CN101386868A

CN101386868A - 一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法

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Publication number: CN101386868A
Application number: CNA2008102003441A
Authority: CN
Inventors: 刘建平; 李育阳; 俞静; 袁汉英; 蔡显鹏
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2008-09-23
Filing date: 2008-09-23
Publication date: 2009-03-18

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高重组蛋白表达水平的技术方案。该方法中，首先将菊粉酶基因的启动子、α－信号肽、目的蛋白和菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接；然后将上述序列***克鲁维酵母表达载体；最后转化克鲁维酵母，发酵，取发酵上清液分离即得。本发明的方法可以促进克鲁维酵母表达重组蛋白的产量显著增长。本发明可用于提高多种蛋白的表达量，为降低生产成本、扩大生产规模提供了新的方法。

Description

一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高重组蛋白表达水平的技术方案。

背景技术

酵母是一类单细胞的低等真核生物，兼有原核和真核细胞的特点：既培养方便，繁殖快，成本低，易于基因操作，又具有分泌途径，可对真核基因产物进行翻译后加工修饰，得到正确折叠、有活性的蛋白质。因此酵母表达***被誉为最有商业价值的表达***(F.R.Schmidt，Recombinant expression systems in thepharmaceutical industry，Appl Microbiol Biotechnol，65:363-372，2004)。除应用广泛的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达***外，还存在一类以克鲁维酵母(Kluyveromyces)为代表的非常规酵母表达***。

克鲁维酵母主要包括乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、马科斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)等种类，其中乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为唯一炭源生长的酵母，具有营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广(25℃-46℃)、分泌蛋白能力强，对人类安全(GRAS，Generally Regarded as Safe)等特点，是一种较理想的重组蛋白表达宿主细胞，迄今已建立了适于外源基因表达的较完善的乳酸克鲁维酵母表达***，利用该***人们已成功表达了人血清白蛋白、α-半乳糖苷酶、牛凝乳酶等多种重组蛋白(Albert J.J.van Ooyen et al，Heterologousprotein production in the yeast Kluyveromyces lactis，FEMS Yeast Res 6:381-392，2006)。

酿酒酵母HAP1基因(ScHAP1)编码一种转录因子，调控一些细胞呼吸代谢途径必需基因的转录表达(Pfeifer，K.，Kim，K.S.，Kogan，S.and Guarente，L.1989.Functional dissection and sequence of yeast HAPI activator.Cell.56：291-301)。作为ScHAP1同源基因，乳酸克鲁维酵母HAP1基因(K1HAP1)的功能目前尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达水平的新方法。

本发明提供了一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白和菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接；(菊粉酶基因的启动子和终止子序列见GenBank登入号：AF178979；α-信号肽的GenBank登入号：J01340)

(2)将(1)得到的序列***克鲁维酵母表达载体pUKD-S或者pUKD；

(3)用(2)获得的重组载体转化克鲁维酵母，发酵，取发酵上清液分离即可。

本发明中，(3)中采用的克鲁维酵母可以是乳酸克鲁维酵母、鹰嘴豆克鲁维酵母、马科斯克鲁维酵母或者脆壁克鲁维酵母。

本发明中，所用的乳酸克鲁维酵母可以是MW179-1D HAP1基因缺陷菌株。乳酸克鲁维菌株MW179-1D信息见文献：Imrichova D et al.YAP1-mediatedKNQ1 expression in Kluyveromyces lactis，FEMS Yeast Research，5(4-5)：323-329，2005。

本发明中，(1)中启动子可以是通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179(出处见Zhang J et al.Cloning of the Kc URA3 Gene and Development of aTransformation System for Kluyveromyces cicerisporus，Appl MicrobiolBiotechnol.，62(4):387-391，.2003.)的总DNA为模板，以P1和P2为引物，PCR扩增获得的；P1的序列如SEQ ID NO 2所示，P2的序列如SEQ ID NO 3所示。

本发明中，(1)中终止子可以是通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，以P5和P6为引物，PCR扩增获得的；P5的序列如SEQ ID NO 6所示，P6的序列如SEQ ID NO 7所示。

本发明中，(1)中的目的蛋白可以是酶、细胞因子、多肽、抗体或者疫苗抗原。本发明中的重组蛋白可以是商业上有用的蛋白质，包括酶、细胞因子、多肽、抗体、疫苗抗原，编码该蛋白质的基因可以来自微生物、植物、动物或人。

本发明的一个实施例中，(1)中的目的蛋白可以是菊粉酶。

本发明中，α-信号肽和菊粉酶编码序列通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，以P3和P4为引物，PCR扩增获得的；P3的序列如SEQ ID NO4所示，P4的序列如SEQ ID NO 5所示。

