CN101776683A - 基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原的检测方法 - Google Patents

基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原(CEA)的检测方法，包括：(1)Fe3O4/SiO2核壳-第一抗体复合物的制备；(2)CdTe-第二抗体复合物的制备；(3)“荧光强度-CEA浓度”标准工作曲线和计算工作方程；(4)测定所得荧光强度数值通过工作方程得到病人CEA的含量。本发明的检测方法简单，灵敏度高，可以让很多癌症初期的病人较简易地检测到病情。

Description

基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原的检测方法
技术领域
本发明属癌胚抗原(CEA)的检测方法领域，特别是涉及一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原的检测方法。
背景技术
癌胚抗原(CEA)是胎儿肠、肝、胰等组织中的一种糖蛋白，分子量150～2000kb，正常人血清中很低，发生癌变后量升高。目前已知在结肠癌、直肠癌以及内胚层来源的其他恶性肿瘤，如食管、胃、肝、胰腺等，在癌变时也升高了。正常人CEA的指标是小于5ng/ml，但抽烟者或部分人的CEA被检测出高于5ng/ml也是属于正常水平。所以CEA不是癌的特异性抗原，而应该认为是一种癌的相关抗原。测定血液中CEA水平可用作癌症病人的监测、确定治疗效果好坏。肿瘤术后或者药疗之后，血液中CEA水平将下降，手术成功，CEA将持续下降直至正常水平。如果手术失败，或癌症复发CEA水平将回升到不正常水平。传统检测CEA的方法有：化学发光免疫定量分析、放射免疫和免疫放射法、酶标法等。这些检测技术是用异硫氰酸荧光黄(FITC)、罗丹明(RB200)标记特异抗体(Ab)，然后作固相荧光染色，最后用酶标仪测其荧光强度从而确定抗原含量。但是，它们在光学性能和光化学稳定性方面存在很多局限性，如发光时间短、光稳定性不好、激发光谱短和发射光谱长。
Fe3O4是一种重要的铁的氧化物，是应用最为广泛的软磁性材料之一。以磁流体形式存在的Fe3O4纳米粒子在液体中具有一般的液体属性和顺磁性，在外加磁场的情况下，能发生定向移动。并且Fe3O4纳米粒子经过表面修饰能够和多种生物分子相连接，在外加磁场的作用下，能够实现这些生物分子的固定化或者纯化。
CdTe量子点是一种荧光半导体纳米晶，量子点具有强度高、稳定性好、能够用一种波长的光源激发多种波长、发射波长随着粒径的增大而有规律地红移等荧光特性。水相合成的CdTe量子点亲水性好，经过表面修饰以后，能够和多种生物分子相互作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原的检测方法，该检测方法简单，灵敏度高，可以让很多癌症初期的病人较简易地检测到病情。
本发明的一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原的检测方法，包括：
(1)Fe3O4/SiO2核壳-第一抗体复合物的制备
(a)共沉淀方法制备Fe3O4颗粒
取超纯水，抽真空20min后充氮气20min，将Fe3+盐和Fe2+盐溶于超纯水中，再向其中加入过量的浓氨水得到黑色的沉淀，结合磁分离用去离子水洗涤沉淀3-5次；
(b)溶胶-凝胶法制备Fe3O4/SiO2核壳结构
将2.3ml无水乙醇、2.5mL去离子水和0.7mg油酸钠充分混合，加入7mg四氧化三铁纳米颗粒，搅拌后加入10μL交联剂γ-缩水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷(GMPS)，超声15min后加入100μL正硅酸乙酯(TEOS)，搅拌1h之后逐滴加入浓氨水，搅拌20h即得到Fe3O4/SiO2核壳结构的纳米颗粒；
(c)Fe3O4/SiO2核壳纳米颗粒与第一抗体的结合
将上述Fe3O4/SiO2溶于10ml含5％γ-缩水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷(GPMS)的甲苯溶液中，磁力搅拌反应12-24h，然后用甲苯和乙醇的混合物洗涤没有偶联的γ-缩水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷(GPMS)，之后溶于10ml PBS缓冲液中，然后加入抗人癌胚抗体，在4℃条件下，反应12-24h，再用PBS缓冲液结合磁分离洗3遍，即制得Fe3O4/SiO2-抗体复合物；
