CN102439023B

CN102439023B - 合成吡美莫司的化学酶法

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Publication number: CN102439023B
Application number: CN201080022350.8A
Authority: CN
Inventors: P·格里森蒂; S·列礼伊拉希; E·韦尔扎
Original assignee: Poli Industria Chimica SpA
Current assignee: Poli Industria Chimica SpA
Priority date: 2009-05-22
Filing date: 2010-05-19
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2030-05-19
Also published as: CA2763034A1; EP2432791A1; HK1164886A1; AU2010250802A1; JP5787880B2; ITMI20090908A1; EP2432791B1; US20120064575A1; JP2012527229A; ES2548847T3; IL216444A0; CA2763034C; CN102439023A; US8778636B2; IT1394309B1; ES2548992T3; IL216444A; EP2706061A1; WO2010134027A1; AU2010250802B2

Abstract

本发明涉及由子囊霉素起始制备吡美莫司的方法，开拓了纯化酶***的选择特性，特别针对位于子囊霉素24和33位的羟基基团的选择性官能化。本方法代表制备吡美莫司的化学酶合成法的第一个实例。

Description

合成吡美莫司的化学酶法

技术领域

本发明涉及一种用于制备吡美莫司的化学酶合成方法。

吡美莫司(注册号137071-32-0；图示1)是一种具有抗炎，抗增殖和免疫抑制特性的大环内酯类药物。这种物质是最近经欧洲和美国审核通过，用于局部治疗如遗传性过敏皮炎的皮肤发炎症状的Elidel 药物的活性成分。

背景技术

吡美莫司的制备首次公开在山德士(Sandoz)的专利申请EP427680。该文献中采用原料为子囊霉素(化合物注册号11011-38-4)，一种通过链霉菌菌株(如例如Streptomyces hygroscopicus var ascomyceticu或Streptomyces hygroscopicus tsukubaensis N°9993)发酵而得的天然产物。由子囊霉素通过四步合成的系列方法得到吡美莫司(方案1)。

方案1：EP427680中描述的合成方法

结构中显示，吡美莫司是子囊霉素的33-表-氯衍生物。如EP427680中所述，在子囊霉素结构中，两个仲醇羟基在24和33位置上的同时存在需要在用氯原子取代33位的羟基之前保护24位的羟基。

为了取得对子囊霉素24位羟基的单一保护，该合成方法提供了24,33-二甲硅烷衍生物的制备并且随后选择性去掉33位的甲硅烷基酯。

甲硅烷基化剂与酶作用物之间的高比例和脱保护的后续步骤的不完全选择性使得需要在硅胶柱上进行两次层析净化(Baumann K.，Bacher M.，Damont A.，Hogenauer K.，Steck A.Tetrahedron，(2003)，59，10075-10087)。

这个合成过程通常的产率并没有在文献中提及，申请人的实验显示这样的产率总计约为子囊霉素初始摩尔数的16％。

其他合成方法近来被推荐作为EP427680的合成法的替选方案。

特别地，诺华(Novartis)的国际专利申请WO2006040111中采用氯原子直接取代子囊霉素33位的羟基，同时TEVA的国际专利申请WO2006060614公开了另一种可选方法，采用子囊霉素的33位磺酸盐衍生物作为合成中间体。

以上所述的合成方案都不能完全令人满意，根据同一作者所述，WO2006040111中提及的卤化试剂(氯代膦和N-氯代琥珀酰亚胺)并不能区域选择性取代33位的羟基官能团，而WO2006060614中，即便是经过层析净化和/或结晶，所得到的产物的质量特性仍低于产物的药用目的(即，如实验部分描述的96％的纯度)

一般来说，纯化酶***可以被用于多官能分子的有机合成(Wang Y-F，Wong C-H.J Org Chem(1988)53，3127-3129；Santaniello E.，Ferraboschi P.，Grisenti P.，ManzocchiA.Chem.Rev.(1992)，92(5)，1071-140；Ferraboschi P.，Casati S.，De Grandi S.，Grisenti P.，Santaniello E.Biocatalysis(1994)，10(1-4)，279-88)；WO2006024582)。

WO2007103348和WO2005105811阐述了在南极假丝酵母脂肪酶存在下，雷帕霉素在42位的酰基化。

发明概括

因此，本发明的目的是由子囊霉素起始制备吡美莫司，开拓纯化酶***的选择特性，特别针对子囊霉素24和33位上的羟基基团的选择性官能化的可能性。这种方法代表制备吡美莫司的化学酶方法的第一个实例。

特别地，本发明的方法使得由子囊霉素得到的吡美莫司具有约30摩尔％的产率，即具有比所提及的EP427680的方法所能得到产率高出约87.5％的产率。

发明内容

本发明的目的是吡美莫司的选择性合成方法，包括对子囊霉素的 33或24位羟基进行选择性酶官能化。

如南极假丝酵母(Candida antartica)脂肪酶(CAL B；E.C.3.1.1.3)、圆柱念珠菌(Candida cylindracea)脂肪酶(CCL，E.C.3.1.1.3)、猪胰腺脂肪酶(PPL；E.C.3.1.13)和洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶(PFL，E.C.3.1.13)的市售酶在水解和醇解条件下以子囊霉素24，33二醋酸盐(方案3的化合物V)作为酶作用物，同时在酯交换反应条件下以子囊霉素作为酶作用物，通过筛选进行评估。

