粒的图示。该质粒是pUCK衍生物，并入了在ldh启动子控制下的含fdh基因的基因整合盒。

发明详述

材料

培养基和缓冲液

LB培养基：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl10g；去离子水加至lL

调整pH值至7，高压灭菌

对于平板培养基，在高压灭菌之前将20g/l的琼脂加入培养基中，冷却至55℃，然后倒入无菌皮氏培养皿中(大约20ml/板)。

对于LB-amp平板，倒入皮氏培养皿之前加入过滤除菌的氨苄青霉素溶液，使最终浓度达到50μg/ml。

SOC培养基：胰蛋白胨2.0g；酵母提取物0.5g；NaCl0.05g；MgCl₂·6H₂O0.204g；

MgSO₄·7H₂O0.247g；葡萄糖0.36g；去离子水加至100ml。

溶解，调整pH值至7.0，过滤除菌。

TGP培养基：胰蛋白胨17g；大豆蛋白胨3g；K₂HPO₄ 2.5g；NaCl5g；丙酮酸钠4g；甘油4ml；去离子水加至1L。调整pH值至7，然后高压灭菌。

对于平板培养基，在高压灭菌之前将20g/l的琼脂加入到培养基中，冷却至55℃，然后倒入无菌皮氏培养皿中(大约25ml/板)。

对于TGP-kan平板，倒入皮氏培养皿之前加入过滤除菌的卡那霉素溶液，使最终浓度达到10μg/ml。

TH缓冲液：海藻糖272mM；HEPES(用KOH调至pH7.5)8mM；双蒸水加至1L

微生物菌株

大肠杆菌(E.coli)DH5-α-化学感受态细胞，购自Invitrogen(Cat.18265-017)。

枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)—德国培养物保藏中心，DSMZ(DSM No.10)

嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus.)LLD-R菌株—保藏号NCIMB 12403

嗜热脂肪芽胞杆菌LLD-15菌株—保藏号NCIMB 12428

质粒

质粒pCR-Blunt和pCR-TOPO2来自Invitrogen

质粒pUB110—携带该质粒的枯草芽孢杆菌BD170菌株来自德国培养物保藏中心DSMZ(DSM No.4514)。

质粒pUC18来自Sigma-Aldrich。

实施例1.合成甲酸脱氢酶基因的构建(图2)

假单胞菌101(Pseudomonas 101)甲酸脱氢酶的氨基酸序列(NCBI蛋白质数据库登记号P33160-SEQ ID NO：3)通过针对热葡糖苷酶地芽孢杆菌进行密码子优化而反向翻译为DNA序列。在翻译序列的上游和下游分别添加来自芽孢杆菌菌株的启动子和rho-非依赖型终止子区(图2)。该新序列与已知fdh基因序列相似性低于40％(与已知fdh1基因的一致性为37％)。该构建体的两侧都设计了Xba1位点，以协助克隆到合适的载体中。

采用Gao等人的方法(见Xinxin Gao，Peggy Yo，Andrew Keith，Timothy J.Ragan和Thomas K.Harris(2003).Nucleic Acids Research，31(22)，e143)合成需要的序列，并克隆到pCR-Blunt中的独特Xba1位置。所得载体pCR-F1(图4)导入大肠杆菌DH5α细胞中，通过PCR和限制性分析验证阳性克隆。

在靶标芽孢杆菌的基因组中***和表达此合成fdh基因有两种替代策略可供应用，如以下实施例所示。

实施例2.将fdh基因***多个(IS)位点

该策略适用于一些菌株，如嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-R菌株，它们含有经常在多个***位点重组的***序列(IS)。预期携带fdh基因和该IS序列的载体将在一个或多个这样的位置稳定地整合。

质粒pUB-ISF1的构建(图5)

首先，以嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-15为模板，使用正向引物(AGTACTGAAATCCGGATTTGATGGCG-SEQ ID NO：6)和反向引物(AGTACTGCTAAATTTCCAAGTAGC-SEQ ID NO：7)PCR扩增LLD-R菌株的已知***序列(SEQ ID NO：5和图3)。在该序列两端都引入Sca1限制位点。PCR产物首先克隆到质粒pCR-TOPO2.1中，然后将所得质粒pCR-IS导入大肠杆菌DH5α细胞，并用于通过Sca1限制性消化作用分离所述IS区。然后，将分离的IS克隆到pUB110中的独特Sca1位点上，将所得质粒pUB-IS导入枯草芽孢杆菌。

