CN102662054B - 一种同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法，能同步系列化检测针对特定抗原的特异性胸腺依赖性淋巴细胞的数量及其接受抗原刺激后的反应活性，既高度特异，又简便易行，不需特殊仪器，能极大地降低特异性T细胞检测的难度，易于在一般单位推广应用。系列化检测是指该方法借助微孔反应板能同步检测由一系列人类主要组织相容性抗原所提呈的针对一系列抗原表位的特异性T细胞，使针对靶抗原的检测试剂盒既能覆盖绝大多数人群，又能在一次检测中分析多种抗原表位的特异性T细胞。本方法使分析机体的特异性细胞免疫功能状态变得简单方便，从而可促进免疫性疾病的研究和治疗。

Description

一种同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，涉及一种抗原特异性胸腺依赖性淋巴细胞检测方法。

背景技术

抗原特异性T淋巴细胞是介导适应性免疫应答的核心细胞，在抗感染、抗肿瘤以及超敏反应和自身免疫病的发生中起着至关重要的作用，其数量的多寡和功能的强弱直接反映了人体特异性细胞免疫的功能状态，在选择治疗方案、评价药物疗效、预测疾病进程以及疫苗效果监测等方面都有着不同于抗体的重要参考价值。但是，与特异性抗体的检测相比，特异性T细胞的数量和功能检测都困难许多，方法少而复杂，试剂少而昂贵。

T细胞膜上的TCR（T细胞抗原受体）与抗原提呈细胞膜上pMHC分子（MHC/抗原肽复合体）的特异性识别和结合是T细胞特异性的物质基础。pMHC四聚体技术结合流式细胞分析是目前检测抗原特异性T细胞的金标准方法，最具特异性和准确性。由于pMHC单体与TCR的亲和力较低，解离速度快，不能用于特异性T细胞的分析，而研究表明四价的pMHC分子在亲和力和生物效应方面都是最佳的。1996年Altman等将生物素化的pMHC单体分子与荧光标记的链霉亲和素结合，制成pMHC四聚体，能同时与同一T细胞膜上的4个TCR分子结合，增强了与T细胞的结合力。该技术不断发展，至今已成为特异性T细胞的数量检测、功能分析、表位验证以及T细胞靶向治疗等诸多方面的有力工具。

由于pMHC四聚体的制备难度较大，商业产品少而昂贵，另一种特异性较低但试剂易得的检测方法也应用较多，即ELISPOT技术。在细胞培养孔中将待检细胞群与特定抗原共孵育，刺激抗原特异性T细胞活化而分泌IFN-γ等，继而被包被在孔底的抗IFN-γ等抗体捕获，再经酶标抗体染色，根据显色斑点的多少判断抗原特异性T细胞的数量，实际体现的是接受抗原刺激后活化而分泌IFN-γ的细胞数量（包括非T细胞）。该法兼有分析T细胞活化和分泌细胞因子的功能，但抗原特异性较低。细胞因子的胞内荧光染色法也有类似的缺点。

