CN101432303A - 利用抗cdh3抗体的效应物功能来损伤细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于抗CDH3抗体的效应物功能的细胞毒性的用途。具体地，本发明提供使用抗体效应物功能损伤CDH3表达细胞的含有作为活性成分的抗CDH3抗体的方法和药物组合物。由于在胰腺癌、肺癌、结肠癌、***癌、乳腺癌、胃癌以及肝癌细胞中有CDH3的明显表达，本发明可用于胰腺癌、肺癌、结肠癌、***癌、乳腺癌、胃癌以及肝癌的治疗。

Description

利用抗CDH3抗体的效应物功能来损伤细胞的方法

本申请要求2006年2月28日提交的美国临时申请流水号60/778,079的权利，这些申请的全部内容在此并入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及利用抗CDH3抗体的效应物功能来损伤细胞的方法或者用于此目的的组合物。

背景技术

胰腺癌症患者的死亡率比其它任何类型的恶性肿瘤都高，5年存活率仅有4％(Greenlee et al.，(2001)CA.Cancer J.Clin.；51：15-36.)。该恶性肿瘤难于早期诊断、并且目前疗法疗效差，这反映为预后不良(DiMagno et al.，(1999)Gastroenterology.；117：1464-84；Greenlee et al.，(2001)CA.Cancer J.Clin.；51：15-36.)。特别是在该疾病的较早的、可能有效治疗的阶段没有临床上可用的肿瘤标志物。目前外科切除手术是唯一可能的治疗方法，但是诊断为可以进行外科切除手术的病例占患有该癌症的患者的比例少于20％(DiMagno et al.，(1999)Gastroenterology.；117：1464-84；Klinkenbijl et al.，(1999)Ann Surg.；230：776-82；discussion 782-4)。可以使用内窥镜超声检查(EUS)，内镜逆行胰胆管造影(ERCP)以及螺旋CT来筛查具有家族性胰腺癌症风险的个体(Brentnall et al.，(1999)Ann Intern Med.；131：247-55)，但是用这些方法来筛查每一个无症状的个体在时间和成本效益的观点上是不可行的。因此，必须发现对于胰腺癌症灵敏并且特异的肿瘤标志物。几乎所有的晚期患者对于任何的治疗方法都没有应答。为了克服这样的情况，已经一些临床试验尝试了建立基于分子技术的治疗策略。这些试验涉及，例如，MMP抑制剂、设计用于抑制Ras法尼基转移酶的药物以及基于抗体的方法(Hao and Rowinsky，(2002)Cancer Invest.；20：387-404.；Laheru et al.，(2001)Cancer J.；7：324-37.；Rosenberg，(2000)Drugs.；59：1071-89.)。然而，到目前为止这些实验对于该疾病没有得到任何的显著效果。

肺癌是一种最普遍的人类致死肿瘤。非小细胞肺癌(NSCLC)是最普遍的形式，占肺肿瘤的近80％(American Cancer Society，Cancer Facts and Figures2001，Am.Chem.Soc.Atlanta)。大多数NSCLC直到晚期才能诊断出来，因此虽然最近在多科性治疗上取得了进展，总体的10年存活率仍低于10％(Fry et al.，(1999)Cancer；86：1867-76)。当前，认为利用铂的化学疗法是治疗NSCLC的重要疗法。然而，药物的治疗作用仍不过是在一定程度上延长晚期NSCLC患者的存活时间((1995)Bmj.；311：899-909)。正在研究包括使用酪氨酸激酶抑制剂的疗法在内的多种导向疗法。然而，迄今为止，仅在少数患者身上得到了有希望的结果，而在一些患者身上，治疗效果伴随着严重的副作用(Kris et al.，(2002)Proc Am Soc Clin Oncol.；21：292a(Al166))。

结肠直肠癌(colorectal carcinoma)是发达国家中癌症死亡的首要原因。具体地，在美国每年都报道超过130,000个新的结肠直肠癌症的病例。结肠直肠癌症占全部癌症的15％。在其中有大约5％直接与遗传性基因缺陷有关。尽管近来在治疗策略上取得了一些进步，但是晚期癌症患者的预后仍然很差。虽然分子研究已经揭示了在癌症发生过程中肿瘤抑制基因和/或原癌基因的改变，但是确切的机理仍然有待阐明。

***癌(prostate cancer，PRC)是男性最普遍的恶性肿瘤，并且在世界范围构成严重的健康问题。该疾病在美国是造成癌症死亡的第二频繁的原因(Greenlee，R.T.，et al.(2001)CA Cancer J Clin；51：15-36.)。由于西式食物的流行和老年人数目的增长，PRC的发病率在发达国家稳步的增长。由于采取西式的生活***的增加。早期的诊断能够提供一些根治性外科手术的机会。器官局限性PRC的患者通常会被治疗，并且其中大约70％的患者可以通过根治性***切除术治愈(Roberts，W.W.，et al.(2001)Urology；57：1033-7.；Roberts，S.G.，et al.(2001)Mayo Clin Proc；76：576-81.)。由于PRC的增殖最初是雄激素依赖的，所以对绝大多数患有晚期或者复发PRC的患者会采取雄激素去除疗法。虽然大多数这样的患者最初会对雄激素去除疗法有应答，但是该疾病最终会发展成非雄激素依赖的PRC，此时该肿瘤对雄激素去除疗法不再有反应。

治疗PRC的一个最严重的临床问题是这种非雄激素依赖的PRC对于其他任何疗法都没有应答，所以理解非雄激素依赖性增殖的机制和建立除雄激素去除疗法以外新的PRC疗法是控制PRC的急迫课题。

乳腺癌是一种遗传上异质的疾病，是女性中最普遍的恶性肿瘤。估计全世界每年报道大约800000个新病例(Parkin DM，et al.，(1999)CA Cancer JClin；49：33-64)。***切除术是治疗该疾病并用的第一选择。即使利用手术切除原发肿瘤，但是仍有可能发生原位或者远距离的复发，这是由于在诊断时无法检出的一些微小的转移造成的(Saphner T，et al.，(1996).J ClinOncol；14：2738-46.)。在手术之后通常会给予细胞毒剂作为辅助疗法来杀死残存细胞或者癌前细胞。

常规的化疗剂治疗通常是依据经验进行，并且主要是基于肿瘤的组织学参数，缺少对具体的机理的理解。因此靶向药物正在成为乳腺癌的基础性疗法。他莫西芬(tamoxifin)和芳香酶抑制剂是这类药物中的两种代表物质，已经证明了当在患有转移的乳腺癌患者身上使用该物质作为辅剂或者化学预防剂时具有很好的应答(Fisher B，et al.(1998)J Natl Cancer Inst；90：1371-88；Cuzick J，et al.，(2002)Lancet；360：817-24)。然而其缺点是只有表达***受体的患者才对这些药物敏感。最近甚至提出关于这些药物副作用的担心，特别是关于长期使用他莫西芬治疗引起子宫内膜癌的可能，以及对长期使用芳香酶的患者中的绝经妇女骨折的有害作用(Coleman RE.(2004)Oncology.；18(5 Suppl 3)：16-20)。由于副作用和药物抗性的出现，显然必须基于确切的作用机理来为选择性智能药物寻找新的分子靶标。

胃癌是世界上癌症死亡的首要原因，特别是在远东地区，全世界每年大约诊断出700,000新的病例。由于化疗仍然不十分有效，所以手术是治疗的主要手段。早期的胃癌可以通过手术切除来治愈，但是晚期胃癌的预后仍然很差。

肝细胞癌(HCC)是全世界最普遍的癌症之一，并且其发病率不但在美国，在日本也在逐渐增加(Akriviadis EA，et al.，(1998)Br J Surg.；85：1319-31)。虽然最近的医学进展在诊断方面取得了巨大的进步，但是仍然有很多HCC患者是在晚期才被诊断出来，他们仍然很难从该疾病完全康复。另外，由于患有肝硬化或者慢性肝炎的患者患HCC的风险很高，所以即使在完全切除原初肿瘤之后这些患者也可能增殖出多发肝肿瘤或者新的肿瘤。因此，需要高度关注的问题是研制高效的化疗药物以及预防方法。

以阐明致癌机理为目的的研究已经发现了很多可以用作抗肿瘤剂的候选靶标分子。例如，在动物模型中法尼基转移酶抑制剂(FTI)对于治疗Ras依赖的肿瘤是有效的(Sun J et al.，(1998)Oncogene，16：1467-73)。研制该药物的目的是用于抑制与Ras相关的增殖信号通路，该通路依赖于转录后的法尼基化。将抗肿瘤剂与抗HER2单抗进行联合给药的人体临床试验已经在改善临床应答以及增加乳腺癌患者的总体存活率上取得了成功，其中该单抗为曲妥珠单抗(trastuzumab)，用于对抗原癌基因HER2/neu的目的。酪氨酸激酶抑制剂STI-571是能够选择性失活bcr-ab1融合蛋白的抑制剂。研制该药物的目的是为了治疗慢性髓样白血病，在该疾病中bcr-ab1酪氨酸激酶的恒定活性对于白血细胞转变具有重要的作用。设计这些药物的目的是用于抑制特异基因产物的致癌活性(O’Dwyer ME and Druker BJ，Curr PoinOncol，12：594-7，2000)。因此，在癌细胞中表达量增加的基因产物通常是开发新抗肿瘤剂的潜在靶标。

