CN104345155A - 甲胎蛋白含量的检测方法 - Google Patents

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CN104345155A CN201410597084.1A CN201410597084A CN104345155A CN 104345155 A CN104345155 A CN 104345155A CN 201410597084 A CN201410597084 A CN 201410597084A CN 104345155 A CN104345155 A CN 104345155A
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谢妮
李仲航
齐素文
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Shenzhen Second Peoples Hospital
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Abstract

本发明公开了一种甲胎蛋白含量的检测方法，包括如下步骤：将待测样品、半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液和羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液混合，加入缓冲液后在37℃下温育20min；温育完成后的反应体系用洗涤液洗涤除杂，接着加入所述缓冲液，并用300nm的激发波长和605nm的发射波长的荧光分光光度计测定荧光值；以及根据测得的荧光值得到待测样品的甲胎蛋白含量。通过半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体和羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体结合甲胎蛋白形成了通过荧光分光光度计检测而监控的夹心免疫反应，这种甲胎蛋白含量的检测方法具有较高的灵敏度和精确度。

Description

甲胎蛋白含量的检测方法
技术领域
本发明涉及免疫荧光领域，特别是涉及一种甲胎蛋白含量的检测方法。
背景技术
1956年，Bergstrandh和Czar发现了甲胎蛋白(AFP)。AFP是一种单聚肽糖蛋白，其平均分子量约为68000Da。作为在胎儿血清里的一种特殊蛋白，正常成人的肝细胞失去了合成AFP的能力。在健康成人体内，AFP的浓度比低于3.4ng/mL的平均值。
临床研究表明，血清AFP的敏感性为41-65％，特异性80-94％(临界值为ng/mL)。AFP一般只可用于肝癌的监视，诊断和监测作为血清学标志物。如果甲胎蛋白水平在手术不降低，复发的可能性较大。伴有高水平AFP的患者在治疗后比普通水平患者的存活率要低。
酶联免疫吸附测定(ELISA)和化学发光酶免疫测定(CLEIA)经常被用来检测血清中AFP的水平。然而，酶联免疫吸附法具有如再现性差，低灵敏度和线性范围窄的限制。CLEIA被认为是准确和可靠的，但其缺点是短暂的照明时间。
半导体量子点(QDs)拥有高亮度和荧光的持续时间长等独特的光学性质，所以它的出现引起相当大的关注。目前，QDs已经被开发成为一类新的高灵敏度和高发光强度的探针并且没有有机染料和荧光蛋白的固有局限性。与其他发光标记物相比，QDs具有独特的光学和电子特性，例如高亮度和狭窄发射带以及其它优于传统的有机荧光团。QDs已在活的动物和细胞成像中用于作为对肿瘤显像的荧光标记。
发明内容
基于此，有必要提供一种基于半导体量子点的甲胎蛋白含量的检测方法。
一种甲胎蛋白含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待测样品、半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液和羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液混合，加入缓冲液后在37℃下温育20min，其中，半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液和羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液中各自的抗甲胎蛋白抗体不同；
温育完成后的反应体系用洗涤液洗涤除杂，接着加入所述缓冲液，并用300nm的激发波长和605nm的发射波长的荧光分光光度计测定荧光值；以及
根据测得的荧光值得到待测样品的甲胎蛋白含量。
在一个实施例中，进行温育的反应体系中，所述待测样品、所述半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液和所述羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液的加入量的体积比为2：3：3，半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液的浓度为16.5μg/mL～18.3μg/mL，羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液的浓度为20.4μg/mL～23.8μg/mL。