然后使用Xba1限制酶从pCR-F1质粒中消化得到包含ldh启动子和fdh基因的1.5kb片段，然后将其克隆到已经用相同酶线性化的质粒pUB-IS中。然后将所得质粒pUB-ISF1(图5)导入枯草芽孢杆菌中，在TPG-kan平板上选择阳性克隆，并通过PCR和限制性分析验证阳性克隆。

fdh基因整合到LLD-R菌株中

然后将质粒pUB-ISF1在体外用HaeIII甲基化酶进行甲基化，然后用甲基化的pUB-ISF1质粒转化嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-R菌株或其ldh缺失菌株(见实施例3)的细胞。在50℃在TGP-kan平板上48小时后选择阳性克隆，并通过fdh基因的PCR扩增进行分析。

通过将转化克隆在60-65℃在TGP-Kan培养基中生长几代并在TGP-Kan平板上选择，将fdh基因整合到染色体中。分析阳性克隆以确认存在fdh基因，然后在摇瓶和发酵罐中针对乙醇生产以及C5(戊糖)和C6(己糖)利用来筛选所述阳性克隆。

实施例3.ldh-缺失菌株的构建。

第一步是将芽孢杆菌卡那霉素抗性标记(kan)和嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-R菌株ldh基因的基因盒克隆到质粒pUC18中，该质粒只能在革兰氏阴性微生物中复制。

芽孢杆菌克隆载体质粒pUCK的构建(图6)。

卡那霉素抗性基因(kan)克隆到质粒pUC18中的独特Zra1位点，该位点位于质粒中任何编码区和报告基因(lacZ)之外。为了克隆kan基因，使用质粒pUB110为模板，用以下引物经PCR扩增含卡那霉素抗性基因的1.13kb片段：

kan-Bs Z-F(ACACAGACGTCGGCGATTTGATTCATAC-SEQ ID NO：10)和

kan-Bs Z-R(CGCCATGACGTCCATGATAATTACTAATACTAGG-SEQ ID NO：11)。

通过引物将Zra1位点导入kan基因的两端。然后，PCR产物用Zra1限制性核酸内切酶进行消化，并与先前经Zra1消化并去磷酸化的质粒pUC18相连接。然后将所得质粒pUCK(图6)导入大肠杆菌DH5α细胞。在LB-amp平板上选择阳性克隆，并通过PCR和限制性分析确认阳性克隆。

携带缺失ldh基因的质粒pUCK-LC(图7)的构建

设计长度为1.36kb的ldh基因盒，其中含有LLD-R菌株的整个ldh基因，从中缺失掉其ORF的363bp并附加侧翼。使用LLD-R菌株为模板，通过PCR扩增ldh基因的上区和下区来构建该基因盒。然后连接这些区域被并克隆到质粒pUCK中。BglII位点导入到内部引物中。用以下引物PCR扩增所述上区：

LC-U-F1(AGGGCAATCTGAAAGGAAGGGAAAATTCC-SEQ ID NO：12)和

LC-UB-R1TGCACAGATCTCCACCAAATCGGCGTC-SEQ ID NO：13)。

用以下引物PCR扩增所述下区：

LC-DB-F1(TTGAGCAGATCTTGATGCAAAACGATAAC-SEQ ID NO：14)和

LC-D-R1(TAAAGCCGATGAGCAGCAGTTGAAG-SEQ ID NO：15)。

PCR产物使用BglII限制性核酸内切酶进行消化，并使用T4DNA连接酶进行连接。然后用连接产物作为模板，用以下引物PCR扩增ldh基因盒：

LC-UX-F2(ATATTATCTAGACATTACGGAAATGATAATGGC-SEQ ID NO：16)和

LC-DX-R2(TCACAATCTAGACAATCGGCCATAAAC-SEQ ID NO：17)。

通过引物在所述基因盒两侧引入XbaI位点。然后用XbaI酶消化PCR产物并克隆到用相同酶预消化和去磷酸化的质粒pUCK中。然后将所得质粒pUCK-LC导入大肠杆菌DH5α中。在LB-amp平板上选择阳性克隆，并通过PCR和限制分析确认。

ldh缺失菌株的构建

质粒pUCK-LC在体外用HaeIII甲基化酶进行甲基化，并将甲基化质粒通过电穿孔(1000V，201欧姆，25微法和5毫秒)转化到野生型嗜热细胞(如LLD-R菌株)中。在65℃在TPG-Kan平板上选择阳性克隆，通过kan基因的PCR扩增确认单交换事件。