癌症治疗的另一种策略是使用能够结合癌细胞的抗体。以下是抗体介导的癌症治疗方法的典型的机理：

导弹疗法(missile therapy)：在该方法中，将药物与能够特异性结合到癌细胞的抗体结合，然后所述药物特异性作用于癌细胞。即使对于有较强副作用的药物也能使它们集中地作用于癌细胞。除药物之外，还报道了将药物前体、将前体代谢成活性形式的酶等与抗体结合的方法。

靶向功能分子的抗体的应用：这种方法利用，例如，能结合生长因子受体或生长因子的抗体来抑制生长因子与癌细胞之间的结合。一些癌细胞的增殖依赖于生长因子。例如，已知一些癌症的细胞生长依赖于表皮生长因子(EGF)或血管内皮生长因子(VEGF)。对于这样的癌症，预期抑制生长因子与癌细胞之间的结合可有治疗作用。

抗体细胞毒性：在癌细胞中，能结合某些种类的抗原的抗体可诱发针对癌细胞的细胞毒性应答。对于所述抗体类型，抗体分子本身能诱发直接的抗肿瘤作用。显示对癌细胞的细胞毒性的抗体作为预期高效抗肿瘤的抗体药物，正日益获得人们的关注。

发明内容

本发明人研究了能够诱导细胞毒性且以细胞中表达增加的基因为靶标的抗体。其结果揭示了当CDH3表达细胞与抗CDH3抗体接触时，能诱导对于该细胞的强力的细胞毒性，从而完成了本发明。

具体地，本发明涉及以下的药物组合物或方法：

[1]含有作为活性成分的抗CDH3抗体的药物组合物，其中抗CDH3抗体通过抗体效应物功能损伤(即杀死细胞，对该细胞有毒性，抑或抑制增殖或细胞***)CDH3表达细胞。

[2]使用该药物组合物来治疗与CDH3表达细胞相关的任何的病理状态。在典型的实施方案中，该细胞是癌症细胞(cancer cell)，诸如胰腺癌症、肺癌症、结肠直肠癌症、***癌症、乳腺癌症、胃癌症以及肝脏癌症细胞。

[3]本发明的药物组合物中的抗体典型的是单克隆抗体。

[4]在某些实施方案中，本发明的抗体含有效应物功能，诸如抗体依赖的细胞毒性，补体依赖性细胞毒性或者这两者。

[5]损伤CDH3表达细胞的方法将包括以下步骤：

a)使CDH3表达细胞接触抗CDH3抗体。作为该抗体结合的结果，该抗体的效应物功能会导致CDH3表达细胞的损伤(即细胞毒性)。

[6]免疫原性组合物，用于诱导含有针对CDH3表达细胞的效应物功能的抗体。典型地，该组合物含有作为活性成分的CDH3多肽、其免疫学活性片段、或者表达该多肽或片段的核酸分子。

[7]使用抗体治疗疾病的方法，其中，该抗体含有针对CDH3表达细胞的效应物功能，该方法包含给药CDH3多肽、其免疫学活性片段、或者能够表达该多肽或片段的细胞或者DNA的步骤。

附图说明

图1是对癌细胞中CDH3基因进行半定量RT-PCR分析的结果的照片。A；显示胰腺癌症细胞系。B；显示肺癌细胞系。C；结肠直肠癌症细胞系。D；***癌症细胞系。E；乳腺癌症细胞系。F；胃癌症细胞系。G；肝脏癌症细胞系。

图2显示的是利用针对A：过表达c-erbB-2基因的KLM-1；和B：低表达c-erbB-2基因的PK-45P的赫塞汀(Herceptin)进行的ADCC分析的结果。

图3显示的是利用针对过表达CDH3的下列细胞的抗CDH3多克隆抗体BB039分别进行ADCC分析的结果：胰腺癌症细胞系KLM-1，B：肺癌症细胞系CNI-H358，C：结肠直肠癌症细胞系HCT-116，D：***癌症细胞系PC-3，E和F，乳腺癌症细胞系HCC1143和HCC1937，G：胃癌症细胞系MKN7，H：肝脏癌症细胞系SNU-449；以及I：低表达的胰腺癌症细胞系PK-45P。

发明详述

本发明涉及利用抗体效应物功能来损伤CDH3表达细胞的药物组合物，其中所述组合物含有作为活性成分的抗CDH3抗体。本发明也涉及抗CDH3抗体用于制备药物组合物的用途，该药物组合物用于利用抗CDH3抗体的效应物功能来损伤CDH3表达细胞。本发明的药物组合物含有抗CDH3抗体以及药学上可接受的载体。

本发明人使用cDNA微阵列对从胰腺癌症患者收集来的胰腺癌症细胞以及正常细胞进行了基因表达分析(Nakamura et al.，(2004)Oncogene；23：2385-400)。随后鉴定出了很多在胰腺癌细胞中表达特异地增强的基因。在这些在胰腺癌症细胞中表达有变化的基因中，挑选了编码细胞质膜蛋白的胎盘钙粘连蛋白(P钙粘连蛋白；CDH3)基因作为胰腺癌症治疗的靶标基因，该基因在主要器官中是低水平表达的。通过挑选在主要器官中低水平表达的基因来避免副作用的危险。在通过该方法挑选的基因所编码的蛋白中，已经确认了抗CDH3抗体含有针对CDH3表达细胞的效应物功能。另外，确认了在其它的癌症细胞系中具有相似的作用，这些细胞系诸如过表达该基因的肺癌症细胞系、结肠直肠癌症细胞系、***癌症细胞系、乳腺癌症细胞系、胃癌症细胞系以及肝脏癌症细胞系。

本发明人所取得的发现显示，在强迫表达***中，具有c-myc-His标签的CDH3定位在细胞质膜上，该定位是通过免疫荧光显微镜检查确认的。CDH3基因编码一种在其N末端可能具有信号肽的氨基酸序列。如上所述，观察到了该蛋白主要定位在细胞质膜上，因此认为该蛋白是跨膜蛋白。另外，CDH3在主要器官中的低水平表达，及其在胰腺癌症细胞、肺癌症细胞、结肠直肠癌症细胞、***癌症细胞、乳腺癌症细胞、胃癌症细胞以及肝脏癌症细胞中的高表达，证明该基因能够用作临床标志物和治疗靶标。

利用效应物功能来破坏癌症细胞的优选条件是，例如如下：

·大量抗原分子在癌症细胞膜表面表达，

·抗原在癌组织中均匀分布，

·与抗体结合的抗原在细胞表面存留较长时间。

更具体地，例如，由抗体识别的抗原必须表达在细胞膜的表面。另外，优选的是在形成癌症组织的细胞中抗原阳性细胞的比例尽可能的高。在理想的状态下，所有的癌症细胞都是抗原阳性的。当癌症细胞群中掺杂了抗原阳性和抗原阴性细胞时，可能无法预期获得抗体的临床治疗效果。

通常，当在细胞表面表达最大可能数目的分子时，可预期强力的效应物功能。结合到抗原上的抗体不被细胞摄入也是很重要的。一些受体在结合了配体之后被摄入细胞内(内吞作用)。同样地，结合细胞表面抗原的抗体也会被吸收到细胞内。将抗体吸收到细胞内的这类现象称为内化作用(internalization)。当内化作用发生时，抗体恒定(Fc)区被摄取进入细胞。然而，效应物功能所必需的细胞或分子保留在抗原表达细胞外。因此，内化作用抑制抗体效应物功能。因此，当期待抗体效应物功能时，选择能够较少引起抗体内化的抗原是重要的。本发明人第一次揭示了CDH3是具有这样的性质的靶标抗原。

分离的”或“纯化的”多肽是基本上不含细胞物质(例如糖类、脂质或来源于该蛋白所由来的细胞或组织源的其它污染蛋白)的多肽，或在其为化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质的多肽。术语“基本上不含细胞物质”包括多肽的制备物，其中该多肽与细胞(该多肽分离自该细胞或者在该细胞中重组表达)的细胞组分分开。因此，基本上不含细胞物质的多肽包括这样的多肽制备物，其中多肽制备物含异源蛋白(本说明书中也称为“污染蛋白”)少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)。当多肽为重组产生时，还优选其基本上不含培养基，包括培养基少于蛋白质制备物体积的约20％、10％或5％的多肽制备物。当多肽是由化学合成产生时，优选基本上不含化学前体或其他化学物质，包括这样的多肽制备物，其中蛋白合成中涉及的化学前体或其他化学物质少于蛋白质制备物体积的约30％、20％、10％或5％(以干重计)。例如，通过随后对蛋白制备物进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳及凝胶考马斯亮蓝染色，出现单一条带，可以证明蛋白制备物含有分离的或纯化的多肽。在优选的实施方案中，本发明的抗体或其片段是分离的或纯化的。

“分离的”或“纯化的”核酸分子是与该核酸分子的天然源中存在的其它核酸分子相分离的核酸分子。当由重组技术产生“分离的”或“纯化的”核酸分子(例如cDNA分子)时，其可基本上不含其它细胞物质或培养基，或者当其由化学合成时，其可基本上不含化学前体或其它化学物质。在优选的实施方案中，编码本发明的抗体或其片段的核酸分子是分离的或纯化的。