在一个实施例中，所述半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液通过如下步骤制备：
将半导体量子点溶液与1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液混合，接着加入抗甲胎蛋白抗体和所述缓冲液，37℃摇动下温育3小时进行耦合反应，接着加入pH为7.4的TIRS-HCl使耦合反应停止，最后将反应体系以3000rpm/min的速度离心20分钟，弃去上清并加入所述缓冲液，得到所述半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液。
在一个实施例中，所述半导体量子点溶液为CdSe半导体量子点溶液。
在一个实施例中，所述羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液通过如下操作制备得到：
将羧基化标准磁珠用活化液洗涤至少三次，接着1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液混合，37℃摇动温育10min，接着加入抗甲胎蛋白抗体同时37℃摇动下温育2h，最后加入所述缓冲液，得到所述羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液。
在一个实施例中，所述活化液为含有4mg/mL的1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的PBS缓冲液。
在一个实施例中，所述缓冲液为PBS缓冲液，所述洗涤液为含有质量百分数为0.05％的吐温20的浓度为0.05mol/L的(羟甲基)氨基乙烷(Tris)溶液。
在一个实施例中，根据测得的荧光值得到待测样品中甲胎蛋白含量的操作为：对若干组不同浓度的已知含量的甲胎蛋白溶液进行与所述待测样品相同的处理，根据测得的甲胎蛋白溶液的荧光值，得到线性拟合曲线，将得到的所述待测样品的荧光值带入所述线性拟合曲线，得到所述待测样品的甲胎蛋白含量。
在一个实施例中，所述若干组不同浓度的甲胎蛋白溶液中的甲胎蛋白的浓度分别为：0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、100ng/mL和400ng/mL。
在一个实施例中，反应体系温育完成后到完成荧光值测定的时间间隔不超过3h。
这种甲胎蛋白含量的检测方法，通过半导体量子点和羧基化标准磁珠去标记两种不同抗甲胎蛋白的单克隆抗体。半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体和羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体结合甲胎蛋白形成了通过荧光分光光度计检测而监控的夹心免疫反应。这种甲胎蛋白含量的检测方法用于甲胎蛋白含量具有较高的灵敏度和精确度，显示出其在临床实验室中应用的巨大潜力。
附图说明
图1为一实施方式的有机聚合物基导热微球的制备方法的流程图；
图2为通过使用三个不同的激发波扫描的QDs抗体偶联物的光谱达到最佳信号得到的光谱图；
图3为温育时间和免疫测定的灵敏度的曲线关系。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明中使用的部分药品和仪器如下：1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自Sigma-Aldrich公司(密苏里州，美国)。牛血清白蛋白(BSA)从北京JingKeHongDa生物技术有限公司(北京，中国)购买。CdSeQDs605自Life Technologies(AB&Invitrogen公司)(卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)购得。羧基化标准磁珠(珠)从Ademtech有限公司(佩萨克，法国)购买。两种不同鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体(AFP-3，AFP-28)从Fapon生物科技股份有限公司公司(深圳，中国)获得。繁殖和摇晃的程序在恒温容器(FYL-YS，中国)和振动筛(ZXWL-100，中国)中进行。使用Hitachi F-4600荧光分光光度计(日本东京)进行免疫程序。
结合图1，一实施方式的甲胎蛋白含量的检测方法，包括如下步骤：
S10、将待测样品、半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液和羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液混合，加入缓冲液后在37℃下温育20min。
待测样品可以为血清。
