CN101441218B - 一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的甲胎蛋白(afp)的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用CdTe量子点和Fe₃O₄-Dextran纳米颗粒检测血清中AFP含量的方法，其特征在于其步骤包括(a)Fe₃O₄-Dextran-第一抗体复合物的制备(b)CdTe-第二抗体复合物的制备(c)绘制“荧光强度-AFP浓度”标准工作曲线，算出工作方程；(d)测定所得荧光强度数值带入工作方程得到肝癌病人AFP的含量。该方法检测手段简单，灵敏度高，可以让很多癌症初期的病人较简易地检测到病情，并及时采取治疗手段，为肝癌的临床检测开辟了一条崭新的道路。

Description

一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的甲胎蛋白(AFP)的检测方法

技术领域

本发明涉及临床检测领域，具体涉及一种利用CdTe量子点和Fe₃O₄-Dextran纳米颗粒检测血清中AFP含量的方法。

背景技术

原发性肝癌作为我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势，已成为我国第二位癌症杀手。甲胎蛋白AFP属于胚胎性蛋白，主要由胚胎时期的肝细胞和卵黄囊产生，出生后浓度即迅速下降，数月至一年内接近成人水平＜20ng/ml。AFP是诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物，具有确立诊断、早期诊断、鉴别诊断的作用。一般认为：测定血清中AFP阳性或定量＞400毫微克/毫升、＞200毫微克/毫升，持续8周，而谷丙转氨酶正常，并排除妊娠和生殖腺胚胎瘤，原发性肝癌的诊断确立。目前常用的AFP定量的方法有酶标法、酶标电泳法、放射免疫法检测。但酶不稳定、放射性物质设备要求高，且危害较大。

Fe₃O₄是一种重要的铁的氧化物，是应用最为广泛的软磁性材料之一。以磁流体形式存在的Fe₃O₄纳米粒子在液体中具有一般的液体属性和顺磁性，在外加磁场的情况下，能发生定向移动。并且Fe₃O₄纳米粒子经过表面修饰能够和多种生物分子相连接，在外加磁场的作用下，能够实现这些生物分子的固定化或者纯化。

CdTe量子点是一种荧光半导体纳米晶，量子点具有强度高、稳定性好、能够用一种波长的光源激发多种波长、发射波长随着粒径的增大而有规律地红移等荧光特性。水相合成的CdTe量子点亲水性好，经过表面修饰以后，能够和多种生物分子相互作用。

本发明通过使用特殊处理的半导体量子点来代替通常的时间分辨发光免疫分析方法中发光体——稀土离子鳌和物和使用磁分离纯化，来解决该免疫分析法的背景光干扰、选择性不好等问题，从而富集目标物，来显著简化甲胎蛋白(AFP)的检测过程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有免疫分析法测定AFP中背景光干扰、选择性不好以及操作繁琐、灵敏度不高的缺点，提供一种利用CdTe量子点和Fe₃O₄-Dextran纳米颗粒检测血清中AFP含量的方法。

本发明提供的一种利用CdTe量子点和Fe₃O₄-Dextran纳米颗粒检测血清中AFP含量的方法包括下列步骤：

(a)Fe₃O₄-Dextran-第一抗体复合物的制备：

利用共沉淀方法制备表面包覆了Dextran的Fe₃O₄，并将抗人甲胎蛋白抗体连接到Fe₃O₄-Dextran上形成Fe₃O₄-Dextran-第一抗体复合物；

(b)CdTe-第二抗体复合物的制备：

利用水热法制备CdTe量子点，并将羊抗人抗体连接到CdTe上，形成CdTe-第二抗体复合物；

(c)绘制“荧光强度-AFP浓度”标准工作曲线，算出工作方程；

(d)测定所得荧光强度数值通过工作方程得到肝癌病人AFP的含量。

步骤(a)所述的Fe₃O₄-Dextran-第一抗体复合物的制备具体包括如下步骤：

(2)共沉淀方法制备Fe₃O₄-Dextran颗粒：

将1g Dextran溶于2ml超纯水中，抽真空20min后充氮气20min，将Fe³⁺盐和Fe²⁺盐溶于3.4ml超纯水中并将其倒入到溶解有Dextran的水中，再向其中加入过量的浓氨水得到黑色的沉淀，结合磁分离用去离子水反复洗涤沉淀多次。所述的Fe³⁺盐可为水合FeCl₃，所述的Fe²⁺盐可为水合FeSO₄、FeCl₂，Fe³⁺盐与Fe²⁺盐摩尔比为2∶1，所述氨水浓度为25％。

