CN101381402A - Ny-eso-1肿瘤抗原模拟表位及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了NY－ESO－1肿瘤抗原模拟表位，其氨基酸序列为Ser－Leu－Leu－Met－Phe－Ile－Thr－Trp－Cys，即SLLMFITWC；该模拟表位可以上调CTL免疫应答并能和天然表位发生交叉反应，具有免疫原性强、可以打破免疫耐受、特异性强、安全、廉价、易于合成和保存的特点，可用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗；本发明还公开了所述模拟表位的预测方法，包括TCR－pMHC复合物结构模型的建立、表位TCR结合位点的分析、表位TCR结合位点的氨基酸置换分析共三个步骤，该方法同样适用于其它抗原CTL表位的计算机辅助改造，可为治疗性多肽疫苗的设计和研究提供有用的工具。

Description

NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位及其应用。

背景技术

NY-ESO-1属于肿瘤-睾丸抗原(Cancer-Testis Antigen，CTA)家族，能在睾丸、卵巢组织和多种不同类型的肿瘤组织中表达，而在其它正常组织中不表达，是一种特异性较强的肿瘤抗原。同时，由于该抗原能引起机体产生细胞免疫和体液免疫，被认为是目前免疫原性最强的肿瘤抗原之一。因此，NY-ESO-1是肿瘤免疫治疗的理想靶标。

随着现代免疫学的发展，细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)在肿瘤中发挥的重要作用越来越受到重视。如何有效地激发CTL介导的特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤效能，已经成为当今肿瘤治疗性多肽疫苗研制领域的一个重要课题。既往研究发现，引起CTL免疫应答反应的，并非完整的肿瘤抗原分子，而是抗原来源的特异性CTL表位(Epitope)。抗原递呈细胞摄取肿瘤抗原后，通过蛋白水解作用将其加工成为8-10个氨基酸长度的多肽片段，即CTL表位，进而与内质网腔中的主要组织相容性复合体I(MHC I)类分子结合形成多肽-MHC复合物(peptide-MHC complex，pMHC)，并最终将pMHC递呈到细胞表面供CD8⁺T细胞表面的T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)识别，从而活化CTL细胞，引发CTL免疫应答反应。但是，免疫原性弱和免疫耐受的存在是CTL表位作为肿瘤治疗性多肽疫苗应用的两大障碍。因此，如何提高CTL表位的免疫原性以及打破机体对CTL表位的免疫耐受成为肿瘤治疗性多肽疫苗发展的关键。

目前，在众多肿瘤治疗性多肽疫苗的增强策略中，对CTL表位进行分子改造被认为是最有前景的方法之一。CTL表位的改造，可以通过改造表位MHC结合位点，从而改善表位与MHC的亲和力和pMHC的稳定性，以达到增强免疫原性的目的；也可以通过改造表位TCR结合位点，从而改善pMHC与TCR结合的稳定性，以达到提高CTL活性并克服CTL耐受的目的。近期研究表明，基于表位MHC结合位点改造的多肽疫苗虽然可以一定程度上提高疫苗的免疫原性，但在肿瘤免疫治疗中达不到理想的抑瘤效果；而基于表位TCR结合位点改造的多肽疫苗，有望通过增强对低亲和力T细胞的刺激能力或者招募一群新的具有交叉反应性的T细胞打破肿瘤免疫耐受而达到理想的抑瘤效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于对NY-ESO-1肿瘤抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位(第157位至第165位氨基酸，序列为SLLMWI TWC，简称WT)的TCR结合位点进行改造，从而获得NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位，可以上调CTL免疫应答并能和天然表位发生交叉反应，打破免疫耐受，产生较好的抑瘤效果。

为达到此目的，本发明的NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位，其氨基酸序列为Ser-Leu-Leu-Met-Phe-Ile-Thr-Trp-Cys(SEQ ID No.1)，即SLLMFITWC。

本发明的另一目的在于提供所述NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位的预测方法，该方法同样适用于其它抗原CTL表位的计算机辅助改造，可为治疗性多肽疫苗的设计和研究提供有用的工具。