(2)CdTe-第二抗体复合物的制备
(a)水热法制备CdTe量子点
在饱含N2的硼酸-柠檬酸钠的缓冲溶液中，分别加入0.04M CdCl2·2.5H2O、0.01MNa2TeO3、0.12M巯基乙酸(TGA)、20mgNaBH4，在95～100℃下煮沸1h；
(b)CdTe-第二抗体复合物的制备
在上述CdTe量子点中加入0.05M N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，在37℃下活化10min，再加入抗人癌胚抗体和0.05M碳二亚胺(EDC)，在37℃条件下反应0.5h，加入1M甘氨酸终止反应，最后用PBS缓冲液定容到1ml，4℃放置12-24h；之后装入分子截留量为10-12kD的透析袋中，在浓度为0.02％的巯基乙酸(TGA)的PBS缓冲液中透析12h，每4h换一次缓冲液，将没有结合的CdTe、NHS、甘氨酸和没有反应的EDC透析掉；
(3)“荧光强度-CEA浓度”标准工作曲线和计算工作方程
(a)分别取100μl的上述“Fe3O4/SiO2-第一抗体”与1.0ng/ml、2.ng/ml、4.0ng/ml、10.0ng/ml、15.0ng/ml、20.0ng/ml、30.0ng/ml、40.0ng/ml的抗原混合，在室温下反应30min；
(b)结合磁分离，将步骤(a)中物质分别用pH 7.4的PBS缓冲溶液洗涤2次，定容到1.0ml，然后分别加入上述“CdTe-第二抗体”复合物200μl，室温下反应30min；
(c)结合磁分离，用pH 7.4的PBS缓冲溶液洗涤2次，然后用同样的缓冲溶液定容到1ml，测荧光；
(d)根据抗原浓度和荧光强度关系，绘制“荧光强度-CEA浓度”标准工作曲线；
(e)根据上述工作曲线，算出工作方程：Y＝A(X-B)，式中Y为CEA的浓度，单位为ng/ml，X为三明治复合物的相对荧光强度，单位为a.u.；
(4)测定所得荧光强度数值通过工作方程得到病人CEA的含量。
所述步骤(1)(a)中的Fe3+盐为水合FeCl3，Fe2+盐为水合FeSO4或FeCl2，Fe3+盐与Fe2+盐摩尔比为2∶1，氨水浓度为28％。
所述步骤(1)(a)中的Fe3+盐为FeCl3·6H2O，Fe2+盐为FeSO4·7H2O。
所述步骤(1)(c)或步骤(2)(b)中的抗人癌胚抗体为鼠抗人癌胚抗体、兔抗人癌胚抗体，其量为100μL，PBS缓冲液的pH为7.4。
所述(2)(a)中的CdCl2与Na2TeO3的摩尔比为6.0∶1。
所述步骤(2)(a)中的硼酸的浓度为15mM，柠檬酸钠的浓度为15mM。
本发明通过使用处理的半导体量子点来代替FITC、RB200标记特异抗体和使用磁分离纯化，来解决该免疫分析法的一系列问题，并且用共价结合的方式实现荧光和磁性纳米材料与抗体的结合，与静电结合相比，共价结合更稳定，更有利于富集目标物，从而显著简化癌胚抗原(CEA)的检测过程。
有益效果
本发明通过使用磁分离纯化和处理的半导体量子点来代替用FITC、RB200标记特异抗体方法，解决该免疫分析法的背景光干扰、选择性不好等问题，从而富集目标物，可以显著简化癌胚抗原(CEA)的检测手段，这种检测手段简单，并且灵敏度高，可以让很多癌症初期的病人较简易地检测到病情，并及时采取治疗手段，为胃肠道癌症的临床检测开辟了一条崭新的道路。
附图说明
图1为实施实例1所制得的Fe3O4/SiO2核壳纳米颗粒的透射电镜图(TEM)；
图2为实施实例3所得Fe3O4/SiO2与抗体结合前后的红外图谱变化情况；
图3为实施实例4所制得的抗体与量子点结合前后荧光光谱变化图；
图4为实施实例5所绘制的“荧光强度-CEA浓度”关系曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(一)Fe3O4/SiO2核壳纳米颗粒的制备：
1.称取1.08g的FeCl3·6H2O和0.555g的FeSO4·7H2O，溶解于20ml超纯水中，抽真空20min，N2饱和20min；在其加入过量氨水得到黑色沉淀，结合磁分离，用超纯水清洗数次。