(3)Fe₃O₄-Dextran-第一抗体复合物的制备

在Fe₃O₄-Dextran中加入过量的KIO₃，再将磁性粒子分散在pH8.4的硼酸缓冲液中，然后加入抗人甲胎蛋白抗体于4℃下保存过夜。然后加入5％的BSA封闭磁性纳米颗粒表面多余活性位点，形成“Fe₃O₄-Dextran-第一抗体”复合物。所述抗人甲胎蛋白抗体可为鼠抗人甲胎蛋白抗体、兔抗人甲胎蛋白抗体。

步骤(b)所述的制备CdTe-第二抗体复合物的步骤具体如下：

(1)水热法制备CdTe量子点：

在饱含N₂的超纯水中，分别加入5％Na-citrate、0.04mol/L CdCl₂·2.5H₂O、0.01mol/LNa₂TeO₃、50mg稳定剂L-cysteine和50mg NaBH₄，在100℃下煮沸1h。所述CdCl₂与Na₂TeO₃的摩尔比为6∶1。

(2)CdTe-第二抗体复合物的制备：

将CdTe加入到溶解有羊抗人的pH6.0的乙酸缓冲液中，形成“CdTe-第二抗体”复合物。

步骤(c)所述的绘制“荧光强度-AFP浓度”标准工作曲线和计算工作方程的步骤具体如下：

(1)分别取300μl的“Fe₃O₄-Dextran-第一抗体”与0、10、20、30、40、50、60ng的抗原混合，在室温下反应30min；

(2)结合磁分离，将步骤(1)中的各个微型离心管样品用pH6.0的醋酸缓冲溶液洗涤2次，然后定溶到1.0ml，然后分别加入“CdTe-第二抗体”复合物200μl，室温下反应30min；

(3)结合磁分离，用pH6.0的醋酸缓冲溶液小心洗涤2次，然后用pH8.4的硼酸缓冲溶液定溶到1ml，测荧光；

(4)根据抗原浓度和558nm处的荧光强度关系，绘制“荧光强度-AFP浓度”标准工作曲线；

(5)根据步骤(4)的工作曲线，算出工作方程： $Y=\frac{1}{V}(X+4.5),$ 式中Y为AFP的浓度，单位为ng/ml，V所采取的血样的体积，单位为ml，X为三明治复合物在558nm处的荧光强度，单位为a.u.。

本发明通过使用磁分离纯化和用特殊处理的半导体量子点来代替通常的时间分辨发光免疫分析方法中的稀土离子鳌和物的方法，解决该免疫分析法的背景光干扰、选择性不好等问题，从而富集目标物，可以显著简化甲胎蛋白(AFP)的检测手段，这种检测手段简单，并且灵敏度高，可以让很多癌症初期的病人较简易地检测到病情，并及时采取治疗手段，为肝癌的临床检测开辟了一条崭新的道路。

附图说明

图1为实施例1所制得的CdTe量子点的荧光和紫外吸收；

图2为实施例1所绘制的“荧光强度-AFP浓度”标准工作曲线；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

Fe₃O₄-Dextran的制备：

1.称取1g的Dextran T40，溶解于2ml超纯水中，抽真空20min，N₂饱和20min；

2.称取90mg的FeCl₃·6H₂O和154mg的FeSO₄·7H₂O，溶解于3.4ml超纯水中，抽真空20min，N₂饱和20min；

3.将步骤1和2做得产物混合，置于60℃水浴中，加磁子搅拌，滴入0.6ml的浓氨水，反应15min；

4.结合磁分离，用超纯水清洗数次。

CdTe量子点制备：

1.将40mL超纯水中先抽真空20min再充入氮气20min。

2.在磁力搅拌下，依次加入2mL 5％Na-citrate溶液，4mL 0.04mol/L CdCl₂·2.5H₂O溶液，4mL 0.01mol/L Na₂TeO₃溶液，50mg L-cysteine和50mg NaBH₄。