为达到此目的，所述NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位的预测方法，包括以下步骤：

a、TCR-pMHC复合物结构模型的建立

借助美国RCSB PDB数据库中NY-ESO-1肿瘤抗原表位与特异性TCR、MHC三分子复合物的晶体结构，在Insight II工作站上建立TCR-pMHC复合物结构模型；所述NY-ESO-1肿瘤抗原表位序列为SLLMWITWC；

b、表位TCR结合位点的分析

根据步骤a所得的TCR-pMHC复合物结构模型，对NY-ESO-1肿瘤抗原表位中处于TCR/pMHC结合界面上的各个氨基酸分别进行丙氨酸点突变，计算突变前后pMHC与TCR的结合自由能差ΔΔG，根据ΔΔG大小判断结合界面上各个氨基酸对TCR/pMHC相互作用的贡献大小，差值越大表示该氨基酸对TCR-pMHC复合物的稳定性贡献越大，由此确定表位TCR结合位点；

突变前后pMHC与TCR的结合自由能差ΔΔG根据下述公式进行计算：

$\mathrm{\Δ\ΔG}=\mathrm{\Δ}{G}_{p_1}^{\mathrm{binding}}-\mathrm{\Δ}{G}_{p_2}^{\mathrm{binding}}=\mathrm{\Δ}{G}_{p_1\→p_2}^{\mathrm{unbound}}-\mathrm{\Δ}{G}_{p_1\→p_2}^{\mathrm{bound}}$

式中：代表突变前的pMHC即p₁-MHC与TCR结合前后的自由能差，

代表突变后的pMHC即p₂-MHC与TCR结合前后的自由能差，

代表突变前后的两个pMHC的自由能差，

代表突变前后的两个TCR-pMHC复合物的自由能差；

c、表位TCR结合位点的氨基酸置换分析

利用Insight II工作站中的Biopolymer、Discover3模块，对步骤b所得的表位TCR结合位点中的各个氨基酸分别进行24种天然氨基酸置换，获得一系列APLs，再进一步利用Insight II工作站中的CHARMm、ZDOCKpro模块精确计算置换前后pMHC与TCR的结合自由能差ΔΔG，根据ΔΔG大小判断置换后的氨基酸对TCR/pMHC相互作用的贡献大小，差值越大表示该氨基酸对TCR-pMHC复合物的稳定性贡献越大，由此预测出与TCR结合能力增强的APLs，即可能的模拟表位，包括所述的NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位。

本发明的再一目的在于提供所述NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。

进一步，所述模拟表位在制备肺癌治疗性多肽疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明以NY-ESO-1肿瘤抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位(第157位至第165位氨基酸)为研究对象，采用本发明建立的模拟表位预测方法，首先构建TCR-pMHC复合物结构模型，再通过丙氨酸点突变和结合自由能差计算方法确定表位TCR结合位点，最后对所得表位TCR结合位点进行24种天然氨基酸置换，通过结合自由能差计算方法预测出可能的模拟表位；所得预测模拟表位通过体外免疫学效应检测进行鉴定，最终获得可以上调CTL免疫应答并能和天然表位发生交叉反应的模拟表位，即以苯丙氨酸F置换天然表位中第5位色氨酸W而得到；本发明的NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位具有免疫原性强、可以打破免疫耐受、特异性强、安全、廉价、易于合成和保存的特点，可以克服天然表位免疫原性弱和免疫耐受的缺点，达到有效***的目的，可用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗，在肿瘤免疫治疗中有着广泛的应用前景；本发明建立的模拟表位预测方法适用于多种抗原CTL表位的计算机辅助改造，可为治疗性多肽疫苗的设计和研究提供有用的工具，能够指导后续实验，减少肽合成与功能实验的工作量，降低研究成本，加快研究进度。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为TCR/pMHC相互作用的热力学循环图；

图2为本发明的NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位诱导的特异性CTL分泌IFN-γ能力的检测结果；