为了通过双交换实现基因缺失，将阳性克隆在TGP培养基上生长几代(约5次传代)，选择能在TGP平板上生长但不能在TGP-kan平板上生长的克隆。然后通过PCR分析确认阳性克隆为ldh基因缺失并且没有卡那霉素基因。然后在摇瓶和发酵罐中表征这些克隆的乙醇生产以及C5和C6糖利用。

实施例4.同时***fdh基因和缺失ldh基因。

这个替代策略可广泛应用于宽范围类型的异乳酸发酵微生物以及嗜热芽孢杆菌，然而将使用后者作为举例说明。

质粒pUCK-LF(图9)的构建

将包含fdh基因加上整个ldh基因以及约300bp的上游和下游侧翼区的基因整合盒克隆到质粒pUCK中。在这个构建体中，ldh开放读码框的前450bp被替换为fdh基因，使得该基因的表达受ldh基因启动子的控制。

为了达到此目的，使用LDHB-X-F1(GAACGATTCTAGATACAGCAAGATTCCGC-SEQ ID NO：8)和LDHB-E-R1(GTTTGCGAATTCATAGACGGACGCAG-SEQ ID NO：9)作为引物以及嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-R菌株作为模板经PCR扩增含有ldh基因下游区的约750bp的DNA片段。将Xba1和EcoR1位点导入该PCR片段的末端。然后消化该PCR片段并定向克隆到质粒pUCK中Xba1和EcoR1位点之间。将所得质粒pUCK-ldhB(图8)导入大肠杆菌DH5α，在LB-amp平板上选择阳性克隆，并通过PCR和限制性分析确认。

然后，使用Xba1限制酶从pCR-F1质粒中消化得到含有ldh启动子和fdh基因的1.5kb片段，并将其克隆到已预先用相同酶线性化的质粒pUCK-ldhB(图8)中。将所得质粒pUCK-LF1(图9)导入大肠杆菌DH5α细胞，在LB-Amp平板上选择克隆。通过PCR和限制性分析确认阳性克隆和该构建体的正确定向。

通过新PFL-FDH途径生产乙醇的菌株的构建。

质粒pUCK-LF1在体外用HaeIII甲基化酶进行甲基化，用甲基化质粒转化野生型靶细胞(如LLD-R菌株细胞)，并在60℃在TPG-Kan平板上进行选择。阳性克隆代表单交换事件，并通过fdh基因的PCR扩增来确认。

为了实现双交换基因整合，选择在TGP平板上生长但不在TGP-kan平板上生长的克隆。然后确认阳性克隆中存在fdh基因并且缺少卡那霉素基因。最后，在摇瓶和发酵罐中根据乙醇生产以及C5和C6糖利用来筛选这些克隆。

所有参考资料均以其全部内容并入本文。

序列表

<110>生物转化技术有限公司

<120>微生物乙醇生产的增强

<130>P86806WO00

<150>GB 0605890.3

<151>2006-03-24

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1170

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的fdh基因

<400>1

<210>2

<211>1558

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的fdh基因，包括启动子和终止子

<400>2

<210>3

<211>401

<212>PRT

<213>假单胞菌属物种101

<400>3

<210>4

<211>307

<212>DNA

<213>嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-R菌株

<400>4

<210>5

<211>3006

<212>DNA

<213>嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-R菌株

<400>5

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

<210>17

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

Claims

1.缺乏乳酸脱氢酶活性的嗜热微生物，其特征在于所述嗜热微生物包含编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因。

2.权利要求1的嗜热微生物，其表达丙酮酸甲酸裂合酶。

3.权利要求1或2的嗜热微生物，其中所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因整合到所述嗜热微生物的基因组中。

4.权利要求1至3中任一项的嗜热微生物，其中所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因从其自身启动子或从所述嗜热微生物的启动子表达。

5.权利要求1至4中任一项的嗜热微生物，其中所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因***到所述嗜热微生物的乳酸脱氢酶基因中，从而灭活所述嗜热微生物的乳酸脱氢酶活性。