3.磁力搅拌反应5分钟形成清亮的绿色溶液。在100℃沸水浴中回流1h，即制备出CdTe量子点。

“Fe₃O₄-Dextran-第一抗体”复合物的制备：

1.取2mlFe₃O₄-Dextran加入过量的KIO₃，室温黑暗条件下磁力搅拌5h，磁子表面Dextran的-OH被氧化成-CHO，后磁分离将其洗干净；

2.将固体Fe₃O₄-Dextran分散在pH8.0的硼酸缓冲液中，然后将1mgl/ml的兔抗人抗体加入其中，4℃条件下过夜，这样抗体就和Fe₃O₄-Dextran结合在一起了；

3.再加入200μl、5％的BSA，在4℃条件下过夜，没有参加反应的基团就被封闭了；“CdTe-第二抗体”复合物的制备：

1.取取1.5ml的QDs原液，加pH6.0的HAc-NaAc缓冲液3.5ml，得到4ml、3×10^-4mol/的CdTe(两者体积比例为3∶5)；

2.取1500μl、0.3mM的CdTe与90μl第二抗体混合，室温下反应20min，得到“CdTe-第二抗体”复合物。

“荧光强度-AFP浓度”曲线的制备：

1.分别取300μl的“Fe₃O₄-Dextran-第一抗体”与0、10、20、30、40、50、60ng的抗原混合，在室温下反应30min；

2.结合磁分离，将步骤1中的各个微型离心管样品用pH6.0的醋酸缓冲溶液洗涤2次，然后定溶到1.0ml，然后分别加入“CdTe-第二抗体”复合物200μ，室温下反应30min；

3.结合磁分离，用pH6.0的醋酸缓冲溶液小心洗涤2次，定溶到0.5ml，测荧光；

4.绘出“荧光强度-AFP浓度”曲线。

5.根据“荧光强度-AFP浓度”标准工作曲线，得出工作方程： $Y=\frac{1}{V}(X+4.5).$ 式中Y为

AFP的浓度，单位为ng/ml，V所采取的血样的体积，单位为ml，X为三明治复合物在558nm处的荧光强度，单位为a.u.。

检测病人血清中AFP的含量：

1.取血清1ml，与300μl的“Fe₃O₄-Dextran-第一抗体”混合，在室温下反应30min；

2.结合磁分离，将步骤1中的各个微型离心管样品用pH6.0的醋酸缓冲溶液洗涤2次，然后定溶到1.0ml，然后分别加入“CdTe-第二抗体”复合物200μ，室温下反应30min；

3.结合磁分离，用pH6.0的醋酸缓冲溶液小心洗涤2次，使用pH8.4的硼酸缓冲溶液定溶到0.5ml，测荧光；

4.将所得到的结果带入工作方程 $Y=\frac{1}{V}(X+4.5)$ 中，计算出血清中AFP的含量，并将结果与时间分辨荧光检测结果对比。

表1本发明的检测方法与时间分辨荧光检测结果对比

Claims (7)

1.一种利用CdTe量子点和Fe₃O₄-Dextran纳米颗粒检测血清中AFP的非诊断治疗方法，其特征在于包括下列步骤：

(a)Fe₃O₄-Dextran-第一抗体复合物的制备：

共沉淀方法制备表面包覆了Dextran的Fe₃O₄，并将抗人甲胎蛋白抗体连接到Fe₃O₄-Dextran上形成Fe₃O₄-Dextran-第一抗体复合物；

具体包括如下步骤：

(1)共沉淀方法制备Fe₃O₄-Dextran颗粒：

将1gDextran溶于2ml超纯水中，抽真空20min后充氮气20min，将Fe³⁺盐和Fe²⁺盐溶于3.4ml超纯水中并将其倒入到溶解有Dextran的水中，再向其中加入过量的浓氨水得到黑色的沉淀，结合磁分离用去离子水反复洗涤沉淀多次；