图3为本发明的NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的检测结果。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、抗原模拟表位的预测

1、TCR-pMHC复合物结构模型的建立

借助美国RCSB Protein Data Bank(PDB，蛋白质数据库)中NY-ESO-1_157-165与特异性TCR、MHC三分子复合物1G4-9C-A2的晶体结构(PDB ID:2BNQ)，在Insight II工作站上建立TCR-pMHC复合物1G4-9C-A2结构模型；

2、表位TCR结合位点的分析

结合自由能是评价蛋白质相互作用中对接分子之间结合强度的一个重要指标，可以精确的评价受体-配体的相互作用。根据步骤1建立的TCR-pMHC复合物结构模型，对NY-ESO-1_157-165中处于TCR/pMHC结合界面上的各个氨基酸分别进行丙氨酸点突变，计算突变前后pMHC与TCR的结合自由能差(ΔΔG)，根据差值大小判断结合界面上各位点氨基酸对TCR/pMHC相互作用的贡献大小，差值越大表示该氨基酸对TCR-pMHC复合物的稳定性贡献越大，由此确定表位TCR结合位点；

TCR/pMHC相互作用的热力学循环图如图1所示，p₁-MHC代表单个氨基酸突变前的pMHC，p₂-MHC代表单个氨基酸突变后的pMHC，TCR-p₁-MHC、TCR-p₂-MHC分别代表p₁-MHC、p₂-MHC与TCR结合形成的复合物，

分别代表p₁-MHC、p₂-MHC与TCR结合前后的自由能差，

代表突变前后的两个pMHC的自由能差，

代表突变前后的两个TCR-pMHC复合物的自由能差，突变前后pMHC与TCR的结合自由能差(ΔΔG)根据下述公式进行计算：

$\mathrm{\Δ\ΔG}=\mathrm{\Δ}{G}_{p_1}^{\mathrm{binding}}-\mathrm{\Δ}{G}_{p_2}^{\mathrm{binding}}=\mathrm{\Δ}{G}_{p_1\→p_2}^{\mathrm{unbound}}-\mathrm{\Δ}{G}_{p_1\→p_2}^{\mathrm{bound}}$

3、表位TCR结合位点的氨基酸置换分析

利用Insight II工作站中的Biopolymer、Discover3模块，对步骤2所得表位TCR结合位点中的各个氨基酸分别进行24种天然氨基酸高通量置换，获得一系列APLs，再进一步利用Insight II工作站中的CHARMm、ZDOCKpro模块精确计算置换前后pMHC与TCR的结合自由能差(ΔΔG)，根据ΔΔG大小判断置换后的氨基酸对TCR/pMHC相互作用的贡献大小，差值越大表示该氨基酸对TCR-pMHC复合物的稳定性贡献越大，由此预测出4个与TCR结合能力增强的APLs，即可能的模拟表位，其氨基酸序列分别为SLLIWITQC(简称M4I)、SLLQWITQC(简称M4Q)、SLLMFITQC(简称W5F)、SLLMRITQC(简称W5R)。

二、预测模拟表位的鉴定

1、预测模拟表位的合成、纯化及鉴定

预测模拟表位委托上海生工生物工程技术服务公司进行合成，合成方案采用标准Fmoc方案，即由去保护和激活交联两个反应反复循环直至合成目的多肽，获得的目的多肽粗品用高效液相色谱法进行纯化，纯化后的多肽经反相高效液相色谱法和质谱法进行纯度(均高于95％)和质量鉴定后，冷冻干燥，置温度-70℃保存，备用；

2、预测模拟表位与HLA-A2.1分子间亲和力检测

方法：采用HLA-A2.1表达阳性且内源性抗原加工处理能力缺失的T2细胞株(ATCC公司)进行亲和力检测，实验原理基于T2细胞株的如下特点：T2细胞表面的未与内源性抗原肽结合的空HLA-A2.1分子表达极不稳定，很快降解；当外源性预测模拟表位与空HLA-A2.1分子结合后，HLA-A2.1分子可以稳定地在T2细胞表面表达，其表达量和预测模拟表位与HLA-A2.1分子间亲和力呈正相关；

