CN101394867A - 大环内酯类免疫抑制剂的水溶性聚乙二醇结合物的制备方法 - Google Patents

大环内酯类免疫抑制剂的水溶性聚乙二醇结合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了制备42－聚乙二醇化雷帕霉素的方法，包括将一种雷帕霉素在脂肪酶存在下与酰化剂起反应，形成酰化的雷帕霉素，然后将酰化的雷帕霉素在碱存在下与甲氧基聚(乙二醇)衍生物起反应。本发明还描述了应用这些步骤制备32－聚乙二醇化他克莫司和/或子囊霉素的方法。

Description

大环内酯类免疫抑制剂的水溶性聚乙二醇结合物的制备方法
发明背景
本发明涉及大环内酯类免疫抑制剂的水溶性聚(乙二醇)结合物的制备方法，所述大环内酯类免疫抑制剂为西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司、temsirolimus(CCI-779)、他克莫司(FK506)和子囊霉素(FK520)。
雷帕霉素(1)、他克莫司(FK506，2)和子囊霉素(FK520，3)为结构相似的大环聚酮化合物，且都是有效的免疫抑制剂，相互作用于相同的细胞内受体，但有不同的作用方式，彼此在不同阶段抑制T细胞活化(Rosen等，“Natural products as probes of cellular function：studies ofimmunophilins”Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1992，31，384-400)。这些大环内酯具有抗微生物活性，并且在包括实验性***反应性脑脊髓炎、关节炎的自身免疫性疾病动物模型，糖尿病动物模型，SLE的MRL/lpr小鼠模型，过度增生性皮肤疾病和葡萄膜视网膜炎中也均有效。
Figure A200780007920D00091
1雷帕霉素          2他克莫司(FK506)R＝CH2CH＝CH2
                   3子囊霉素(FK520)R＝CH2CH3
雷帕霉素和他克莫司已被批准用于防止移植排斥反应。但是，这两种化合物由于它们非常有限的水溶性在按配方制造组合物时存在类似的问题。例如，他克莫司在水中的溶解度为12μg/mL。如此低的溶解度要求相当复杂的制剂。举例来说，需要200mg/mL氢化聚氧乙烯(polyoxy)60蓖麻油(HCO-60)和80％(v/v)无水酒精作为增溶剂，以帮助5mg他克莫司溶解形成静脉注射剂。雷帕霉素在水中的溶解度约为2.6μg/mL且具有低的口服生物利用度(<15％)(Yatscoff等，“Rapamycin：distribution，pharmacokinetics，and therapeutic rangeinvestigations”Ther.Drug Monit.1995，17，666-671)。尽管雷帕霉素也是一种有效的肿瘤生长抑制剂，对多种实体肿瘤通常具有IC50<5Onm，但这些特性限制了雷帕霉素除低剂量治疗如免疫抑制以外的临床应用。
聚乙二醇(PEG)和甲氧基聚乙二醇(mPEG)是可用的线性或分支的中性聚合物，具有不同的分子量和低多分散性(Mw/Mn<1.05)。已发现这些水/有机溶剂可溶的无毒聚合物有用于生物和制药应用。一个这样的应用是将这些聚合物与非或低水溶性的小分子治疗剂结合，制得水溶性PEG-药物结合物，这称为聚乙二醇化。据报道有机分子的聚乙二醇化可提高有机分子的水溶性，并赋予其他有益的性能如改善血浆半衰期、改善生物分布和降低毒性(Greenwald等，“Effective drug deliveryby PEGylated drug conjugates”，Advanced Drug Delivery Rev.2003，55，217-250；Pasut等，“Protein，peptide and non-peptide drug PEGylation fortherapeutic，application”，Expert Opin.Ther.Patents 2004，14，859-894)。
美国专利申请出版号US-2005/0234234中论述了脂肪酶催化乙酰化的雷帕霉素。这种酶方法在温和条件下从雷帕霉素区域特异地(regiospeciflcally)得到雷帕霉素42-酯衍生物，且具有优良产率。在此引入所述美国专利申请出版物，作为参考。
美国专利号5,955,457；5,780,462；6,432,973和6,331,547中描述了雷帕霉素及其衍生物的PEG结合物的制备。美国专利号5,362,718中描述了雷帕霉素CCI-779的羟基酯的制备，由该羟基酯可制得聚乙二醇化CCI-779。这些美国专利在此全部引入作为参考。这些专利描述了通过酯键经化学连接雷帕霉素及其衍生物至甲氧基聚乙二醇化合物如硫醇衍生物(mPEGSH)，形成了结合物。藉此要求进行溶剂萃取法和色谱纯化以收回所期望的PEG结合物。照这样，在高效液相色谱法(HPLC)纯化后，制得产率55％的雷帕霉素42-碘醋酸酯。