2.去步骤1产物7mg与2.3mL无水乙醇、2.5mL去离子水和0.7mg油酸钠充分混合，磁子搅拌并加入10μL的GMPS。
3.将步骤2混合物超声15min后加入TEOS 100μL，搅拌1h之后逐滴加入28％的氨水10.2mL，搅拌20h即得到Fe3O4/SiO2核壳纳米颗粒，结合磁分离，用超纯水清洗数次。
(二)CdTe量子点制备：
1.将40ml包含15mM硼酸和15mM柠檬酸钠的缓冲溶液中先抽真空20min再充入氮气20min。
2.在磁力搅拌下，依次加入0.04M CdCl2·2.5H2O溶液，0.01M Na2TeO3溶液，1.2M TGA和20mgNaBH4。
3.磁力搅拌反应5min形成清亮的绿色溶液。在95～100℃沸水浴中回流1h，即制备出CdTe量子点。
(三)“Fe3O4/SiO2-第一抗体”复合物的制备：
1.将制得的Fe3O4/SiO2溶于10ml含5％GPMS的甲苯溶液中，磁力搅拌过夜反应，然后用甲苯和乙醇的混合物洗涤没有偶联的GPMS。
2.将上述制备的Fe3O4/SiO2-GPMS溶于10ml PBS缓冲液中，加入100μL抗体，在4℃条件下，过夜反应，再用PBS缓冲液结合磁分离洗3遍，即制得Fe3O4/SiO2-GPMS-IgG复合物。
再加入200μl、5％的BSA，在4℃条件下过夜，没有参加反应的基团就被封闭了；
(四)“CdTe-第二抗体”复合物的制备：
1.500μl CdTe中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，在37℃下活化10min，再加入100μl抗体和碳二亚胺(EDC)，在37℃条件下反应0.5h，加入甘氨酸终止反应，最后用PBS缓冲液定容到1ml。
2.将上述样品放4℃冰箱过夜。然后装入分子截留量为10-12kD的透析袋中，在巯基乙酸(TGA)的PBS缓冲液中透析12h，每4h换一次缓冲液。这样就可以将没有结合的CdTe、NHS、甘氨酸和没有反应的EDC透析掉。
(五)“荧光强度-CEA浓度”曲线的制备：
1.分别取100μl的“Fe3O4/SiO2-第一抗体”与1.0、2.0、4.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0ng/ml的抗原混合，在室温下反应30min；
2.结合磁分离，将步骤1中的各个微型离心管样品用pH 7.4的PBS缓冲溶液洗涤2次，然后定溶到1.0ml，然后分别加入“CdTe-第二抗体”复合物200μl，室温下反应30min；
3.结合磁分离，用pH 7.4的PBS缓冲溶液小心洗涤2次，然后用同样的缓冲溶液定容到1ml，测荧光；
4.根据抗原浓度和荧光强度关系，绘制“荧光强度-CEA浓度”标准工作曲线；
5.根据步骤4的工作曲线，算出工作方程：Y＝A(X-B)，式中Y为CEA的浓度，单位为ng/ml，X为三明治复合物的相对荧光强度。
实施例2
检测病人血清中CEA的含量：
1.取血清1ml，与100μl的“Fe3O4/SiO2-第一抗体”混合，在室温下反应30min；
2.结合磁分离，将步骤1中的各个微型离心管样品用pH 7.4的PBS缓冲溶液洗涤2次，然后定溶到1.0ml，然后分别加入“CdTe-第二抗体”复合物200μl，室温下反应30min；
3.结合磁分离，用pH 7.4的PBS缓冲溶液小心洗涤2次，使用该缓冲溶液定容到0.5ml，测荧光；
4.将所得到的结果带入工作方程Y＝A(X-B)中，计算出血清中CEA的含量，并将结果与免疫荧光检测结果对比，见表1。
表1本发明的检测方法与免疫荧光检测结果对比
Figure G2010100224555D00061

Claims (6)

1.一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原CEA的检测方法，包括：
(1)Fe3O4/SiO2核壳一第一抗体复合物的制备
(a)取超纯水，抽真空20min后充氮气20min，将Fe3+盐和Fe2+盐溶于超纯水中，再向其中加入过量的浓氨水得到黑色的沉淀，结合磁分离用去离子水洗涤沉淀3-5次，得Fe3O4颗粒；
(b)将2.3ml无水乙醇、2.5mL去离子水和0.7mg油酸钠充分混合，加入7mg四氧化三铁纳米颗粒，搅拌后加入10μL交联剂γ-缩水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷GMPS，超声15min后加入100μL正硅酸乙酯TEOS，搅拌1h之后逐滴加入浓氨水，搅拌20h，即得Fe3O4/SiO2核壳结构的纳米颗粒；