HLA-A2.1分子的表达量采用间接免疫荧光染色法检测，共设7个实验组和空白对照组(以PBS替代表位)，7个实验组分别为：预测模拟表位M4I组、M4Q组、W5F组和W5R组，天然表位WT组、阳性对照表位PC组(HIV-1_po1476-484，氨基酸序列为ILKEPVHGV，简称PC)和阴性对照表位NP组(OVA_257-264，氨基酸序列为AHTKDGFNF，简称NP)；

具体方法为：T2细胞经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后，用RPMI1640培养液重悬至细胞密度为1.0×10⁶/mL，接种于24孔培养板上，并加入浓度为500ng/mL的β-2微球蛋白；各组预测模拟表位或天然表位分别用二甲基亚砜(DMSO)溶解，制成浓度为10mg/mL的溶液，加至上述T2细胞培养孔中至终浓度为100μg/mL，置温度37℃、CO₂气体体积百分浓度为5％、饱和湿度条件下培养16小时，收集T2细胞培养液，800r/min离心5分钟，细胞沉淀用冰PBS洗涤3次后，加入100μL由BB7.2杂交瘤细胞(ATCC公司)产生的鼠抗人HLA-A2.1的单克隆抗体，置温度4℃孵育30分钟，用PBS洗涤3次后，加入100μL稀释度为1∶50的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG，置温度4℃避光孵育30分钟，用PBS洗涤3次后，用0.5mL冰PBS重悬，用流式细胞仪测定平均荧光强度，并按如下公式计算荧光系数(Fluorescence index，FI)：FI＝(实验组平均荧光强度-空白对照组平均荧光强度)/空白对照组平均荧光强度，当FI>1.5时为高亲和力，当1.0<FI<1.5时为中等亲和力，当FI<1.0时为低亲合力；

结果：如下表所示，4个预测模拟表位没有显著改变与HLA-A2.1分子间的亲和力；

表、各组预测模拟表位或天然表位与HLA-A2.1分子间亲和力检测结果

3、预测模拟表位诱导的特异性CTL分泌细胞因子IFN-γ能力的检测

方法：采用密度梯度离心法从HLA-A*0201⁺健康志愿者的静脉血中分离外周血单个核细胞(PBMCs)，用RPMI1640培养基重悬至细胞密度为1.0×10⁶/mL，接种于24孔培养板上，置温度37℃、CO₂气体体积百分浓度为5％条件下孵育2小时，收集非贴壁细胞(主要为淋巴细胞)，用磁珠分选CD8⁺T细胞试剂盒分选CD8⁺T细胞，按照试剂盒说明书操作，纯度用流式细胞仪分析(高于98％)；贴壁细胞为抗原递呈细胞-树突状细胞(DC)，加入RPMI 1640培养液[内含质量百分浓度为10％的胎牛血清、浓度为100ng/mL的集落刺激因子(GM-CSF)、浓度为100ng/mL的白细胞介素4(IL-4)]，置温度37℃、CO₂气体体积百分浓度为5％条件下孵育7天，孵育期间，培养基每48小时半量换液，并于第5天加入细胞因子TGF-α，继续孵育2天后，即获得成熟DC，用流式细胞仪鉴定，备用；

共设5个实验组，分别为：预测模拟表位M4I组、M4Q组、W5F组和W5R组，天然表位WT组，阴性对照表位NP组；

用各组预测模拟表位或天然表位分别脉冲成熟DC，即向成熟DC中，加入预测模拟表位或天然表位，以及β-2微球蛋白，置温度37℃孵育4小时后，用3000rad γ射线照射，再用PBS洗去未结合的预测模拟表位或天然表位；按脉冲后的成熟DC与CD8⁺T细胞的数量比为5∶1，取上述两种细胞，加入RPMI 1640培养液[内含质量百分浓度为10％的人AB血清、浓度为5ng/mL的白细胞介素7(IL-7)、浓度为5ng/mL的白细胞介素12(IL-12)、浓度为5ng/mL的白细胞介素2(IL-2)]，置温度37℃、CO₂气体体积百分浓度为5％条件下孵育7天，孵育期间，培养基每48小时换液；7天为1个循环，共诱导3个循环，获得各组预测模拟表位或天然表位诱导的特异性CTL；