国际专利出版号WO 99/03860中使用类似的操作，论述了水溶性PEG-他克莫司(FK-506)结合物的制备。由于在雷帕霉素/他克莫司的骨架上存在多样的OH-官能度，这些操作的一个主要缺点为酯键引入是低选择性的。此外，在聚乙二醇化过程中应用作为碱的碳酸氢钠水溶液，产生了几种副产物，需要多个纯化步骤，具有低或中等的回收产率。
美国专利号6,440,990中描述了依维莫司的合成，美国专利号6,331,547中描述了PEG-依维莫司(II)的合成。在此引入所述美国专利作为参考。
本领域需要制备大环内酯类免疫抑制剂的水溶性聚(乙二醇)结合物的替代方法。
发明概述
在一个方面，提供制备大环内酯类免疫抑制剂的聚乙二醇结合物的方法。
在另一个方面，提供制备雷帕霉素、依维莫司、替莫西罗莫司(temsirolimus)、他克莫司和子囊霉素的聚乙二醇结合物的方法。
在以下详细说明的优先实施方案中，进一步描述了本发明其他方面和优点。
发明详述
提供制备一种雷帕霉素(包括雷帕霉素、依维莫司、替莫西罗莫司、他克莫司或子囊霉素)聚乙二醇结合物的新颖高效的高产率方法。该方法包括简单的分离步骤，其核心在于应用脂肪酶在这些大环内酯上完全区域选择性引入酯键，得到优良产率的聚乙二醇化结合物。
当本文使用时，聚乙二醇，缩写为(PEG)，是一种线性聚合物，在各个末端具有羟基：
HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OH
该式可以表示为HO-PEG-OH，其中应当理解-PEG-代表没有末端基团的聚合物骨干：
-(CH2CH2O)nCH2CH2-
聚乙二醇还可以包括单活化的，烷基结尾的聚乙二醇，如甲氧基-PEG-OH(mPEGOH)：
CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH
其中，一个末端为惰性甲氧基，而另一个末端为准备用于化学改性的羟基。在一个实施方案中，活化的mPEG为甲氧基-PEG-SH(mPEGSH)：
CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2-SH
在另一个实施方案中，聚乙二醇还可以包括双活化的，硫氢基-结尾的聚乙二醇，如HS-PEG-SH(PEGSH)：
HS-(CH2CH2O)nCH2CH2-SH
也打算用于这样的目的。
虽然聚乙二醇的分子量可以充分地变化，通常选择分子量约400至约30,000的聚合物。在一个实施例中，选择分子量约1000至约30,000的聚乙二醇。在另一个实施例中，选择分子量约2500至约20,000的聚乙二醇。在再一个实施例中，选择分子量约5000至约20,000的聚乙二醇。本领域技术人员将容易明白在这些式中的n为通常范围10～1000的整数。
本文所用的“一种雷帕霉素”是指雷帕霉素和可被化学或生物改性为雷帕霉素环衍生物的化合物，所述化合物仍然保留生物活性。因此术语“一种雷帕霉素”包括雷帕霉素的酯、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、肟、腙、和羟基胺，以及其中环上的官能团已被例如通过还原或氧化改性的雷帕霉素。术语“一种雷帕霉素”还包括雷帕霉素的药学上可接受的盐，该雷帕霉素由于含有酸性或碱性部分能够形成这样的盐。
在一个实施方案中，雷帕霉素的酯和醚为雷帕霉素环31-位羟基的酯和醚、27-位羟基(27-酮化学还原后)的酯和醚、42-位羟基的酯和醚，尤其为雷帕霉素42-位羟基的羟基烷基、羟基烯基、羟基烷基芳基的酯和醚。肟、腙、和羟基胺为雷帕霉素环的酮。
在另一个实施方案中，雷帕霉素的31-酯和醚描述于下列专利中：烷基酯(美国专利号4,316,885)；氨基烷基酯(美国专利号4,650,803)；氟化酯(美国专利号5,100,883)；酰胺酯(美国专利号5,118,677)；氨基甲酸酯(美国专利号5,118,678；5,441,967；5,434,260；5,480,988；5,480,989；和5,489,680)；甲硅烷基酯(美国专利号5,120,842)；氨基酯(美国专利号5,130,307)；缩醛(美国专利号5,51,413)；氨基二酯(美国专利号5,162,333)；磺酸酯或硫酸酯(美国专利号5,177,203)；酯(美国专利号5,221,670)；烷氧基酯(美国专利号5,233,036)；O-芳基、-烷基、-链烯基和-炔基醚(美国专利号5,258,389)；碳酸酯(美国专利号5,260,300)；芳基羰基和烷氧基羰基氨基甲酸酯(美国专利号5,262,423)；氨基甲酸酯(美国专利号5,302,584)；羟基酯(美国专利号5,362,718)；受阻酯(美国专利号5,385,908)；杂环酯(美国专利号5,385,909)；偕-二取代的酯(美国专利号5,385,910)；氨基链烷酸酯(美国专利号5,389,639)；磷酰基氨基甲酸酯(美国专利号5,391,730)；氨基甲酸酯(amino carbamate esters)(美国专利号5,463,048)；受阻的N-氧化物酯(美国专利号5,491,231)；生物素酯(美国专利号5,504,091)；和O-烷基醚(美国专利号5,665,772)。在上述专利中描述了这些酯和醚的制备。