为了既高度特异又简单方便地检测抗原特异性T细胞，人们在两个方面不断地进行探索：一是改进和创新pMHC四聚体或多聚体的制备技术，使工艺简化，成本降低，促进四聚体技术的推广应用。传统的pMHC复合体制备方法是稀释法，即将原核重组表达的MHC I类分子的重链及β2微球蛋白（或MHC II类分子的α链及β链）与人工合成的抗原肽稀释到缓冲液中进行复性折叠，浓缩后再纯化pMHC单体分子，而后经生物素-亲和素***制备四聚体。主要缺点是步骤繁杂，费时3天，复性效率低于5%，而且需要原核表达不同型别MHC分子的基因工程蛋白。对此，人们不断进行改进，如：2006年，Ruan等建立EBV转化的能表达各型别HLA-A、-B和-C分子的B细胞系，从细胞膜上提取纯化真核表达的α链，再经稀释法与外源性β2和抗原肽进行折叠。受真核表达和操作繁杂的限制，此方法的产量也比较低下。另一种较新颖的改进是条件性抗原肽策略，即将MHC重链、β2和条件性抗原肽以传统稀释法制备成pMHC复合体，然后在紫外线的作用下使条件性抗原肽在特定部位断裂而从复合体中解离，再加载新的目的抗原肽而制成新pMHC复合体。该法虽可更换抗原肽，但制备过程仍很复杂，难以大批量生产。2010和2011年，季明春和Samanta等先后报道了抗原肽-MHC I类分子重链和β2相融合的单链重组蛋白技术，并制备了单链蛋白的四聚体。该技术省去了重链和β2蛋白的体外折叠，但仍需将大分子量的融合蛋白恢复正确的pMHC空间构象以及浓缩、纯化等步骤，复性效率较低。因此，继续发展更加简便和高效的pMHC制备方法仍十分必要。

二是探索基于pMHC分子靶向的T细胞检测的新方法，如pMHC芯片技术。

2003年，Soen等将不同型别pMHC四聚体分子点至带覆层的玻片表面制成芯片，然后将细胞悬液滴至芯片表面，抗原特异性T细胞即可与相应的pMHC复合体相结合而吸附在相应的斑点区域，洗去其他细胞后可肉眼观察结果，也可利用微分干涉相差显微镜或荧光显微镜观察。2007年，Deviren.等利用pMHC-Ig融合分子和抗Ig抗体制备了间接标记的pMHC芯片。在此基础上，Stone等建立了人工抗原递呈芯片技术，即将pMHC单体或四聚体、共刺激分子的抗体以及细胞因子捕获抗体（例如抗IFN-γ、抗TNF、抗IL-4、抗颗粒酶B）等一起点在芯片的同一斑点中，抗原特异性T细胞识别并结合在含相应pMHC分子的斑点内（此时可计数），同时，在共刺激分子的刺激下活化而分泌细胞因子，并被同一斑点内的细胞因子抗体捕获，经荧光标记的细胞因子抗体染色后检测荧光信号的强弱，评价特异性T细胞的功能状况。2010年，Ge等也制备了人工抗原提呈芯片，并建立了荧光数据分析***，检测了患者和健康者体内流感病毒抗原特异性的T细胞反应以及胰岛β细胞自身抗原特异性的T细胞反应。该法的主要优点是可同时检测针对一系列抗原表位的特异性T细胞，并同时进行数量和功能的评价；但其缺点也比较明显，如：⑴仅靠pMHC分子与T细胞的结合力不易使特异性T细胞固定在芯片上，而在洗涤中易被冲掉；⑵芯片难以满足细胞培养所需的良好条件，影响T细胞的活化和细胞因子的分泌；⑶芯片技术中不同荧光标记物之间的干扰和影响；⑷临床操作中需要芯片荧光检测仪等设备，限制了在中小医院的应用等。

人工抗原提呈细胞（artificial antigen-presenting cell,aAPC）是模拟T细胞活化的双重信号机制，在载体表面展现MHC/抗原肽复合物及共刺激分子、黏附分子的配体或抗体，模拟天然抗原提呈细胞。近年来，以细胞大小的磁珠或胶乳微球做载体标记pMHC多聚体和CD28抗体等分子的aAPC已成为在体外细胞培养或体内治疗中靶向结合和扩增抗原特异性T细胞的有力工具。2007年，我们利用pMHC四聚体制备了胶乳微球式aAPC，注入小鼠体内有效诱导了抗肿瘤的主动免疫反应；2011年，我们又制备了杀伤性aAPC，在小鼠皮肤移植模型中诱导了同种反应性T细胞的靶向杀伤和清除。