取上述各组预测模拟表位或天然表位诱导的特异性CTL作为效应细胞，调整细胞密度至1.0×10⁶/mL，接种于96孔培养板中，每孔100μL；靶细胞采用相应的预测模拟表位或天然表位脉冲的T2细胞，按效靶比(即效应细胞与靶细胞的数量比)为5∶1，将靶细胞加入上述效应细胞培养孔中，置温度37℃、CO₂气体体积百分浓度为5％条件下孵育24小时后，用胞内因子染色试剂盒(eBioscience公司)对IFN-γ进行染色，按照试剂盒说明书操作，用流式细胞仪测定，计算预测模拟表位诱导的特异性CTL中分泌IFN-γ的T细胞(即CD8⁺IFN-γ⁺T细胞)所占的百分率；

结果：如图2所示，预测模拟表位W5F诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于天然表位WT(P<0.01)，而W5R诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力略低于WT，M4I、M4Q诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显低于WT(P<0.05)；

4、预测模拟表位诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的检测

方法：采用标准⁵¹Cr释放法，靶细胞采用乳腺癌细胞MCF-7(NY-ESO-1^-，HLA-A2⁺)和肺癌细胞NCI-H526(NY-ESO-1⁺，HLA-A2⁺)(均由ATCC公司提供)，分别将两种靶细胞用RPMI 1640培养液洗涤3次，用0.5mL不含碳酸氢钠的完全培养液重悬，再加入100μCi(3.7MBq)⁵¹Cr铬酸钠，置温度37℃标记1小时，之后用RPMI 1640培养液洗涤3次，再用RPMI 1640培养液重悬，置温度37℃水浴30分钟以减少非特异的自然释放，离心弃上清，细胞沉淀用RPMI 1640培养液重悬，调整细胞密度为10⁵/mL，备用；效应细胞采用预测模拟表位W5F诱导的特异性CTL和天然表位WT诱导的特异性CTL，调整细胞密度为10⁷/mL，备用；

共设6个实验组、阴性对照组和阳性对照组，6个实验组分别为：W5F/MCF-7组(以W5F诱导的特异性CTL为效应细胞，以MCF-7为靶细胞)、WT/MCF-7组(以WT诱导的特异性CTL为效应细胞，以MCF-7为靶细胞)、W5F组(以W5F诱导的特异性CTL为效应细胞，以NCI-H526为靶细胞)、WT组(以WT诱导的特异性CTL为效应细胞，以NCI-H526为靶细胞)、W5F+anti-HLA-A2组(以W5F诱导的特异性CTL为效应细胞，以NCI-H526为靶细胞并加入抗HLA-A2抗体)、WT+anti-HLA-A2组(以WT诱导的特异性CTL为效应细胞，以NCI-H526为靶细胞并加入抗HLA-A2抗体)；阴性对照组即自然释放组(以完全培养液替代效应细胞)，阳性对照组即最大释放组(以质量百分浓度为1％的NP-40裂解液替代效应细胞)；

在96孔圆底培养板中，分别加入⁵¹Cr标记的靶细胞，每孔100μL，每组设三个复孔，再按效靶比为100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1，加入效应细胞，置温度37℃、CO₂气体体积百分浓度为5％条件下孵育4小时，离心取上清液，用γ-计数仪测定上清液的每分钟放射性活性(cpm值)，并按如下公式计算特异性杀伤率：特异性杀伤％＝[(实验组cpm-阴性对照组cpm)/(阳性对照组cpm-阴性对照组cpm)]×100％；