菊粉酶(inulinase)是一类水解β-2，1-D-多聚果糖果糖糖苷键的一类水解酶。菊粉酶根据其酶切多聚果糖糖链的方式分为外切酶(EC3.2.1.80)和内切酶(EC3.2.1.7)。产生菊粉酶的微生物主要为真菌。鹰嘴豆克鲁维酵母菊粉酶基因GenBank登入号为AF178979，启动子和终止子序列包括在内。菊粉酶在以下方面有重要的应用前景。第一是高果糖浆的制备。高果糖浆是理想的天然甜味剂，果糖的甜度比蔗糖高出80％；能适合糖尿病人食用。同时还具有营养保健功能，能调节肠胃、提高免疫力、排毒养颜、降解血糖和抗癌等优越的生理学活性，被称为第三代功能食品。第二方面，是生物能源领域的应用。目前，生物乙醇的生产主要是以玉米淀粉为原料，原料的种植面临与人用粮食争夺土地的尴尬。菊芋的主要成分菊粉，它的生长条件粗狂，种植不占用耕地，不仅能生长盐碱地，还能生长在沙漠地区，能防止土地沙化，以菊粉为原料生产生物乙醇可以成为目前淀粉乙醇的补充和后备方法。菊粉在菊粉酶的作用下，水解成单糖，能直接被酵母利用，产生乙醇。因此，制备菊粉乙醇是否可行关键是成本的高低，这其中生产菊粉酶成本是关键中的关键。

本发明的方法具体说明如下：

1.菊粉酶基因启动子、终止子控制的重组蛋白克鲁维酵母表达质粒构建。

(1)重组蛋白基因表达盒构建

以克鲁维酵母基因组DNA为模板，设计特异性引物，利用PCR技术分别扩增外切菊粉酶基因启动子和终止子序列，再通过PCR扩增重组蛋白基因序列，将菊粉酶基因启动子、终止子和重组蛋白基因序列分别进行限制性内切酶酶切处理，经过DNA连接酶的连接反应，将菊粉酶基因启动子、重组蛋白基因和菊粉酶基因终止子序列依次克隆于pBS_SK质粒上，获得由菊粉酶基因启动子、重组蛋白基因和菊粉酶基因终止子序列三种元件构成的重组蛋白基因表达盒。采用的PCR、酶切、连接、大肠杆菌转化等基因工程技术方法均为常规方法，参照《分子克隆实验指南》(J.Sambrook，et al.，第二版，1996)。

(2)重组蛋白克鲁维酵母表达质粒构建

pUKD-S是在克鲁维酵母中高度稳定的载体，由克鲁维酵母质粒pKD1、鹰嘴豆克鲁维酵母KcURA3基因和大肠杆菌pUC19序列构成。将载体pUKD-S用限制性内切酶Sse3871切开，用Klenow酶填平粘性末端；将克隆PBS-SK质粒上的重组蛋白表达盒用限制性内切酶切下，表达盒片段经分离后，也用Klenow酶填平粘性末端。然后，表达盒片段和载体pUKD-S片段用DNA连接酶连接，得到菊粉酶基因启动子和终止子控制的重组蛋白基因克鲁维酵母表达质粒。

2.菊粉酶基因启动子、终止子控制的重组蛋白克鲁维酵母表达质粒导入HAP1基因缺陷型克鲁维酵母菌株，构建重组蛋白表达工程菌。

将菊粉酶基因启动子和终止子控制的重组蛋白基因克鲁维酵母表达质粒用LiAc完整细胞转化方法导入HAP1基因缺陷的克鲁维酵母菌株(Ura3^-)，筛选能在缺少尿嘧啶的选择性培养基中生长的酵母菌，即得到重组蛋白克鲁维酵母基因工程菌株。酵母细胞LiAc转化方法参照《酵母遗传学方法实验指南》(A.Adams，et al.，2000)。

另一方面，本发明还提供了一种用于提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的载体，该载体由菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码序列和载体序列组成；其中菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接，载体是pBS_SK、pUKD-S或者pUKD，菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码序列组成的DNA片段***载体的多克隆位点。

本发明构建了含有菊粉酶基因启动子、终止子元件和重组蛋白基因序列的克鲁维酵母表达质粒，并将该质粒导入克鲁维酵母菌株中，建成克鲁维酵母基因工程菌生产重组蛋白，明显促进克鲁维酵母表达重组蛋白。本发明可用于提高多种蛋白的表达量，为降低生产成本、扩大生产规模提供了新的方法。