“抗体”和“免疫球蛋白”是具有相同的一般结构特征的糖蛋白。抗体显示对特异性抗原的结合专一性，而免疫球蛋白包括抗体和抗原特异性还没有得到确定的其它类抗体分子。例如，属于后一种类的多肽由例如淋巴***低水平产生，而由骨髓瘤以更高的水平产生。

“天然抗体和免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键数目有变化。每条重链和轻链也具有间隔规则的链内二硫键。每条重链的一端有一个可变域(VH)，其后是许多恒定域(CH)。每条轻链的一端有一个可变域(VL)，其另一端有一个恒定域(CL)；轻链的恒定域与重链的第一个恒定域对齐，轻链的可变域与重链的可变域对齐。有人认为，某些氨基酸残基形成轻链和重链可变区之间的界面(Chothia et al.，(1985)J MolBiol.；186：651-63；Novotny and Haber，(1985)Proc Natl Acad SciUSA.；82：4592-6)。

术语“可变域”是指抗体的特定部分，所述部分在序列上在抗体之间有很大的不同，因此被用于每一特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中。然而，可变性并不是平均分布于抗体的整个可变区。在轻链可变域和重链可变域中，它都集中在三个区段中，这三个区段称为“互补决定区”(“CDRs”)或超变区。可变域中保守性更高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域分别包括4个框架区，它们主要采取β-折叠构型，由3个CDR连接，这3个CDR形成环，这些环连接该β-折叠结构，在一些情况下构成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR被框架区紧密保持在一起，并与来自于其它链的CDR一道促成抗体的抗原结合位点的形成(Kabat et al.，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，NationalInstitute of Health，Bethesda，Md.)。恒定区不直接参与抗体和抗原的结合，但是显示各种效应物功能，例如在抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。

木瓜蛋白酶消化抗体得到两个相同的具有单一抗原结合位点的抗原结合片段，称为“Fab”片段，和一个残余的“Fc”片段。胃蛋白酶处理得到一个F(ab’)₂片段，其具有两个抗原结合位点。“Fv”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个区域由一个重链可变域和一个轻链可变域紧密非共价联系而成的二聚体所组成。正是在这种构型中，每个可变域的3个CDR相互作用，从而在VH-VL二聚物表面上定义出一个抗原结合位点。6个CDR共同使抗体具有抗原结合特异性。然而，即使单一的可变域(或Fv的一半，仅包括3个对抗原特异的CDR)也能识别和结合抗原，虽然亲和力比完整的结合位点低。

Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一个恒定域(CH-1)。Fab’片段与Fab片段不同，其重链CH-1域的C-末端增加了几个残基，包括来自于抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本说明书中，Fab’-SH用来指称恒定区的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab’。F(ab’)₂抗体片段最初是作为中间有铰链半胱氨酸的成对Fab’片段产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

基于其恒定区的氨基酸序列，可将源自所有脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分为两种明显不同的类型，称为κ(kappa)和λ(lambda)。

根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分成不同种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几类可进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同种类免疫球蛋白相应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。

本说明书中使用的术语“单克隆抗体”指从基本上同种的抗体群体获得的抗体，即，除了少量存在的可能自然发生的突变之外，构成群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的，定向针对单个抗原位点。此外，每种单克隆抗体定向针对抗原上的单个决定簇，这与传统(多克隆)抗体制备物不同，传统(多克隆)抗体制备物通常包括定向针对不同决定簇(表位)的不同抗体。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的有利之处还在于它们可通过杂交瘤细胞培养合成，不会受其它免疫球蛋白污染。因此，修饰语“单克隆的”表示抗体系获自基本上同一的抗体群体这一特征，并不解释为要求用任何特殊方法生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler和Milstein(1975)Nature.；256：495-7首次提出的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备(Cabillyetal.，(1984)Proc NatlAcad Sci USA.；81：3273-7)。

本说明书中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体或免疫球蛋白，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或者属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而该链的剩余部分与源自别的物种或者属于别的抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，只要它们显示所需的生物活性(Cabilly et al.，supra；Morrison et al.，(1984)Proc Natl Acad SciUSA.；81：6851-5)，还包括所述抗体的片段。最典型的，嵌合抗体或免疫球蛋白包含人和鼠抗体片段，通常是包含人的恒定区和鼠的可变区。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含源自非人免疫球蛋白最小序列的特异性的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。所述片段还包括Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂或者抗体的其它抗原结合序列。大多数情况下，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种的CDR的残基(供体抗体)所取代，所述非人物种例如具有所需特异性、亲和力和能力(capacity)的小鼠、大鼠或兔。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以被相应的非人残基所取代。在本发明中，人源化抗体中的少数框架，两个，或优选一个框架，可被非人残基的框架所取代。此外，人源化抗体可含有既不是在受体抗体中也不是在引入的CDR中发现的残基或框架序列。进行这些修饰以进一步改良和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体基本上全部包含至少一个，通常是两个可变域，其中所有或基本上所有与非人免疫球蛋白CDR区对应的CDR区以及所有或基本上所有框架区具有人免疫球蛋白共有序列。人源化抗体还优选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详情参见Jones et al.，(1986)Nature.；321：522-5；Riechmann et al.，(1988)Nature.；332：323-7；Presta，(1992)Curr Opin Struct Biol.2：593-6。

也可以使用除了含有人源框架区和恒定区以外还含有人源可变区的完全人源抗体。可以使用本领域已知的多种技术来制备该抗体。例如体外方法包括使用在噬菌体上展示重组的人源抗体片段库(例如，Hoogenboom &Winter，J.Mol.Biol.227：381-8(1991))。相似地，人源抗体可以通过将人源免疫球蛋白基因座转入到内源免疫球蛋白基因已经部分或者全部失活的转基因动物(例如小鼠)的体内来制备。该方法在例如美国专利Nos.6,150,584，5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016中已有描述。

“单链Fv”或“sFv”抗体片段由抗体的VH域和VL域组成，其中所述域存在于单个多肽链中。优选地，Fv多肽进一步包括VH域和VL域之间的接头，其使sFv能够形成抗原结合所需的三维结构。已经提出许多方法以识别化学结构，用于将由来于抗体V区的、天然聚集但化学上分离的轻多肽链和重多肽链转化为sFv分子，后者会折叠成基本上类似于抗原结合位点结构的三维结构(美国专利5,091,513、5,132,405和4,946,778；Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenberg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994))。本文中的术语“效应物功能”指与抗体的Fc区有关的细胞毒性。或者，效应物功能也可解释为一种决定由抗体的抗原识别触发的生物活性的作用。例如，驱动结合于抗原的抗体的Fc区损伤表达所述抗原的细胞的功能，也可称为抗体效应物功能。本说明书中优选的靶细胞是癌症细胞。具体地，将抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)，补体依赖的细胞毒性(CDC)以及中和活性称为抗体效应物功能。以下对每种功能进行描述。

抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)：

由各种抗体的Fc区实现的效应细胞功能极大地依赖于抗体种类。存在包含对免疫球蛋白类IgG、IgE或IgA特异的Fc受体的细胞。IgG、IgE和IgA类抗体的Fc区各自与特异的Fc受体结合，含有相应Fc受体的细胞识别并与结合到细胞膜等的抗体结合。结果，例如，具有Fc受体的细胞被活化，并在细胞间抗体转运中发挥作用。

举例来说，IgG类抗体被T细胞、NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞上的Fc受体所识别。这些细胞与IgG类抗体的Fc区结合并被它活化，并针对所述抗体结合的细胞表达细胞毒性。通过抗体效应物功能获得细胞毒性的细胞，例如T细胞、NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，称为效应细胞。特别是IgG类抗体通过效应细胞上的Fc受体活化这些细胞，然后杀死抗体的可变区所结合的靶细胞。这称为抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)。可基于效应细胞的类型将ADCC划分如下：

ADMC：IgG依赖巨噬细胞介导的细胞毒性，和

ADCC：IgG依赖NK细胞介导的细胞毒性。

在本发明的ADCC中，对效应细胞类型没有限制。换言之，本发明的ADCC还包括ADMC，其中巨噬细胞是效应细胞。

已知抗体的ADCC是抗肿瘤作用的一种重要机制，特别是在应用抗体的癌症治疗中(Clynes RA，et al.，(2000)Nature Med.，6：443-6.)。例如，抗-CD20抗体嵌合抗体的疗效与ADCC之间的密切关系已有报道(Cartron G，etal.，(2002)Blood，99：754-8.)。因此，在本发明中，ADCC在抗体效应物功能中也是特别重要的。

例如，人们认为ADCC是已经开始临床应用的美罗华(Rituxan)、赫赛汀(Herceptin)等的抗肿瘤作用中的一种重要机制。美罗华和赫赛汀是治疗药，分别用来治疗非何杰金氏淋巴瘤和转移性乳腺癌。

目前，ADCC介导的细胞毒性的机制大致解释如下：通过结合至细胞表面的抗体将效应细胞桥联到靶细胞上，认为效应细胞通过投递某种致死信号至靶细胞从而诱导靶细胞凋亡。无论如何，在本发明中含有效应物功能的抗体中都包括通过效应细胞诱导细胞毒性的抗体。