因此，令人惊喜地发现只有南极假丝酵母脂肪酶(以市售的游离酶的形态或作为固定在聚合物树脂的酶的形态；后一种形态也被认为是CAL B)在不可逆的酯交换条件下(使用醋酸乙烯酯作为酰化剂并且使用叔丁基二甲基醚作为溶剂的条件)，80小时内用定量的方法能够选择性酰化子囊霉素的33位，恰好只有南极假丝酵母脂肪酶，特别是CAL B，在醇解条件下与子囊霉素的24，33-二醋酸盐反应，令人惊奇地证实能够化学选择性生成相应的子囊霉素24-单醋酸盐(方案3的化合物VI)

因此，本发明的目的是制备吡美莫司的方法，其特征在于该方法包括用南极假丝酵母脂肪酶进行酰化和/或酶醇解的步骤，优选所述南极假丝酵母脂肪酶为CAL B(E.C.3.1.1.3.)。

而且，本发明的目的是合成吡美莫司的方法，包括通过南极假丝酵母脂肪酶，优选脂肪酶CAL B(E.C.3.1.1.3.)选择性酶醇解子囊霉素33位酯(优选C₁-C₄的酯类)或这些酯的硅烷基化衍生物，及其更具体的衍生物，如33-酰基-24甲硅烷基子囊霉素和24和33位二乙酰化子囊霉素的步骤。

这些方法代表用于制备吡美莫司的化学酶合成的第一个实例。就先前文献中涉及的化学合成方法而言，本方法具有在如子囊霉素或其衍生物的多官能大分子上使用非极端反应条件(如pH和温度)的优势，因此减少了产物自身的降解。

使用与聚合物基质结合的南极假丝酵母脂肪酶(CAL B)，得到对子囊霉素33和24位存在的羟基官能团的保护/脱保护作用，代表了这个合成的更进一步的优势，在于负载的酶的使用不仅仅相当大地简化反应进程，并且因此还可以多次循环使用。作为事实的本质，众所周知，与非负载的脂肪酶相反，CAL B不仅不溶于绝大多数有机溶剂和水中，从而通过简单的过滤易于从反应介质中回收，并且这种类型的负载的脂肪酶在酶活性这一点上更加稳定(Ferraboschi P.，Grisenti P.，Pengo D.，Prestileo P，.Biocatalysis and Biotransformation(2006)，24(3)，209-213；Heldt-Hansen，Hans Peter；Ishii，Michiyo；Patkar，Shamkant A.；Hansen，Tomas T.；Eigtved，Peter.Novo Ind.A/S，Bagsvaerd，Den.ACS Symposium Series(1989)，389(Biocatal.Agric.Biotechnol.)，158-72)。

本发明另一个目的是一种合成吡美莫司的方法，包含以下步骤：a)对子囊霉素33位的羟基选择性酶酰化；b)转化33-酰化子囊霉素衍生物，从而得到相应的24-叔丁基二甲基硅醚；c)将步骤b)制备所得化合物33位的酰基酶法去除(醇解)以得到子囊霉素的24-叔丁基二甲基硅醚；d)用氯原子取代子囊霉素的24-叔丁基二甲基硅醚33位的羟基，得到24-叔丁基二甲基甲硅烷基-33-表-氯子囊霉素；且最后e)将24位的叔丁基二甲基甲硅醚去除。

特别地，按照下述进行上述步骤：

a)子囊霉素在33位羟基上的化学选择性酰化反应通常如下进行：使用南极假丝酵母脂肪酶(CAL B，E.C.3.1.1.3)作为生物酶，在适当的有机溶剂中，在酰化剂如乙烯基酯或C₁-C₈的三氟乙基酯类的活化酯，优选三氟乙酸乙酯或醋酸乙烯酯存在下，所述有机溶剂选自分离系数(logP)超过0.5的质子惰性有机溶剂，如甲苯、正己烷、正庚烷、二氯甲烷、三氯甲烷和叔丁基二甲基醚。通过使用0.1-1，优选0.4的毫克量子囊霉素和单位量CAL B的相对比值，在15-50℃，优选30℃的温度下搅拌进行该酯化反应。子囊霉素与活化酯的相对摩尔比例为1-6，优选4.5。进行该酯交换反应的酶作用物的浓度为0.01-0.1摩尔。

b)24-叔丁基二甲基甲硅醚-33-酰基子囊霉素衍生物的制备如下进行：在甲硅烷基化剂，如叔丁基二甲基氯硅烷或叔丁基二甲基三氟甲磺酸酯存在下，使用1/2-1/7，优选1/5的相对摩尔比，在有机碱，如例如咪唑、嘧啶或2，6-二甲基吡啶，优选2，6-二甲基吡啶存在下。甲硅烷基化剂和有机碱的相对摩尔比为1/1-1/4，优选1/3。在非质子惰性有机溶剂，如例如二氯甲烷或四氢呋喃中，以0.02-0.15摩尔，优选0.04 摩尔的浓度范围，在0℃-40℃，优选25℃的温度下操作来进行该反应。

c)子囊霉素的24-叔丁基二甲基硅醚(中间体24-甲硅烷基-33-OH；方案2的化合物III)的酶反应(即33位的醇解反应)的制备通常如下进行：使用南极假丝酵母脂肪酶(CAL B，E.C.3.1.1.3)作为生物酶。所用的有机溶剂选自log P超过0.5的质子惰性溶剂(如例如叔丁基二甲基硅醚、二氯甲烷或甲苯，优选叔丁基二甲基硅醚)，在C₁-C₈一级脂肪醇，优选1-正辛醇存在下。通过使用0.1-0.5，优选0.25的毫克量24-叔丁基二甲基硅醚-33-乙酰基子囊霉素衍生物和单位量CAL B的相对比值，在15-60℃，优选40℃的温度下搅拌来进行该醇解反应。酶作用物和一级脂肪醇的相对摩尔比为0.1-0.4，优选0.2。在0.01-0.1摩尔，优选0.02摩尔的酶作用物浓度下进行该反应。

