CN101508721A

CN101508721A - 肿瘤抗原Ran HLA-A*0201限制性模拟CTL表位及其应用

Info

Publication number: CN101508721A
Application number: CNA2009101034362A
Authority: CN
Inventors: 吴玉章; 倪兵; 李凡
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2009-03-24
Filing date: 2009-03-24
Publication date: 2009-08-19

Abstract

本发明公开了肿瘤抗原Ran HLA－A^*0201限制性模拟CTL表位，由Tyr－Met－Phe－Asp－Val－Thr－Ser－Arg－Val氨基酸序列组成；与天然CTL表位比较，该模拟CTL表位与HLA－A^*0201分子具有更强的亲和力和结合稳定性，同时，其诱导的特异性CTL能分泌更高水平的IFN－γ，并且对HLA－A^*0201和Ran表达阳性的MCF－7细胞以及负载天然CTL表位的T2细胞均表现出更强的抗原特异性杀伤效应；肿瘤抗原Ran广泛表达于不同类型的肿瘤组织中，本发明的模拟CTL表位可以用于制备Ran表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

Description

肿瘤抗原Ran HLA-A*0201限制性模拟CTL表位及其应用

技术领域

本发明涉及一种肿瘤抗原模拟表位，特别涉及肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位，还涉及该模拟CTL表位的应用。

背景技术

恶性肿瘤是当前威胁人类生命健康的几大主要疾病之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，位居我国城市居民死亡原因的第一位，对其采取有效的预防和治疗已经迫在眉睫。目前，临床上***的主要方法包括手术切除、放射治疗和化学药物治疗，但这些方法对某些肿瘤，特别是晚期恶性肿瘤的治疗效果还不能尽如人意。近年来迅速发展起来的肿瘤特异性免疫治疗和肿瘤治疗性多肽疫苗，基于肿瘤抗原的CTL表位，以主动免疫方式，体内激活免疫***，诱导产生特异性CTL杀伤肿瘤细胞，而对正常组织无损害，是一种完全、有效的肿瘤治疗方法。已有众多文献报道，肿瘤抗原的CTL表位在体外、体内均可有效诱导特异性杀瘤CTL的产生，使部分肿瘤患者的肿瘤缩小，生存期延长。因此，肿瘤抗原的发现及其CTL表位的鉴定成为肿瘤特异性免疫治疗以及肿瘤治疗性多肽疫苗研制的重要前提。

Ran(ras-related nuclear protein)是由216个氨基酸组成的GTP酶，大量分布于细胞核内，参与调控细胞周期中各个时期的许多细胞生命活动，包括细胞核重建、DNA复制、细胞核物质转运和细胞***时纺锤体的组装等，为Ras类原癌基因超家族的重要成员。近来文献报道，Ran是一种肿瘤相关抗原，在RNA水平上广泛表达于多种肿瘤和正常组织中，但在蛋白水平上仅在肿瘤组织中表达，与肿瘤的恶性转移和增殖密切相关，是恶性肿瘤特异性免疫治疗的良好靶标。鉴于HLA-A^*0201是中国人群和北美高加索人种最常见的HLAI类分子型别(阳性率分别高达50％和98％)，因此，Ran HLA-A^*0201限制性CTL表位的鉴定及其肿瘤治疗性多肽疫苗的研制更具现实意义和应用价值。

本发明人在前期研究中(Ran HLA-A2.1限制性CTL表位的预测和初步鉴定.李凡等.免疫学杂志，第22卷第3期，2006年5月)应用超基序和量化基序相结合的方法对Ran HLA-A^*0201限制性天然CTL表位进行了预测，得到4个候选天然表位，分别是YVATLGVEV、TLGVEVHPL、IMFDVTSRV和VLCGNKVD，并对4个候选天然表位与HLA-A^*0201分子的亲和力和结合稳定性分别进行了分析，亲和力实验结果显示YVATLGVEV、TLGVEVHPL和IMFDVTSRV与HLA-A^*0201分子有中等亲和力而VLCGNKVD无明显亲和力；结合稳定性实验结果显示IMFDVTSRV的结合稳定性最好而YVATLGVEV和TLGVEVHPL的结合稳定性较差。