半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液和羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液中，被半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体与被羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体不同。本实施例中，两种抗甲胎蛋白抗体分别为AFP-3，AFP-28(从Fapon生物科技股份有限公司公司获得，深圳)。
进行温育的反应体系中，待测样品、半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液和羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液的加入量的体积比为2：3：3，半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液的浓度为16.5μg/mL～18.3μg/mL，羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液的浓度为20.4μg/mL～23.8μg/mL。
缓冲液可以为浓度为0.1mol/L的pH为7.4的PBS缓冲液。
本实施例中，待测样品的体积为20μL、半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液的体积为30μL、羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液的体积为30μL、缓冲液的体积为1mL。
半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液通过如下步骤制备：将半导体量子点溶液与1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液混合，接着加入抗甲胎蛋白抗体和所述缓冲液，37℃摇动下温育3小时进行耦合反应，接着加入pH为7.4的TIRS-HCl使耦合反应停止，最后将反应体系以3000rpm/min的速度离心20分钟，弃去上清并加入所述缓冲液，得到所述半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液。
具体而言，本实施例中，半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液通过如下步骤制备：将10μL浓度为8μmol/L的半导体量子点溶液与7μL浓度为1.3μmol/L的1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液混合，接着加入500μL浓度为0.2mg/mL的抗AFP抗体和100μL的pH为6.0的PBS，37℃摇动下温育3小时进行耦合反应，接着加入100μL浓度为50mmol/L的pH为7.4的TIRS-HCl使耦合反应停止，最后将反应体系以3000rpm/min的速度离心20分钟，弃去上清并加入1mL浓度为0.1mol/L的pH为7.4的PBS，得到所述半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液。
本实施例中，半导体量子点溶液为CdSe半导体量子点溶液。在其他的实施例中，还可以采用其他的半导体量子点。本实施例的CdSe半导体量子点(QDs)为CdSeQDs605。
羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液通过如下操作制备得到：将羧基化标准磁珠用活化液洗涤至少三次，接着1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液混合，37℃摇动温育10min，接着加入抗甲胎蛋白抗体同时37℃摇动下温育2h，最后加入所述缓冲液，得到所述羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液。
具体而言，本实施例中，羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液通过如下操作制备得到：首先，将810μL质量分数为3％羧基化标准磁珠放入所需的试管然后用活化液洗涤珠粒三次。其次，加入80μL的羧基化标准磁珠的每毫克EDC溶液(4毫克/毫升)，37℃摇动温育10分钟。然后，将25μL(2毫克/毫升)抗AFP抗体加入到活化了的羧基化标准磁珠中，然后37℃摇动下温育2小时。最后，加入2mL缓冲液，得到羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液。
活化液为含有4mg/mL的EDC的PBS缓冲液。
S20、将S10得到的温育完成后的反应体系用洗涤液洗涤除杂，接着加入上述缓冲液，并用300nm的激发波长和605nm的发射波长的荧光分光光度计测定荧光值。
本实施例中，缓冲液的加入量为1mL。
通过使用三个不同的激发波(300nm，370nm，400nm)扫描的QDs抗体偶联物的光谱达到最佳信号，得到偶联量子点的单克隆抗体在300nm、370nm和400nm激发波长的发射光谱如图2所示。