为了评价所述分子的ADCC活性，可进行体外ADCC试验，例如U.S.Pat.Nos.5,500,362或5,821,337中所描述的。可选地，或另外，可在体内如在动物模型中，评价所述分子的ADCC活性，例如Clynes et al.，(1998)ProcNatl Acad Sci USA.；95：652-56中显示的。

补体依赖细胞毒性(CDC)：

已知与抗原结合的免疫球蛋白的Fc区激活补体途径。也已经显示激活途径可能根据免疫球蛋白的种类而不同。例如，在人抗体中，IgM和IgG激活经典途径。另一方面，IgA、IgD和IgE则不激活该途径。即，激活补体的功能局限于IgM和IgG类抗体。特别地，对抗体可变区所结合的细胞的溶解作用称为补体依赖细胞毒性(CDC)。

活化的补体通过若干反应产生C5b-9膜攻击复合物(MAC)，其具有损伤细胞膜的活性。人们认为以这种方式产生的MAC损伤病毒颗粒和细胞膜，而不依赖于效应细胞。MAC介导的细胞毒性的机制的基础如下所述。MAC对细胞膜具有强亲和力。与细胞膜结合的MAC在细胞膜中开孔，使得水容易流进和流出细胞。结果使细胞膜不稳定，或使渗透压改变，从而细胞被破坏。活化的补体所致的细胞毒性仅延及位于已结合抗原的抗体附近的膜。因此，MAC介导的细胞毒性依赖于抗体特异性。ADCC和CDC可表达彼此独立的细胞毒性。但事实上，这些细胞毒性可在生物体中复合发挥作用。

为了评定靶标分子的CDC活性，可以按照例如Gazzano-Santoro等，(1997)J Immunol Methods.；202：163-71中描述的方法进行CDC分析。

中和活性：

存在具有使病原体丧失感染性和毒素丧失活性的功能的抗体。抗体介导的中和可以通过抗原可变区与抗原的结合来实现，或者，可能需要补体的介导。例如在某些情况下，抗病毒抗体需要补体介导从而使病毒丧失其感染性。Fc区对于补体的参与是必不可少的。因此，所述抗体含有需要Fc用于中和病毒和细胞的效应物功能。

在这些效应物功能中本说明书优选的是ADCC和/或CDC。本发明基于抗-CDH3抗体与CDH3表达细胞结合，然后表达效应物功能这一发现。

本发明也涉及损伤CDH3表达细胞的方法，该方法包括以下步骤：

1)使CDH3表达细胞接触抗CDH3抗体；以及

2)利用已结合到细胞上的抗体的效应物功能损伤CDH3表达细胞。

在本发明的方法或者药物组合物中，可以损伤或者杀死任何CDH3表达细胞。例如本发明中优选的CDH3表达细胞是胰腺癌症细胞、肺癌症细胞、结肠直肠癌症细胞、***癌症细胞、乳腺癌症细胞、胃癌症细胞以及肝脏癌症细胞。其中优选的是胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、***癌、乳腺导管癌、胃的管状腺癌、肝细胞癌(HCC)或者细胞。

可以在体内或者体外使细胞和抗体接触。当将体内的癌症细胞作为靶标CDH3表达细胞时，本发明的方法实际上是治疗或者预防癌症的方法。具体地，本发明提供治疗癌症的方法，该方法包括以下步骤：

对癌症患者给药能够结合CDH3的抗体，以及

通过结合到癌细胞的抗体的效应物功能损伤癌症细胞。

本发明人确认了结合CDH3的抗体可以通过效应物功能有效地损伤CDH3表达细胞，特别是胰腺癌症细胞、肺癌症细胞、结肠癌症细胞、***癌症细胞、乳腺癌症细胞、胃癌症细胞以及肝脏癌症细胞。本发明人还确认了CDH3有很高的可能性在胰腺癌症细胞、肺癌症细胞、结肠直肠癌症细胞、***癌症细胞、乳腺癌症细胞、胃癌症细胞以及肝脏癌症细胞中高水平表达。另外，在正常组织中，CDH3的表达水平很低。综合这些信息可知，施用抗CDH3抗体的胰腺癌症、肺癌症、结肠癌症、***癌症、乳腺癌症、胃癌症以及肝脏癌症的治疗方法可能是有效的，并且几乎没有副作用的危险。

优选的使用含有IgA、IgE或IgG的Fc区的抗体来表现ADCC。同样地，优选地使用IgM或者IgG的抗体Fc区来表现CDC。然而，本发明的抗体不受限制，只要该抗体含有所需的效应物功能即可。可以通过，例如对残基或者序列进行各种取代来构建Fc部分的变体、类似物或者衍生物。

变体(或类似物)多肽包括Fc氨基酸序列中加入一个或多个氨基酸残基的***变体。***可位于蛋白质的任一或两个末端，或者可位于Fc氨基酸序列的内部区域中。在任一或两个末端有额外氨基酸序列的***变体可包括例如融合蛋白和含氨基酸标记或标签的蛋白质。例如，Fc分子可选地包含N-末端Met，特别是当分子在细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))中重组表达时。

在Fc缺失变体中，Fc多肽中一个或多个氨基酸残基被去除。缺失可能在Fc多肽的一个或两个末端发生，或者去除Fc氨基酸序列内的一个或多个残基。因此，缺失变体包括Fc多肽序列的所有片段。

在Fc取代变体中，Fc多肽的一个或多个氨基酸残基被除去并代之以备选的残基。在一个方面中，取代的性质是保守的，然而本发明包括非保守性的取代。

亲本多肽Fc区优选人Fc区，例如天然序列的人Fc区人IgG1(A和非A同种异型)或人IgG₃Fc区。在一个实施方案中，ADCC提高的变体与带有天然序列的IgG₁或IgG₃Fc区和该变体的抗原结合区的抗体相比，介导ADCC实质上更有效。优选地，变体包括对Fc区的298、333和334位点的残基中两个或三个残基的取代，或基本上由它们组成。免疫球蛋白重链中残基的编号方式是如Kabat et al.，(见上文)中所述的EU索引的编号方式，明确地以提述方式将其并入本文。更优选地，取代298、333和334位点处的残基(例如用丙氨酸残基)。此外，为了产生ADCC活性提高的Fc区变体，人们通常会通过重组产生对FcγRIII(其被认为是介导ADCC的一个重要的FcR)的亲和力提高的Fc区变体。例如，可在氨基酸位点256、290、298、312、326、330、333、334、360、378或430中任何一个或多个位点处将氨基酸修饰(例如***、缺失或取代)引入亲本Fc区，以产生这样的变体。对FcγRIII亲和力提高的变体还可能对FcγRII的亲和力降低，特别是对抑制性的FcγRIIb受体亲和力降低。

无论如何，任何变体氨基酸***、删除和/或取代(例如，1-50个氨基酸，优选地，1-25个氨基酸，更优选地，1-10氨基酸)是都为本发明所考虑到，并且在本发明的范围之内。通常优选保守的氨基酸取代。而且，有些情况下，修饰可以是肽模拟物或者修饰氨基酸(诸如D氨基酸)的形式。

或者，在本发明中，可通过修饰除氨基酸序列之外的生物化学性质，例如添加至Fc区的糖链，来增强ADCC活性。例如据报道，IgG无岩藻糖残基可增强ADCC活性(Shinkawa et al.，(2003)J.Biol.Chem.：278(5)：3466-73.)。因此，缺乏Fc区岩藻糖残基的抗体是本发明优选的抗体。更具体地说，为了增强ADCC活性，可去除附接于Fc区的CH2域的岩藻糖残基。可使用除CHO以外的细胞作为宿主细胞，来表达无Fc区岩藻糖残基的抗体。这里，岩藻糖残基被CHO中高表达的α，1-6-岩藻糖基转移酶(FUT8)添加至抗体。

因此，本发明中优选的是属于这些种类的来源于人的抗体。利用从人或移植人抗体基因的嵌合动物收集的产生抗体的细胞，可获得人抗体(IshidaI，et al.，(2002)Cloning and Stem Cells.，4：91-102.)。

此外，抗体Fc区可与任意可变区联结。具体地，不同动物物种的可变区与人恒定区结合的嵌合抗体是公知的。或者，通过将源于人的可变区与任意恒定区结合也可获得人-人嵌合抗体。另外，CDR移植技术也是众所周知的，其中将构成人抗体可变区的互补决定区(CDRs)用异源抗体的CDR取代(“Immunoglobulin genes”，Academic Press(London)，pp260-274，1989；Roguska MA，etal.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，91：969-73.)。通过替换CDR而替换了抗体结合特异性。即，转入了人CDH3结合抗体的CDR的人源化抗体会识别人CDH3。这些经转移的抗体也可称为人源化抗体。这样获得的并带有效应物功能所必需的Fc区的抗体均可用作本发明的抗体，不管其可变区的来源如何。例如，本发明中优选包括人IgG Fc的抗体，即使它们的可变区包括源自另一种类或其它物种的免疫球蛋白的氨基酸序列。

本发明的抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体。甚至当施用于人的时候，可以使用来源于上述转移了人源抗体基因的动物的人源多克隆抗体。或者，可以使用遗传工程技术构建的免疫球蛋白，诸如人化抗体、人-非人嵌合抗体以及人-人嵌合抗体。而且通过人源抗体生成细胞来获得人源单克隆抗体的方法也是已知的。