迄今为止，未见有将pMHC四聚体技术、人工抗原提呈细胞技术与ELISPOT技术、磁性细胞分选技术及微孔反应板整合一体制备磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板的知识产权情况，也未见利用本发明方案检测抗原特异性T细胞的研究报道。

发明内容

技术问题：本发明提供了能同步系列化检测针对特定抗原的特异性T细胞的数量及其接受抗原刺激后的反应活性，既高度特异，又简便易行，不需特殊仪器，易于在一般单位推广应用的同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法。

技术方案：本发明的同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法，包括以下步骤：

1）制备主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体：利用基因工程技术和蛋白质工程技术制备MHC分子与其所提呈的靶抗原的抗原表位肽的复合体分子，再利用生物素-亲和素***制备所述主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体；

2）制备磁珠式人工抗原提呈细胞：将步骤1）中制备的主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体与共刺激分子配体一起共同包被磁性微米球或磁性纳米颗粒，制备得到磁珠式人工抗原提呈细胞；

3）制备磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板：在微孔反应板的不同微量反应孔中分别包被抗干扰素-γ、抗肿瘤坏死因子、抗白细胞介素-4和抗颗粒酶B抗体，用牛血清白蛋白封闭上述微量反应孔，再将所述步骤2）中制备的磁珠式人工抗原提呈细胞，按照针对主要组织相容性抗原MHC分子型别和抗原表位的不同加入不同的微量反应孔中，制成磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板；

4）抗原特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的检测：

取待检机体的血细胞标本，常规分离单个核细胞PBMC，计数后将分离的单个核细胞PBMC加入步骤3）中制备的磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板的每个微量反应孔中，反应0.5~3小时后，将该磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板置于板式磁块Plate Magnet上，洗涤微量反应孔并倾倒上清液，从而去除未与磁珠结合的细胞；

移走板式磁块Plate Magnet后将淋巴细胞培养液加入每个微量反应孔中，在显微镜下计数每个微量反应孔中与磁珠结合的细胞数量，即抗原表位特异性的胸腺依赖性淋巴细胞数量；

将磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板置于细胞培养箱培养24~72小时，弃去淋巴细胞培养液后用蒸馏水洗涤每个微量反应孔，破坏细胞，弃除微量反应孔内所有磁珠及细胞碎片，将生物素标记的细胞因子抗体加入微量反应孔中，静置0.5~2小时后洗涤微量反应孔，向每个微量反应孔加入酶标亲和素继续静置0.5~1.5小时，洗涤微量反应孔后加入酶底物显色，用酶标仪检测每个微量反应孔的吸光度或者用显微镜计数每个微量反应孔中的斑点数，根据所测得的吸光度或斑点数评价特异性胸腺依赖性淋巴细胞接受人工抗原提呈细胞的双信号刺激后活化并分泌细胞因子和颗粒酶B的能力。

本发明的步骤2）中，共刺激分子配体为抗分化抗原28抗体和抗分化抗原137抗体的任一种或其混合物。

本发明的步骤2）中，磁性微米球的直径为4.5μm，磁性纳米颗粒的直径小于4.5μm。

本发明的步骤4）中，生物素标记的细胞因子抗体为生物素标记的抗干扰素-γ、抗肿瘤坏死因子、抗白细胞介素-4和抗颗粒酶B抗体的一种或多种，当生物素标记的细胞因子抗体为多种时，将它们分别加入不同的微量反应孔中。

本发明将pMHC四聚体技术、人工抗原提呈细胞技术与ELISPOT技术、磁性细胞分选技术及微孔反应板整合一体，制备成磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板(aAPC-microplate)：针对特定的靶抗原，先制备一系列MHC型别所提呈的抗原表位的pMHC四聚体，与CD28等共刺激分子的抗体共同包被磁性微球，制备一系列磁珠式人工抗原提呈细胞；在微孔反应板中包被抗IFN-γ、抗TNF和抗颗粒酶B等抗体，然后在微量反应孔中加入磁珠式人工抗原提呈细胞，制备成靶抗原特异性的T细胞数量和功能检测反应板。