在再一个实施方案中，美国专利号5,256,790论述了雷帕霉素的27-酯和醚。在上述专利中描述了这些酯和醚的制备。
在又一个实施方案中，雷帕霉素的42-羟基烷基、42-羟基烯基、42-羟基烷基芳基的醚公开于美国专利号6,440,990；5,665,772；和5,258,389中。雷帕霉素的42-羟基烷基、42-羟基烯基、42-羟基烷基芳基的酯公开在美国专利号5,362,718中。在上述专利中描述了这些酯和醚的制备。
在一个实施方案中，大环内酯类免疫抑制剂包含莽草酸衍生的环己基区域。在一个实施例中，大环内酯类免疫抑制剂是雷帕霉素、他克莫司或子囊霉素。
在另一个实施方案中，大环内酯类免疫抑制剂为一种雷帕霉素，具有以下结构：
Figure A200780007920D00141
其中，R1选自H和烷基、链烯基、芳基、和芳基烷基；R2选自H、羟基和-O-烷基；R3为H、烷基、链烯基、芳基、芳基烷基、和-C(O)R31；R31选自H、烷基、链烯基、芳基、和芳基烷基；R4选自H、羟基和-O-烷基；R5选自H、羟基烷基、羟基烯基、羟基芳基、羟基芳烷基、和-C(O)R51；和R51选自羟基烷基、羟基烯基、羟基芳基、和羟基芳烷基。
“一种雷帕霉素”的实例包括但不限于雷帕霉素(美国专利号3,929,992)、32-去甲基雷帕霉素、32-去甲氧基雷帕霉素、41-去甲基雷帕霉素、41-去甲氧基雷帕霉素(国际专利公布号WO-2004/007709)、7，32-二-去甲基雷帕霉素、脯氨酸-雷帕霉素、与3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸形成的雷帕霉素42-酯(CCI-779，美国专利号5,362,718)、和42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素(依维莫司，RADOOl，美国专利号5,665,772)。
因此提供本文描述的方法，用于制备大环内酯类免疫抑制剂的聚乙二醇结合物。这些方法包括在脂肪酶存在下将酰化剂与含莽草酸衍生的环己基区域的大环内酯类免疫抑制剂起反应，形成酰化的大环内酯。然后将酰化的大环内酯在碱存在下与甲氧基聚(乙二醇)衍生物起反应。在一个实施方案中，大环内酯类免疫抑制剂为一种雷帕霉素化合物。
在一个实施方案中，PEG-雷帕霉素结合物具有以下结构：
Figure A200780007920D00142
其中，R1选自H和烷基、链烯基、芳基、和芳基烷基；R2选自H、羟基和-O-烷基；R3为H、烷基、链烯基、芳基、芳基烷基、或-C(O)R31；R31选自H、烷基、链烯基、芳基、和芳基烷基；R4选自H、羟基和-O-烷基；X选自氧(-O-)、-O-烷基-O-、-O-链烯基-O、-O-芳基-O-、-O-芳基烷基-O-、和-OC(O)R7；R7选自-烷基-O-、-链烯基-O-、-芳基-O-、和-芳基烷基-O-；n为10～1000的整数；和X为O或S。
在进一步的实施方案中，PEG-雷帕霉素结合物具有以下结构(I)：
Figure A200780007920D00151
其中n为10～1000的整数；和X为O或S。
在另一个实施方案中，PEG-雷帕霉素结合物具有以下结构(II)：
Figure A200780007920D00152
其中X和n定义如上。
在再一个实施方案中，PEG-雷帕霉素结合物具有以下结构(III)：
Figure A200780007920D00161
其中X和n定义如上。
在还一个实施方案中，PEG-雷帕霉素结合物具有以下结构(IV)：
Figure A200780007920D00162
其中X和n定义如上。
本方法也有用于制备除雷帕霉素化合物以外的亲免素PEG结合物。这些亲免素含有莽草酸衍生的环己基区域(该区域类似于雷帕霉素化合物的42-OH官能度)，包括但不限于FK-506相关的自然产物。
本文所用的术语“FK-506相关的自然产物”是指具有下列核心结构的化合物：
Figure A200780007920D00171
其中，R7、R8、和R9独立地为H或烷基且R是乙基或烯丙基。在一个实例中，R7、R8、和R9为Me；且R为CH2CH＝CH2。在另一个实例中，R7、R8、和R9为Me；且R为CH2CH3。
本文所用的术语“烷基”是指直链和支链的饱和脂肪烃基团，具有一个至十个碳原子(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、或C10)，例如一个至八个碳原子(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、或C8)、一个至六个碳原子(例如C1、C2、C3、C4、C5、或C6)、或一个至四个碳原子(例如C1、C2、C3、或C4)。术语“链烯基”是指含有至少有一个碳碳双键的直链和支链的烷基基团，且具有二个至八个碳原子(例如C2、C3、C4、C5、C6、C7、或C8)、二个至六个碳原子(例如C2、C3、C4、C5、或C6)、或二个至四个碳原子(例如C2、C3、或C4)。术语“炔基”是指含有至少有一个碳碳叁键的直链和支链的烷基基团，且具有二个至八个碳原子(例如C2、C3、C4、C5、C6、C7、或C8)、二个至六个碳原子(例如C2、C3、C4、C5、或C6)、或二个至四个碳原子(例如C2、C3、或C4)。