由图2可以看出，透射波长(605nm)是独立的激发波长。无论是在300nm，370nm还是400nm下，透射的形状保持不变，而300nm的强度最强。因此，设定最佳的激发和透射波分别为300nm和605nm。
洗涤液为含有质量百分数为0.05％的吐温20的浓度为0.05mol/L的(羟甲基)氨基乙烷(Tris)溶液。
特别的，反应体系温育完成后到完成荧光值测定的时间间隔不超过3h。
为了测试QDs抗体偶联物的持续时间，选择同一样品的荧光强度分别在1小时，2小时，4小时，12小时，1天和2天。结果发现，免疫复合物的荧光强度3小时后变小，12小时后失去了三分之一，1天后消失。
因此，设定反应体系温育完成后到完成荧光值测定的时间间隔不超过3h。
S30、根据S20测得的荧光值得到待测样品的甲胎蛋白含量。
根据测得的荧光值得到待测样品中甲胎蛋白含量的操作为：对若干组不同浓度的已知含量的甲胎蛋白溶液进行与所述待测样品相同的处理，根据测得的甲胎蛋白溶液的荧光值，得到线性拟合曲线，将得到的待测样品的荧光值带入线性拟合曲线，得到待测样品的甲胎蛋白含量。
得到线性拟合曲线可以为：在双重wells中测定校准器和样品，平均荧光强度值；通过绘制AU(Y)和分析物浓度(X)得到一个四参数线性拟合标准曲线。
具体而言，本实施例中，若干组不同浓度的甲胎蛋白溶液中的甲胎蛋白的浓度分别为：0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、100ng/mL和400ng/mL，并且分别记为S0、S1、S2、S3、S4和S5。甲胎蛋白溶液用BSA/PBS溶液(0.01mol/L的磷酸氢二钠，0.003mol/L的KH2PO4，0.15mol/L的NaCl，10g/L的BSA，pH为7.4)配制。
对温育时间可能对免疫测定的灵敏度进行测定，AFP标准品浓度为2ng/ml，量子点偶联的AFP抗体稀释比例为1:80，羧基化标准磁珠偶联的AFP抗体稀释比例为1:50，得到免疫反应温育时间优化效果图如图3所示。
如图3所示，因为免疫复合物的量增加，A.U.(荧光单位强度值)值随反应时间的增加而增加到20分钟。20分钟后，A.U.值缓慢下降，这表明反应是在抗原和抗体之间达到平衡。
因此，设定温育时间为20分钟。
对免疫测定试剂进行优化。
免疫反应试剂是影响免疫测定灵敏度的一个关键参数。在实验中，对QDs标记的抗AFP抗体和羧基化标准磁珠标记的抗AFP抗体原液的稀释率进行了研究。QDs标记的抗AFP抗体原液稀释的稀释缓冲液的稀释比率为1：10至1：100。用校正曲线来研究的免疫测定试剂的优化。如表I显示，1：80的稀释比被选择为最佳比率，因为它对应了最宽的线性范围(最高AUS5/AUS0)和最高灵敏度(最高AUS1/AUS0)。
表I：偶联了量子点的AFP单克隆抗体浓度稀释效果。
羧基化标准磁珠标记的抗AFP的浓度也是影响免疫测定的灵敏度和作用范围的重要因素之一。羧基化标准磁珠标记的抗AFP抗体原液用稀释缓冲液稀释到稀释比率为1:10至1:50。类似地，根据AUS1/AUS0和AUS5/AUS0的值，1：30的稀释比被选择用于进一步的研究(表II)。
表II：偶联了羧基化标准磁珠的AFP单克隆抗体稀释效果
对于本实验的总结：
灵敏度：通过第一次获得10个S0重复的平均A.U.信号计算出了检出限，然后加入2个SDs平均值。这个计算结果从标准曲线中推测得到，并表示该测定的灵敏度。AFP检出限的值是1.2毫微克/毫升。
精确度：两个不同的浓度在一次试验中检测10次得到intra试验的精确度。同样地，使用相同的规程(每次2个重复)在不同天数(5天)里分析这些样品，得到inter试验的变化率。intra试验的不完全精确结果[mean(CV)]为5.0ng/mL(5.81％)和10.0ng/mL(5.53％)；inter试验的不完全精确结果为[5.0ng/mL(6.26％)],[10.0ng/mL(6.15％)]。
对人血清的AFP水平分析的具有高灵敏度以QDs为基础的萤光免疫检验法已经建立了。此试验包括抗AFP抗体珠，QDs标记的抗AFP抗体和IF检测***。在免疫学“三明治”反应中，免疫试剂的浓度和免疫反应时间是影响免疫测定的灵敏度的关键参数。如表Ⅰ和表Ⅱ显示中，当QDs标记的抗AFP抗体和羧基化标准磁珠标记的抗AFP抗体稀释率升高，S1和S5的A.U.呈下降趋势。考虑到线性范围(AUS5/AUS1值)和灵敏度(A.U.S1/A.U.S0值)，我们选择1:80和1:50的比率。免疫反应的温育时间是影响免疫测定的灵敏度的关键参数之一。如图2显示，A.U.随着培养时间的延长，20分钟后达到峰值。我们设定20分钟作为培养时间，是因为非特异性吸附能延长免疫反应的时间。
该方法的参数，如灵敏度和精确度都被预先验证。该结果表明，该方法提示了临床分析的可能性。
此试验的主要优点是它的稳定性和强大的荧光强度。结果表明免疫复合物的荧光强度在3小时后减少，12小时后失去了三分之一。其他发光标记物如ABEI和吖啶酯，它们发射信号的持续时间短，该信号通常是小于1秒。因此，QDs的结合物可以用于作为临床实验室应用的发光分析的一个特别有价值的工具。此外，所提出的方法显示1.2ng/毫升的高灵敏度，而它为ELISA法为2.0ng/mL，CLEIA法为1.29ng/mL。很明显该方法的灵敏度比ELISA和CLEIA更好。