可以使用CDH3或者含有其部分肽的片段作为免疫原来获得本发明的抗体。本发明的CDH3可以是来源于任何物种的，优选地是来自于诸如人，小鼠或者大鼠这样的哺乳动物，更加优选的是来自于人的。人源CDH3核苷酸序列和氨基酸序列是已知的。CDH3的cDNA核苷酸序列(GenBankAccession No.BC041846)如SEQ ID NO：1所示，由该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示(GenBank Accession No.AAH41846.1)。本领域中的技术人员能够常规的分离含有所提供的核苷酸序列的基因，按需要制备序列的片段，并获得含有目标氨基酸序列的蛋白。

例如，可以将编码CDH3蛋白或其片段的基因***到已知的表达载体中，并用其转化宿主细胞。所需蛋白或其片段可以通过任意的和标准的方法从宿主细胞内部或者外部收集，并且也可用作抗原。另外，也可以使用蛋白、其水解产物、以及化学合成的蛋白作为抗原。而且，也可以将表达CDH3或其片段的细胞本身用作免疫原。

当使用肽片段作为CDH3免疫原时，特别优选的是选择含有被预测为胞外域的区域的氨基酸序列。可以通过CDH3的N末端的1到26位置来预测信号肽的存在(Shimoyama Y，et al.，(1989)J Cell Biol.；109(4Pt1)：1787-94.)。因此，例如，优选以除了N末端信号肽(26个氨基酸残基)以外的区域作为免疫原来获得本发明的抗体。就是说，优选以能够结合CDH3胞外域的抗体作为本发明的抗体。

因此，本发明中优选的抗体是具有对于效应物功能重要的Fc以及能够结合胞外结构域的可变区的抗体。当以对人给药为目标时，优选的是具有IgG Fc。

可用所述抗原免疫任意哺乳动物。但优先考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常使用啮齿类(rodents)，兔形目(lagomorphs)或灵长类(primates)动物。

啮齿目包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目包括例如家兔。灵长类包括例如狭鼻猿(东半球猴)如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(Macacamulatta)、狒狒(sacred baboons)和黑猩猩(chimpanzees)。

用抗原免疫动物的方法是本领域中已知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫动物的标准方法。具体地，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，可将抗原悬液与适量的标准佐剂如弗氏(Freund’s)完全佐剂混合，乳化后施用于哺乳动物。其后优选每4至21天多剂量施用与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。还可以使用合适的载体进行免疫。如上述进行免疫后，可以用标准方法检验血清中所需抗体的水平的增加。

可以从已检查了血清中所需抗体的增加的经免疫哺乳动物制备针对CDH3蛋白的多克隆抗体。为此可以从这些动物收集血液，或通过使用任意常规的方法从它们的血液中分离血清。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，以及包含从所述血清中分离的多克隆抗体的级分。IgG和IgM可从识别CDH3蛋白的级分中制备，例如使用与CDH3蛋白偶联的亲和柱，并进一步用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。在本发明中，抗血清可用作多克隆抗体。可选地，还可应用纯化的IgG、IgM等。

为了制备单克隆抗体，从用抗原免疫的哺乳动物收集免疫细胞，检查血清中所需抗体水平的升高(如上所述)，并用于细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选来自脾。其它优选的用于与上述免疫原融合的亲本细胞包括，例如，哺乳动物骨髓瘤细胞，更优选获得了便于用药物选择融合细胞的性质的骨髓瘤细胞。

根据已知的方法，如Milstein等(Galfre，G.and Milstein，C.，(1981)Methods.Enzymol.：73，3-46.)的方法，可将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞进行融合。

对于细胞融合产生的杂交瘤，可通过在标准选择培养基如HAT培养基(包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中进行培养而加以选择。细胞培养通常在HAT培养基中连续进行数天至数周，这段时间足以杀死除了所需的杂交瘤细胞之外的所有细胞(非融合的细胞)。然后，进行标准的有限稀释，筛选并克隆生产所需抗体的杂交瘤细胞。

上述方法中可用抗原免疫非人动物以制备杂交瘤。此外，可以在体外用蛋白、表达蛋白的细胞或它们的悬液免疫来自于EB病毒等感染细胞的人淋巴细胞。然后，使免疫后的淋巴细胞与能够无限***的源自人的骨髓瘤细胞(U266等)融合，从而获得产生所需的能与所述蛋白结合的人抗体的杂交瘤细胞(特公昭63-17688)。(未审查的日本公开专利申请(JP-A)Sho63-17688)

然后将获得的杂交瘤细胞移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。获得的单克隆抗体可以应用例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联了本发明的蛋白的亲和柱进行纯化。本发明的抗体不仅可以用于纯化和检测本发明的蛋白，还可以作为本发明的蛋白的激动剂和拮抗剂的候选物。这些抗体还可以用于与本发明的蛋白相关的疾病的抗体治疗。当将获得的抗体施用于人体时(抗体治疗)，优选使用人抗体或人源化抗体，因为它们的免疫原性低。

例如，可以用选自蛋白、表达蛋白的细胞或它们的悬液的抗原免疫包含人抗体基因库的转基因动物。然后，从该动物收集产生抗体的细胞，将其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤，从这些杂交瘤可制备抗-蛋白的人抗体(参见国际公布号92-03918，94-02602，94-25585，96-33735和96-34096)。

或者，可以通过癌基因使产生抗体的免疫细胞，如经免疫的淋巴细胞无限增殖化(immortalize)，并用于制备单克隆抗体。

以这种方式获得的单克隆抗体也可以利用基因工程方法制备(例如参见Borrebaeck，C.A.K.and Larrick，J.W.，(1990)Therapeutic MonoclonalAntibodies，MacMillan Publishers，UK)。例如，可以从免疫细胞(如产生抗体的杂交瘤或经免疫的淋巴细胞)克隆编码抗体的DNA；然后将这些DNA***合适的载体；并转入宿主细胞，从而制备重组抗体。本发明中也可以使用如上所述制备的重组抗体。

抗体可以通过与各种分子【如聚乙二醇(PEG)】结合来加以修饰。以这种方式修饰的抗体也可用于本发明。可通过将抗体进行化学修饰来获得修饰抗体。这些修饰方法对本领域技术人员来说是常规的。还可以用其它蛋白质修饰抗体。用蛋白质分子修饰的抗体可以利用基因工程产生。即，可以通过将抗体基因与编码修饰蛋白的基因融合来表达靶蛋白。例如，抗体效应物功能可以在与细胞因子或趋化因子结合时得到增强。事实上，与IL-2、GM-CSF等融合的蛋白，其抗体效应物功能的增强已得到证实(Penichet ML，etal.，(2001)Hum Antibodies，10：43-9.)。增强效应物功能的细胞因子或趋化因子包括IL-2、IL-12、GM-CSF、TNF、嗜酸性粒细胞趋化物质(eosinophilchemotactic substance)(RANTES)等。

或者，本发明的抗体可作为含有源自非人抗体的可变区和源自人抗体的恒定区的嵌合抗体，或者作为含有源自非人抗体的互补决定区(CDR)、源自人抗体的框架区(FR)及恒定区的人源化抗体而获得。这样的抗体可利用已知方法产生。

可以利用分子生物学的标准技术来制备编码嵌合产物和CDR-移植产物的DNA序列。例如利用聚合酶链式反应(PCR)从产生抗体的细胞的RNA合成可变区，来制备编码感兴趣的抗体的CDR的基因(参见例如Larrick etal.，“Methods：a Companion to Methods in Enzymology”，vol.2：page 106(1991)；Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”inMonoclonal Antibodies：Production，Engineering and Clinical Application；Ritter et al.(eds.)，page166(Cambridge University Press，1995)，和Ward et al.，“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”in Monoclonal Antibodies：Principles and Applications；Birch et al.(eds.)，page137(Wiley-Liss，Inc.，1995))。可以利用寡核苷酸合成技术完全或部分合成编码嵌合产物和CDR-移植产物的DNA序列。可视情况应用定点诱变和聚合酶链式反应技术。例如，可以应用如Jones等(1986)Nature.；321：522-5所描述的寡核苷酸定向合成。还可以应用如Verhoeyen等(1988)Science.；239：1534-6或Riechmann et al.，(同上文)所描述的事先存在的可变区的寡核苷酸定向突变。还可以应用如Queen等(1989)Proc Natl Acad Sci USA.；86：10029-33；PCT公布WO90/07861所描述的利用T4DNA聚合酶填补有缺口的寡核苷酸。

可以用任意合适的宿主细胞/载体***来表达编码CDR移植重链和轻链的DNA序列。可以应用细菌(例如大肠杆菌)和其它微生物***，特别是用于表达抗体片段如Fab和(Fab’)₂片段，尤其是Fv片段和单链抗体片段如单链Fv。可以应用真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达***，特别用于产生大的CDR移植抗体产物，包括完整的抗体分子。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞和骨髓瘤或杂交瘤细胞系。

可以将如上获得的抗体纯化至均质。例如，可根据用于纯化和分离蛋白质的一般方法纯化或分离抗体。例如，可以利用适当选择的柱层析组合，包括但不限于亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦，来分离抗体(Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow andDavid，Lane(edit.)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。