本文所用的术语“芳基”是指碳环芳香族***，它可以是单个环，或多个稠合或连接在一起的芳环，照这样稠合或连接的环的至少一部分形成结合的芳香族***。该芳基包括但不限于苯基、萘基、联苯、蒽基、四氢萘基、菲基、和茚满。
术语“芳基烷基”是指被芳基取代的烷基。烷基可位于芳基的任何位点，条件是该连接形成一个稳定的化学键。
本文所用的术语“芳烷基”是指具有芳基连接到所述烷基任何碳原子上的烷基。
术语“羟基烷基”、“羟基烯基”、“羟基芳基”、和“羟基芳烷基”是指刚才所述的烷基、链烯基、芳基、芳烷基具有-OH基团连接到所述烷基、链烯基、芳基、或芳烷基的任何碳原子上，条件是该连接形成一个稳定的化学键。
术语“卤素”是指Cl、Br、F、或I。
在一个实施方案中，FK-506相关的自然产物结合物是具有以下结构(V)的PEG-他克莫司：
Figure A200780007920D00181
其中n为10～1000的整数；和X为O或S。
在另一个实施方案中，FK-506相关的自然产物结合物是具有以下结构(VI)的PEG-子囊霉素：
Figure A200780007920D00182
其中n为10～1000的整数；和X为O或S。
因此，在一个实施方案中，提供制备水溶性结合物式I的方法。参见，方案1。
方案1
Figure A200780007920D00191
其中R1、R2、R3、R4定义如上。
在另一个实施方案中，通过如方案2中概述的两步骤序列，提供制备水溶性的由式(I)所代表的PEG-雷帕霉素结合物的方法。
方案2
Figure A200780007920D00201
其中，X为O或S；Y为诸如卤素的离去基团；和R6为H或甲基。
从方案1和2中可以看出，雷帕霉素结合物为酯的形式，其中甲氧基聚乙二醇与雷帕霉素通过酯接头(linker)在位置42连接。与本领域的现有方法不同，这种如本文所述的活化雷帕霉素42-酯衍生物的合成是通过雷帕霉素与以下通式活化酯(A)的脂肪酶催化酰化来完成的：
Figure A200780007920D00202
其中，R6为H或甲基；Y为离去基团。
离去基团的例子包括但不限于卤素和磺酸酯如甲烷磺酸酯(甲磺酸酯，MsO)和对甲苯磺酸酯(甲苯磺酸酯，TsO)。在一个实施方案中，离去基团为卤素诸如I、Br、或Cl。在另一个实施方案中，活化酯为2-卤代乙酸的乙烯基酯(R6＝H)。在进一步的实施方案中，活化酯为溴乙酸的乙烯酯。2-卤代乙酸的其他活化酯如异丙烯酯(R6＝CH3)、肟酯、三氯乙酯或三氟乙酯是本领域技术人员已知的并包含在本文中。
本文所述方法的一个优势为雷帕霉素转换成酰化雷帕霉素(VII)可以以近定量产率进行。预期地，酰化雷帕霉素(VII)可以以大于95％、96％、97％、98％、或99％的产率制得。
可以利用多种脂肪酶。在一个实施方案中，脂肪酶是一种微生物脂肪酶，即可催化水解并形成酯键的微生物来源的脂肪酶。微生物脂肪酶包括例如南极假丝酵母(Candida antarctica)、皱褶假丝酵母(Candidarugosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、代氏根霉(Rhizopusdelemar)、和黑曲霉菌(Aspergillus niger)。然而，为本文应用而选择的脂肪酶不必是从原始来源中直接分离或纯化的，但可以是合成或重组或通过其他合适的手段制备的脂肪酶。各种各样的这些酶可从一些商业渠道获得，此外，这些酶制品可以应用不同供应商的不同商标名称的不同微生物来源的，粗制的、部分纯化的、纯化的或固定的酶制品。
在一个实施方案中，利用南极假丝酵母B型脂肪酶。南极假丝酵母脂肪酶是商业可得的，例如，产品指名为Novo SP43TM、Novozym 43TM(Novo Nordisk)、或Chirazyme L-2TM(Roche Molecular Biochemicals andBioCatalytics)。在另一个实施方案中，应用洋葱假单胞菌脂肪酶。洋葱假单胞菌是商业可用的，例如，产品指名为脂肪酶PS(AmanoEnzymes，Inc)。预期地，酶以其固定的形式应用。在一个实施方案中，固定的脂肪酶为脂肪酶PS-C“Amano”IITM或脂肪酶PS-C“Amano”ITM(Amano Enzymes，Inc.)。在另一个实施方案中，固定的脂肪酶为脂肪酶PS-D“Amano”ITM(Amano Enzymes，Inc.)。
脂肪酶以其有效催化量应用，有效催化量即以合理速率有效催化酰化的量。本领域技术人员应当理解酶可以以约20至约800wt％的量(相对于雷帕霉素或FK506/FK520的量)应用。在一个实施方案中，酶以约25至约500wt％的量应用。在另一个实施方案中，酶以约50至约250wt％的量应用。在进一步的实施方案中，酶以约75至约150wt％的量应用。