d)24-叔丁基二甲基硅醚-33-表-氯子囊霉素(中间体24-甲硅烷基-33-氯；方案2化合物IV)的制备通常如下进行：使用二氯三苯正膦或N-氯琥珀酰亚胺作为反应试剂；在质子惰性溶剂(如例如甲苯、正己烷、二氯甲烷，优选甲苯)中，该反应试剂与酶作用物的相对分子量比为1.2-1.8，优选1.6。酶作用物的浓度为0.05-0.1摩尔，优选0.07摩尔，温度为25℃至80℃，优选60℃。

e)去除24位的叔丁基甲硅烷基醚以得到吡美莫司是通过使用酸催化进行，所述酸催化可以通过使用一元无机酸(如氢氟酸或盐酸)或有机酸(如对甲苯磺酸一水合物或甲磺酸，优选对甲苯磺酸一水合物)，使用1∶0.3-1∶1，优选1∶0.4的酶作用物和酸的摩尔比，在15-40℃，优选25℃的温度范围内，超过24-72小时的反应时间下获得。在0.05-0.2M，优选0.12M的酶作用物的摩尔浓度，使用2/8-8/2的相对体积比例的质子惰性和质子溶剂的混合物作为反应溶剂进行该反应。该步骤可用的质子惰性溶剂的例子为二氯甲烷和烃或C₅-C₇直链或支链的烃的混合物，优选二氯甲烷。该步骤可用的质子溶剂是C₁-C₄直链或支链的醇，优选甲醇。

通过下述方案2图示根据以上方法所述的优选合成过程：

方案2：子囊霉素酶法酯交换合成吡美莫司。

使用醋酸乙烯酯作为酰化剂，叔丁基二甲基醚(TBDME)作为溶剂催化，由南极假丝酵母脂肪酶(CAL B)不可逆酯交换催化原始产物(即子囊霉素)。这可以在80小时内以定量方式获得子囊霉素33位的选择性乙酰化。

所得反应产物(中间体子囊霉素33-OAc，方案2化合物I)不需任何纯化，用叔丁基二甲基三氟甲磺酸酯，在二氯甲烷和2，6-二甲基吡啶中，0.5小时后转化为相应的24-叔丁基二甲基硅醚(中间体24-甲硅烷基-33-OAc；方案2化合物II)，产率为75％。

在通过硅胶柱层析纯化后，仍在醇解条件下(即使用叔丁基二甲基硅醚中的1-辛醇)使用CAL B将中间体24-甲硅烷基-33-OAc33位上的醋酸盐去除，生成子囊霉素24-甲硅烷基醚衍生物(方案2化合物III)，产率为80-100％。

通过与二氯三苯基正膦反应，该中间产物转化成由氯原子取代33位羟基的最终产物。中间体24-甲硅烷基-33氯(方案2化合物IV)可在层析纯化后得到。

最后，在二氯甲烷/甲醇中使用对甲苯磺酸一水合物去除24位的甲硅烷基得到源自子囊霉素的吡美莫司，总产量为大约30摩尔％。

因此，本发明与之前所述的吡美莫司合成的方法相比具有更高的产率，尤其与根据EP427680描述的方法可获得的产率相比，产率提高了87.5％。事实上，根据EP427680所公开的内容，申请人进行的实验测试证实总的转化率为16％，正如对比实施例4所述。特别地，该方法的总产率特别处于不利的方面在于在之前提及的专利的实施例1b和47(产率45-50％)的条件下和实施例1中(产率50-60％)描述的卤化反应下进行的叔丁基二甲基硅醚在24和33位的脱保护的停止。化合物24-甲硅烷基-33-OAc(方案2化合物II)，即化合物24-叔丁基二甲基硅烷基-33-乙酰基-子囊霉素从未在文献中公开过并且在本发明中第一次合成和表征。

因此，本发明的另一方面涉及化合物24-叔丁基二甲基硅烷基-33-乙酰基-子囊霉素作为吡美莫司酶合成方法中间体。

本发明的另一主题在于化合物24-叔丁基二甲基硅烷基-33-乙酰基-子囊霉素作为吡美莫司合成过程中的中间体的用途。

本发明的另一个目的是吡美莫司合成方法，包括以下步骤：a’)制备24和33位乙酰化的子囊霉素；b’)在33位酶去除(醇解)酰基以得到24位单乙酰化子囊霉素；c’)用氯原子取代子囊霉素33位羟基以得到化合物24-醋酸盐-33-表-氯子囊霉素；d’)去除24位的醋酸盐。

特别地，上述提及步骤按照如下进行：

a’)子囊霉素24，33-二醋酸盐(中间体24，33二醋酸盐，方案3化合物V)的制备通常如下进行：使用乙酰氯或乙酸酐作为酰化剂，其与酶作用物相对摩尔比值为3-6，优选4.5，在N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)存在下，其与酰化剂的相对比例为1.0-1.2，优选1.0。使用有机碱(如吡啶或三乙胺，优选吡啶)作为溶剂，在0.08-0.5摩尔，优选0.1摩尔的酶作用物浓度下进行该反应。该反应的温度可以为-5℃至25℃，优选0℃。