可以使用蛋白A柱和蛋白G柱作为亲和柱。可用的蛋白A柱的例子包括Hyper D，POROS和Sepharose F.F(Pharmacia)。

例示性的层析(除亲和层析外)包括离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析和吸附层析(“Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual”Daniel R.Marshak et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1996)。可以按照液相层析(如HPLC或FPLC)程序进行层析。

举例来说，可以采用吸光度测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和/或免疫荧光方法来测定本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定在平板上，将本发明的蛋白质施加到平板上，再施加含有所需抗体的样品(如产生抗体的细胞的培养上清液或纯化的抗体)。然后施加带有酶(如碱性磷酸酶)标签的识别第一抗体的第二抗体，并温育平板。洗涤后，在平板中加入酶底物如磷酸对硝基苯酯，测定吸光度，评价样品的抗原结合活性。可按照与蛋白质相同的方式使用蛋白质片段(C-末端或N-末端片段等)。可以使用BIAcore(Pharmacia)评价本发明抗体的结合活性。

此外，按照实施例中概述的方法，也可以评价抗体效应物功能。例如，在意欲评价其效应物功能的抗体存在的条件下，将靶CDH3表达细胞与效应细胞温育。如果检测到靶细胞的破坏，可以确认所述抗体具有诱导ADCC的效应物功能。可以将在无抗体或无效应细胞的条件下观察到的靶细胞破坏的水平作为对照与效应物功能水平比较。明显地表达CDH3的细胞可以用作靶细胞。具体地，可以应用许多种在实施例中证实表达CDH3的细胞系。所述细胞系可以从细胞库获得。此外，可选择具有更强效应物功能的单克隆抗体。

在本发明中，抗-CDH3抗体可作为药物施用于人或其它动物。本发明中可以施用抗体的除人之外的动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猫、犬、羊、猪、牛、猴、狒狒和黑猩猩。抗体可直接施用于受试者，另外可以利用已知的药物制备方法配制成剂型。例如，根据需要，可将药物以可注射形式，如与水或者任何其它药物可接受的液体所成的无菌溶液或混悬液，进行非胃肠道施用。例如，可将这种化合物与可接受的载体或溶剂混合制成一般接受的用作药物所需的单位剂型，所述载体或溶剂具体地说有无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、溶剂、防腐剂、黏合剂等。

包括生理盐水、葡萄糖和佐剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠)等的其它等张溶液可用作注射用水溶液。还可将它们与适当的增溶剂一起使用，所述增溶剂例如醇，特别是乙醇和多元醇(例如丙二醇和聚乙二醇)，和非离子型表面活性剂(例如聚山梨酯80^TM或HCO-50)。

麻油或大豆油可用作油质液体，可将苯甲酸苄酯或苯甲醇与它们一起使用作为增溶剂。配方中可使用缓冲溶液(磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液等)、镇痛药(盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(苯甲醇、苯酚等)和抗氧化剂。制备的注射剂可以装入到合适的安瓿中。

在本发明中，可以给患者施用抗-CDH3抗体，例如动脉内、静脉内、经皮、鼻内、经支气管、局部或肌内施用。通过滴注或注射血管内(静脉内)给药是给肺、结肠、胰腺、***、乳腺、胃或肝脏癌症患者全身施用抗体的一般方法的一个例子。使抗体试剂局部集中于肺中原发性病灶或转移灶的方法包括利用支气管镜(支气管镜检查)进行的局部注射和在CT引导下或用胸腔镜检查进行的局部注射。使抗体试剂局部集中于肝中原发性病灶或转移灶的方法包括利用肝门静脉注射或动脉输注进行的局部注射。此外，将动脉内导管***供给癌症细胞营养的静脉附近从而局部注射抗肿瘤剂如抗体试剂，这种方法作为局部控制疗法对于肺、结肠、胰腺、***、乳腺、胃或肝脏癌症的原发性病灶和转移灶有效。

虽然剂量和施用方法根据患者的体重、年龄和施用方法而变化，但是本领域技术人员能够常规选择它们。另外，可将编码抗体的DNA***用于基因治疗的载体中，并施用该载体以进行治疗。剂量和施用方法根据患者的体重、年龄和状况而变化；不过本领域技术人员能够适当选择它们。

可以将抗CDH3抗体以可使基于针对CDH3表达细胞之效应物功能的细胞毒性得到证实的量施用于活体。例如，虽然根据症状有一定程度的差别，但抗-CDH3抗体的剂量为0.1mg/kg-250mg/kg每天。通常，用于成年人(体重60kg)的剂量为5mg-17.5g每天，优选为5mg-10g每天，更优选为100mg-3g每天。服药日程为以2-10天的间隔给药1-10次，并在例如给药3-6次后观察进展。

虽然本发明的抗体保留效应物功能，但是在某些实施方案中，可使用公知的技术将细胞毒剂与抗体结合。细胞毒剂数量多且种类多，包括但不限于细胞毒类药物、毒素或所述毒素的活性片段。合适的毒素及其相应片段包括白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)、auristatin等。细胞毒剂还包括放射化学试剂，所述放射化学试剂是通过将放射性同位素与本发明的抗体缀合或将放射性核素与共价附接于抗体的螯合剂结合而制得的。制备所述缀合物的方法是本领域公知的。

或者，施用包含编码抗体或其功能衍生物的序列的核酸，通过基因治疗的方式来治疗或预防与CDH3表达细胞有关的疾病，例如胰腺、肺、结肠、***、乳腺、胃和肝脏癌症。基因治疗指通过给受试者施用被表达的(expressed)或可表达的(expressible)核酸而进行的治疗。在本发明的这个实施方案中，核酸产生其编码的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段介导预防或治疗效果。

本领域可用的任何基因治疗方法都可以根据本发明应用。例示性的方法描述如下。

关于基因治疗方法的综述，参见Goldspiel et al.，(1993)Clin.Pharm.；12：488-505；Wu and Wu，(1991)Biotherapy.；3：87-95；Tolstoshev，(1993)Ann Rev Pharmacol Toxicol.；32：573-96；Mulligan，(1993)Science.；260：926-32；Morgan and Anderson，(1993)Ann Rev Biochem.；62：191-217；Clare RobinsonTrends Biotechnol.；11(5)：155-215。重组DNA技术领域中普遍公知的可应用的方法描述于Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)。

在一个优选的方面中，本发明的组合物包括编码抗体的核酸，所述核酸是表达载体的组成部分，所述表达载体在合适的宿主中表达所述抗体或者其片段或嵌合蛋白质或者重链或轻链。特别是，这样的核酸具有与抗体编码区可操作地连接的启动子，优选异源启动子，所述启动子是诱导型或组成型，以及，可选地，是组织特异型的。在另一特定的实施方案中，应用这样的核酸分子，其中在抗体编码序列和任何其它期望的序列两侧有促进在基因组中的期望位点发生同源重组的区域，从而使编码抗体的核酸能够在染色体内表达(Koller and Smithies，(1989)Proc Natl Acad SciUSA.；86：8932-5；Zijlstra et al.，(1989)Nature.；342：435-8)。在具体的实施方案中，所表达的抗体分子是单链抗体；或者，核酸序列包括编码抗体的重链和轻链二者或它们的片段的序列。

核酸分子投递至受试者的方式可以是直接的，或者是间接的，直接的情况下，受试者直接暴露于核酸或携带核酸的载体，间接的情况下，首先用核酸在体外转化细胞，然后将细胞移植进入受试者。所述两种方法分别被称为体内基因治疗或体外基因治疗。

在一个具体实施方案中，核酸序列直接施用于体内，其在体内表达产生编码产物。这可以通过本领域已知的众多方法中任何一种来实现，例如，通过将核酸序列构建为适当的核酸表达载体的组成部分，并施用该载体从而使它们进入细胞内，例如通过使用缺陷型或减毒的反转录病毒或其它病毒载体感染(参见U.S.Pat.No.4,980,286)，或者通过直接注射裸露DNA，或者使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或者通过用脂质或细胞表面受体或转染试剂包覆，封装在脂质体、微粒或微粒体中，或者通过与已知进入核的肽相连结来施用，或者通过与易受到受体介导的内吞作用的配体(可用于靶向特异表达该受体的细胞类型)相连结来施用(参见例如Wu and Wu，(1987)J Biol Chem.；262：4429-32)等。在另一个实施方案中，可以形成核酸-配体复合物，其中配体包括融合病毒肽用以破坏内体，使得核酸免受溶酶体降解。在另一实施方案中，可通过靶向特异受体使核酸在体内定向，以实现细胞特异性摄取和表达(参见例如PCT公布WO 92/06180，WO 92/22635，WO92/20316，WO93/14188或WO 93/20221)。或者，可将核酸引入细胞内，并通过同源重组掺入到宿主细胞DNA中表达(Koller andSmithies，(1989)Proc Natl Acad Sci USA.；86：8932-5；Zijlstra et al.，(1989)Nature.；342：435-8)。