本发明的基本原理是：全血中的抗原特异性T细胞借TCR与aAPC（磁珠）表面的pMHC四聚体特异性结合，在板式磁场（Plate Magnet）下固定于微量反应孔中，未与磁珠结合的细胞被洗去，显微镜下计数每孔内的剩余细胞，即该抗原表位特异性的T细胞数量；继续培养中，特异性T细胞在磁珠提供的双信号刺激下活化，分泌的细胞因子或颗粒酶B被孔底的抗体捕获，经酶标抗体染色后检测每孔中的OD值或在显微镜下计数斑点数，评价特异性T细胞活化和分泌细胞因子的功能。

本发明的检测方法可用来检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞的数量和功能，特别是最重要的病原体抗原、肿瘤抗原、自身抗原或移植抗原特异性的胸腺依赖性淋巴细胞。

有益效果：本发明方法与现有技术相比，具有以下优点：

（1）本发明的方法是一种将pMHC四聚体技术、人工抗原提呈细胞技术与ELISPOT技术、磁性细胞分选技术以及微孔反应板整合一体的免疫学方法，既保留了pMHC四聚体技术的高度特异性、人工抗原提呈细胞在体外双信号刺激T细胞增殖的优势以及ELIPOST技术对细胞的功能性分析，又利用了磁性细胞分选的简便性和微孔反应条板的高通量性和灵活性，最终使抗原特异性T细胞的数量、功能及系列化分析同步进行，又不需特殊仪器，操作简便易行，能极大地降低特异性T细胞检测的难度，易于在一般单位推广应用。

（2）本发明的方法适用于针对各种病原体抗原、肿瘤抗原、自身抗原以及同种反应性抗原等进行特异性T细胞的数量和功能分析，为检测各种感染、肿瘤、自身免疫病和移植排斥患者的特异性细胞免疫功能提供了简单易行的检测方法，对各种免疫性疾病的治疗方案选择、药物疗效评价、疾病进程预测以及疫苗效果监测等有着不同于抗体检测的重要参考价值。

（3）本发明方法避免了传统方法对抗原特异性T细胞的数量检测和功能分析分开进行的弊端，而且利用试剂盒可以同步针对一系列MHC型别所提呈的一系列抗原表位的特异性T细胞进行分析，使携带不同HLA型别的大多数人群不用进行HLA基因分型而直接使用试剂盒检测，因为大多数人群至少与试剂盒中的一种HLA基因型别相匹配。

具体实施方式

本发明的同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法，包括以下步骤：

1）制备主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体：利用常规的基因工程技术和蛋白质工程技术制备MHC分子与其所提呈的靶抗原的抗原表位肽的复合体分子，再利用生物素-亲和素***制备所述主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体。具体方案如下：

①特定MHC分子α链蛋白的重组构建和表达：

选用人群中频率较高的一组特定的MHC等位基因，针对每种等位基因设计引物，用常规RT-PCR技术从细胞DNA样品中扩增α链胞外区的基因，并利用PCR引物在3′端连接一段由15个氨基酸组成的生物素底物肽BSP的基因序列，然后构建pET28a重组质粒，鉴定序列后转化表达菌BL21，经IPTG诱导后用常规方法提取和纯化包涵体蛋白。

②特定MHC分子β链蛋白（或β2微球蛋白）的重组构建和表达：

针对每种等位基因设计引物，用常规RT-PCR技术从细胞DNA样品中扩增MHC II类分子的β链胞外区基因（或者MHC I类分子的β2微球蛋白），然后构建pET28a重组质粒，鉴定序列后转化表达菌BL21，经IPTG诱导后用常规方法提取和纯化包涵体蛋白。