反应通常是在有机溶剂中进行。合适的溶剂包括但不限于甲苯、叔丁基甲醚(TBME)、***、四氢呋喃(THF)、乙腈(MeCN)、二氯甲烷(CH2Cl2)、氯仿(CHCl3)、二异丙醚(iP2O)、己烷、二噁烷、或包括这些溶剂的混合物。在一个实施方案中，应用TBME。本领域技术人员应当理解溶剂以开始时可有效溶解全部或部分起初的雷帕霉素的量应用，并允许反应以合理速率进行。例如，溶剂如TBME可以以至少4wt体积(即大于雷帕霉素量的4倍(4X)体积)至约10wt体积的量应用。在一个实例中，溶剂可以以约5～8wt体积(即大于雷帕霉素量的5～8倍的体积)的量应用。
TBME可含有残质水(大约为0.05％)，而水可分解雷帕霉素化合物。为了尽量减少这种副反应，在反应体系中保持低量的水分。在一个实施方案中，应用无水TBME与脂肪酶催化剂的标准商业制品。在另一个实施方案中，通过加入干燥剂调节脂肪酶溶液中水存在的量，可控制水分。在再一个实施方案中，分子筛可以用来控制水分。由于分子筛将减慢反应，可加入更多的酶补偿，或可以应用更长的反应时间。在一个实施方案中，应用5
Figure A200780007920D0022160913QIETU
分子筛。然而，可轻易利用其他大小的筛，包括但不限于4
Figure A200780007920D0022160913QIETU
和3
Figure A200780007920D0022160913QIETU
。合适的分子筛可从多种商业来源获得。在再一个实施方案中，干燥剂诸如MgSO4、Na2SO4等可以用来控制水分含量。
该酰化反应在足够低的温度进行，以减少不必要副产物的形成，但又不能太低，以致需要不合理长的反应时间。在一个实施方案中，酰化作用在约20～约55℃进行。在另一个实施方案中，酰化反应在约25～约50℃进行。在进一步的实施方案中，酰化反应在约35～约45℃进行
在一个实施方案中，通过雷帕霉素、溴乙酸乙烯、和脂肪酶PS-C“Amano”IITM(为雷帕霉素的100％w/w)在无水TBME化合，进行酰化作用。在40℃将混合物在氮气下加热约8小时或直至薄层色谱法(TLC)或HPLC监测时起始原料雷帕霉素消失为止。在过滤除去酶后，获得几乎定量产率的雷帕霉素42-溴乙酸酯。
一旦引入酯接头，下一步包括将PEG分子连接到活化的雷帕霉素乙酸酯(VII)。该聚乙二醇化通过将(VII)与甲氧基聚乙烯衍生物在有机溶剂中非亲核性碱存在下起反应完成，所述衍生物以通式HX-(CH2CH2O)n-CH3(B)表示，其中X和N定义如上。
本文所用的“非亲核性碱”是指充当碱的没有亲核性的化学化合物。预期地，非亲核性碱不与其他化合物和聚乙二醇化试剂起反应。各种非亲核性碱是本领域技术人员已知的，例如参见，Richard C.Larock，in“Comprehensive Organic Transformation”，第二版，1999。在一个实施方案中，非亲核性碱为叔胺。在一个例子中，叔胺为芳族胺。在另一个例子中，叔胺为三烷基胺如三乙胺或二异丙基乙胺。
聚乙二醇化中适用的溶剂包括但不限于四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷、氯仿、二噁烷、二甲基甲酰胺(DMF)或包括这些溶剂的混合物。在一个实施方案中溶剂为乙腈。
PEG-雷帕霉素结合物可以应用本领域技术人员众所周知的操作进行分离，包括沉淀、萃取、过滤等。
因此，在一个实施方案中，将雷帕霉素42-溴乙酸酯和mPEG硫醇(MW-5000)在乙腈中用二异丙基乙胺处理某一段时间。照这样，在通过向反应混合物中加入异丙醇所进行的简单沉淀后，可以得到优良产率的理想的PEG-雷帕霉素结合物(I)。
在另一个实施方案中，通过如方案3中概述的两步骤序列，提供制备水溶性的由式(II)代表的PEG-依维莫司(42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素，RADOOl)结合物的方法。PEG-依维莫司结合物(II)可以按照PEG-雷帕霉素结合物(I)所述的类似方式制得。总的来说，反应是经中间产物(VIII)进行的，所述中间产物经由脂肪酶与式(A)酰化剂催化的酰化作用得到。然后将化合物(VIII)与甲氧基聚乙烯衍生物式(B)在上文所述的有机溶剂中非亲核性碱存在下起反应。在一个实例中，非亲核性碱为三烷基胺。在另一个实例中，有机溶剂是乙腈。从而以优良产率和不需要进一步纯化的高纯度，制得化合物II。
方案3
Figure A200780007920D00241
在另一个实施方案中，通过类似的两步骤序列，提供制备水溶性的由式(III)、(IV)或它们的组合所代表的PEG-CCI-779结合物的方法。参见方案4。CCI-779分子42-位酯侧链的一个或两个OH基团，可以被式(A)的酰化剂经脂肪酶如方案3中所述催化酰化。单酰化产物(IX)和双酰化产物(X)的比率可以随脂肪酶的量、乙烯基酯(A)的量、反应时间、和温度的修改而变化。此外，式(IX)和(X)化合物可以用色谱法分别从混合物中分离。化合物(IX)和(X)然后可以分别用于制备相应的PEG-CCI-779结合物(III)和(IV)。替代选择地，化合物(IX)和(X)可以保持为混合物，该混合物用于制备相应的PEG-CCI-779结合物(III)和(IV)。
将化合物(IX)和(X)与式(B)甲氧基聚乙烯衍生物在上文所述的有机溶剂中上文所述的非亲核性碱存在下起反应，进行PEG-结合物(III)和(IV)的制备。在一个实例中，非亲核性碱为三烷基胺。在另一个实例中，有机溶剂是乙腈。照这样，不需要进一步纯化的步骤，以优良产率和高纯度，可分别制得化合物(III)和(IV)。