在一个具体实施方案中，应用含有编码本发明的抗体或其片段的核酸序列的病毒载体。例如，可应用反转录病毒载体(参见Miller et al.，(1993)Methods Enzymol.；217：581-99)。所述反转录病毒载体包含使病毒基因组正确包装和整合到宿主细胞DNA中所必需的组分。将编码意欲用于基因治疗的抗体的核酸序列克隆至一个或多个载体，这些载体帮助将基因投递至受试者。关于反转录病毒载体的详情可在Boesen et al.，(1994)Biotherapy.；6：291-302找到，其描述应用反转录病毒载体将mdr 1基因投递至造血干细胞，从而使这些干细胞对化疗更有抵抗力。其它说明反转录病毒载体在基因治疗中应用的参考资料有：Clowes et al.，(1994)J ClinInvest.；93：644-51；Kiem et al.，(1994)Blood.；83：1467-73；Salmons andGunzberg，(1993)Hum Gene Ther.；4：129-41；Grossman and Wilson，(1993)Curr Opin Genet Dev.；3：110-4。

腺病毒是另一类可以用于基因治疗的病毒载体。腺病毒对于将基因投递至呼吸道上皮而言是特别引人注目的载体。腺病毒自然感染呼吸道上皮，在呼吸道上皮引起轻度疾病。用于基于腺病毒的递药***的其它靶标有肝、中枢神经***、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能感染不***细胞的优点。Kozarsky和Wilson，(1993)Curr Opin Genet Dev.；3：499-503提出一篇关于基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等(1994)Hum Gene Ther.；5：3-10演示了应用腺病毒载体将基因转移至恒河猴的呼吸道上皮。其它在基因治疗中应用腺病毒的实例可在Rosenfeld et al.，(1991)Science.；252：431-4；Rosenfeld et al.，(1992)Cell.；68：143-55；Mastrangeli et al.，(1993)J Clin Invest.；91：225-34；PCT公布WO94/12649；Wang et al.，(1995)Gene Ther.；2：775-83中找到。在一个优选的实施方案中应用腺病毒载体。

在基因治疗中也视情况使用腺伴随病毒(AAV)(Walsh et al.，(1993)ProcSoc Exp Biol Med.；204：289-300；美国专利5,436,146)。

另一种基因治疗的方法涉及将基因转移至组织培养中的细胞，通过如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染等方法。通常，转移方法包括将可选标记转移至细胞。然后使细胞置于选择下，以分离出已摄取了转移基因并正在表达它的细胞。然后将所述细胞投递至受试者。

在本实施方案中，将核酸引入细胞，然后在体内施用产生的重组细胞。所述引入可以通过本领域公知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转化、微细胞介导(microcellmediated)的基因转移、原生质球融合等。很多用于将外源基因引入细胞的技术是本领域众所周知的(参见例如Loeffler and Behr，(1993)Methods Enzymol.；217：599-618；Cotton et al.，1993，Methods Enzymol.；217：618-44；Cline MJ.Pharmacol Ther.1985；29(1)：69-92.)，并且可以根据本发明加以应用，只要不破坏受体细胞必需的发育和生理功能。所述技术应可使核酸稳定转移至细胞，以便核酸能够被所述细胞表达，优选能够被其细胞后代遗传和表达。

产生的重组细胞可以通过本领域公知的各种方法投递至受试者。重组血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)优选由静脉内施用。预计应用的细胞量依赖于期待的效果、患者状态等，可由本领域技术人员确定。

为基因治疗目的而引入核酸的细胞包括任何期望的、可用的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得的。在优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是受试者自体的。

在重组细胞用于基因治疗的一种实施方案中，将编码抗体或其片段的核酸序列引入细胞，以便它们可由所述细胞或它们的后代表达，然后将重组细胞在体内施用以取得疗效。在特定的实施方案中，应用干细胞或祖细胞。任何可在体外分离和保持的干细胞和/或祖细胞都有可能根据本发明的该实施方案应用(参见例如PCT公布WO 94/08598；Stemple and Anderson，(1992)Cell.；71：973-85；Rheinwald，(1980)Methods Cell Biol.；21A：229-54；Pittelkow and Scott，(1986)Mayo Clin Proc.；61：771-7)。

在一个具体的实施方案中，为基因治疗目的而意欲引入的核酸包括与编码区可操作地连接的诱导型启动子，以便可以通过控制适当转录诱导物的有无来控制核酸的表达。

此外，本发明提供用于诱导抗体的免疫原性组合物，所述抗体含有针对CDH3表达细胞的效应物功能，其中组合物包含作为活性成分的CDH3或免疫学活性CDH3片段，或者可表达CDH3或免疫学活性CDH3片段的DNA或细胞。或者，本发明涉及CDH3或免疫学活性CDH3片段，或者可表达CDH3或免疫学活性CDH3片段的DNA或细胞在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于诱导含有针对CDH3表达细胞的效应物功能的抗体。

抗-CDH3抗体的施用通过所述抗体的效应物功能损伤癌细胞。因此，如果可在体内诱导抗CDH3抗体，则可取得相当于施用抗体的疗效。当施用由抗原组成的免疫原性组合物时，可在体内诱导靶抗体。因此本发明的免疫原性组合物在针对CDH3表达细胞的疫苗疗法中特别有用。所以，本发明的免疫原性组合物作为，例如，用于胰腺、肺、结肠、***、乳腺、胃、或肝脏癌症治疗的疫苗组合物是有效的。

本发明的免疫原性组合物可以含有作为活性成分的CDH3或者具有免疫学活性的CDH3片段。免疫学活性的CDH3片段是指能够诱导识别CDH3并含有效应物功能的抗CDH3抗体的片段。以下，将CDH3和具有免疫学活性的CDH3片段称为免疫原性蛋白。可以通过实际免疫动物并确认所诱导的抗体的活性来确定给定的片段是否能够诱导目标抗体。可以使用，例如实施例中描述的方法来实施抗体诱导及其活性的确认。例如，可以将含有对应于CDH3的382到654位的氨基酸序列的片段作为本发明中的免疫原使用。

本发明的免疫原组合物包括药学上可接受的载体以及免疫原性蛋白，活性成分。如果需要，也可以将组合物与佐剂组合。可以使用灭活的结核菌，白喉类毒素，皂苷以及诸如此类的物质作为佐剂。

或者，可以使用编码免疫原性蛋白的DNA或保持可表达状态的所述DNA的细胞作为免疫原性复合物。利用表达靶抗原的DNA作为免疫原(即所谓的DNA疫苗)的方法是众所周知的。可以通过将编码CDH3或其片段的DNA***适当的表达载体而获得DNA疫苗。

可以使用反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、仙台病毒载体等作为所述的载体。此外，可以将如下所述的DNA作为裸露DNA直接引入细胞，然后表达：在该DNA中，编码免疫原性蛋白的DNA功能性地连接于启动子的下游。可以将裸露DNA包裹在核糖体或病毒被膜载体中引入细胞。

本发明的CDH3多肽和多核苷酸还可以用于在体内诱导免疫反应，包括抗体和特异性针对CDH3表达细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的产生。在所述方法中，期望的肽对CTL的诱导可以通过在体内或者回体由抗原呈递细胞(APC)将所述肽呈递到T细胞来实现。

举例来说，收集患者的血细胞，如外周血单个核细胞(PBMC)，利用可表达免疫原性蛋白的载体将它们转化，并返回至患者。经转化的血细胞在患者体内产生免疫原性蛋白，并诱导靶抗体。或者，收集患者的PBMC，使细胞以回体方式与多肽接触，诱导APC或CTL之后，可将所述细胞施用于受试者。施用体外诱导的APC或CTL之前可将它们克隆。通过克隆和培养具有较高靶细胞损伤活性的细胞，可更有效地进行细胞免疫疗法。此外，用这种方式分离的APC和CTL不仅可用于针对细胞所来源的个体的细胞免疫疗法，还可用于针对来自于其它个体的相似类型的肿瘤的细胞免疫疗法。

通常，当多肽用于细胞免疫疗法时，已知通过组合多数具有不同结构的多肽并使它们与APC(特别是树突状细胞)接触可增强CTL诱导的效率。因此，用蛋白质片段刺激APC时，使用多种类型的片段的混合物是有利的。

可通过观察针对肿瘤的抗体产生的诱导来确认由多肽诱导的抗肿瘤免疫。例如，当以多肽免疫的实验动物中诱导了针对该多肽的抗体时，以及肿瘤细胞的生长受所述抗体抑制时，认为多肽有能力诱导抗肿瘤免疫。

当用编码免疫原性蛋白的DNA或用该DNA转化的细胞作为本发明的免疫原性复合物时，可将它们与免疫原性蛋白和增强其免疫原性的载体蛋白组合。

如上所述，本发明提供诱导含有针对CDH3表达细胞的效应物功能的抗体的方法，该方法包括施用CDH3、免疫学活性CDH3片段或者能够表达该CDH3或者该片段的DNA或者细胞的步骤。本发明的诱导含有效应物功能的抗体，所述效应物功能能够损伤CDH3表达细胞，诸如肺癌症、结肠癌症、胰腺癌症、***癌症、乳腺癌症、胃癌症或者肝脏癌症。结果，可以获得针对胰腺癌症、肺癌症、结肠癌症、***癌症、乳腺癌症、胃癌症以及肝脏癌症的治疗效果。

每天，可以口服或非胃肠道施用0.1-250mg/kg的本发明的免疫原性组合物。非胃肠道施用包括皮下注射和静脉注射。施用于单个成年人的剂量通常为5mg-17.5g每天，优选5mg-10g每天，更优选100mg-3g每天。