综上所述，使用了QDs作为荧光标记物开发一种新的免疫荧光法来检测血清中AFP的水平，QDs的适用性甚至可以扩展到临床分析领域，为AFP提供的新试验。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种甲胎蛋白含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待测样品、半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液和羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液混合，加入缓冲液后在37℃下温育20min，其中，半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液和羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液中各自的抗甲胎蛋白抗体不同；
温育完成后的反应体系用洗涤液洗涤除杂，接着加入所述缓冲液，并用300nm的激发波长和605nm的发射波长的荧光分光光度计测定荧光值；以及
根据测得的荧光值得到待测样品的甲胎蛋白含量。
2.根据权利要求1所述的甲胎蛋白含量的检测方法，其特征在于，进行温育的反应体系中，所述待测样品、所述半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液和所述羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液的加入量的体积比为2：3：3，半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液的浓度为16.5μg/mL～18.3μg/mL，羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液的浓度为20.4μg/mL～23.8μg/mL。
3.根据权利要求1所述的甲胎蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液通过如下步骤制备：
将半导体量子点溶液与1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液混合，接着加入抗甲胎蛋白抗体和所述缓冲液，37℃摇动下温育3小时进行耦合反应，接着加入pH为7.4的TIRS-HCl使耦合反应停止，最后将反应体系以3000rpm/min的速度离心20分钟，弃去上清并加入所述缓冲液，得到所述半导体量子点标记的抗甲胎蛋白抗体溶液。
4.根据权利要求3所述的甲胎蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述半导体量子点溶液为CdSe半导体量子点溶液。
5.根据权利要求1所述的甲胎蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液通过如下操作制备得到：
将羧基化标准磁珠用活化液洗涤至少三次，接着1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液混合，37℃摇动温育10min，接着加入抗甲胎蛋白抗体同时37℃摇动下温育2h，最后加入所述缓冲液，得到所述羧基化标准磁珠标记的抗甲胎蛋白抗体溶液。
6.根据权利要求5所述的甲胎蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述活化液为含有4mg/mL的1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的PBS缓冲液。
7.根据权利要求1所述的甲胎蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液，所述洗涤液为含有质量百分数为0.05％的吐温20的浓度为0.05mol/L的(羟甲基)氨基乙烷(Tris)溶液。
8.根据权利要求1所述的甲胎蛋白含量的检测方法，其特征在于，根据测得的荧光值得到待测样品中甲胎蛋白含量的操作为：对若干组不同浓度的已知含量的甲胎蛋白溶液进行与所述待测样品相同的处理，根据测得的甲胎蛋白溶液的荧光值，得到线性拟合曲线，将得到的所述待测样品的荧光值带入所述线性拟合曲线，得到所述待测样品的甲胎蛋白含量。
9.根据权利要求8所述的甲胎蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述若干组不同浓度的甲胎蛋白溶液中的甲胎蛋白的浓度分别为：0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、100ng/mL和400ng/mL。
10.根据权利要求8所述的甲胎蛋白含量的检测方法，其特征在于，反应体系温育完成后到完成荧光值测定的时间间隔不超过3h。
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