方案4
Figure A200780007920D00251
在再在一个实施方案中，提供分别制备水溶性的由式(V)和(VI)表示的PEG-他克莫司和PEG-子囊霉素结合物的方法。如方案5中所述，通过用式(A)的酰化剂，在脂肪酶存在下，以区域特异方式酰化他克莫司(FK506)或子囊霉素(ascolimus)(FK520)，以优良产率获得各自的32-酯化中间产物(XI)。随后将(XI)用式(B)甲氧基聚乙烯衍生物在上文所述的有机溶剂中上文所述的非亲核性碱存在下处理，分别得到优良产率和高纯度的式(V)PEG-他克莫司结合物或式(VI)PEG-子囊霉素(ascolimus)结合物。在一个实例中，非亲核性碱为三烷基胺。在另一个实例中，有机溶剂是乙腈。
方案5
Figure A200780007920D00261
本文所述的路线具有超过美国专利号5,955,457；6,331,547；5,780,462；和6,432,973以及国际专利出版号WO 99/03860中公布的合成方法的几个不同优势。这些优势包括不需要额外的纯化步骤便于处理和更高的总收率。这是通过使用脂肪酶作为催化剂以区域特异地引入酯接头来实现的。更高的总收率也归因于随后的结合反应中应用有机碱如三烷基胺，而不是应用分解起始原料和产品的无机碱如碳酸氢钠。例如美国专利号5,955,457所述的合成路线在两次HPLC纯化后，提供小于50％产率的42-聚乙二醇化雷帕霉素，而本文所述的方法提供几乎定量产率的产品，而不需要纯化。
实施例
以下实施例仅用于说明本发明，而不旨在限制本发明。Novozym 435为固定在丙烯酸树脂上的南极假丝酵母脂肪酶B的商标名。
实施例1-通过雷帕霉素42-溴乙酸酯(VII)制备PEG-雷帕霉素结合物(I)
A.制备雷帕霉素42-溴乙酸酯(VII)
在40℃，将于无水叔丁基甲醚(TBME)(8mL)中的雷帕霉素(914mg，1mmol)、溴醋酸乙烯(660mg，4mmol)、5
Figure A200780007920D0022160913QIETU
分子筛(100mg)和Novozym 435TM脂肪酶(1.0g)的混合物在氮气下加热8小时。经过滤除去酶，用TBME洗涤。将混合物浓缩，然后在己烷中沉淀。通过过滤收集雷帕霉素42-溴乙酸酯(VII)，在真空中干燥。产率：1.01g(98％)。MS(ESI)m/e 1035(M-)。
B.制备PEG-雷帕霉素结合物(I)
向mPEGSH(500mg，MW＝5000)于MeCN(1.5mL)的溶液中，加入二异丙基乙胺(17mg)，随后加入雷帕霉素42-溴乙酸酯(VII)(95mg)。然后将该混合物在室温下搅拌3小时。加入2-丙醇(18mL)，将混合物冷却到10-15℃并保持30分钟。通过过滤收集沉淀的聚乙二醇化雷帕霉素，在真空中干燥。产率：550mg(95％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ 2.84(t，2H，S-CH2-CH2)，3.27(s，2H，CO-CH2-S)，3.36(s，3H，-OCH3)，4.69(m，1H，H-42)；MS(MALDI/TOF)m/z 5877.47(平均MW)。
实施例2-通过依维莫司42-溴乙酸酯(VIII)制备PEG-依维莫司结合物(II)
Figure A200780007920D00281
A.制备依维莫司42-溴乙酸酯(VIII)
在35℃，将于无水叔丁基甲醚(TBME)(3mL)中的依维莫司(250mg，0.26mmol)、溴醋酸乙烯(165mg，1mmol)、5
Figure A200780007920D0022160913QIETU
分子筛(20mg)和Novozym 435TM脂肪酶(200mg)的混合物在氮气下加热10小时。经过滤除去酶，用TBME洗涤。将混合物浓缩，然后用己烷研磨。通过过滤收集依维莫司42-溴乙酸酯(VIII)，在真空中干燥。产率275mg(96％)。MS(ESI)m/e 1078(M-)。
B.制备PEG-依维莫司结合物(II)
向mPEGSH(500mg，MW＝5000)于MeCN(1.5mL)的溶液中，加入二异丙基乙胺(18mg)，随后加入依维莫司42-溴乙酸酯(VIII)(110mg)。然后将该混合物在室温下搅拌3小时。经10分钟内加入2-丙醇(18mL)，将混合物冷却到10-15℃并保持30分钟。通过过滤收集白色粉末，在真空中干燥。产率：530mg(87％)。
实施例3-制备CCI-779单-溴乙酸酯(IX)和CCI-779双-溴乙酸酯(X)
将于无水叔丁基甲醚(TBME)(130mL)中的CCI-779(7.0g，6.8mmol)、溴醋酸乙烯(4.0g，24.24mmol)、5
Figure A200780007920D0022160913QIETU