(c)将上述Fe3O4/SiO2核壳结构的纳米颗粒溶于10ml含5％γ-缩水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷GPMS的甲苯溶液中，磁力搅拌反应12-24h，然后用甲苯和乙醇的混合物洗涤没有偶联的γ-缩水甘油醚氧基丙基三甲基硅烷GPMS，之后溶于10ml PBS缓冲液中，然后加入抗人癌胚抗体，在4℃条件下，反应12-24h，再用PBS缓冲液结合磁分离洗3遍，即得Fe3O4/SiO2-抗体复合物；
(2)CdTe-第二抗体复合物的制备
(a)在饱含N2的硼酸-柠檬酸钠的缓冲溶液中，分别加入0.04M CdCl2·2.5H2O、0.01MNa2TeO3、0.12M巯基乙酸TGA、20mg NaBH4，在95～100℃下煮沸1h，即得CdTe量子点；
(b)在上述CdTe量子点中加入0.05M N-羟基丁二酰亚胺NHS，在37℃下活化10min，再加入抗人癌胚抗体和0.05M碳二亚胺EDC，在37℃条件下反应0.5h，加入1M甘氨酸终止反应，最后用PBS缓冲液定容到1ml，4℃放置12-24h；之后装入分子截留量为10-12kD的透析袋中，在浓度为0.02％的巯基乙酸TGA的PBS缓冲液中透析12h，每4h换一次缓冲液，即得CdTe-第二抗体复合物；
(3)“荧光强度-CEA浓度”标准工作曲线和计算工作方程
(a)分别取100μl的上述“Fe3O4/SiO2-第一抗体”与1.0ng/ml、2.ng/ml、4.0ng/ml、10.0ng/ml、15.0ng/ml、20.0ng/ml、30.0ng/ml、40.0ng/ml的抗原混合，在室温下反应30min；
(b)结合磁分离，将步骤(a)中物质分别用pH 7.4的PBS缓冲溶液洗涤2次，定容到1.0ml，然后分别加入上述“CdTe-第二抗体”复合物200μl，室温下反应30min；
(c)结合磁分离，用pH 7.4的PBS缓冲溶液洗涤2次，然后用同样的缓冲溶液定容到1ml，测荧光；
(d)根据抗原浓度和荧光强度关系，绘制“荧光强度-CEA浓度”标准工作曲线；
(e)根据上述工作曲线，算出工作方程：Y＝A(X-B)，式中Y为CEA的浓度，单位为ng/ml，X为三明治复合物的相对荧光强度，单位为a.u.；
(4)测定所得荧光强度数值通过工作方程得到病人CEA的含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原CEA的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)(a)中的Fe3+盐为水合FeCl3，Fe2+盐为水合FeSO4或FeCl2，Fe3+盐与Fe2+盐摩尔比为2∶1，氨水浓度为28％。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原CEA的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)(a)中的Fe3+盐为FeCl3·6H2O，Fe2+盐为FeSO4·7H2O。
4.根据权利要求1所述的一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原CEA的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)(c)或步骤(2)(b)中的抗人癌胚抗体为鼠抗人癌胚抗体、兔抗人癌胚抗体，其量为100μL，PBS缓冲液的pH为7.4。
5.根据权利要求1所述的一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原CEA的检测方法，其特征在于：所述(2)(a)中的CdCl2与Na2TeO3的摩尔比为6.0∶1。
6.根据权利要求1所述的一种基于荧光纳米发光和磁性纳米材料的癌胚抗原CEA的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)(a)中的硼酸的浓度为15mM，柠檬酸钠的浓度为15mM。
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