免疫原性弱是天然CTL表位作为肿瘤治疗性多肽疫苗应用的障碍之一。如何提高天然CTL表位的免疫原性成为肿瘤治疗性多肽疫苗发展的关键。目前，在众多肿瘤治疗性多肽疫苗的增强策略中，对天然CTL表位进行分子改造被认为是最有前景的方法之一。由于CTL表位与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的结合是诱导CTL免疫应答的关键因素，而CTL表位与MHC I类分子结合的重要基础是锚着残基，因此，可以通过改变锚着残基或其相邻位置的氨基酸残基达到增强免疫原性而特异性不受影响的目的。

发明内容

有鉴于此，为克服现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于对前期研究中经预测和初步鉴定的Ran HLA-A^*0201限制性天然CTL表位进行改造，并通过亲和力实验和细胞毒性实验等筛选出免疫原性增强而特异性不受影响的模拟CTL表位，为肿瘤治疗性多肽疫苗的研制奠定基础。

为达到此目的，在本发明的第一方面，提供了肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟CTL表位，由Tyr-Met-Phe-Asp-Val-Thr-Ser-Arg-Val(SEQ ID No.1)氨基酸序列组成。

本发明的第二个目的在于提供一种肿瘤治疗性多肽疫苗。

为达到此目的，在本发明的第二方面，提供了一种肿瘤治疗性多肽疫苗，含有免疫学有效量的所述肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟CTL表位。

进一步，还含有药学上可接受的载体。

本发明的第三个目的在于提供所述肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟CTL表位的应用。

为达到此目的，在本发明的第三方面，提供了所述肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟CTL表位在制备Ran表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗中的应用。

进一步，所述Ran表达阳性肿瘤为乳腺癌。

本发明的有益效果在于：本发明公开了肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟CTL表位，经亲和力实验和细胞毒性实验等证实，与天然CTL表位相比，该模拟CTL表位与HLA-A^*0201分子具有更强的亲和力和结合稳定性，同时，其诱导的特异性CTL能分泌更高水平的IFN-γ，并且对HLA-A^*0201和Ran表达阳性的MCF-7细胞以及负载天然CTL表位的T2细胞均表现出更强的抗原特异性杀伤效应；由于肿瘤抗原Ran广泛表达于不同类型的肿瘤组织中，因此，本发明的模拟CTL表位可以作为活性成分，和药学上可接受的载体组成组合物，或者，与其它具有药理活性的提取物和/或合成药物和药学上可接受的载体组成组合物，再按照药学领域的常规方法制成Ran表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性天然CTL表位诱导的特异性CTL分泌IFN-γ能力的检测结果；

图2为肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟CTL表位诱导的特异性CTL分泌IFN-γ能力的检测结果；

图3为肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性天然CTL表位和模拟CTL表位诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的检测结果；

图4为肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性天然CTL表位和模拟CTL表位诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A^*0201限制性检测结果。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明以前期研究中经预测和初步鉴定的Ran HLA-A^*0201限制性天然CTL表位：IMFDVTSRV(简称Ran1)、TLGVEVHPL(简称Ran2)和YVATLGVEV(简称Ran3)为基础，根据HLA-A^*0201限制性表位基序(主要锚着残基为第2位和第9位氨基酸残基，其中第2位氨基酸残基为L或M，第9位氨基酸残基为L、I或V)和其它位置上不同氨基酸残基对表位与HLA-A^*0201分子亲和力的影响，对上述3个天然CTL表位的主要锚着残基或其相邻位置的氨基酸残基进行改造，使CTL表位不包含不利于结合的氨基酸残基或有利于结合的氨基酸残基多于不利于结合的氨基酸残基，由此设计出4个候选模拟CTL表位：YMFDVTSRV(简称Ran1-1Y)、YLGVEVHPL(简称Ran2-1Y)、YLATLGVEV(简称Ran3-2L)和YMATLGVEV(简称Ran3-2M)，分别检测了上述4个候选模拟CTL表位与HLA-A^*0201分子的亲和力、其诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力和肿瘤细胞特异性杀伤效应，最终筛选出免疫原性增强而特异性不受影响的模拟CTL表位。