分子筛(2.0g)和Novozym 435TM脂肪酶(1.3g)的混合物在室温氮气下加热8小时。HPLC表明反应混合物中含有64％单-溴乙酸酯、20％双-溴乙酸酯和12％CCI-779起始原料。经过滤除去酶，用TBME洗涤。将混合物浓缩，经硅胶色谱法纯化。更小的极性部分含有双-溴乙酸酯(X)，将其收集(1.41g)。MS(ESI)m/e 1317(M+45)-。更大的极性部分含有单-溴乙酸酯(IX)(4.56g)，然后将其分离，得到白色粉末。MS(ESI)m/e 1196(M+45)-。
实施例4-制备PEG-CCI779结合物(III)
向mPEGSH(20.0g，MW＝5000)于MeCN(45mL)的溶液中，加入二异丙基乙胺(722mg，5.6mmol)，随后加入如实施例3中制备的CCI-779单溴乙酸酯(IX)(4.60g，4mmol)。然后将该混合物在室温下搅拌4小时。经10分钟内加入2-丙醇(540mL)，将混合物冷却到10-15℃并保持30分钟。通过过滤收集白色粉末PEG-CCI-779结合物(III)，在真空中干燥。产率：20.3g(83％)。
实施例5-制备PEG-CCI-779结合物(IV)
Figure A200780007920D00292
向mPEGSH(3.0g，MW＝5000)于MeCN(9mL)的溶液中，加入二异丙基乙胺(101mg，0.78mmol)，随后加入如实施例3中制备的CCI-779双溴乙酸酯(X)(414mg，0.32mmol)。然后将该混合物在室温下搅拌4小时。经10分钟内加入2-丙醇(540mL)，将混合物冷却到10-15℃并保持30分钟。收集白色粉末PEG-CCI779结合物(IV)，在真空中干燥。产率：3.25g(96％)。
实施例6：通过他克莫司32-溴乙酸酯(XI)制备PEG-他克莫司结合物(V)
Figure A200780007920D00301
A.制备他克莫司32-溴乙酸酯(XI)
在40℃，将于无水叔丁基甲醚(TBME)(0.2mL)中的他克莫司(10mg)、溴醋酸乙烯(20mg)和Novozym 435TM脂肪酶(20mg)的混合物在氮气下加热12小时。经过滤除去酶，用TBME洗涤。将滤液通过硅胶垫并用己烷-丙酮(3:1)洗涤。收集他克莫司32-溴乙酸酯，在真空中干燥。产率：10.5mg(91％)。MS(ESI)m/e 924(M-)。
B.制备PEG-他克莫司结合物(V)
向mPEGSH(25mg，MW＝5000)于MeCN(0.1mL)的溶液中，加入二异丙基乙胺(1mg)，随后加入他克莫司32-溴乙酸酯(5mg)。然后将该混合物在室温下搅拌3小时。加入2-丙醇(1.5mL)，将混合物冷却到10-15℃并保持30分钟。通过过滤收集沉淀的PEG-他克莫司结合物(V)，在真空中干燥。产率：24mg(80％)。
在此引入本说明书中引用的所有出版物作为参考。虽然发明是以参考具体实施方案的方式进行描述，但应当理解在没有偏离本发明的精神下可以作出修改。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (32)

1.大环内酯类免疫抑制剂的聚乙二醇结合物的制备方法，包括：
(a)将酰化剂在脂肪酶存在下与含莽草酸衍生的环己基区域的大环内酯类免疫抑制剂起反应，形成酰化的大环内酯；
(b)将酰化的大环内酯在碱存在下与甲氧基聚(乙二醇)衍生物或硫氢基结尾的聚(乙二醇)衍生物起反应。
2.根据权利要求1的方法，其中大环内酯类免疫抑制剂为一种雷帕霉素，所述雷帕霉素在42-位被区域特异性酰化。
3.根据权利要求1或2的方法，其中大环内酯类免疫抑制剂结构如下：
Figure A200780007920C00021
其中：
R1选自H和烷基、链烯基、芳基、和芳基烷基；
R2选自H、羟基和-O-烷基；
R3为H、烷基、链烯基、芳基、芳基烷基、和-C(O)R31；
R31选自H、烷基、链烯基、芳基、和芳基烷基；
R4选自H、羟基和-O-烷基；
R5选自H、羟基烷基、羟基烯基、羟基芳基、羟基芳烷基、和-C(O)R51；和
R51选自羟基烷基、羟基烯基、羟基芳基、和羟基芳烷基。
4.根据权利要求1或2的方法，其中大环内酯类免疫抑制剂为42-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素。
5.根据权利要求1或2的方法，其中大环内酯类免疫抑制剂为CCI-779。
6.根据权利要求1的方法，其中大环内酯类免疫抑制剂选自他克莫司和子囊霉素，所述他克莫司和所述子囊霉素在32-位被区域特异性酰化。
7.根据权利要求1或6的方法，其中所述大环内酯类免疫抑制剂结构如下：
Figure A200780007920C00031
其中：
R7、R8、和R9独立地为H或烷基；
R是乙基或烯丙基。
8.选自以下式I、式II、式III、式VI、式V和式VI的聚乙二醇化大环内酯类免疫抑制剂的制备方法：
Figure A200780007920C00032
其中：
n为10～1000的整数；
X为O或S。
其中所述的方法包括：
(a)将大环内酯在脂肪酶存在下与酰化剂起反应，形成酰化大环内酯，其中所述酰化剂结构如下：
Figure A200780007920C00041
其中：
R6为H或甲基；
Y为离去基团；和
(b)将酰化的大环内酯在碱存在下与甲氧基聚(乙二醇)衍生物起反应，其中所述甲氧基聚(乙二醇)衍生物结构如下：