b’)由子囊霉素24，33-双醋酸盐(中间体24.33-双醋酸盐)起始制备24-乙酰基-子囊霉素(中间体24-醋酸盐-33-OH；方案3化合物VI)的酶反应(醇解)通常如下进行：使用南极假丝酵母脂肪酶(CAL B，(E.C.3.1.1.3.))作为酶，在选自log P超过0.5的质子惰性溶液的合适有机溶剂(如例如叔丁基二甲基醚、二氯甲烷或甲苯，优选叔丁基二甲基醚)存在下，在C₁-C₈一级脂肪醇，优选1-正辛醇存在下。使用0.1-0.5，优选0.23的毫克量子囊霉素24，33-二醋酸盐和单位量CAL B的相对比值，在15-60℃，优选30℃的温度下搅拌进行该反应。一级脂肪醇和酶作用物的相对摩尔比值为0.2-0.8，优选0.5。在0.01-0.1摩尔，优选0.02摩尔的酶作用物浓度下进行该反应。

c’)由24-乙酰基子囊霉素起始制备24-乙酰基-33-表-氯子囊霉素(中间体24-乙酰基-33氯，方案3化合物VII)通常如下进行：使用市售聚合物-负载的三苯基膦(每克苯乙烯和二乙烯基苯共聚物大约3毫摩尔三苯基膦的滴定量)，其与酶作用物的摩尔比值(以三苯基膦含量计算)为2.0-3.0，优选2.3。在C₁-C₂含氯溶剂中，如单独的四氯化碳，或与其他非极性质子惰性有机溶剂(如例如C₅-C₈直链或支链脂肪烃或芳族烃如例如甲苯或二甲苯)共存的六氯乙烷，优选四氯化碳，在60-85℃，优选77℃的温度范围内，在0.05-0.20摩尔，优选0.1摩尔的酶作用物浓度下进行该反应。

d’)去除24位的醋酸盐以得到吡美莫司如下进行：使用在5-40℃温度范围下，在极性质子溶剂(如C₁-C₈直链或支链醇，优选甲醇)中进行的酸催化，酶作用物的浓度为0.05-0.2M。该步骤可用的酸催化剂可以是无机一元酸(如氢氟酸或盐酸)或有机酸(如对甲苯磺酸或甲硫酸)，优选盐酸。该步骤中酶作用物和最优选酸的摩尔比例为1∶5-1∶20，优选1∶13。

有利地，步骤c’)中用氯原子取代33位的羟基的取代反应中使用负载的三苯基膦可以相当大地简化该合成步骤的建立，事实上减为简单的过滤。这个合成的改进的另一优势在于在同一个方法中，反应结束后回收的负载的氧化的三苯基膦在使用三氯硅烷再生后可以被重新利用(注册号10025-778-2；Regent S.L.，Lee D.P.Journal of Organic Chemistry，(1975)，40，1669-1670)。

通过下述方案3图示根据以上所述方法的合成过程：

方案3.由子囊霉素的33，24-二醋酸盐酶催化醇解合成吡美莫司。

根据上述方法的优选合成方法是在0℃的吡啶中，子囊霉素与乙酸酐和二甲基氨基吡啶(DMAP)进行反应。在1小时内制备24，33-二醋酸盐衍生物(方案3化合物V；产率95％)。

令人惊奇地发现，在南极假丝酵母脂肪酶(CAL B；E.C.3.1.1.3) 这个酶作用物上，在醇解条件下操作，能够化学选择性地生成相应的子囊霉素24-单醋酸盐(方案3化合物VI)。

因此，在CAL B和1-辛醇催化转化成叔丁基二甲基醚(TBDME)的过程中，子囊霉素的24，33-二醋酸盐(化合物V)转化成24-单醋酸盐(24-醋酸盐-33-OH，化合物VI)(100％，5小时)。

33位氯通过负载的三苯基膦和四氯化碳反应的方式引入，得到产率40％的中间体24-醋酸盐-33-氯(方案3化合物VII)。

作为之前文献中涉及到的三苯基膦的替代物的在这个步骤中使用负载的三苯基膦以将氯引入受保护的子囊霉素的24位羟基上使得，假设相同的产率，由于负载的三苯基膦，通过简单过滤反应混合物和简化真空下蒸发滤液以相当大地简化进程。该试剂还具有在同一方法中用三氯硅烷再生之后可以被重新利用的优势。

室温下在甲醇中用3N盐酸去除24位的醋酸盐(产率40％)得到具有与参比样品相同的表征的吡美莫司，总产率为13％(方案3)。过程中的中间体子囊霉素24，33-二醋酸盐(化合物V)、子囊霉素24-单醋酸盐(化合物VI)和子囊霉素24-醋酸盐-33-表-氯(化合物VII)并未描述于文献中并且是在本发明中第一次合成和表征。

因此，本发明另一方面涉及通过吡美莫司酶合成方法中得到的中间体，子囊霉素24，33-二醋酸盐、子囊霉素24-单醋酸盐和子囊霉素24-醋酸盐-33-氯化合物。

本发明另一目的在于在合成方法中作为中间体的子囊霉素24，33-二醋酸盐、子囊霉素24-单醋酸盐和子囊霉素24-醋酸盐-33-氯化合物的吡美莫司的用途。

下列实施例用于列举本发明，而非以任何方式限制本发明。

具体实施方式

实施例

材料和方法

在下列的实施例中，采用Bruker AM500设备在氘代氯仿中记录 ¹H-NMR(500MHz)；所指的波谱峰以ppm(δ)计并且他们涉及主要异构体的鉴定峰。

在装有ATR的Perkin Elmer FT IR(Mod.Spectrum One)设备上记录IR分析。在Perkin Elmer(Mod.343)设备上进行旋光分析。采用直接输入技术由Finnigan LCQ Deca Termoquest分光仪(Ion trap；ESI positive)记录质谱。