一、候选模拟CTL表位的合成

候选模拟CTL表位委托上海生工生物工程技术服务公司采用标准Fmoc方案进行合成，并采用反相高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定。结果显示，各候选模拟CTL表位的纯度均高于95％，分子量与理论值相符。

所得候选模拟CTL表位用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成储备液，置温度-70℃保存，临用前用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释。

二、候选模拟CTL表位与HLA-A^*0201分子的亲和力检测

原理：采用HLA-A^*0201表达阳性但内源性抗原肽递呈途径必需的抗原加工相关转运体(TAP)缺陷的T2细胞株进行实验，未与内源性抗原肽结合的HLA-A^*0201分子在T2细胞表面的表达极不稳定，很快发生降解；而与外源性抗原肽结合的HLA-A^*0201分子可以在T2细胞表面稳定地表达，且表达量与外源性抗原肽和HLA-A^*0201分子的亲和力呈正相关。

方法：(1)实验组设置：7个样品组：Ran1组、Ran2组、Ran3组、Ran1-1Y组、Ran2-1Y组、Ran3-2L组和Ran3-2M组；1个阳性对照组：HBcAg_18-27组(乙肝病毒核心抗原的HLA-A^*0201限制性CTL表位，氨基酸序列为FLPSDFFPSV)；1个阴性对照组：不加入任何表位。

(2)间接免疫荧光法检测：每组取体外常规培养的T2细胞1.0×10⁶个，用冰冷PBS洗涤后，加入表位至终浓度为10μg/mL，温度37℃孵育4小时，用冰冷PBS洗涤后，加入BB7.2杂交瘤细胞分泌的鼠抗人HLA-A^*0201单克隆抗体100μL，温度4℃孵育40分钟，用冰冷PBS洗涤后，加入稀释度为1∶50的异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG100μL，温度4℃避光孵育40分钟，用冰冷PBS洗涤后，加入冰冷PBS 0.5mL重悬，用流式细胞仪于波长488nm处测定平均荧光强度，并计算荧光系数(FI)：FI＝(样品组平均荧光强度-阴性对照组平均荧光强度)/阴性对照组平均荧光强度，当FI>1.5时为高亲和力，当1.0<FI<1.5时为中等亲和力，当FI<1.0时为低亲合力。

结果：见表1，由表1可知，3个天然CTL表位(Ran1、Ran2和Ran3)与HLA-A^*0201分子具有中等亲和力，而4个候选模拟CTL表位(Ran1-1Y、Ran2-1Y、Ran3-2L和Ran3-2M)与HLA-A^*0201分子具有高亲和力，与其对应的天然CTL表位比较，模拟CTL表位的亲和力有显著增强。