结果：如图3所示，预测模拟表位W5F诱导的特异性CTL在各效靶比对既表达NY-ESO-1又表达HLA-A2的肺癌细胞NCI-H526有特异性杀伤作用，且特异性杀伤率高于天然表位WT诱导的特异性CTL，表明W5F可以上调CTL免疫应答并能与NCI-H526递呈于细胞表面的天然表位发生交叉识别；W5F对不表达NY-ESO-1只表达HLA-A2的乳腺癌细胞MCF-7未见特异性杀伤；加入抗HLA-A2抗体后，W5F诱导的特异性CTL在各效靶比对NCI-H526未见特异性杀伤，表明W5F诱导的特异性CTL对NCI-H526为抗原特异性、MHC限制性杀伤。

基于以上体外免疫学效应检测结果，可得出如下结论：W5F是可以上调CTL免疫应答并能和天然表位发生交叉反应的模拟表位，该模拟表位可以用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗，特别是肺癌治疗性多肽疫苗。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位及其应用

<160>1

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位

<400>1

Ser Leu Leu Met Phe Ile Thr Trp Cys

1                5

Claims (4)

1、NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位，其氨基酸序列为Ser-Leu-Leu-Met-Phe-Ile-Thr-Trp-Cys，即SLLMFITWC。

2、权利要求1所述的NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位的预测方法，包括以下步骤:

a、TCR-pMHC复合物结构模型的建立

借助美国RCSB PDB数据库中NY-ESO-1肿瘤抗原表位与特异性TCR、MHC三分子复合物的晶体结构，在Insight II工作站上建立TCR-pMHC复合物结构模型；所述NY-ESO-1肿瘤抗原表位序列为SLLMWITWC；

b、表位TCR结合位点的分析

根据步骤a所得的TCR-pMHC复合物结构模型，对NY-ESO-1肿瘤抗原表位中处于TCR/pMHC结合界面上的各个氨基酸分别进行丙氨酸点突变，计算突变前后pMHC与TCR的结合自由能差ΔΔG，根据ΔΔG大小判断结合界面上各个氨基酸对TCR/pMHC相互作用的贡献大小，差值越大表示该氨基酸对TCR-pMHC复合物的稳定性贡献越大，由此确定表位TCR结合位点；

突变前后pMHC与TCR的结合自由能差ΔΔG根据下述公式进行计算:

$\mathrm{\&Delta;\&Delta;G}=\mathrm{\&Delta;}{G}_{p_1}^{\mathrm{binding}}-\mathrm{\&Delta;}{G}_{p_2}^{\mathrm{binding}}=\mathrm{\&Delta;}{G}_{p_1\&RightArrow;p_2}^{\mathrm{unbound}}-\mathrm{\&Delta;}{G}_{p_1\&RightArrow;p_2}^{\mathrm{bound}}$

式中:

代表突变前的pMHC即p₁-MHC与TCR结合前后的自由能差，

代表突变后的pMHC即p₂-MHC与TCR结合前后的自由能差，

代表突变前后的两个pMHC的自由能差，

代表突变前后的两个TCR-pMHC复合物的自由能差；

c、表位TCR结合位点的氨基酸置换分析

利用Insight II工作站中的Biopolymer、Discover3模块，对步骤b所得的表位TCR结合位点中的各个氨基酸分别进行24种天然氨基酸置换，获得一系列APLs，再进一步利用Insight II工作站中的CHARMm、ZDOCKpro模块精确计算置换前后pMHC与TCR的结合自由能差ΔΔG，根据ΔΔG大小判断置换后的氨基酸对TCR/pMHC相互作用的贡献大小，差值越大表示该氨基酸对TCR-pMHC复合物的稳定性贡献越大，由此预测出与TCR结合能力增强的APLs，即可能的模拟表位，包括权利要求1所述的NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位。

3、权利要求1所述的NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。

4、根据权利要求4所述的NY-ESO-1肿瘤抗原模拟表位在制备治疗性多肽疫苗中的应用，其特征在于:所述模拟表位在制备肺癌治疗性多肽疫苗中的应用。

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