所述的差示扫描量热法(DSC)值由Perkin Elmer(Mod.DSC7)设备进行记录，加热值为5℃/min。南极假丝酵母脂肪酶(CAL B 2U/mg；E.C.3.1.1.3)，圆柱念珠菌脂肪酶(CCL 15-25U/mg；E.C.3.1.1.3)，猪胰腺脂肪酶(PPL≥200U/mg；E.C.3.1.13)，洋葱假单胞菌脂肪酶(PFL 50U/mg；E.C.3.1.13)以及负载的三苯基膦(大约3.2毫摩尔/克三苯基膦)可由Fluka购得。子囊霉素作为合成反应的初始试剂由Poli Industria Chimica SpA，Quinto de Stampi，Rozzano (MI)，Italy制备。

实施例1

子囊霉素的33-乙酰基衍生物的制备(方案II化合物I)

将南极假丝酵母脂肪酶(CAL B，Novozym 435)[0.140g(2U/mg)FLUKA]加入到子囊霉素(100mg；0.126毫摩尔)的甲苯(8ml)和醋酸乙烯酯(4.5当量；0.473g)的溶剂中。反应在30℃温度下持续搅拌80小时，然后通过过滤将酶滤除并将滤液减压浓缩得到105mg 33-乙酰基-子囊霉素。

为了分析的目的，将中间体样品通过硅胶柱层析(正己烷/丙酮＝8/2v/v作为洗脱液)进行纯化然后用丙酮/水结晶。

在该样品上进行下列分析：¹H-NMR(500MHz)δ：2.10(CH₃CO)，3.92和4.70(24CH和33CH)；IR(cm^-1)：3484.245，2935.287，1735.331，1649.741，1450.039，1372.278；差示扫描量热法：吸热温度134.25℃；旋光度([α]_D)＝-74,0°(c＝0.5CHCl₃)。

MS波谱(ESI+)：m/z：856.4(M+23；100.0％)

元素分析计算结果为C₄₅H₇₁NO₁₃：C 64.80％；H，8.58％；N，1.68％；O，24.94％

元素分析实测值为C 64.78％；H，8.54％；N，1.59％；O，24.89％

子囊霉素的24-叔丁基二甲基硅醚-33-乙酰基衍生物的制备(中间体24-甲硅烷基-33-OAc；方案2化合物II)

将2，6-二甲基吡啶(0.290g；2.7毫摩尔)和叔丁基二甲基三氟甲磺酸酯(0.238g；0.9毫摩尔)加入到子囊霉素的33-乙酰基衍生物(150mg；0.18毫摩尔)的二氯甲烷溶液(5ml)中。反应在室温下搅拌30分钟。这阶段之后将反应混合物用碳酸氢钠饱和溶液(5ml)洗涤，得到的有机相依次用0.1N的HCl(5ml/次，3次)和30％NaCl溶液(5ml)洗涤。有机相用硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩成残留物，得到128mg产物。

MS波谱(ESI+)：m/z：970.5(M+23；100.0％)

¹H-NMR(500MHz)δ：0.05 and 0.06((CH₃)₂Si)，0.90((CH₃)₃C-Si)，2.10(CH₃CO)，4.70(33CH)

IR(cm^-1)：3462.948，2934.450，1739.236，1649.937

元素分析计算结果为C₅₁H₈₅NO₁₃Si：C 64.59％；H，9.03％；N，1.48％；O，21.93％

元素分析实测值为：C 64.50％；H，9.05％；N，1.41％；O，21.88％

差示扫描量热法：吸热温度为236.43℃，旋光度＝-81，4°(c＝0.5CHCl₃).

子囊霉素的24-叔丁基二甲基硅醚的制备(中间体24-甲硅烷基-33-OH；方案2的化合物III)

将1-正辛醇(0.035g；0.265毫摩尔)和CAL B(Novozym 435)[0.100g(2U/mg)FLUKA]加入到含有子囊霉素的24-叔丁基二甲基硅醚-33-乙酰基衍生物(50mg；0.053毫摩尔)的叔丁基甲基醚(4ml)的溶液中。反应在40℃温度下持续搅拌120小时。这阶段之后过滤反应混合物并将滤液在真空下浓缩得到反应粗产物并通过硅胶柱层析进行纯化：以石油醚/丙酮(7/3)为洗脱剂，得到44mg(0.048毫摩尔)产物。

所得产物的化学/物理特性与根据专利EP427680得到的参比样品的一致。

24-叔丁基二甲基硅醚-33-表-氯子囊霉素的制备(中间体24-甲硅烷基-33-氯；方案2化合物IV)

将24-甲硅烷基FR520溶液，即24-甲硅烷基子囊霉素(165g；0.18摩尔)的无水甲苯(1.4升)和吡啶(50ml)溶液，在室温(20-25℃) 惰性气体环境下加入到搅拌中的三苯基二氯化膦(99.95g)的无水甲苯(1.1升)混悬液中。

加入之后，反应混合物在60℃温度下加热1小时。

这阶段之后，使反应混合物温度至25℃并此后将有机相依次用水(1升/次，1次)和10％NaCl水溶液(1升/次，4次)洗涤，然后用硫化钠干燥，过滤并真空浓缩得到大约250g湿甲苯固体。这些残余产物用正己烷(500ml)重新回收然后蒸干(为了除去存在的甲苯)。在正己烷(500ml)中室温下搅拌45分钟以稀释残余产物，然后在布氏漏斗上过滤去掉未溶解的固体(这是三苯基二氯化膦的副产物)。