附图说明

图1：菊粉酶基因表达质粒pUKD-S-αF-PinuT结构示意图。

图2：乳酸克鲁维酵母工程菌K1-WT/pUKD-S-αF-PinuT发酵分泌表达菊粉酶聚丙烯酰氨凝胶电泳图。

图3：乳酸克鲁维酵母工程菌klhap1Δ/pUKD-S-αF-PinuT发酵分泌表达菊粉酶聚丙烯酰氨凝胶电泳图。与图2相比，菊粉酶蛋白条带的浓度大大加深，说明其表达产量大大增加。

图4：乳酸克鲁维酵母工程菌K1-WT/pUKD-S-αF-PinuT和klhap1Δ/pUKD-S-αF-PinuT发酵样品单位体积菊粉酶活性分析。其中，用黑色三角表示的是乳酸克鲁维酵母工程菌K1-WT/pUKD-S-αF-PinuT发酵样品，用黑色方块表示的是klhap1Δ/pUKD-S-αF-PinuT发酵样品。

图5：乳酸克鲁维酵母工程菌K1-WT/pUKD-S-αF-PinuT和klhap1Δ/pUKD-S-αF-PinuT发酵样品单位菌体生产菊粉酶活性分析。

具体实施方式

实施例1 鹰嘴豆克鲁维酵母菊粉酶基因表达质粒pUKD-S-αF-PinuT构建

①.鹰嘴豆克鲁维酵母菊粉酶基因表达盒构建

首先，以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，分别以P1和P2、P5和P6为引物，通过PCR技术扩增出鹰嘴豆克鲁维酵母外切菊粉酶基因的启动子区DNA片段、菊粉酶基因编码区与终止子区DNA片段，再以pPIC9K质粒为模板，以P3和P4为引物，通过PCR技术扩增出α-Factor信号肽DNA片段。按照各个片段设计的酶切位点进行相应的限制性内切酶处理，所得3个酶切片段与经过限制性内切酶EcoR1、HindIII双酶切处理的质粒pBS_SK连接，获得质粒pBS_SK-αF-PinuT，即由菊粉酶基因启动子、α-Factor信号肽、菊粉酶基因编码区和终止子构成的菊粉酶基因表达盒克隆在质粒pBS_SK上。

所用的6条引物的核苷酸序列如下：

克隆菊粉酶基因启动子片段两条引物序列是：

P1：5’AG GAATTC AAAACGACAAGAGAAGCAAACACA3’(见SEQ IDNO 2，下划线部分为BamH1酶切位点)

P2：5’ACACTAGT ATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT3’(见SEQID NO 3，下划线部分为Spel1酶切位点)

克隆α-Factor片段两条引物序列是：

P3：5’ACACTAGT TGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA3’(见SEQ IDNO 4，下划线部分为Spel1酶切位点)

P4：5’ACAGATCT TCTTTTATCCAAAGATACCCCTTCTTC 3’(见SEQID NO 5，下划线部分为BglII酶切位点)

克隆菊粉酶基因编码区与终止子区片段两条引物序列是：

P5：5’ACAGATC GATGGTGACAGCAAGGCCATCAC3’(见SEQ ID NO6，下划线部分为Bgl II酶切位点)

P6：5’ATAAGCTT TAGGCAGGGCTGTGATACACCTGT3’(见SEQ IDNO 7，下划线部分为HindIII酶切位点)

②鹰嘴豆克鲁维酵母菊粉酶基因表达质粒pUKD-S-αF-PinuT构建

将①中质粒pBS_SK-αF-PinuT用限制性内切酶BamH1、HindIII切出菊粉酶基因表达盒DNA片段，片段分离后用Klenow酶填平粘性末端；将酵母载体pUKD-S用限制性内切酶Sse3871切开，也用Klenow酶填平粘性末端。然后两者用DNA连接酶连接，得到鹰嘴豆克鲁维酵母菊粉酶基因表达质粒pUKD-S-αF-PinuT，图谱见图1。

实施例2表达菊粉酶基因的乳酸克鲁维酵母工程菌K1-WT/pUKD-S-αF-PinuT和工程菌klhap1Δ/pUKD-S-αF-PinuT构建。

质粒pUKD-S-αF-PinuT分别转化乳酸克鲁维酵母MW179-1D菌株和HAP1基因缺陷菌株MW179-1D hap1Δ，采用LiAc转化法。乳酸克鲁维酵母HAP1基因序列为SEQ1.ID.NO 1。