表1、候选模拟CTL表位与HLA-A^*0201分子的亲和力检测结果

三、候选模拟CTL表位诱导的特异性CTL分泌IFN-γ能力检测

方法：(1)实验组设置：7个样品大组：Ran1组、Ran2组、Ran3组、Ran1-1Y组、Ran2-1Y组、Ran3-2L组和Ran3-2M组，分别以各表位诱导的特异性CTL为效应细胞；其中，Ran1组、Ran2组和Ran3组各自又分为4个样品小组：T2+peptide组(以负载相应表位的T2细胞为靶细胞)、T2+HBcAg组(以负载HBcAg_18-27的T2细胞为靶细胞)、T2+peptide+A2Ab组(以负载相应表位并用抗HLA-A^*0201抗体封闭了HLA-A^*0201分子的T2细胞为靶细胞)和T2+peptide+CD8Ab组(以负载相应表位并用抗CD8抗体封闭了CD8分子的T2细胞为靶细胞)；Ran1-1Y组、Ran2-1Y组、Ran3-2L组和Ran3-2M组各自又分为6个样品小组：T2+WT100(μg)组(以负载相应天然表位100μg的T2细胞为靶细胞)、T2+WT10(μg)组(以负载相应天然表位10μg的T2细胞为靶细胞)、T2+WT1(μg)组(以负载相应天然表位1μg的T2细胞为靶细胞)、T2+HBcAg组(以负载HBcAg_18-27的T2细胞为靶细胞)、T2+WT+A2Ab组(以负载相应天然表位并用抗HLA-A^*0201抗体封闭了HLA-A^*0201分子的T2细胞为靶细胞)和T2+WT+CD8Ab组(以负载相应天然表位并用抗CD8抗体封闭了CD8分子的T2细胞为靶细胞)。

(2)效应细胞制备：HLA-A^*0201阳性健康人的抗凝新鲜全血经常规聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心法分离，获得外周血单个核细胞(PBMC)，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1.0×10⁶/mL，接种至24孔培养板中，每孔1mL；每组用浓度为10μg/mL的表位、浓度为50U/mL的重组白细胞介素2(rhIL-2)连续刺激PBMC 3次，每周1次，末次刺激后第3日收集细胞，即得表位诱导的特异性CTL，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养液调整至适当浓度，作为效应细胞。

(3)酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测分泌IFN-γ能力：采用ELISPOT检测试剂盒，在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70％的乙醇100μL，室温放置10分钟，用PBS洗涤后，加入用PBS按1∶100稀释的IFN-γ捕获抗体100μL，温度4℃孵育过夜，用PBS洗涤后，加入质量百分浓度为2％的脱脂奶粉100μL，室温封闭2小时，用PBS洗涤后，加入效应细胞100μL和靶细胞100μL[效应细胞与靶细胞的数量比即效靶比(E/T)为10]，在温度37℃、CO₂气体浓度为50mL/L的条件下孵育20小时，用含有质量百分浓度为0.1％的吐温20的PBS洗涤后，加入用含有质量百分浓度为1％的BSA的PBS按1∶100稀释的生物素标记的抗IFN-γ抗体100μL，在温度37℃、CO₂气体体积百分浓度为5％的条件下孵育1.5小时，用含有质量百分浓度为0.1％的吐温20的PBS洗涤后，加入用含有质量百分浓度为1％的BSA的PBS按1∶5000稀释的链霉亲和素标记的碱性磷酸酶100μL，温度37℃孵育1小时，用含有质量百分浓度为0.1％的吐温20的PBS洗涤后，拍干96孔板，加入即用型BCIP/NBT底物反应液100μL，室温避光显色2～10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后读点。

结果：见图1和图2，由图1和图2可知，4个候选模拟CTL表位(Ran1-1Y、Ran2-1Y、Ran3-2L和Ran3-2M)诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于其对应的天然表位(P<0.05)，并且在4个候选模拟CTL表位中，Ran1-1Y诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力最强。

四、候选模拟CTL表位诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的检测

方法：(1)实验组设置：7个样品大组：Ran1组、Ran2组、Ran3组、Ran1-1Y组、Ran2-1Y组、Ran3-2L组和Ran3-2M组，分别以各表位诱导的特异性CTL为效应细胞；每个样品大组又分为3个样品小组：MCF-7组(以HLA-A^*0201和Ran表达阳性的人乳腺癌细胞MCF-7为靶细胞)、T2组(以HLA-A^*0201表达阳性而Ran表达阴性的T2细胞为靶细胞)和T2+WT组(以负载相应天然表位的T2细胞为靶细胞)。

(2)效应细胞制备：按照前述同样方法制备表位诱导的特异性CTL，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养液调整至适当浓度，作为效应细胞。