减压浓缩滤液得到148.6g固体，然后在硅胶柱层析，然后在硅胶柱上层析(用庚烷/丙酮＝9/1洗脱)纯化得到123g(0.13摩尔)产物。

所得产物的化学/物理性质与文献(EP427680)所描述的一致。

由24-叔丁基二甲基硅醚-33-表-氯子囊霉素制备吡美莫司

将中间体24-甲硅烷基-33氯(123g，0.13摩尔；方案2化合物IV)室温下溶解在搅拌中的二氯甲烷/甲醇混合物＝1/1＝v/v(1.1升)，然后加入对甲苯磺酸一水合物(10.11g)。

反应在20-25℃温度下持续搅拌72小时，然后将水(600ml)和碳酸氢钠(4.46g)溶液加入到反应混合物中。反应混合物在室温下持续搅拌10分钟，然后制备有机相并用10％氯化钠水溶液(600ml)洗涤。

有机相用硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩得到119g粗吡美莫司。这些粗产物通过硅胶柱层析(正己烷/丙酮作为洗脱液)纯化并用醋酸乙烯酯、环己烷/水结晶，得到66g(81.5毫摩尔)的纯化吡美莫司。

所得的化学/物理数据与文献中所述的数据一致。

实施例2

子囊霉素24，33-二醋酸盐的制备(中间体24.33-二醋酸盐，方案3化合物V)

将4-二甲基氨基吡啶(4.5当量，0.136g)和乙酸酐(4.5当量；0.114g)在0℃下搅拌加入子囊霉素(200mg；0.25毫摩尔)的吡啶溶液中(2.5ml)。

反应在0℃下持续搅拌1.5小时然后用水稀释并且用醋酸乙烯酯萃取(5ml/次，3次)。有机萃取物用0.5NHCl(10ml/次，5次)洗涤，用硫酸钠干燥真空浓缩。

残余产物通过硅胶柱层析(正己烷/丙酮v/v作为洗脱剂)纯化得到子囊霉素24，33-二醋酸盐(210mg，0.24毫摩尔)。

我们对纯化样品进行如下分析

¹H-NMR(500MHz)δ：2.02 and 2.06(2CH₃CO)，5.20 and 4.70(24CH and 33CH)；

IR(cm^-1)：3462.749，2935.824，1734.403，1650.739，1449.091，1371.079。

差示扫描量热法：吸热峰在234.10℃；旋光度＝-100.0°(C＝0.5CHCl₃)。

MS波谱(ESI+)：m/z：898.4(100.0％；m+23)。

元素分析计算结果为C₄₇H₇₃NO₁₄：C 64.44％；H 8.40％；N 1.60％；O 25.57％

元素分析实测值为：C 64.55％；H 8.44％；N 1.61％；O 25.40％

24-乙酰基子囊霉素的制备(中间体24-醋酸盐-33-OH；方案3化合物VI)

将南极假丝酵母脂肪酶(CAL B Novozym 435)[1.1g(2U/mg)FLUKA]加入到子囊霉素33，24-二醋酸盐(500mg；0.57毫摩尔)的叔丁基二甲基醚(25ml)和1-正辛醇(4.5当量；0.371g)的溶液中。反应在30℃下持续搅拌100小时，然后将酶过滤去除并且所得滤液进行减压浓缩得到425mg(0.51毫摩尔)产物。

为了分析的目的，将样品通过硅胶柱层析(正己烷/丙酮＝7/3v/v作为洗脱剂)纯化，而后用丙酮/水结晶。

我们对纯化的产物进行如下分析：¹H-NMR(500MHz)δ：2.05(CH3CO)；IR(cm^-1)：3491.528，2935.860，1744.728，1710.227，1652.310，1448.662，1371.335.差示扫描量热法：吸热峰在134.68℃；旋光度＝-102.7°(c＝0.5CHCl₃)

MS波谱(ESI+)：m/z：856.4(M+23；100.0％)

元素分析实测值为：C 64.71％；H，8.49％；N，1.60％；O，24.97％

24-乙酰基-33表-氯子囊霉素的制备(中间体24-乙酰基-33氯；方案3化合物VII)

将负载的三苯基膦(0.335g；1.1毫摩尔)加入到24-乙酰基子囊霉素(400mg；0.48毫摩尔)的四氯化碳(5ml)溶液中。反应混合物持续回流3小时后在室温下冷却。过滤所得混悬物并将滤液真空下浓缩成残余物，得到0.45g粗反应产物，并将粗产物通过硅胶柱层析(以石油醚/丙酮＝90/10洗脱)纯化，得到163mg(0.19毫摩尔)产物。

¹H-NMRδ：2.08(CH₃CO)；4.60(33CH)；IR(cm^-1)＝3464.941，2934.360，1738.993，1650.366，1450.424，1371.557；差示扫描量热法：吸热峰在231.67℃

旋光度＝-75.2°(c＝0.5CHCl₃)

MS波谱(ESI+)：m/z：874.3(M+23；100.0％)

元素分析计算结果为C₄₅H₇₀ClNO₁₂：C 63.40％；H，8.28％；Cl，4.16％；N，1.64％；O，22.52％

元素分析实测值为C 63.31％；H，8.30％；Cl，4.05％；N，1.58％；O，22.42％

由24-乙酰基-33-表-氯子囊霉素制备吡美莫司

将24-乙酰基-33表-氯子囊霉素(200mg；0.23毫摩尔；化合物VII)的甲醇(2ml)和3N HCl(1ml)溶液在室温下搅拌40小时。这阶段之后，用碳酸氢盐水溶液中和反应，在真空下蒸发甲醇。混合物用二氯甲烷萃取(5ml/次，3次)，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩成残余物，得到残余产物，其用硅胶柱层析(正己烷/丙酮作为洗脱剂)纯化，而后用醋酸乙烯酯，环己烷/水结晶得到78mg纯化的吡美莫司(0.096毫摩尔)。