将本文中引用的所有现有技术文献以提述的方式并入本文。

实施例

以下，基于实施例对本发明进行进一步的说明。

细胞系：

在含有10％或者20％的胎牛血清的合适的培养基中以单层形式增殖了人胰腺癌症、肺癌症、结肠癌症、***癌症、乳腺癌症、胃癌症或者肝脏癌症细胞系。实验中所使用的细胞系如表1中所示。

E-MEM；Eagle′s基础培养基

F-12；F-12营养混合物(HAM)

L-15；Leibovitz′s L-15培养基

McCoy；改良型McCoy′s 5A培养基

RPMI；RPMI 1640培养基

ATCC；美国典型培养物保藏中心

HSRRB；健康科学研究资源库

JFCR；日本癌症研究基金会

TKG；发育、衰老与癌症研究所，东北大学(Tohoku University)

而且，在使用抗CDH3抗体进行的ADCC测定中使用了以下的细胞系：

胰腺癌症细胞系KLM-1。

肺癌症细胞系CNI-H358。

结肠直肠癌症细胞系HCT-116。

***癌症细胞系PC-3。

乳腺癌症细胞系HCC1143和HCC1937。

胃癌症细胞系MKN7。

肝脏癌症细胞系SNU-449。

抗体的构建

按照标准规程，在医学生物学研究所(Medical Biological Laboratories，MBL；Nagoya，Japan)使用细菌中表达的具有His标签的融合蛋白作为免疫原制备了各种蛋白特异性抗体。这些融合蛋白包含对应于该蛋白的一部分(382到654位的残基)的蛋白部分。

针对CDH3的半定量RT-PCR：

使用Kit(QIAGEN)从细胞系中抽提了总RNA。另外，通过Oligo(dT)纤维素柱(Amersham Biosciences)从总RNA中纯化了mRNA，并将其利用SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen)通过反转录(RT)合成为第一链cDNA。通过监测GAPDH作为定量对照，为每种第一链cDNA制备合适的稀释液用于后续的PCR扩增。本发明人所使用的引物序列为针对CDH3：

5’-CTGAAGGCGGCTAACACAGAC-3’(SEQ.ID.NO.3)以及

5’-TACACGATTGTCCTCACCCTTC-3’(SEQ.ID.NO.4)；

针对c-erbB2：

5’-GTATTTGATGGTGACCTGGGAAT-3’(SEQ.ID.NO.5)以及

5’-CCCCTGGGTCTTTATTTCATCT-3’(SEQ.ID.NO.6)；

针对GAPDH：

5’-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3’(SEQ.ID.NO.7)以及

5’-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3’(SEQ.ID.NO.8)；

针对β-肌动蛋白：

5’-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’(SEQ.ID.NO.9)以及

5’-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’(SEQ.ID.NO.10)。

所有的PCR反应包括最初的在94℃保温2分钟的变性步骤，并且由94℃ 30秒、58℃ 30秒和72℃保温1分钟组成，对于GAPDH进行21个循环，对于c-erbB2进行32个循环(退火温度为从62℃逐渐降低到58℃)，对于β-肌动蛋白进行20个循环(退火温度为从62℃逐渐降低到57℃)或者对于CDH3进行28个循环(退火温度为从62℃逐渐降低到56℃)，该反应是在GeneAmp PCR system9700(PE Applied Biosystems)上进行的。

在胰腺癌症细胞系KLM-1中发现了CDH3的过表达(图1A)。另外，为了阐明抗CDH3多克隆抗体(BB039)对于多种癌症的效力，确认了CDH3的表达。确认了在肺癌症细胞系CNI-H358、结肠直肠癌症细胞系HCT-116、***癌症细胞系PC-3、乳腺癌症细胞系HCC-1143和HCC-1937、胃癌症细胞系MKN7、肝脏癌症细胞系SNU-449中CDH3的过表达(图1B-G)。

流式细胞术分析

将癌症细胞(5 x 10⁶个)与纯化的多克隆抗体(pAb)或者兔IgG(对照)在4℃温育30分钟。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤该细胞，然后将该细胞在FITC标记的Alexa Flour 488(Invitrogen)中4℃温育30分钟。用PBS洗涤该细胞，并且在流式细胞仪(Becton Dickinson)上对其进行了分析，并且用BD CellQuest^TM Pro软件(Becton Dickinson.)对数据进行了分析。将平均荧光强度(MFI)定义为流式细胞计数强度的比率(每种蛋白特异性抗体的强度/兔IgG的强度)。

使用CDH3过表达细胞，考察了抗CDH3抗体在细胞表面的结合比率。其结果是，与兔IgG(对照)相比，更高比例的抗CDH3多克隆抗体(BB039)结合到了KLM-1、CNI-H358，HCT-116、PC-3、HCC1143、HCC1937、MKN7、SNU-449和PK-45P细胞上(MFI分别为：124.09、145.96、78.44、56.77、151.2、67.32、102.7、75.67和8.51)。

ADCC测定

在37℃使靶标细胞暴露于0.8μM的钙荧光素乙酰氧甲基酯(Calcein-AM，DOJINDO)30分钟。在细胞酯酶剪切Calcein-AM产生荧光衍生物钙荧光素之后，calcein-AM会发出荧光。用AIM-V培养基(LifeTechnologies，Inc.)洗涤靶标细胞两次后将它们加入测定中，然后接种到96孔U形底平板中(4 x 10³个细胞/孔)。从健康的志愿者体内获得了人外周血单个核细胞(PBMC)，利用Ficoll-Paque(Amersham Biosciences)梯度密度离心加以分离，然后使用该细胞作为效应细胞。在96孔U形底平板上，将不同E：T比例的靶标癌细胞和效应细胞与抗CDH3抗体BB039(1μg/孔)或者对照抗体赫塞汀【Herceptin】(10μg/孔；Roche)在200μl的AIM-V培养基中37℃共温育6小时，每个样品三组平行。使用IN Cell Analyzer 1000(AmershamBioscience)快速获得了活细胞的荧光图像，基于该图像评价了抗CDH3多克隆抗体(BB039)对于这些细胞的ADCC效果。利用Developer tool ver.5.21软件(Amersham Bioscience)，通过对荧光物体或者小泡计数将这些图像数值变换为活细胞数(对于靶标细胞的细胞面积)。

对照分析包括将靶标细胞仅与抗CDH3抗体BB039或者仅与效应细胞温育。在一些实验中使用了赫塞汀作为对照。

没有观察到BB039抗CDH3多克隆抗体本身对于细胞的直接细胞损伤。然而，BB039抗CDH3多克隆抗体在过表达CDH3的细胞KLM-1、NCI-H358、HCT-116、PC-3、HCC1143、HCC1937、MKN7和SNU-449细胞中诱导了ADCC(图3A-H)，然而对于CDH3低表达的PK-45P细胞没有作用(图3I)。

工业实用性：

本发明是基于，至少是部分基于抗体细胞毒性可以损伤CDH3表达细胞的发现。本发明人鉴定了CDH3是一种在胰腺癌症、肺癌症、结肠癌症、***癌症、乳腺癌症、胃癌症以及肝脏癌症中有强表达的基因。因此，可以使用能够结合CDH3的抗体对CDH3表达细胞相关的疾病(例如，胰腺癌症、肺癌症、结肠癌症、***癌症、乳腺癌症、胃癌症以及肝脏癌症等)适宜地实施治疗。本发明人实际确认的结果显示了在抗CDH3抗体存在的情况下由于ADCC作用在胰腺癌症、肺癌症、结肠癌症、***癌症、乳腺癌症、胃癌症以及肝脏癌症细胞系中存在细胞毒性作用。

序列表

<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)

<120>利用抗CDH3抗体的效应物功能来损伤细胞的方法

<130>ONC-A0519P

<150>US60/778,079

<151>2006-02-28

<160>10

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>3686

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(545)..(3034)

<400>1

<210>2

<211>829

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列.

<400>3

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列.

<400>4

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列.

<400>5

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列.

<400>6

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列.

<400>7

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列.

<400>8

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>9

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列.

<400>10

Claims (7)

1.一种用于损伤CDH3表达细胞的药物组合物，该药物组合物包含抗CDH3抗体作为活性成分，该抗体含有抗体效应物功能。

2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述CDH3表达细胞是胰腺癌症细胞、肺癌症细胞、结肠癌症细胞、***癌症细胞、乳腺癌症细胞、胃癌症细胞或肝脏癌症细胞。

3.根据权利要求1的药物组合物，其中所述抗CDH3抗体是单克隆抗体。

4.根据权利要求1的药物组合物，其中所述抗体效应物功能是抗体依赖性细胞毒性，或补体依赖性细胞毒性，或上述两者。

5.一种用于损伤CDH3表达细胞的方法，该方法包括以下步骤：

a)使CDH3表达细胞接触抗CDH3抗体；和

b)通过已结合到细胞的抗体的效应物功能来损伤CDH3表达细胞。

6.一种用于诱导含有针对CDH3表达细胞的效应物功能的抗体的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含CDH3、CDH3的免疫学活性片段、或者能够表达CDH3或其免疫学活性片段的DNA作为活性成分。

7.一种用于诱导含有针对CDH3表达细胞的效应物功能的抗体的方法，该方法包括施用CDH3、CDH3的免疫学活性片段、或者能够表达CDH3或其免疫学活性片段的细胞或DNA。

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