(2)Fe₃O₄-Dextran-第一抗体复合物的制备：

在Fe₃O₄-Dextran中加入过量的KIO₃，再将磁性粒子分散在pH8.4的硼酸缓冲液中，然后加入抗人甲胎蛋白抗体于4℃下保存过夜。然后加入5%的BSA封闭磁性纳米颗粒表面多余活性位点，形成“Fe₃O₄-Dextran-第一抗体”复合物；

(b)CdTe-第二抗体复合物的制备

水热法制备CdTe量子点，并将羊抗人抗体连接到CdTe上，形成CdTe-第二抗体复合物；

具体如下：

(1)水热法制备CdTe量子点：

在饱含N₂的超纯水中，分别加入Na-citrate、CdCl₂·2.5H₂O、Na₂TeO₃、L-cysteine和NaBH₄，在100℃下煮沸1h；

(2)CdTe-第二抗体复合物的制备：

将CdTe加入到溶解有羊抗人的pH6.0的乙酸缓冲液中，形成“CdTe-第二抗体”复合物；

(c)绘制“荧光强度-AFP浓度”标准工作曲线，算出工作方程；

步骤具体如下：

(1)分别取300μl的“Fe₃O₄-Dextran-第一抗体”与0、10、20、30、40、50、60ng的抗原混合，在室温下反应30min；

(2)结合磁分离，将步骤(1)中的各个微型离心管样品用pH6.0的醋酸缓冲溶液洗涤2次，然后定容到1.0ml，然后分别加入“CdTe-第二抗体”复合物200μl，室温下反应30min；

(3)结合磁分离，用pH6.0的醋酸缓冲溶液小心洗涤2次，然后用pH8.4的硼酸缓冲溶液定容到lml，测荧光；

(4)根据抗原浓度和558nm处的荧光强度关系，绘制“荧光强度-AFP浓度”标准工作曲线；

(5)根据步骤(4)的工作曲线，算出工作方程：

式中Y为AFP的浓度，单位为ng/ml，V所采取的血样的体积，单位为ml，X为三明治复合物在558nm处的荧光强度，单位为a.u.；

(d)测定所得荧光强度数值带入工作方程得到AFP的含量。

2.根据权利要求1所述的利用CdTe量子点和Fe₃O₄-Dextran纳米颗粒检测血清中AFP的非诊断治疗方法，其特征在于：(a)中步骤(1)所述的Fe³⁺盐为水合FeCl₃，所述的Fe²⁺盐为水合FeSO₄或FeCl₂。

3.根据权利要求2所述的利用CdTe量子点和Fe₃O₄-Dextran纳米颗粒检测血清中AFP的非诊断治疗方法，其特征在于：所述的Fe³⁺盐为FeCl₃·6H₂O，所述的Fe²⁺盐为FeSO₄·7H₂O。

4.根据权利要求2或3所述的利用CdTe量子点和Fe₃O₄-Dextran纳米颗粒检测血清中AFP的非诊断治疗方法，其特征在于：所述Fe³⁺盐与Fe²⁺盐摩尔比为2:1。

5.根据权利要求1所述的利用CdTe量子点和Fe₃O₄-Dextran纳米颗粒检测血清中AFP的非诊断治疗方法，其特征在于：(a)中步骤(1)的所述氨水浓度为25%。

6.根据权利要求1所述的利用CdTe量子点和Fe₃O₄-Dextran纳米颗粒检测血清中AFP的非诊断治疗方法，其特征在于：(a)中步骤(2)所述的抗人甲胎蛋白抗体为鼠抗人甲胎蛋白抗体或兔抗人甲胎蛋白抗体。

7.根据权利要求1所述的利用CdTe量子点和Fe₃O₄-Dextran纳米颗粒检测血清中AFP的非诊断治疗方法，其特征在于：(b)中步骤(1)所述的CdCl₂·2.5H₂O与Na₂TeO₃的摩尔比为6:1。

Images