①接种单菌落到3ml液体YEPD培养基中30℃振荡培养16-18小时。

②将培养物稀释到50ml液体YEPD中，使起始OD₆₀₀＝0.2，置30℃振荡培养3-5小时，OD₆₀₀＝0.4-0.6。

③5K，5分钟离心收集细胞。

④弃培养液，用25ml无菌水悬浮细胞，再同上离心。

⑤弃水，用1ml0.1mol/L LiAc悬浮细胞，转移到一个无菌1.5ml离心管中。

⑥高速离心5秒钟沉淀细胞，去除上清，然后加入500μl 0.1mol/L LiAc充分悬浮细胞。

⑦取50μl细胞加到标记的离心管中，高速离心5秒钟沉淀细胞，去除上清，然后依次

加入240μl PEG(50％w/v)，36μl 1.0mol/L LiAc，10μl ssDNA(5mg/ml)，50μl水和质粒DNA(0.1-1μg)。

⑧充分混匀细胞，置30℃保温30分钟，然后置42℃水浴热激20分钟。

⑨高速离心15秒，去除上清，加入150μl无菌水悬浮细胞，然后涂布选择性SD培养基平板，置30℃培养。选择性SD培养基成分为：0.67％ YNB，2％葡萄糖，0.002％尿嘧啶，0.002％甲硫氨酸和2％琼脂。

实施例3乳酸克鲁维酵母工程菌K1-WT/pUKD-S-αF-PinuT和klhap1Δ/pUKD-S-αF-PinuT发酵培养及菊粉酶表达分析

①将乳酸克鲁维酵母工程菌K1-WT/pUKD-S-αF-PinuT和klhap1Δ/pUKD-S-αF-PinuT分别接入3ml选择性SD液体培养基中，在30℃，250rpm转速摇床中培养过夜后作为种子液。选择性SD液体培养基成分为：0.67％YNB，2％葡萄糖，0.002％尿嘧啶和0.002％甲硫氨酸。

②将种子液以1：25的比例接入装有25ml液体YEPD培养基的150ml三角瓶中，在30℃，250rpm转速摇床中培养120小时。液体YEPD培养基成分为：1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖。

③每隔24小时吸取发酵液样品，5000rpm离心5min沉淀菌体，取上清液进行表达产物菊粉酶聚丙烯酰胺凝胶电泳分析及菊粉酶活性分析。

④图2和图3为120小时发酵周期中，不同时间点发酵样品聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，与乳酸克鲁维酵母工程菌K1-WT/pUKD-S-αF-PinuT相比，klhap1Δ/pUKD-S-αF-PinuT菌株产酶量明显提高。

⑤发酵液菊粉酶活性测定结果表明(图4、图5)：无论单位体积酶活，还是单位菌体酶活，HAP1基因缺陷株klhap1Δ/pUKD-S-αF-PinuT均明显高于非缺陷株K1-WT/pUKD-S-αF-PinuT，发酵120小时时，HAP1基因缺陷株klhap1Δ/pUKD-S-αF-PinuT产酶量达到391.2单位/毫升，而非缺陷株K1-WT/pUKD-S-αF-PinuT产酶量只有178.2单位/毫升，HAP1基因缺陷株产菊粉酶量是非缺陷株的2.2倍。

序列表

<110>复旦大学

<120>一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法

<130>52

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5079

<212>DNA

<213>酵母

<400>1

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

<210>3

211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

Claims

1.一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)将菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白和菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接；

(2)将(1)得到的序列***克鲁维酵母表达载体pUKD-S或者pUKD；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中采用的克鲁维酵母是乳酸克鲁维酵母、鹰嘴豆克鲁维酵母、马科斯克鲁维酵母或者脆壁克鲁维酵母。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所用的乳酸克鲁维酵母是MW179-1D HAP1基因缺陷菌株。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中启动子是通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，以P1和P2为引物，PCR扩增获得的；P1的序列如SEQ ID NO2所示，P2的序列如SEQ ID NO3所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中终止子是通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，以P5和P6为引物，PCR扩增获得的；P5的序列如SEQ ID NO6所示，P6的序列如SEQ ID NO7所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中的目的蛋白是酶、细胞因子、多肽、抗体或者疫苗抗原。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中的目的蛋白是菊粉酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，α-信号肽和菊粉酶编码序列通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，以P3和P4为引物，PCR扩增获得的；P3的序列如SEQ ID NO4所示，P4的序列如SEQ ID NO5所示。

9.一种用于提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的载体，其特征在于，该载体由菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码序列和载体序列组成；其中，菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接；载体是pBS_SK、pUKD-S或者pUKD；菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码序列组成的DNA片段***载体的多克隆位点。