③特定pMHC复合体的制备：

表位选择：

针对某一特定抗原（如病原体抗原、肿瘤抗原、自身抗原或者同种抗原等），选用一系列能被特定MHC分子所提呈的优势T细胞抗原表位，并人工合成这些抗原肽。

pMHC复合体的折叠：

利用常规的稀释复性法或者离子交换层析法等技术，将特定MHC分子的α链、β链（或者MHC I类分子的β2微球蛋白）进行复性，并与特定抗原肽进行折叠，浓缩折叠液后用FPLC技术或其他技术纯化折叠正确的pMHC复合体，并用分子筛层析法分析其组成和纯度。

④pMHC四聚体的制备：

纯化后的pMHC复合体在生物素酶BirA的催化下使β2微球蛋白末端的BSP与生物素结合（按Avidity公司产品说明进行），超滤除去多余的生物素，按一定比例分批加入链酶亲和素（包被磁珠用）或荧光素PE标记的链酶亲和素（流式分析用），超滤去除游离的链酶亲和素即得pMHC四聚体。

2）制备磁珠式人工抗原提呈细胞：将步骤1）中制备的主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体与共刺激分子配体一起共同包被磁性微米球或磁性纳米颗粒，制备得到磁珠式人工抗原提呈细胞。其中，共刺激分子配体为抗分化抗原28抗体和抗分化抗原137抗体的任一种或其混合物。具体方案如下：

取直径4.5μm的磁性微球（表面已基团功能化）或者直径小于4.5μm的磁性纳米颗粒10⁷，用无菌PBS洗涤处理。将anti-His6、anti-CD28和anti-CD137等单抗（2.5μg：2.5μg：2.5μg）混合后加入beads悬液中，4°C缓慢旋转1小时。无菌PBS（磷酸盐缓冲溶液）离心洗涤3次后将beads重悬于封闭缓冲液中（0.1M PBS,3%human sera,0.05%sodium azide），于4°C慢转1小时，让血清蛋白封闭beads表面剩余的结合位点。洗涤后加入一种pMHC四聚体，2.5μg/10⁷beads，于4°C再慢转1小时。至此，Anti-CD28和anti-CD137等共刺激分子的抗体被直接包被于beads表面，pMHC四聚体则通过anti-His6单抗的桥联作用被间接包被于beads表面，从而形成磁珠式人工抗原提呈细胞。

3）制备磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板：在微孔反应板的不同微量反应孔中分别包被抗干扰素-γ、抗肿瘤坏死因子、抗白细胞介素-4和抗颗粒酶B抗体，用牛血清白蛋白封闭上述微量反应孔，再将所述步骤2）中制备的磁珠式人工抗原提呈细胞，按照针对主要组织相容性抗原MHC分子型别和抗原表位的不同加入不同的微量反应孔中，锡箔纸真空封孔后即制成磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板。

4）抗原特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的检测：

①标本采集与HLA等位基因分型：

采集待检机体的血细胞标本，经常规分型方法确定每份标本的HLA等位基因型别。

②人工抗原提呈细胞微孔反应板法对标本的检测：

用Ficoll分离液常规分离外周血中单个核细胞（PBMC），利用计数板和显微镜计数细胞，在MHC等位基因型别相对应的微量孔中加入100μl（约105细胞）PBMC，于370C孵育0.5h、1h或者3h，将磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板置于板式磁块（Plate Magnet）上，洗涤微量反应孔并倾倒上清液，洗涤去除未与磁珠结合的细胞。移走板式磁块Plate Magnet后将淋巴细胞培养液加入每个微量反应孔中，在显微镜下计数每孔中与磁珠结合的细胞数量（即该抗原表位特异性的T细胞数）。然后，微孔反应板继续培养24h、48h或者72h，弃上清后用蒸馏水破坏细胞，经TBST缓冲液洗涤弃除孔内所有磁珠及细胞碎片，将生物素标记的细胞因子抗体加入微量反应孔中，室温反应0.5h、1h或者2h，洗涤后补加酶标链酶亲和素继续室温孵育0.5h、1h或1.5h，洗涤后加酶底物显色，用酶标仪检测吸光度值或在显微镜下计数每孔中的斑点数，评价特异性T细胞接受人工抗原提呈细胞的双信号刺激后活化并分泌细胞因子或颗粒酶B的能力。其中的生物素标记的细胞因子抗体可以是生物素标记的抗干扰素-γ、抗肿瘤坏死因子、抗白细胞介素-4和抗颗粒酶B抗体的一种或多种，采用单一类型的生物素标记的细胞因子抗体也可以做评价，但是四种类型的吸光度更能全面充分地说明问题，所以在一次检测中可以四种材料都用。当生物素标记的细胞因子抗体为多种时，将它们分别加入不同的微量反应孔中。