6.权利要求1至5中任一项的嗜热微生物，其中所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因编码耐热的NAD连接型甲酸脱氢酶。

7.前述任一项权利要求的嗜热微生物，其中所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因包含如SEQ ID NO：1或2所示的核苷酸序列。

8.前述任一项权利要求的嗜热微生物，其已被包含调节序列的DNA构建体所转化，所述调节序列操作性连接至编码耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的基因，所述编码耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的基因包含如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。

9.权利要求1至7中任一项的嗜热微生物，其已被包含编码NAD连接型甲酸脱氢酶基因和***序列的DNA构建体所转化，其中所述***序列促进所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因整合入被该DNA构建体转化的所述嗜热微生物的基因组中。

10.权利要求1至7中任一项的嗜热微生物，其已被包含编码NAD连接型甲酸脱氢酶之基因的DNA构建体所转化，所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因操作性连接到编码乳酸脱氢酶基因的上游区，其中所述上游区包含启动子。

11.权利要求10的嗜热微生物，其中在所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶基因的下游，所述DNA构建体还包含编码所述乳酸脱氢酶基因的至少一部分，使得所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因介于在任一侧上所述乳酸脱氢酶基因的充分部分之间，以促进将所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因通过与乳酸脱氢酶基因重组而整合到所述嗜热微生物的基因组中。

12.前述任一项权利要求的嗜热微生物，其是嗜热细菌。

13.权利要求12的嗜热微生物，其属于芽孢杆菌属。

14.权利要求13的嗜热微生物，其是嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)或热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)。

15.权利要求14的嗜热微生物，其中所述的嗜热脂肪芽胞杆菌来源于菌株LLD-R或LLD-15。

16.编码耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的基因，其包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

17.包含调节序列的DNA构建体，所述调节序列操作性连接到编码耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的基因，所述编码基因包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

18.权利要求17的DNA构建体，其中所述调节序列是启动子。

19.权利要求18的DNA构建体，其中所述启动子包含如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

20.包含编码NAD连接型甲酸脱氢酶基因和***序列的DNA构建体，其中所述***序列促进将编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因整合入用该DNA构建体转化的嗜热微生物的基因组中。

21.权利要求20的DNA构建体，其中所述***序列来源于嗜热脂肪芽胞杆菌菌株LLD-R或LLD-15。

22.权利要求21的DNA构建体，其中所述***序列包含如SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列。

23.权利要求22的DNA构建体，其中所述***序列通过用引物扩增而产生，所述引物包含如SEQ ID NO：6和7所示的核苷酸序列，并以嗜热脂肪芽胞杆菌菌株LLD-15为模板。

24.包含编码NAD连接型甲酸脱氢酶基因的DNA构建体，所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因操作性连接了编码乳酸脱氢酶的基因的上游区，其中所述上游区包含启动子。

25.权利要求24的DNA构建体，其中在所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶基因的下游，所述DNA构建体还包含所述乳酸脱氢酶基因的至少一部分，使得所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因介于在任一侧上所述乳酸脱氢酶基因的充分部分之间，以促进将所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因通过与乳酸脱氢酶基因重组而整合到嗜热微生物的基因组中。

26.权利要求17至25中任一项的DNA构建体，其中所述编码NAD连接型甲酸脱氢酶的基因是编码耐热的NAD连接型甲酸脱氢酶的基因。

27.权利要求26的DNA构建体，其中所述编码耐热NAD连接型甲酸脱氢酶的基因包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

28.权利要求17至27中任一项的DNA构建体，其是表达载体。

29.权利要求17至28中任一项的DNA构建体，其是质粒。

30.包含权利要求17至29中任一项所定义之DNA构建体的微生物。

31.权利要求30的微生物，其是嗜热细菌。

32.权利要求31的微生物，其属于芽孢杆菌属。

33.权利要求32的微生物，其是嗜热脂肪芽胞杆菌或热葡糖苷酶地芽孢杆菌。

34.权利要求1至15任一项的嗜热微生物或权利要求30至33任一项的微生物用于生产乙醇的用途。

35.用于生产乙醇的发酵方法，其包括为权利要求1至15任一项的嗜热微生物或权利要求30至33任一项的微生物供应糖。