(3)靶细胞标记：将MCF-7细胞、T2细胞和负载相应天然表位的T2细胞(将T2细胞预先用浓度为10μg/mL的相应天然表位于温度37℃孵育4小时)用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×10⁶/mL，取1mL置10mL血清瓶中，加入100μCi Na⁵¹CrO₄，在温度37℃、CO₂气体浓度为50mL/L的条件下孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的⁵¹Cr，再用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×10⁵/mL，作为靶细胞。

(4)⁵¹Cr释放法检测肿瘤细胞特异性杀伤效应：在96孔V型底培养板中，每孔加入效应细胞100μL和靶细胞100μL(E/T为90)，每组设3个复孔，同时设自然释放孔(由靶细胞加入浓度为2mol/L的盐酸制得)和最大释放孔(由靶细胞加入培养液制得)；将96孔板在温度37℃、CO₂气体浓度为50mL/L的条件下孵育4小时，1000rpm离心10分钟，每孔取上清100μL，用γ计数器分别测定脉冲数(即cpm值)，并计算特异性释放率：特异性释放率(％)＝[(实验组cpm平均值-自然释放孔cpm平均值)/(最大释放孔cpm平均值-自然释放孔cpm平均值)]×100％。

(5)⁵¹Cr释放法检测肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A^*0201限制性：在96孔V型底培养板中，每孔加入靶细胞MCF-7 100μL和BB7.2杂交瘤细胞分泌的鼠抗人HLA-A^*0201单克隆抗体100μL，温度4℃孵育40分钟，用PBS洗涤后，再加入不同细胞浓度的效应细胞100μL，使E/T分别为20、50和90，孵育，离心取上清，测定cpm值并计算特异性释放率。

结果：见图3和图4，由图3可知，天然CTL表位Ran1及其模拟CTL表位Ran1-1Y诱导的特异性CTL对HLA-A^*0201和Ran表达阳性的MCF-7细胞和负载Ran1的T2细胞均有特异性杀伤作用，且Ran1-1Y的特异性杀伤率高于Ran1，表明Ran1-1Y可以上调CTL免疫应答并能与T2细胞表面的天然CTL表位发生交叉识别；Ran1-1Y对不表达Ran只表达HLA-A^*0201的T2细胞未见特异性杀伤；由图4可知，用抗HLA-A^*0201抗体封闭MCF-7细胞表面的HLA-A^*0201分子后，Ran1和Ran1-1Y诱导的特异性CTL在各效靶比对MCF-7细胞均未见特异性杀伤，表明其诱导的特异性CTL对MCF-7为抗原特异性、MHC限制性杀伤。

基于以上实验结果，可得出如下结论：与Ran1相比，Ran1-1Y与HLA-A^*0201分子具有更强的亲和力和结合稳定性，同时，其诱导的特异性CTL能分泌更高水平的IFN-γ，并且对HLA-A^*0201和Ran表达阳性的MCF-7细胞以及负载Ran1的T2细胞均表现出更强的抗原特异性杀伤效应；由于肿瘤抗原Ran广泛表达于不同类型的肿瘤组织中，因此，本发明的模拟CTL表位可以作为活性成分，和药学上可接受的载体组成组合物，或者，与其它具有药理活性的提取物和/或合成药物和药学上可接受的载体组成组合物，再按照药学领域的常规方法制成Ran表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟CTL表位及其应用

<160>1

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟CTL表位

<400>1

Tyr Met Phe Asp Val Thr Ser Arg Val

1 5

Claims

1、肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟CTL表位，其特征在于：由Tyr-Met-Phe-Asp-Val-Thr-Ser-Arg-Val氨基酸序列组成。

2、肿瘤治疗性多肽疫苗，其特征在于：含有免疫学有效量的权利要求1所述的肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟CTL表位。

3、根据权利要求2所述的肿瘤治疗性多肽疫苗，其特征在于：还含有药学上可接受的载体。

4、权利要求1所述的肿瘤抗原Ran HLA-A^*0201限制性模拟CTL表位在制备Ran表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗中的应用。

5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述Ran表达阳性肿瘤为乳腺癌。