所得产物的化学/物理性质与吡美莫司文献中所示的数据一致。

实施例3

脂肪酶筛洗：子囊霉素的酯交换和子囊霉素33，24-二醋酸盐(方案3化合物V)的醇解

通过采用¹H-NMR分析法来确定酶反应的区域性选择。子囊霉素的24，33-二醋酸盐(化合物V)和24和33-单醋酸盐(分别是方案3化合物VI和方案2化合物I)并未表征在文献中。唯一被提及的子囊霉素的酯是24，33-二甲酸酯：该化合物在24和33位上的质子有两个分别在5.22 and 4.71ppm上的特征信号。

33-单醋酸盐(化合物I)的波谱中的体现是在3.92和4.70ppm的两个峰，与其预期结构一致。

子囊霉素24，33-双醋酸盐(化合物V)的波谱图中，这些质子在5.20和4.70ppm处减弱。

24-醋酸盐(化合物VI)的波谱图中观察到在5.0-5.4ppm范围内有所改变，而4.7ppm处的峰消失。

表1和2总结了关于子囊霉素和子囊霉素33，24-双醋酸盐(化合物V)进行酶反应的酯化(酯交换)、水解和醇解的实验数据。

表1：子囊霉素的酶酯化作用

脂肪酶	溶剂	活化酯	时间(小时)	转化率％(所得产物)
					PFL	氯仿	醋酸乙烯酯	100	0
PPL	甲苯	醋酸乙烯酯	94	0
					CCL	甲苯	醋酸乙烯酯	92	0
CAL B	乙腈	醋酸乙烯酯	53	30(33-OAc，化合物I)
					CAL B	甲苯	醋酸乙烯酯	80	100(33-OAc，化合物I)

PFL：洋葱假单胞菌脂肪酶(PFL，E.C.3.1.13)

PPL：猪胰腺脂肪酶(PPL；E.C.3.1.13)

CCL：圆柱念珠菌脂肪酶(CCL，E.C.3.1.1.3)

CAL B：南极假丝酵母脂肪酶(CAL B；E.C.3.1.1.3)

表2：子囊霉素33，24-双醋酸盐的水解和醇解(方案3化合物V)

实施例4(对比)

验证EP427680中所述的吡美莫司的合成的方法

将咪唑(508mg)和叔丁基二甲基硅烷氯(1.125g)以数份加入到2g(2.53毫摩尔)子囊霉素的无水N，N-二甲基乙酰胺溶液中(40ml)。反应混合物在室温下持续搅拌4.5天。该反应此后用醋酸乙烯酯(200ml)稀释并用水(100ml/次，5次)处理。分离有机相，用硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩成残余物得到泡沫状粗产物，其随后用硅胶柱层析(1∶30p/p)，以正己烷/醋酸乙烯酯(3/1)洗脱纯化：得到2.1g(2.05毫摩尔，产率为81摩尔％)子囊霉素24，33双甲硅烷基中间体。该中间体的化学/物理性质与EP427680所示的一致。

将2.1g(2.05毫摩尔)子囊霉素24，33双甲硅烷基中间体在0℃温度下溶解于持续搅拌的由乙腈(42ml)和40％氢氟酸水溶液(23.1ml)组成的溶液中。反应混合物在0℃温度下持续搅拌2小时然后用二氯甲烷(30ml)稀释。然后将反应物按顺序用碳酸氢钠饱和水溶液(30ml)和水(30ml)洗涤。分离的有机相用硫酸钠干燥，过滤并且在真空下浓缩成残余物，得到泡沫状产物，其之后用硅胶柱层析(1∶30p/p)，以二氯甲烷/甲醇(9/1)为洗脱剂纯化：得到839mg(0.92毫摩尔；产率45摩尔％)子囊霉素24单甲硅烷基中间体。该中间体的化学/物理数据与方案2化合物III的一致，并且与EP427680所示文献的数据一致。将839mg(0.92毫摩尔，产率45％摩尔)中间体子囊霉素24单甲硅烷基与三苯基膦(337mg)混合物在四氯化碳(36.4ml)中持续搅拌下加热回流15小时。这阶段之后使反应混合物在真空下蒸发成残余物，其通过硅胶柱层析(1∶30p/p)，以正己烷/醋酸乙酯(2/1)为洗脱剂纯化得到固体产物：535mg(0.57摩尔，产率63摩尔％)子囊霉素24-单甲硅烷基中间体，33-氯衍生物。该中间体的化学/物理数据与我们所得方案2化合物IV的那些一致且与EP427680所示文献的数据一致。

将535mg(0.57毫摩尔)子囊霉素24单甲硅烷基中间体，33-氯衍生物在室温下溶解于持续搅拌的乙腈(16.4ml)和40％氢氟酸水溶液(0.44ml)中。反应混合物在室温下持续搅拌45分钟然后用醋酸乙酯(100ml)稀释。有机相依次用碳酸氢钠水溶液(70ml)和水(70ml/次，2次)洗涤，接着用硫酸钠干燥，过滤并真空下蒸发，得到固体，随后其用硅胶柱层析(1∶30p/p)，以正己烷/醋酸乙烯酯(2/3)为洗脱剂纯化：得到323mg(0.339毫摩尔；产率70摩尔％)吡美莫司。所得产物的化学/物理性质与关于吡美莫司的文献所示的数据一致；总产率为16％。