Claims (3)

1.一种同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）制备主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体：利用基因工程技术和蛋白质工程技术制备MHC分子与其所提呈的靶抗原的抗原表位肽的复合体分子，再利用生物素-亲和素***制备所述主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体；

2）制备磁珠式人工抗原提呈细胞：将所述步骤1）中制备的主要组织相容性抗原MHC分子与抗原肽复合体的四聚体与共刺激分子配体一起共同包被磁性微米球或磁性纳米颗粒，制备得到磁珠式人工抗原提呈细胞，所述共刺激分子配体为抗分化抗原28抗体和抗分化抗原137抗体的任一种或其混合物；

3）制备磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板：在微孔反应板的不同微量反应孔中分别包被抗干扰素-γ、抗肿瘤坏死因子、抗白细胞介素-4和抗颗粒酶B抗体，用牛血清白蛋白封闭所述微量反应孔，再将所述步骤2）中制备的磁珠式人工抗原提呈细胞，按照针对主要组织相容性抗原MHC分子型别和抗原表位的不同加入不同的微量反应孔中，制成磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板；

4）抗原特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的检测：

取待检机体的血细胞标本，常规分离单个核细胞PBMC，计数后将所述分离的单个核细胞PBMC加入所述步骤3）中制备的磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板的每个微量反应孔中，反应0.5～3小时后，将该磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板置于板式磁块PlateMagnet上，洗涤微量反应孔并倾倒上清液，从而去除未与磁珠结合的细胞；

移走板式磁块PlateMagnet后将淋巴细胞培养液加入每个微量反应孔中，在显微镜下计数每个微量反应孔中与磁珠结合的细胞数量，即抗原表位特异性的胸腺依赖性淋巴细胞数量；

将磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板置于细胞培养箱培养24～72小时，弃去淋巴细胞培养液后用蒸馏水洗涤每个微量反应孔，破坏细胞，弃除微量反应孔内所有磁珠及细胞碎片，将与被检测物质对应的生物素标记的细胞因子抗体加入微量反应孔中，静置0.5～2小时后洗涤微量反应孔，向每个微量反应孔加入酶标亲和素继续静置0.5～1.5小时，洗涤微量反应孔后加入酶底物显色，用酶标仪检测每个微量反应孔的吸光度或者用显微镜计数每个微量反应孔中的斑点数，根据所测得的吸光度或斑点数评价特异性胸腺依赖性淋巴细胞接受人工抗原提呈细胞的双信号刺激后活化并分泌细胞因子和颗粒酶B的能力。

2.根据权利要求1所述的同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法，其特征在于，所述步骤2）中，磁性微米球的直径为4.5μm，磁性纳米颗粒的直径小于4.5μm。

3.根据权利要求1所述的同步检测特异性胸腺依赖性淋巴细胞数量和功能的方法，其特征在于，所述步骤4）中的生物素标记的细胞因子抗体为生物素标记的抗干扰素-γ、抗肿瘤坏死因子、抗白细胞介素-4和抗颗粒酶B抗体的一种或多种，当生物素标记的细胞因子抗体为多种时，将它们分别加入不同的微量反应孔中。