HX-(CH2CH2O)n-CH3
其中：
n为10～1000的整数；和
X为O或S。
9.根据权利要求1～8任何一项的方法，其中所述脂肪酶是来自微生物的微生物脂肪酶，所述微生物包括黑曲霉菌、南极假丝酵母、皱褶假丝酵母、米黑毛霉、洋葱假单胞菌、荧光假单胞菌、或代氏根霉。
10.根据权利要求1～9任何一项的方法，其中所述脂肪酶来自南极假丝酵母。
11.根据权利要求1～10任何一项的方法，其中所述脂肪酶为固定的南极假丝酵母B型脂肪酶(优选固定在丙烯酸树脂上)。
12.根据权利要求1～9任何一项的方法，其中所述脂肪酶为来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS。
13.根据权利要求1～9任何一项或权利要求12的方法，其中所述脂肪酶为来自洋葱假单胞菌的固定的脂肪酶PS-C，其中所述酶固定在硅藻土或陶瓷支撑物上，例如Amano IITM脂肪酶或脂肪酶PS-D Amano ITM脂肪酶。
14.根据权利要求1～8任何一项的方法，其中步骤(a)在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自甲苯、叔丁基甲醚、***、四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷、氯仿、己烷，二噁烷及它们的混合物。
15.根据权利要求1～14任何一项的方法，其中步骤(a)在20～70℃进行。
16.根据权利要求1～15任何一项的方法，其中步骤(a)进一步包括应用分子筛。
17.根据权利要求16的方法，其中步骤(a)在40℃叔丁基甲醚中进行，所述酰化剂为溴醋酸乙烯，所述脂肪酶为固定的南极假丝酵母脂肪酶B(优选固定在丙烯酸树脂上)，和所述分子筛为5
Figure A200780007920C0005135531QIETU
分子筛。
18.根据权利要求8～17任何一项的方法，其中Y为I、Br、或Cl。
19.根据权利要求1～18任何一项的方法，其中酰化剂为溴醋酸乙烯。
20.根据权利要求1～19任何一项的方法，其中步骤(b)中所述的碱为叔胺。
21.根据权利要求20的方法，其中所述叔胺为脂肪族叔胺或芳香族叔胺。
22.根据权利要求20的方法，其中所述叔胺为三烷基胺。
23.根据权利要求1～19任何一项的方法，其中所述的碱为二异丙基乙胺。
24.根据权利要求8～23任何一项的方法，其中所述的甲氧基聚(乙二醇)衍生物为甲氧基聚(乙二醇)硫醇化合物。
25.根据权利要求24的方法，其中所述的甲氧基聚(乙二醇)硫醇具有400～30000的平均分子量。
26.根据权利要求25的方法，其中所述的甲氧基聚(乙二醇)硫醇具有5000的平均分子量。
27.制备以下结构的聚乙二醇化雷帕霉素的方法：
Figure A200780007920C00051
其中：
n为105-115；
其中所述的方法包括：
(a)将雷帕霉素在固定的南极假丝酵母脂肪酶B(优选固定在丙烯酸树脂上)存在下与溴醋酸乙烯起反应，形成酰化的雷帕霉素；和
(b)将酰化的雷帕霉素在二异丙基乙胺存在下与平均分子量5000的甲氧基聚(乙二醇)硫醇起反应。
28.制备以下结构的聚乙二醇化依维莫司的方法：
Figure A200780007920C00061
其中，n为105-115且所述的方法包括：
(a)将依维莫司在固定的南极假丝酵母脂肪酶B(优选固定在丙烯酸树脂上)存在下与溴醋酸乙烯起反应，形成酰化的依维莫司；和
(b)将酰化的依维莫司在二异丙基乙胺存在下与平均分子量5000的甲氧基聚(乙二醇)硫醇起反应。
29.制备以下结构的聚乙二醇化CCI-779的方法：
Figure A200780007920C00062
或
Figure A200780007920C00071
其中，n为105-115且所述的方法包括：
(a)将CCI-779在固定的南极假丝酵母脂肪酶B(优选固定在丙烯酸树脂上)存在下与溴醋酸乙烯起反应，形成单-酰化的CCI-779或双-酰化的CCI-779；和
(b)将酰化的CCI-779在二异丙基乙胺存在下与平均分子量5000的甲氧基聚(乙二醇)硫醇起反应。
30.制备以下结构的聚乙二醇化他克莫司的方法：
Figure A200780007920C00072
其中，n为105-115且所述的方法包括：
(a)将他克莫司与溴醋酸乙烯在固定的南极假丝酵母脂肪酶B(优选固定在丙烯酸树脂上)存在下起反应，形成酰化的他克莫司；和
(b)将酰化的他克莫司在二异丙基乙胺存在下与平均分子量5000的甲氧基聚(乙二醇)硫醇起反应。
31.制备以下结构的聚乙二醇化他克莫司的方法：
Figure A200780007920C00081
其中，n为105-115的整数，且所述的方法包括：
(a)将他克莫司在固定的南极假丝酵母脂肪酶B(优选固定在丙烯酸树脂上)存在下与溴醋酸乙烯起反应，形成酰化的他克莫司；和
(b)将酰化的他克莫司在二异丙基乙胺存在下与平均分子量5000的甲氧基聚(乙二醇)硫醇起反应。
32.通过权利要求1-31任何一项的方法制备的产品。
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