Claims

1.制备吡美莫司的方法，其特征在于该方法包括采用南极假丝酵母Candida antartica脂肪酶进行的酶酰化步骤和酶醇解步骤，且所述方法包括以下步骤：

a)在酰化剂和有机溶剂存在下，用南极假丝酵母脂肪酶选择性酶酰化子囊霉素33位的羟基；

b)在有机碱存在下，用甲硅烷基化剂，转化33-酰化衍生物得到相应的24-叔丁基二甲基硅醚；

c)在有机溶剂和C₁-C₈一级脂肪醇存在下，用南极假丝酵母脂肪酶将步骤b)制备的化合物的33位的酰基酶法消除，得到子囊霉素的24-叔丁基二甲基硅醚。

2.根据权利要求1所述的方法，其中南极假丝酵母脂肪酶是CALB。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述醇解是选择性醇解子囊霉素33位的酯或其甲基硅烷化衍生物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述醇解是选择性醇解子囊霉素33位的C₁-C₄酯或其甲基硅烷化衍生物。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述子囊霉素33位的酯或其甲基硅烷化衍生物是33-酰基-24甲基硅烷子囊霉素和24和33位的二乙酰子囊霉素。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的酰化剂选自乙烯基酯或C₁-C₈三氟乙酯。

7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的酰化剂是醋酸乙烯酯或三氟乙酸乙酯。

8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)和c)的有机溶剂是分离系数超过0.5的质子惰性有机溶剂。

9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的有机溶剂是甲苯、正己烷、正庚烷、二氯甲烷、氯仿或叔丁基二甲基醚，且步骤c)的有机溶剂是叔丁基二甲基醚、二氯甲烷或甲苯。

10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)和c)的有机溶剂是叔丁基二甲基醚。

11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)的甲硅烷基化剂是叔丁基二甲基氯硅烷或叔丁基二甲基三氟甲磺酸酯。

12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)的有机碱是咪唑、嘧啶或2,6-二甲基吡啶。

13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)的有机碱是2,6-二甲基吡啶。

14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)的一级脂肪醇是1-正辛醇。

15.根据权利要求1所述的方法，包括用氯原子取代子囊霉素24-叔丁基二甲基硅醚33位的羟基，得到子囊霉素24-叔丁基二甲基硅烷基-33-表-氯衍生物，并且随后去除24位的叔丁基二甲基硅醚。

16.根据权利要求15所述的方法，其中用氯原子对24-叔丁基二甲基硅醚33位的羟基的取代是使用三苯基二氯化膦或N-氯琥珀酰亚胺来进行。

17.根据权利要求15所述的方法，其中24位的叔丁基二甲基硅醚的去除是通过使用一元无机酸或有机酸的酸催化来进行。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述一元无机酸是氢氟酸或盐酸，所述有机酸是对甲苯磺酸一水合物或甲磺酸。

19.根据权利要求15所述的方法，其中24位的叔丁基二甲基硅醚的去除是通过使用对甲苯磺酸一水合物的酸催化来进行。

20.具有如下通式的24-叔丁基二甲基硅烷基-33乙酰基子囊霉素：

21.根据权利要求20所述的化合物用作反应中间体在合成吡美莫司中的用途。

22.制备吡美莫司的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a’)在N,N-二甲氨基吡啶存在下，由有机溶剂中的子囊霉素和酰化剂起始制备24和33位乙酰化的子囊霉素；

b’)在有机溶剂和C₁-C₈一级脂肪醇存在下，用南极假丝酵母脂肪酶酶法去除步骤a’)制备的化合物33位上的酰基，得到24位单乙酰化子囊霉素。

23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤a’)的酰化剂是乙酰氯或乙酸酐。

24.根据权利要求22所述的方法，其中步骤a’)的有机溶剂是有机碱。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述有机碱是吡啶或三乙胺。

26.根据权利要求22所述的方法，其中步骤b’)的有机溶剂是分离系数超过0.5的质子惰性有机溶剂。

27.根据权利要求22所述的方法，其中步骤b’)的有机溶剂是叔丁基二甲基醚、二氯甲烷或甲苯。

28.根据权利要求22所述的方法，其中步骤b’)的有机溶剂是叔丁基二甲基醚。

29.根据权利要求22所述的方法，其中步骤b’)的一级脂肪醇是1-正辛醇。

30.根据权利要求22所述的方法，包括用氯原子取代24位单乙酰化的子囊霉素33位的羟基，得到24-醋酸盐-33-表-氯子囊霉素衍生物，且随后除去24位的醋酸盐。

31.根据权利要求30所述的方法，其中用氯原子对24位单乙酰化的子囊霉素33位的羟基的取代是使用聚合物-负载的三苯基膦，在C₁-C₂含氯溶剂中进行。

32.根据权利要求31所述的方法，其中C₁-C₂含氯溶剂是四氯化碳或与另一种非极性质子惰性有机溶剂共存的六氯乙烷。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述另一种非极性质子惰性有机溶剂是C₅-C₈直链或支链的脂肪族烃或芳族烃。

34.根据权利要求32所述的方法，其中所述芳族烃是甲苯或二甲苯。

35.根据权利要求30所述的方法，其中去除24位的醋酸盐是通过使用一元无机酸或有机酸的酸催化来进行。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述一元无机酸是氢氟酸或盐酸，所述有机酸是对甲苯磺酸一水合物或甲磺酸。

37.根据权利要求30所述的方法，其中其中去除24位的醋酸盐是通过使用盐酸的酸催化来进行。

38.具有如下通式的24,33-二醋酸盐子囊霉素：

39.根据权利要求38所述的化合物用作反应中间体在合成吡美莫司中的用途。

40.具有如下通式的24-单醋酸盐子囊霉素：

41.根据权利要求40所述的化合物用作反应中间体在合成吡美莫司中的用途。

42.具有如下通式的24-醋酸盐-33-表-氯子囊霉素：

43.根据权利要求42所述化合物用作反应中间体在合成吡美莫司中的用途。